一株具殺線蟲活性的木黴屬真菌及其製備方法和應用的製作方法

2023-12-08 17:47:36

專利名稱：一株具殺線蟲活性的木黴屬真菌及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物農藥技術領域，具體涉及一種毒殺植物寄生線蟲的真菌及其製備方法 和應用。
背景技術：
植物寄生線蟲在世界上許多國家和地區發生和為害，種類多種多樣。在全球範圍內，植 物寄生線蟲的發生與危害隨著農林業的發展和耕作栽培制度的變化日益嚴重，據Esser統計， 到19卯年為止全世界已報導發現植物寄生線蟲207屬4832種(劉維志，段玉璽.2000.植物病原 線蟲學.北京中國農業出版社，pl-2)。據估計，植物寄生線蟲造成世界主要農作物的年損失率為 12.3%，超過1000億美元，而實際的損失遠遠超過估計，理由是許多線蟲造成的危害因沒有 田間可見症狀或專化性特徵而未引起注意(王壽華.果樹線蟲學.北京中國農業科技出版 社,1994,P.l-5)，此外，世界範圍內對線蟲為害的新發現還在不斷增加，而且一些更新的農業栽 培體制使線蟲問題更加突出，再者，線蟲與其它生物相互作用而對植物產生的直接或間接影 響還在急劇增加。從這種意義上說，線蟲造成的危害較其它生物更加隱蔽！目前對植物有害 的線蟲約有3000多種，在我國主要有根結線蟲、胞囊線蟲、松材線蟲、甘薯莖線蟲等。根結 線蟲是農業上為害最大的一類線蟲，病害發生後， 一般減產10%左右，嚴重的高達75%以上， 甚至絕收(A.G.Whitehead,1998.Plant Nematode Control. ISBN0851991882 CAB International)。目前，植 物寄生線蟲的防治仍以化學防治為主，但近年來，化學殺線劑的應用浪費大，汙染環境，選 擇性差，滅生性強，破壞土壤生物區系等弊端日益為人們所重視(張克勤，何世川，周薇等.1991, 真菌和細菌在線蟲生防中的作用及其研究進展.殺蟲微生物.3:55-66)， 21世紀稱為環保世紀， 一些有 效的化學殺線劑的應用逐步受到限制，因此對植物寄生線蟲的生物防治研究自然成為熱點問 題。本發明正是基於上述理論，以植物寄生線蟲為靶標，從真菌代謝產物中尋找具有高效殺 線蟲活性物質，擬為研究開發新型生物殺線蟲劑尋找新的資源。
早在1932年，Weindling (1932)首次發現木素木黴菌(7Wc/zotfem7" "g朋n/w)對植物病 原真菌有拮抗作用，之後研究者發現了木黴菌對許多植物病害都有防治能力。多年來，人們 對木黴菌的生防應用、生物藥劑的開發以及生防機製做了許多嘗試和深入的研究。然而，木 黴菌在植物寄生線蟲領域上的研究卻起步較晚，在國內，木黴菌對線蟲的生防作用的研究很 少，在國外，已有一些利用木黴防治植物寄生線蟲的報導，尤其以研究哈茨木黴為重點，但 多數報導都是利用哈茨木黴等木黴菌株的活菌劑對植物寄生線蟲進行生物防治(Akhtar，
2005.; Abd-El-MoityWfl/., 1997.; ReddyWa/, 1996.)，但利用活菌劑防治植物寄生線蟲存
在弊端，如生防效果穩定性較差等等；也有少數報導是利用哈茨木黴發酵液對植物寄生線蟲
進行防治的，Djian等(1991)在淡紫擬青黴(屍aec!7om少ces /!7a"'m^)和長枝木黴(7Wc/zocfcrma /o"gz力mc^加"w)的發酵濾液中分離並鑑定了一種活性殺線產物——乙酸。它對植物寄生線 蟲的防治非常有效，而其他線蟲如腐生線蟲、食真菌線蟲，捕食線蟲和動物寄生線蟲對乙酸 都不敏感。Khattakwa/. (2001， 2002)利用哈茨木黴防治爪哇根結線蟲，其發酵液抑制線蟲 卵孵化，發酵液稀釋2x時抑制率高達80X，稀釋100x抑制率可達20X。 Ansari等(2002)利 用哈茨木黴等菌株的發酵液抑制爪哇根結線蟲卵孵化。Pathak等(1996)利用50%哈茨木黴的 發酵液對侵染水稻的擬禾本科根結線蟲的致死率超過96%。 Sankaranarayanan等(1998)研究 哈茨木黴發酵液毒殺南方根結線蟲和爪哇根結線蟲的影響，結果表明24h後，哈茨木黴對兩種 線蟲的致死率能達到100%。 Pathak等(2003)研究哈茨木黴的發酵液對侵入水稻根部的擬禾 本科根結線蟲的影響，結果表明哈茨木黴能抑制線蟲侵入寄主組織。除木黴菌對線蟲的互作 外，木黴菌還可誘導寄主植物的防衛反應，促進植物生長。Begum等(2004)利用綠色木黴 和印楝渣混合對受木豆胞囊線蟲和菜豆殼球孢侵染的綠豆進行處理，結果顯示葉片中酚類化 合物含量和過氧化物酶活性有明顯升高，這兩種物質能使植株產生對病原物和害蟲的抗性。 除此之外,Harman (2000)指出，木黴的生防機制可能還包括在逆境中，如乾旱、養分的 脅迫下，通過加強根系和植株的發育提高耐性；可通過增加土壤中營養成分以及各種礦物質 成分的溶解性，促進植株吸收；以及鈍化病原菌的酶，促進植物生長。
綜上所述，利用哈茨木黴對植物寄生線蟲進行生物防治具有重大的理論研究意義和實際 應用的潛力，但在世界範圍內尤其是我國均未對其進行更深入的研究。本研究旨在利用哈茨 木黴對植物寄生線蟲的生物防治研究進行更全面、透徹的研究，以期發明新型線蟲生防製劑， 為我國植物寄生線蟲的生物防治開闢新的途徑。 發明內容-
本發明的目的是選擇對根結線蟲(Me/o!Wogy加spp.)、水稻幹尖線蟲U;^e/e"c/7oitfey 6m一)和大豆胞囊線蟲(股fero&ra gfyc/"^)具高殺蟲活性的真菌菌株，將菌株按常規液 體發酵培養後，從代謝產物中提取具殺線蟲活性物質的有效成分，開發殺線蟲生物農藥。
本發明篩選到的一株具有殺線蟲活性的木黴菌菌株Snef85為哈茨木黴7Wc/zo^rmfl ，已於2007年10月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (地址:中國北京市朝陽區大屯路,郵編100101)，保藏號為CGMCCNo.2235。木黴菌Snef85是 從人參土壤中篩選出的一株對根結線蟲(Me/o/cfogywe spp.)、水稻幹尖線蟲"; /ze/e"c/^W^ &esw_yO和大豆胞囊線蟲(股teroc^ag/戸T^)都具有良好殺線蟲活性的真菌菌株。
本發明通過研究發現，土壤真菌有很多株真菌都具有較高的殺線蟲活性，從這些真菌中 篩選出一株性狀相對最好的木黴菌菌株Snef85進行了進一步的研究。
本發明還涉及用於防治植物寄生線蟲的真菌代謝物，其是由本發明木黴菌菌株Snef85經 過常規的液體發酵培養後提取製備的。
本發明的木黴菌菌株Snef85是通過試管種培養後，再經擴大發酵培養來製備，其具體方 法如下
1. 試管種培養
培養基配方為馬鈴薯瓊脂(PDA)培養基，即馬鈴薯200g;葡萄糖20g;瓊脂17g;蒸 餾水1000mL。
2. 液體發酵培養
其中液體發酵培養基為査氏培養基，配方為NaN03: 2.0g、 K2HP04: l.Og、 KC1: 0.5g、 MgS04'7H20: 0.5g、 FeS04: O.Olg、蔗糖30.0g;蒸餾水1000mL。
將試管種接種到100mL三角瓶(每瓶裝50mL)液體培養基中，25。C 28。C下，搖床轉 速以150r.min-' 200r.min-'、發酵168h。
本發明還涉及一種殺線蟲製劑，其包含有效量的本發明所述的木黴菌菌株Snef85本身或 其代謝物作為有效活性成分。
本發明的木黴菌菌株Snef85或其代謝物具有殺線蟲活性物質，可用於植物寄生線蟲的生 物防治，特別是根結線蟲(Me/o/cfogy"e spp.)、水稻幹尖線蟲(^7/ze/e"c/^Vto 6ew—)和大 豆胞囊線蟲(//"eray)。
具體實施例方式
為了更詳細地進一步闡明而不是為了限制本發明，給出了下列實施例。 首先對木黴菌菌株Snef85進行發酵培養，然後對發酵培養後的代謝產物進行殺線蟲活性 試驗，確定其對線蟲的作用。
實施例l:木黴菌菌株SnefS5的培養
將木黴菌菌株Snef85的菌絲體接種到試管瓊脂培養基上，培養基配方為PDA培養基，即 馬鈴薯200g;葡萄糖20g;瓊脂17g;蒸餾水1000mL。 25。C培養10d，獲得試管種。
再將試管種接種到100mL三角瓶(每瓶裝50mL)液體培養基(查氏培養基)中，培養基 配方為NaN03: 2.0g、 K2HP04: l.Og、 KC1: 0.5g、 MgS047H20: 0.5g、 FeS04: O.Olg、蔗 糖30.0g:蒸餾水lOOOmL。 25。C 28。C下，搖床轉速以lSOrmin-i-SOOrmin^發酵168h。 將發酵液配成不同的倍數進行殺線蟲藥效試驗。
實施例2:木黴菌菌株Snef85的殺線蟲活性
將發酵液濃縮10x液的基礎上依次稀釋為lx (原液)、5x、 8x、 10x、 15x、 20x液6個濃 度梯度，分別處理根結線蟲(Me/ozWogv股spp.)、水稻幹尖線蟲(^ /^/e"c/w/tfes 6^ye少/)和 大豆胞囊線蟲(//"erocfera g(yd腦)。
1. 製備試驗用製劑
按前述液體發酵培養方法製備的木黴菌菌株Snef85，用不同倍數的發酵液進行殺線蟲活 性試驗。
2. 製備試驗用線蟲
根結線蟲(ikfe/0W0gy eSpp.):採自瀋陽渾南地區受根結線蟲侵染的番茄。將番茄根系 取出，用水輕輕衝洗，小心取下卵囊，放在1%的次氯酸鈉中消毒3 min、再用無菌水衝洗3 次，放在內有少量無菌水的培養皿裡，25'C恆溫箱中培養，每隔24h收集一次新孵化的根結 線蟲J2。水稻幹尖線蟲Uj^e/ewc/7oW^ 6^^yO :採自受水稻幹尖線蟲侵染嚴重的水稻稻粒。 取發病嚴重的稻粒放在盛有無菌水的培養皿中，在25 'C下，24 h後用貝曼漏鬥收集活的線蟲。 大豆胞囊線蟲(T/e/eracferag/;;d"M):大豆胞囊線蟲3號生理小種採自本實驗室的實驗地。 通過淘洗過篩法[3]收集胞囊，0.5%的次氯酸鈉表面消毒3 min，用無菌水衝洗3次，放在含 有少量無菌水的培養皿裡，在25'C的恆溫箱中培養，每隔24h收集一次新孵化的J2。。
3. 試驗方法
3.1木黴菌菌株Snef85不同倍數發酵液處理相同時間對三種線蟲的毒力作用 在經滅菌的冠狀小皿內中加入不同濃度的試驗用發酵液各200pL，以加20(VL無菌水作 為對照，然後分別向處理和對照中各加入100pL線蟲懸浮液(約含線蟲30條)，放入25。C培 養箱中，24h後觀察線蟲死亡情況，計算校正死亡率即為殺線蟲藥效。每處理重複3次。
校正死亡率(％),理線蟲死亡率—對照線蟲死亡率禱
l一對照線蟲死亡率
3.2木黴菌菌株Snef85五倍稀釋發酵液不同處理時間對各種線蟲的毒力 在經滅菌的冠狀小皿中加入20(HiL五倍稀釋濃度的木黴菌菌株Snef85發酵液，分別加入 各種線蟲的懸浮液100pL，內含約30條線蟲，放在25'C溫箱中培養，設置3次重複，以加 200nL無菌水作為對照。分別在6h、 12h、 24h和48h觀察線蟲的死亡情況，根據以下公式計 算線蟲的校正死亡率即為殺線蟲藥效。
試驗3.1和3.2的操作均在無菌環境下進行，儘量避免環境和人為因素對試驗結果的影響。
4. 試驗結果
4.1木黴菌菌株SnefB5不同倍數發酵液處理相同時間對3種線蟲的毒力作用
表1不同倍數發酵液處理相同時間對3種線蟲的毒力作用
發酵液稀釋倍數根結線蟲校正 死亡率/%水稻幹尖線蟲校正 死亡率/%大豆胞囊線蟲校正 死亡率/%
198.12 Aa97.22 Aa93.40 Aa
93.21 Aa92.13 Aa83.43 Aa
888.40 Aa88.00 Aa51.82 Aa
1059.56 Bb50.54 Bb36.97 Bb
1541.66 Bc36.47 Bc34.17 Cc
2013.85 Cd3.32 Bc23.00 Dd
注數字後字母為Duncan's新復極差測驗結果，不同大小寫英文字母分別表示差異極顯著(pO.01)和差異顯著(pO.05)，下 表同。
通過測定了不同倍數發酵液處理24h對各種線蟲的毒力作用(見表l)，結果表明，不同 倍數發酵液對不同的線蟲有不同的作用效果。發酵原液(lx)作用根結線蟲的校正死亡率為 98.12°/。，而水稻幹尖線蟲的校正死亡率達到97.22%，大豆胞囊線蟲的校正死亡率為93.40%。 隨著稀釋倍數的增加，對各種線蟲的毒力作用遂漸減弱。根結線蟲和水稻幹尖線蟲在稀釋10x 時，對線蟲的校正死亡率均能達到50%以上，對大豆胞囊線蟲的校正死亡率較根結線蟲和水 稻幹尖線蟲差，為36.97%。 5x發酵液稀釋液對3種線蟲的作用效果與原液的作用效果無明顯 差異，說明木黴菌的發酵液5x液時較合理的稀釋倍數。
4.2木黴菌菌株Snef85五倍稀釋發酵液不同處理時間對各種線蟲的毒力作用 表2五倍稀釋發酵液不同處理時間對各種線蟲的毒力作用
—""Tn^加n+向^ 根結線蟲校正 水稻幹尖線蟲校正 人豆胞囊線蟲校正
二___^_死亡率/%_死亡率/%_死亡率/%
6 35.14Aa 0.00Aa 16.88Aa
12 89.40 Bb 29.36 Ab 45.66 Bb
24 94.38 Bb 91.80 Bc 88.35 Cc
48 100.00 Bb 99.27 Bc 94.18 Cc
木黴菌菌株Snef85發酵液5倍稀釋液處理各種線蟲結果發現，隨著處理時間的延長，對 各種線蟲的死亡率有明顯增加的現象。在處理6h內，未發現死亡的水稻幹尖線蟲，而對大豆 胞囊線蟲的校正死亡率為16.88%，處理12h，對根結線蟲的校正死亡率明顯多於其他種類線 蟲，處理12h後，水稻幹尖線蟲和大豆胞囊線蟲的死亡速度加快，處理48h，根結線蟲的校 正死亡率達到100°/。。
通過以上用試驗結果表明，木黴菌菌株Snef85是一株極具有應用價值的真菌，特別是對根 結線蟲(Tlfe/okfogv"e spp.)、 7jC稻幹尖線蟲"p/^/e"c/ o/cfey Z>e^e>;/)和大豆胞囊線蟲(He^wfera 的殺線蟲作用，顯示出其良好的應用開發前景。
權利要求
1、一株具有殺線蟲活性的真菌，其特徵在於該菌株Snef85為哈茨木黴Trichodermaharzianum，已於2007年10月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路，郵編100101)，保藏號為CGMCC No.2235。
2、 一株防治植物寄生線蟲的真菌代謝物，其特徵在於由權利要求1所述的真菌經過液體發 酵提取製備的，液體發酵培養基配方為NaN03 2.0g、 K2HP04 l.Og、 KC1 0.5g、 MgS04*7H2 0.5g、 FeSO40.01g、蔗糖30.0g;蒸餾水1000mL。
3、 根據權利要求2所述的真菌代謝物，其特徵為pH為5至6。
4、 權利要求1所述的具有殺線蟲活性的真菌的製備方法，包括生產菌株經過常規的液體發酵 後製備殺線蟲製劑，其特徵在於該真菌的液體發酵培養基配方為NaNO32.0g、 K2HP04 l.Og、 KC10.5g、 MgS04'7H2 0.5g、 FeSO40.01g、蔗糖30.0g;蒸餾水1000mL。根據權利 要求4所述的製備方法，其特徵為pH為5至6。
5、 一種殺線蟲製劑，其特徵為包含有效量的權利要求1所述的真菌或權利要求2所述的真菌 代謝物作為活性成分。
6、 權利要求1所述的真菌或權利要求2所述的真菌代謝物或權利要求6所述的殺線蟲製劑在 植物寄生線蟲生物防治中的應用。
7、 根據權利要求7所述的應用，其特徵為所述的植物寄生線蟲為根結線蟲(Afe/oWog^e spp.)、 zK稻幹尖線蟲"p/ e/ewc/zo^"①，')禾口大豆胞囊線蟲(Z/"mK/eragW證)。
全文摘要
本發明涉及一株具毒殺植物寄生線蟲作用的真菌的培養方法及其代謝物製備方法和應用，屬於微生物農藥技術領域。本發明涉及的木黴菌菌株Snef85為哈茨木黴Trichoderma harzianum，已於2007年10月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路，郵編100101)，保藏號為CGMCC No.2235。該木黴菌菌株Snef85的分類地位是半知菌亞門，絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，木黴屬，哈茨木黴。通過液體發酵培養製備，其代謝產物對植物寄生線蟲，特別是對南方根結線蟲、水稻幹尖線蟲和大豆胞囊線蟲具有毒力高，殺線蟲效果明顯的突出特點。該菌株的發酵液對根結線蟲(Meloidogynespp.)、水稻幹尖線蟲(Aphelenchoides besseyi)和大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)防治效果明顯。不同稀釋濃度發酵液的處理和無菌水處理有顯著差異，發酵原液的殺線蟲效果可達到95％以上，具良好的應用開發前景。
文檔編號C12N1/14GK101182468SQ20071015802
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月8日 優先權日2007年11月8日
發明者段玉璽, 王媛媛, 陳立傑, 靳瑩瑩 申請人:瀋陽農業大學