水稻幹尖線蟲的檢測方法及診斷試劑盒的製作方法

2023-12-08 17:46:11 1

專利名稱：水稻幹尖線蟲的檢測方法及診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測或鑑定水稻幹尖線蟲的方法以及一種檢測或鑑定水稻幹尖 線蟲的試劑盒。
背景技術：
水稻幹尖線蟲(Aphelenchoides besseyi Christie)，又稱貝西滑刃線蟲，寄 主最主要是水稻，可引起水稻幹尖或白尖病，全國各水稻產區都有發生，一般可造成減產 10% -20%，嚴重者可達30%以上。其還會引起草莓的夏矮病，受害草莓葉片皺縮畸形、植 株矮化、開花減少，產量大大降低。同時，該線蟲也是玉米、甘薯、大豆、蔬菜、蘭花、菊花、大 麗花等作物或花卉的重要病害，導致經濟價值降低。水稻幹尖線蟲主要是種子帶病傳播，一旦侵入植株就難以用藥劑防治，只能及時 拔除，集中燒毀，因此防治的主要措施是通過檢疫進行隔絕。中國專利申請98111429. 6公開了一種採用二硫氰基甲烷或其鹽類化合物，通過 浸種、拌種或種子包衣技術來防治水稻幹尖線蟲病、惡苗病、胡麻斑病、苗稻瘟病、大、小麥、 青稞和玉米等作物條紋病、堅黑穗病、腥黑穗病、網斑病、紋枯病的方法。中國專利申請200710158025. 4公開了具毒殺植物寄生線蟲作用的真菌的培 養方法及其代謝物製備方法和應用，該申請所公開的木黴菌菌株Snef85為哈茨木黴 Trichoderma harzianum，其代謝產物對植物寄生線蟲，特別是對南方根結線蟲、水稻幹尖 線蟲和大豆胞囊線蟲具有毒力高，殺線蟲效果明顯的突出特點。中國專利申請200810010465. X則公開了具毒殺植物線蟲作用的鏈黴菌的培養方 法及其代謝物製備方法和應用，該申請所公開的鏈黴菌菌株Snea253為委內瑞拉鏈黴菌 Streptomyces venezuelae,其代謝產物對植物寄生線蟲，特別是對大豆胞囊線蟲、根結線 蟲和水稻幹尖線蟲具有很高毒力。防治水稻幹尖線蟲的基礎是首先對水稻幹尖線蟲進行檢測。然而，到目前為止，針 對水稻幹尖線蟲的檢測方法仍是傳統的方法，其檢測手段主要是用直接浸泡法或貝曼漏鬥 法分離線蟲，然後鏡檢，根據水稻幹尖線蟲的形態特徵進行判斷。這種方法存在一定的弊 端，主要表現在一、水稻幹尖線蟲屬於滑刃線蟲屬，滑刃線蟲種類繁多，通常鑑定的樣品中 會有多種形態相似的線蟲，這就要求鑑定者具有豐富的經驗；二、線蟲個體間存在差異，這 需要有足夠的鑑定樣本；三、形態學鑑定只適用於成蟲，而對於幼蟲不適用。因此，研究出對水稻幹尖線蟲快速、準確的檢測方法實為必要。

發明內容
為克服上述缺陷，本發明的目的之一在於提供一種快速、準確地檢測出水稻幹尖 線蟲的方法。本發明的另一目的在於提供水稻幹尖線蟲病診斷用試劑盒。為實現上述目的，本發明提供的水稻幹尖線蟲的檢測方法包括(a)從可疑植物材料或土樣中分離出待檢測線蟲，提取DNA ；
(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2的引物， 進行聚合酶鏈式反應，得到擴增產物；(c)檢測步驟(b)中獲得的擴增產物，根據檢測結果判斷水稻幹尖線蟲的存在。優選地，步驟(C)中所述的檢測的方法為電泳檢測，更優選為瓊脂糖凝膠電泳。通 過瓊脂糖凝膠電泳可方便、快捷地檢測出擴增產物中是否含有特異性擴增的片段，以及該 片段的大小。本發明的方法利用分子生物學原理，使用發明人設計的如序列表中所列的一對特異性引物，來擴增水稻幹尖線蟲的基因組DNA。如果待檢測的線蟲確為水稻幹尖線蟲，則通 過聚合酶鏈式反應(PCR)後可獲得擴增的特異性片段，當電泳檢測時，會顯示出特異性條 帶；如果待檢測的線蟲非水稻幹尖線蟲，則通過PCR後不能獲得擴增的特異性片段，當電泳 檢測時，就不會顯示出特異性條帶。因此，可通過電泳檢測結果中是否出現特異性條帶來判 斷出待檢測線蟲是否為水稻幹尖線蟲。為更好地實現本發明，針對不同數量的線蟲，其DNA提取方法可分為(1)當所述可疑植物材料或土樣中存在大量線蟲時，採用酚氯仿提取法(也稱作 "Miniprep 法」)分離出 DNA0(2)當所述可疑植物材料或土樣中存在單條線蟲時，步驟(a)中所述的提取包括 以下步驟(i)將單條線蟲加入含有WLB溶液的管中；(ii)於-70°C放置 30-60min ；95°C放置 15_20min ；55_65°C放置 2min ；(3)再加入蛋白酶K，55-65°C處理30min-2h ；95°C處理15_20min，以獲得作為單條 線蟲DNA模板的產物。優選地，上述植物材料是水稻植株或種子，或是草莓、玉米、甘薯、大豆、蔬菜、蘭 花、菊花或大麗花的植株。另一方面，為了更方便地使用本發明的方法，本發明還提供了一種用於診斷水稻 幹尖線蟲病的試劑盒，其包含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的引物對。本發明的方法適用於土樣、種子和植株樣品中水稻幹尖線蟲的快速檢測和鑑定， 與現有方法相比，本發明的優點表現在(1)結果可靠通過對水稻幹尖線蟲的3個不同地理種群和菊花滑刃線蟲 (A. ritzemabosi)、福建滑刃線蟲(A. fujianensis)、擬滑刃線蟲(Paraphelenchidea sp.)、 真滑刃線蟲(Apelenchus sp.)、阿蘇裡傘滑刃線蟲(Bursaphelenchus athuri)和松材線蟲 (B. xylophilus)等線蟲的測試驗證表明，本發明的方法檢測的結果具有極高的可靠性。(2)操作簡便快速應用本發明方法，對線蟲樣本進行簡單處理、PCR擴增和常規 的瓊脂糖凝膠電泳後即可判定結果，一般整個檢測過程可在4小時內完成。(3)檢測靈敏度高利用本發明的引物對可擴增出單條水稻幹尖線蟲的幼蟲或成 蟲的特異性片段，因此本發明的方法靈敏度高、實用性強，可滿足農作物種植前和植物檢疫 過程中對水稻幹尖線蟲快速可靠的檢測和鑑定需要。


圖1顯示的是利用本發明的引物對，對不同滑刃線蟲的基因組DNA的PCR擴增的結果；圖2顯示的是利用本發明的引物對，對水稻幹尖線蟲的單條線蟲基因組DNA的PCR擴增的結果；圖3顯示的是利用本發明的引物對，對3個不同水稻幹尖線蟲地理種群的單條線 蟲基因組DNA的PCR擴增的結果。
具體實施例方式以下通過具體實驗例來進一步詳細描述本發明。本發明提供的水稻幹尖線蟲基因組DNA擴增引物序列如下所示5， -TCGATGAAGAACGCAGTGAATT-3，；5， -AGATCAAAAGCCAATCGAATCAT-3，上述引物可在水稻幹尖線蟲基因組DNA上特異性地擴增出312bp的產物。1. _十牛微-*軒4 觸白■尉牛牛「曾試驗步驟採用本領域技術人員熟知的酚氯仿法(Minipr印DNA提取法)，分別提 取水稻幹尖線蟲、菊花滑刃線蟲、福建滑刃線蟲，滑刃線蟲種1(A. sp. 1)，滑刃線蟲種2 (Α. sp. 2)，真滑刃線蟲，擬滑刃線蟲，阿蘇裡傘滑刃線蟲和松材線蟲的基因組DNA。提取方法 如下(1)將線蟲收集到1.5mL離心管中，用與離心管配套的錐形研磨棒研磨成粉末，加入 700 μ 1 提取緩衝液(50mM Tris-HCl, ρΗ7· 5 ；50mM NaCl ；5mM EDTA, ρΗ8· 0 ；0. 5% SDS)禾口 7 μ 1的20mg/ml蛋白酶K，輕輕混勻；(2) 50°C水浴2_5h ； (3)加入等體積的Tris飽和酚，輕 輕混勻，12000rpm，4°C下離心lOmin，取上清液轉入另一滅菌的1. 5ml離心管中；(4)加入等 體積的氯仿/異戊醇(24 1)，輕輕混勻，12000rpm，4°C下離心lOmin，取上清液轉入另一 滅菌的1. 5ml離心管中；(5)加入1/10體積的3M/L醋酸鈉(pH5. 2)和2. 5體積經預冷的 無水乙醇，輕輕混勻，放入_20°C冰箱中放置2h以上，過夜效果更好；(6) 12000rpm，4°C下離 心IOmin以沉澱DNA ； (7)沉澱物用75%的乙醇洗滌2次，待乙醇揮發完全後，將沉澱的DNA 溶解於 20 μ 1 TEdOmM Tris-HCl ρΗ8· 0，ImM EDTA)中；(7)任選地，取 1 μ 1 在 1. 0% 的瓊 脂糖凝膠上粗略檢測所提DNA的量和純度。然後，按如下PCR反應體系和條件，使用本發明 的引物對對線蟲樣本進行PCR擴增PCR 反應體系25μ L，包括5ng 線蟲 DNA，引物各 0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs，lXPCR 緩 衝液(包括2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反應條件預變性 94 °C 3min ；32 個循環的 94 °C 40s，57°C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16 °C 保存。將5 μ L PCR產物用1. O % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經DNA染料染色 後於紫外凝膠成像系統下顯像。實驗結果結果如圖1所示，其中各泳道分別為M:DNA標記DL 2000 (Takara Biotech,大連，中國)(其條帶大小由上至下分別對應為2000bp、1000bp、750bp、500bp、 250bp 和 IOObp) ；1 水稻幹尖線蟲(Aphelenchoides besseyi) ；2 菊花滑刃線蟲 (A. ritzemabosi) ；3 福建滑刃線蟲(A. fujianensis) ；4 滑刃線蟲種群 1 (A. sp. 1)； 5 滑刃線蟲種群2 (A. sp. 2) ;6 擬滑刃線蟲(Paraphelenchidea sp. ) ;7 真滑刃線 蟲(Apelenchus sp.) ；8:阿蘇裡傘滑刃線蟲(Bursaphelenchus athuri) ；9:松材線蟲(B.xylophilus)。從圖中可看出，只在水稻幹尖線蟲上擴增出特異性條帶(對應於第1泳道)，經分析為312bp的產物。因此，可看出本發明的方法使用的引物對具有高度的特異性，從而保證了檢測結 果的高準確性。2. 靈敏度實驗－對單條水稻幹尖線蟲的擴增
實驗步驟在解剖鏡下分離出的單條成蟲或幼蟲，將其加入含有8 μ LffLB溶液 (2. 5mmol/L 二硫蘇糖醇，1. 125%吐溫 20,0. 25g/L 明膠，125mmol/L 氯化鉀，3. 75mmol/L 氯 化鎂，25mmol/L Tris-Cl (pH 8.3))的 PCR 管中，然後-70°C放置 45min ;95°C放置 15min ； 65°C放置2min ；再加入20mg/mL的蛋白酶K 1 μ L，65°C處理Ih ；95°C處理15min後，作為單 條線蟲DNA模板直接用於PCR擴增。PCT反應體系和條件如下PCR反應體系25μ L，包括2μ L單條線蟲裂解DNA，引物各0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs, IXPCR緩衝液(含2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反應條件預變性 94 °C 3min ；32 個循環的 94 °C 40s，57°C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16°C 保存；將5 μ L PCR產物用1. 0 % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經DNA染料染色 後於紫外凝膠成像系統下顯像。實驗結果結果如圖2所示，其中泳道M :DNA標記DL 2000 (TakaraBiotech，大連， 中國)；泳道1-12為單條水稻幹尖線蟲裂解DNA擴增；泳道13 清水對照。從圖中可看出， 實驗泳道都擴增出特異性條帶，經分析為312bp的產物，而對照組則沒有特異性條帶。因此，本發明的方法靈敏度非常高，即使單條水稻幹尖幼蟲亦能準確檢測出，大大 方便了實際應用。3.可靠性實驗_對水稻幹尖線蟲不同種群的單條線蟲的擴增實驗步驟對採集於福建、浙江和雲南的水稻上的水稻幹尖線蟲的3個種群單條 線蟲，按上述靈敏度實驗中的方法裂解DNA，以進行PCR擴增。PCR反應體系和條件如下PCR反應體系25μ L，包括2μ L單條線蟲裂解DNA，引物各0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs, IXPCR緩衝液(含2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反應條件預變性 94 °C 3min ；35 個循環的 94 °C 40s, 57 °C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16 °C 保存。將5 μ L PCR產物用1. 0 % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經DNA染料染色 後於紫外凝膠成像系統下顯像。實驗結果結果如圖3所示，其中泳道M :DNA標記DL2000 (TakaraBiotech，大連， 中國)；泳道1-2 福建水稻幹尖線蟲裂解DNA擴增；泳道3-4 浙江水稻幹尖線蟲裂解DNA 擴增；泳道5 雲南水稻幹尖線蟲裂解DNA擴增；泳道6 清水對照。從圖中可看出，實驗泳 道均顯示出特異性條帶，經分析對應大小為312bp，而對照組則未顯示。因此，本發明的方法具有很高的可靠性，對於不同地區的水稻幹尖線蟲均能非常 靈敏地檢測出。因而，本發明的方法適用範圍廣，不受局部地區的限制。另一方面，為更加方便地實施本發明的方法，本發明還提供一種用於診斷水稻幹 尖線蟲病的試劑盒，其包含如序列表中SEQ ID NO 1和SEQID NO 2所提供的引物對、PCR 反應緩衝液、DNA聚合酶、dNTP和DNA提取液。
利用本發明提供的方法或試劑盒檢測或鑑定水稻幹尖線蟲，具有很高的可靠性和 靈敏度，且操作方便，不依賴操作人員的經驗，準確度高，實用性強，可滿足農作物種植前和 植物檢疫過程中對水稻幹尖線蟲快速可靠的檢測和鑑定需要。雖然本發明只對水稻上的水稻幹尖線蟲的檢測作出介紹，但本領域的技術人員在 閱讀本發明的內容後，將容易地意識到，本發明的方法和試劑盒當然也可適用於任何感染 了水稻幹尖線蟲的植株或種子(例如，草莓等)的檢測、鑑別或診斷。序列表 崔汝強水稻幹尖線蟲的檢測方法及診斷試劑盒2122DNA人工序列1tcgatgaaga acgcagtgaa tt223DNA人工序列2agatcaaaag ccaatcgaat cat
權利要求
一種檢測水稻幹尖線蟲的方法，其包括(a)從可疑植物材料或土樣中分離出待檢測線蟲，提取DNA；(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQ ID NO1和SEQID NO2的引物對，進行聚合酶鏈式反應，得到擴增產物；(c)檢測步驟(b)中獲得的擴增產物，根據檢測結果判斷水稻幹尖線蟲的存在。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，當所述可疑植物材料或土樣中存在大量線 蟲時，採用酚氯仿提取法提取DNA。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，當所述可疑植物材料或土樣只存在單條線 蟲時，步驟(a)中所述的提取包括以下步驟(1)將單條線蟲加入含有WLB溶液的管中；(2)於_70°C 放置 30-60min ；95°C 放置 15_20min ；55-65 °C 放置 2min ；(3)再加入蛋白酶K，55-65°C處理30min-2h；95°C處理15_20min，以獲得作為單條線蟲 DNA模板的產物。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述植物材料為水稻植株或種子。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述植物材料是草莓、玉米、甘薯、大豆、蔬 菜、蘭花、菊花或大麗花的植株。
6 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(c)中所述檢測步驟(b)中獲得的擴增 產物的方法為電泳檢測。
7.一種用於診斷水稻幹尖線蟲病的試劑盒，其包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的引 物對。
全文摘要
本發明公開了一種水稻幹尖線蟲的檢測方法，該方法使用序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2作為引物對，進行聚合酶鏈式反應，通過電泳分析可得知是否得到特異性片段，從而檢測或鑑定出是否為水稻幹尖線蟲。本發明還提供了一種診斷水稻幹尖線蟲病的試劑盒，該試劑盒包含上述引物對。本發明的方法和試劑盒具有很高的可靠性和靈敏度，且操作方便，不依賴操作人員的經驗，準確度高，實用性強，可滿足農作物種植前和植物檢疫過程中對水稻幹尖線蟲快速可靠的檢測和鑑定需要。
文檔編號C12Q1/68GK101812501SQ20091003729
公開日2010年8月25日 申請日期2009年2月20日 優先權日2009年2月20日
發明者卓侃, 孫曉棠, 崔汝強, 廖金鈴, 王衛芳, 胡學難, 郭權, 鍾國強 申請人:崔汝強