一種酸牛奶中雙歧桿菌的檢測方法

2023-12-10 06:24:02 2

專利名稱：一種酸牛奶中雙歧桿菌的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種酸牛奶中雙歧桿菌的檢測方法，更具體地涉及一種含有4種乳酸 菌的酸牛奶中雙歧桿菌的檢測方法。屬於微生物製品的檢測技術領域。
背景技術：
雙歧桿菌是人類最早發現的生理性細菌，是能在健康人腸道內定植的益生菌。母 乳餵養的嬰兒腸道內該菌佔總菌群的92%以上，現在已確認雙歧桿菌的數量和品質是人 體健康的重要標誌之一。國內外研究報導雙歧桿菌具有多種生理活性功能，可作為宿主氮 的來源之一，同時，具有合成維生素、潤腸通便、增強機體的免疫功能、降低膽固醇和甘油三 酯、抑癌作用以及抗衰老作用等功能。隨著科技研究水平的提高和乳品加工業的快速發展，雙歧桿菌在酸奶中的應用越 來越廣泛。人們在食用這些乳品的同時，通過其中活菌的作用可以改善胃、腸道內微生態 的平衡，抑制病原菌的生長，從而促進身體健康。但要達到此作用，一般認為其活菌數要在 106cfu/g(mL)以上。然而，人們長期忽視了對準確檢測酸奶中雙歧桿菌活菌數的方法的需 要，導致市場上許多發酵奶製品中雙歧桿菌活力甚微而又難以檢出。與此同時，對健康有益 的乳酸菌如嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌等被越來越多地添加到發酵乳中，加之酸奶加工使用 的發酵劑中的嗜熱乳鏈球菌和保加利亞乳桿菌，這些乳酸菌的存在均對雙歧桿菌的檢測帶 來幹擾。2004年國家發布了《GB/T 4789. 34-2008食品中雙歧桿菌的檢測方法》，此方法採 用的培養基為非選擇性培養基計數，可以實現雙歧桿菌的活菌檢測，但是對於酸奶產品而 言，酸奶中其他乳酸菌均能在該培養基上生長，每次檢驗都需要多步鑑定才能得到準確的 數據，檢測時間長，成本高。中國專利CN1880471A 「乳製品中雙歧桿菌檢測方法」中公開了 一種乳製品中雙歧桿菌的檢測方法，在培養基中添加抗菌素抑制其他雜菌生長，發明中採 用了氯化鋰、丙酸鈉、雙氯青黴素3種抗菌素。雙氯青黴素為廣譜青黴素類抗生素，雙歧杆 菌對該類抗生素敏感，對雙歧桿菌的生長也有一定的抑制作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種酸牛奶中雙歧桿菌的檢測方法，完全避免酸牛奶中其他 乳酸菌對雙歧桿菌檢測數量的影響，以便及時對含有嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞 種、嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌乳亞種酸牛奶產品質量進行監督和控制。本發明的酸牛奶中雙歧桿菌的檢測方法包括以下步驟1)稀釋液、MRS培養基、抗生素溶液和培養液的配製；2)樣品稀釋；3)接種培養；4)菌落計數；5)顯微鏡檢查、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗；
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所述抗生素溶液包含硫酸新黴素和硫酸巴龍黴素。酸牛奶樣品是含有4種乳酸菌(嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜酸乳杆 菌和動物雙歧桿菌)的酸牛奶。酸牛奶中長雙歧桿菌菌粉來自蒙牛乳業(北京)有限責任 公司保藏菌種，CGMCC No. 2265。所使用的稀釋液是用滅菌的0. 9%的生理鹽水。所述MRS培養基的組成為(g/L):蛋白腖10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖 20.0，吐溫801. 0ml，磷酸氫二鉀(7H20)2. 0，乙酸鈉(3H20) 5. 0，檸檬酸三銨2.0，硫酸鎂 (7H20) 0. 2，硫酸錳(4H20) 0. 05，瓊脂 15. 0。將上述成分溶解在蒸餾水中，將pH調節到6.2 士 0. 1，並用蒸餾水定容至lOOOmL， 121°C，高壓滅菌15min。所述抗生素溶液的組成為硫酸新黴素80 120mg，硫酸巴龍黴素35 65mg， LiCl 1. 5 4. 5g，丙酸鈉15 45g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 25 0. 75g，蒸餾水50mL。製法0. 45 um微孔濾膜過濾後加入滅菌瓶中。4°C下保藏一個月。在無菌條件下，在1000mL47°C MRS培養基中加入50mL抗生素溶液，混勻，製成本發 明檢測方法中使用的培養液。所述樣品稀釋是通過無菌操作，將充分混勻的檢樣酸牛奶25mL放入含有225mL滅 菌生理鹽水的滅菌錐形瓶內作成1 10的均勻稀釋液。再用lmL滅菌吸管吸取1 10稀 釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內，振搖均勻，做成1 100的稀釋 液。另取lmL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此操作，每遞增一次，換用 1支lmL滅菌吸管，製成幾個適當倍數的均勻稀釋液。所述接種培養包括選擇2個 3個適宜的稀釋度，分別注入滅菌培養皿中，然後將 融化並冷卻至45°C左右的培養液傾注於平皿中，培養液的用量恰好覆蓋平皿底部一薄層， 迅速與稀釋菌液混勻，凝固後培養，同時作滅菌生理鹽水空白對照。待瓊脂表面幹後，翻轉平皿，放在厭氧罐內，加入厭氧產氣包並快速關緊厭氧罐， 或關緊厭氧罐後抽充高純氮氣三次。從稀釋樣品到傾注平板及放入厭氧罐的過程要迅速， 在20分鐘內完成操作。將厭氧罐置於36°C 士 1°C恆溫培養箱內培養72h士3h。菌落計數計數原則同GB4789. 2-2003種菌落總數計數原則。選取菌落數在30 300之間的平板對可疑菌落進行計數。計數出平皿內的雙歧桿菌菌數，然後乘以樣品的稀釋 倍數，得每毫升樣品中雙歧桿菌數。例如，檢樣IX 104倍的稀釋液在MRS瓊脂平板上，生成 的可疑菌落為35個，取5個鑑定，證實為雙歧桿菌的是4個，則lmL樣品中雙歧桿菌數為 35X4/5X 104 = 2. 8X 104。菌落形態菌體細胞末端膨大，呈骨棒狀，微彎曲，0. 63 1. 25 X 3. 12 6. 25 y m， 單個、成對或欄柵狀排列，無芽孢，革蘭氏陽性，嚴格厭氧，菌落乳白色，溼潤，液滴狀，圓形， 表面光滑，突起，不透明，邊緣整齊。菌種鑑定隨機挑取五個可疑菌落進行如下3項鑑定。①革蘭氏染色挑取瓊脂培養基上培養的菌落，按以下方法進行染色鑑定a.塗片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液染色lmin，水洗；b.滴加革蘭氏碘液，作用lmin，水洗；
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c.滴加脫色酒精，約30s ；d.水洗，滴加番紅復染lmin，水洗，待幹，鏡檢。結果革蘭氏染色陽性、無芽孢桿菌。革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。②菌體形態顯微鏡觀察呈現「Y」或「V」型的分叉狀、棒狀等多形態的桿菌。③過氧化氫酶試驗過氧化氫酶陰性。具體方法用接種環挑取一小環瓊脂培養基上培養的菌落，接到塗有3%過氧化 氫的玻片上，用竹籤攪動，有氣泡出現者為陽性，無氣泡為陰性。本發明的優點是本發明針對酸牛奶產品的特點，採用雙歧桿菌不敏感或中度敏 感的氨基糖苷類抗生素作為選擇性試劑，使得培養基對其他乳酸菌有一定程度的抑制，從 而選擇性計數酸奶中的雙歧桿菌，減少鑑定步驟，在48小內得到準確的檢測數據。能夠有 效的排除其他乳酸菌的幹擾，準確檢測出含有4種乳酸菌的酸牛奶中雙歧桿菌的活菌數 量，降低檢測成本，提高檢測效率。


圖1是顯示乳雙歧桿菌細胞形態的顯微照片；圖2是顯示長雙歧桿菌細胞形態的顯微照片；圖3是顯示青春雙歧桿菌細胞形態的顯微照片；圖4是顯示乳雙歧桿菌菌落形態的照片。
具體實施例方式實施例1待測樣品已知乳雙岐桿菌活菌數1. 0 X 105cfu/mL的酸牛奶樣品樣品的製備將已知活菌數的乳雙歧桿菌菌粉(科 漢森公司產品)按一定 比例添加到酸牛奶產品中，使酸牛奶中嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌的活菌數量分別達到 1.0X105,嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的數量總計達到1. 0X 106。儀器和設備超淨工作檯(蘇淨集團安泰公司、BCM-1000A)、高壓滅菌鍋(上海申 安醫療器械廠、LDZX-50KB)、厭氧罐(長沙市馭儀電子科技有限公司、2. 5L)、電熱恆溫培養 箱(黃石恆豐醫療器械有限公司、SKP02. 600)、生物顯微鏡(重慶光學儀器廠，XSZ-4)。試劑0. 9%的滅菌生理鹽水。MRS培養基(g/L)蛋白腖10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐溫80 1.0ml，磷酸氫二鉀(7H20)2. 0，乙酸鈉(3H20) 5.0，檸檬酸三銨2.0，硫酸鎂(7H20)0. 2，硫酸 錳(4H20) 0.05，瓊脂15.0。將上述成分溶解在蒸餾水中，將pH調節到6.2 士 0. 1，並用蒸餾 水定容至1000mL，121°C，高壓滅菌15min。抗生素溶液的組成為硫酸新黴素80mg，硫酸巴龍黴素65mg，LiCl 1.5g，丙酸鈉 15g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 25g，蒸餾水50mL。製法0. 45 um微孔濾膜過濾後加入滅菌瓶中。4°C下保藏一個月。在無菌條件下，在1000mL47°C MRS培養基中加入50mL抗生素溶液，混勻，製成培養液。操作步驟樣品稀釋是通過無菌操作，將充分混勻的檢樣酸牛奶25mL放入含有 225mL滅菌生理鹽水的滅菌錐形瓶內作成1 10的均勻稀釋液。再用lmL滅菌吸管吸 取1 10稀釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內，振搖均勻，做成 1 100的稀釋液。另取lmL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此操作，每 遞增一次，換用1支lmL滅菌吸管，製成幾個適當倍數的均勻稀釋液。選擇2個 3個適宜 的稀釋度，分別注入滅菌培養皿中，然後將融化並冷卻至45°C左右的培養液傾注於平皿中， 培養液的用量恰好覆蓋平皿底部一薄層，迅速與稀釋菌液混勻，凝固後培養，同時作滅菌生 理鹽水空白對照。待瓊脂表面幹後，翻轉平皿，放在厭氧罐內，加入厭氧產氣包並快速關緊 厭氧罐，或關緊厭氧罐後抽充高純氮氣三次。從稀釋樣品到傾注平板及放入厭氧罐的過程 要迅速，在20分鐘內完成操作。將厭氧罐置於36°C 士 1°C恆溫培養箱內培養72h士3h。菌落計數計數原則同GB4789. 2-2003種菌落總數計數原則。選取菌落數在30 300之間的平板對可疑菌落進行計數。計數出平皿內的雙歧桿菌菌數，然後乘以樣品的稀釋 倍數，得每毫升樣品中雙歧桿菌數。例如，檢樣IX 104倍的稀釋液在MRS瓊脂平板上，生成 的可疑菌落為35個，取5個鑑定，證實為雙歧桿菌的是4個，則lmL樣品中雙歧桿菌數為 35X4/5X 104 = 2. 8X 104。菌落形態觀察結果受試樣品在本發明方法所述條件下培養，培養基上生長的菌 落乳白色，溼潤，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不透明，邊緣整齊。 菌種鑑定隨機挑取五個可疑菌落進行如下3項鑑定。①革蘭氏染色挑取瓊脂培養基上培養的菌落，按以下方法進行染色鑑定a.塗片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液染色lmin，水洗；b.滴加革蘭氏碘液，作用lmin，水洗；c.滴加脫色酒精，約30s ；d.水洗，滴加番紅復染lmin，水洗，待幹，鏡檢。結果受試樣品在本發明方法所述條件下培養，從培養基上隨機挑取五個可疑菌 落，按革蘭氏染色鑑定方法，鏡檢均為革蘭氏陽性菌。②菌體形態受試樣品在本發明方法所述條件下培養，從培養基上隨機挑取五個可疑菌落，按 革蘭氏染色鑑定方法，在顯微鏡(1000倍)下觀察菌體形態，呈現「Y」或「V」型的分叉狀、 棒狀等多形態的桿菌。③過氧化氫酶試驗具體方法用接種環挑取一小環瓊脂培養基上培養的菌落，接到塗有3%過氧化 氫的玻片上，用竹籤攪動，有氣泡出現者為陽性，無氣泡為陰性。結果受試樣品在本發明方法所述條件下培養，從培養基上隨機挑取五個可疑菌 落，過氧化氫酶試驗為陰性。結果活菌數為5. 1 X 105cfu/mL。為了驗證本實施例1中計數結果的可靠性，提取本次檢測中培養基上生長的菌 落，採用生理生化和分子生物技術鑑定方法對培養菌落進行鑑定，驗證方法及結果如下生理生化和基因鑑定方法對培養菌落進行鑑定，驗證方法形態特徵在培養基上菌落形態為乳白色，溼潤，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不 透明，邊緣整齊。革蘭氏染色，電子顯微鏡下鏡檢，菌體革蘭氏陽性，無芽孢，細胞末端膨大， 呈骨棒狀。微彎曲，0.63 1.25X3. 12 6.25 iim，單個、成對或欄柵狀排列。生理生化特徵 16SrDNA基因序列分析培養菌落按細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(天根生化科技有限公司)說 明提取基因組DNA。以提取的細菌基因組DNA為模板，PCR擴增16SrDNA，細菌域的16SrDNA 基因擴增的通用引物27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3『)和1541R(5' -TAAGGAGGTGATCCAGCC-3『)
oPCR 反應體系(30ul 體系):1. 5ul 引物 1，1. 5ul 引物 2，5ul 5Xbuffer,0. 2ul Mg (250mM)，1. 2ul dNTP (2. 5mM)，18. 4ul H20, lul 模板(5ng)。PCR過程為94°C預變性3min後，進行下述30個循環94°C變性30s，55°C退火30s， 72°C延伸90s，最後72°C保溫lOmin。PCR結束後，取15ul反應混和物在1 %瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中添加EB替代物， 電泳緩衝液1XTAE緩衝液。電泳結束後在紫外光下觀察，可見相應大小為1. 5kb的條帶。 用DNA回收試劑盒回收PCR產物。將回收的PCR產物送樣到測序公司測序(美國英傑生命 技術有限公司)，將得到的鹼基序列在NCBI資料庫進行同源序列搜索(blast)，找出與數據 庫中同源性最高的模式菌株。結果如下基因序列(序列數字標識1)cgcgttgcgtggcattgaagtccaccgacggcttggtgcgtggcgccatcgtgcacgaca60
ccggcggcccgatcgaggtgccggtcggcgatgttaccaagggccatgtgttcgacgttt120
ccggccacattctcaacaagaagccgggcgagaagatcgtgatcaaggagcgctggccca180
tccaccgcaacccgccggcattcgatcagctcgagtcgaagacgcagatgttcgagacgg240
gcatcaaggtcatcgatctgctcaccccgtacgtgcagggcggcaagatcggtctgttcg300
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cccgcatctgcgacggcgtg tacgacaacg tgccggagca ggcatctcgg ca 1192
系統發育分析結果菌株BB-1216SrDNA基因序列與B. animalis subsp.lactis
DSM 10140T 同源性為 100%，與 B. animal is subsp. animalisATCC25527T 同源性為 97. 2%, 與B.bifidum ATCC 29521同源性為96. 1 %，與雙歧桿菌屬內其它種同源性均低於90%，在 亞種水平上有很好的解析度。鑑定結論乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)。在實施例1中，受試樣品按本發明方法操作步驟進行接種、培養、計數和菌種鑑 定，活菌數計數結果為5. lX105cfu/mL。為了驗證本實施例中計數結果的可靠性，提取本 次檢測中培養基上生長的菌落，採用生理生化和分子生物技術鑑定方法對培養菌落進行鑑 定，鑑定結論表明培養物為乳雙歧桿菌Bifidobacterium lactis，與本實施例1樣品中所 添加的雙歧桿菌為同一種屬菌種，表明受試樣品按本發明方法操作步驟進行培養和計數， 可準確計數雙歧桿菌活菌數數量。實施例2待測樣品已知長雙岐桿菌活菌數1.0X106cfU/mL的酸牛奶樣品樣品的製備將已知活菌數的長雙歧桿菌菌粉(蒙牛乳業(北京)有限責任公司 保藏菌種，CGMCC No. 2265)按一定比例添加到酸牛奶產品中，使酸牛奶中嗜酸乳桿菌和長 雙歧桿菌的活菌數量分別達到1. OX 106cfu/mL，嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的 數量達到 1. 0X106cfu/mL。試劑0. 9%的滅菌生理鹽水。MRS培養基(g/L)蛋白腖10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐溫 801. 0ml，磷酸氫二鉀(7H20)2.0，乙酸鈉(3H20) 5. 0，檸檬酸三銨2. 0，硫酸鎂(7H20)0.2，硫 酸錳(4H20) 0.05，瓊脂15.0。將上述成分溶解在蒸餾水中，將pH調節到6.2 士 0.1，並用蒸 餾水定容至1000mL，121°C，高壓滅菌15min。抗生素溶液的組成為硫酸新黴素lOOmg，硫酸巴龍黴素50mg，LiC13g，丙酸鈉 30g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g，蒸餾水50mL。製法0. 45 um微孔濾膜過濾後加入滅菌瓶中。4°C下保藏一個月。在無菌條件下，在1000mL47°C MRS培養基中加入50mL抗生素溶液，混勻，製成培養液。
操作步驟樣品稀釋是通過無菌操作，將充分混勻的檢樣酸牛奶25mL放入含有 225mL滅菌生理鹽水的滅菌錐形瓶內作成1 10的均勻稀釋液。再用lmL滅菌吸管吸 取1 10稀釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內，振搖均勻，做成 1 100的稀釋液。另取lmL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此操作，每 遞增一次，換用1支lmL滅菌吸管，製成幾個適當倍數的均勻稀釋液。選擇2個 3個適宜 的稀釋度，分別注入滅菌培養皿中，然後將融化並冷卻至45°C左右的培養液傾注於平皿中， 培養液的用量恰好覆蓋平皿底部一薄層，迅速與稀釋菌液混勻，凝固後培養，同時作滅菌生 理鹽水空白對照。待瓊脂表面幹後，翻轉平皿，放在厭氧罐內，加入厭氧產氣包並快速關緊 厭氧罐，或關緊厭氧罐後抽充高純氮氣三次。從稀釋樣品到傾注平板及放入厭氧罐的過程 要迅速，在20分鐘內完成操作。將厭氧罐置於36°C 士 1°C恆溫培養箱內培養72h士3h。菌落計數計數原則同GB4789. 2-2003種菌落總數計數原則。選取菌落數在30 300之間的平板對可疑菌落進行計數。計數出平皿內的雙歧桿菌菌數，然後乘以樣品的稀釋 倍數，得每毫升樣品中雙歧桿菌數。例如，檢樣IX 104倍的稀釋液在MRS瓊脂平板上，生成 的可疑菌落為35個，取5個鑑定，證實為雙歧桿菌的是4個，則lmL樣品中雙歧桿菌數為 35X4/5X 104 = 2. 8X 104。菌落形態觀察結果受試樣品在本發明方法所述條件下培養，培養基上生長的菌 落乳白色，溼潤，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不透明，邊緣整齊。菌種鑑定隨機挑取五個可疑菌落進行如下3項鑑定。①革蘭氏染色挑取瓊脂培養基上培養的菌落，按以下方法進行染色鑑定a.塗片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液染色lmin，水洗；b.滴加革蘭氏碘液，作用lmin，水洗；c.滴加脫色酒精，約30s ；d.水洗，滴加番紅復染lmin，水洗，待幹，鏡檢。結果受試樣品在本發明方法所述條件下培養，從培養基上隨機挑取五個可疑菌 落，按革蘭氏染色鑑定方法，鏡檢均為革蘭氏陽性菌。②菌體形態受試樣品在本發明方法所述條件下培養，從培養基上隨機挑取五個可疑菌落，按 革蘭氏染色鑑定方法，在顯微鏡(1000倍)下觀察菌體形態，呈現「Y」或「V」型的分叉狀、 棒狀等多形態的桿菌。③過氧化氫酶試驗具體方法用接種環挑取一小環瓊脂培養基上培養的菌落，接到塗有3%過氧化 氫的玻片上，用竹籤攪動，有氣泡出現者為陽性，無氣泡為陰性。結果受試樣品在本發明方法所述條件下培養，從培養基上隨機挑取五個可疑菌 落，過氧化氫酶試驗為陰性。經以上鑑定步驟，本次樣品中雙歧桿菌計數結果活菌數為3.0X106cfu/mL。為了驗證本實施例中計數結果的可靠性，提取本次檢測中培養基上生長的菌落， 採用生理生化和分子生物技術鑑定方法對培養菌落進行鑑定，驗證方法及結果如下形態特徵在培養基上菌落形態為乳白色，溼潤，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不透明，邊緣整齊。革蘭氏染色，顯微鏡下鏡檢，菌體革蘭氏陽性，無芽孢，杆狀、多形態。
生理生化特徵接觸酶陰性，氧化酶陰性，嚴格厭氧生長，果糖-6-磷酸鹽磷酸酮 酶陽性，發酵葡萄糖產生乳酸。 16SrDNA基因序列分析培養菌落按細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(天根生化科技有限公司)說 明提取基因組DNA。以提取的細菌基因組DNA為模板，PCR擴增16SrDNA，細菌域的16SrDNA 基因擴增的通用引物27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3『)和1541R(5' -TAAGGAGGTGATCCAGCC-3『)
oPCR 反應體系(30ul 體系)1. 5ul 引物 1，1. 5ul 弓丨物 2，5ul 5 * buffer, 0. 2ulMg(250mM)，1. 2ul dNTP (2. 5mM)，18. 4ul H20, lul 模板(5ng)。PCR 過程為 94°C預變 性3min後，進行下述30個循環94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，最後72°C保溫 lOmin。PCR結束後，取15ul反應混和物在1 %瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中添加EB替代物， 電泳緩衝液1XTAE緩衝液。電泳結束後在紫外光下觀察，可見相應大小為1. 5kb的條帶。 用DNA回收試劑盒回收PCR產物。將回收的PCR產物送樣到測序公司測序(美國英傑生命 技術有限公司)，將得到的鹼基序列在NCBI資料庫進行同源序列搜索(blast)，找出與數據 庫中同源性最高的模式菌株。結果如下(序列數字標識2)ttagacggctccatcccacaaggggttaggccaccggcttcgggtgctgcccactttcat60
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gcaggtcggtcacgcattactcacccgttcgccactctcaccaccaagcaaagcctgatg1380
gatcccgttc gacttgca1398鑑定結論長雙歧桿菌 Bifidobacterium longum。本實施例中，受試樣品按本發明方法操作步驟進行接種、培養、計數和菌種鑑定， 活菌數計數結果為3. 0 X 106cfu/mL。為了驗證本實施例2中計數結果的可靠性，提取本次檢 測中培養基上生長的菌落，採用生理生化和分子生物技術鑑定方法對培養菌落進行鑑定， 鑑定結論表明培養物為長雙歧桿菌Bifidobacterium longum,與本實施例樣品中所添加的 雙歧桿菌為同一種屬菌種，表明受試樣品按本發明方法操作步驟進行培養和計數，可準確 計數雙歧桿菌活菌數數量。實施例3待測樣品已知青春雙岐桿菌活菌數1. OX 106cfu/mL的酸牛奶樣品樣品的製備將已知活菌數的青春雙歧桿菌菌粉(蒙牛乳業(北京)有限責任公 司保藏菌種，CGMCC No. 2264)按一定比例添加到酸牛奶產品中，使酸牛奶中嗜酸乳桿菌和 青春雙歧桿菌的活菌數量分別達到1. OX 106cfu/mL，嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞 種的數量達到1. OX 106cfu/mL。試劑0. 9%的滅菌生理鹽水。MRS培養基(g/L)蛋白腖10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐溫 801. 0ml，磷酸氫二鉀(7H20)2. 0，乙酸鈉(3H20) 5. 0，檸檬酸三銨2. 0，硫酸鎂(7H20)0. 2，硫 酸錳(4H20) 0.05，瓊脂15.0。將上述成分溶解在蒸餾水中，將pH調節到6.2 士 0.1，並用蒸 餾水定容至1000mL，121°C，高壓滅菌15min。抗生素溶液的組成為硫酸新黴素120mg，硫酸巴龍黴素35mg，LiCl 4. 5g，丙酸鈉 45g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 75g，蒸餾水50mL。製法0. 45 um微孔濾膜過濾後加入滅菌瓶中。4°C下保藏一個月。在無菌條件下，在1000mL47°C MRS培養基中加入50mL抗生素溶液，混勻，製成培養液。操作步驟樣品稀釋是通過無菌操作，將充分混勻的檢樣酸牛奶25mL放入含有 225mL滅菌生理鹽水的滅菌錐形瓶內作成1 10的均勻稀釋液。再用lmL滅菌吸管吸 取1 10稀釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內，振搖均勻，做成1 100的稀釋液。另取lmL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此操作，每 遞增一次，換用1支lmL滅菌吸管，製成幾個適當倍數的均勻稀釋液。選擇2個 3個適宜 的稀釋度，分別注入滅菌培養皿中，然後將融化並冷卻至45°C左右的培養液傾注於平皿中， 培養液的用量恰好覆蓋平皿底部一薄層，迅速與稀釋菌液混勻，凝固後培養，同時作滅菌生 理鹽水空白對照。待瓊脂表面幹後，翻轉平皿，放在厭氧罐內，加入厭氧產氣包並快速關緊 厭氧罐，或關緊厭氧罐後抽充高純氮氣三次。從稀釋樣品到傾注平板及放入厭氧罐的過程 要迅速，在20分鐘內完成操作。將厭氧罐置於36°C 士 1°C恆溫培養箱內培養72h士3h。菌落計數計數原則同GB4789. 2-2003種菌落總數計數原則。選取菌落數在30 300之間的平板對可疑菌落進行計數。計數出平皿內的雙歧桿菌菌數，然後乘以樣品的稀釋 倍數，得每毫升樣品中雙歧桿菌數。例如，檢樣IX 104倍的稀釋液在MRS瓊脂平板上，生成 的可疑菌落為35個，取5個鑑定，證實為雙歧桿菌的是4個，則lmL樣品中雙歧桿菌數為 35X4/5X 104 = 2. 8X 104。菌落形態觀察結果受試樣品在本發明方法所述條件下培養，培養基上生長的菌 落乳白色，溼潤，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不透明，邊緣整齊。菌種鑑定隨機挑取五個可疑菌落進行如下3項鑑定。①革蘭氏染色挑取瓊脂培養基上培養的菌落，按以下方法進行染色鑑定a.塗片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液染色lmin，水洗；b.滴加革蘭氏碘液，作用lmin，水洗；c.滴加脫色酒精，約30s ；d.水洗，滴加番紅復染lmin，水洗，待幹，鏡檢。結果受試樣品在本發明方法所述條件下培養，從培養基上隨機挑取五個可疑菌 落，按革蘭氏染色鑑定方法，鏡檢均為革蘭氏陽性菌。②菌體形態受試樣品在本發明方法所述條件下培養，從培養基上隨機挑取五個可疑菌落，按 革蘭氏染色鑑定方法，在顯微鏡(1000倍)下觀察菌體形態，呈現不規則桿菌。③過氧化氫酶試驗具體方法用接種環挑取一小環瓊脂培養基上培養的菌落，接到塗有3%過氧化 氫的玻片上，用竹籤攪動，有氣泡出現者為陽性，無氣泡為陰性。結果受試樣品在本發明方法所述條件下培養，從培養基上隨機挑取五個可疑菌 落，過氧化氫酶試驗為陰性。經以上鑑定步驟，本次樣品中雙歧桿菌計數結果活菌數為2. lX106cfu/mL。為了驗證本實施例3中計數結果的可靠性，提取本次檢測中培養基上生長的菌 落，採用生理生化和分子生物技術鑑定方法對培養菌落進行鑑定，驗證方法及結果如下形態特徵在培養基上菌落形態為乳白色，溼潤，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不 透明，邊緣整齊。革蘭氏染色，顯微鏡下鏡檢，菌體革蘭氏陽性，無芽孢，杆狀、多形態。生理生化特徵接觸酶陰性，氧化酶陰性，嚴格厭氧生長，果糖-6-磷酸鹽磷酸酮 酶陽性，發酵葡萄糖產生乳酸。 16SrDNA基因序列分析培養菌落按細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(天根生化科技有限公司)說 明提取基因組DNA。以提取的細菌基因組DNA為模板，PCR擴增16SrDNA，細菌域的16SrDNA 基因擴增的通用引物27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 『)和 1541R(5' -TMGGAGGTGATCCAGCC-3 『)。PCR 反應體系(30ul 體系)1. 5ul 引物 1，1. 5ul 弓丨物 2，5ul 5 * buffer, 0. 2ulMg(250mM)，1. 2ul dNTP (2. 5mM)，18. 4ul H20, lul 模板(5ng)。PCR 過程為 94°C預變 性3min後，進行下述30個循環94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，最後72°C保溫 lOmin。PCR結束後，取15ul反應混和物在1 %瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中添加EB替代物， 電泳緩衝液1XTAE緩衝液。電泳結束後在紫外光下觀察，可見相應大小為1. 5kb的條帶。 用DNA回收試劑盒回收PCR產物。將回收的PCR產物送樣到測序公司測序(美國英傑生命 技術有限公司)，將得到的鹼基序列在NCBI資料庫進行同源序列搜索(blast)，找出與數據 庫中同源性最高的模式菌株。結果如下(序列數字標識3)ccaggagcttgctcctgggtgagagtggcgaacgggtgagtaatgcgtgaccgacctgcc60
ccatacaccggaatagctcctggaaacgggtggtaatgccggatgctccagttgactgca120
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ggggtaacggcccaccatggcttcgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacat240
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tcgcggatcagcaacgccgcggtgaatgcgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaa1320
gtcatgaaagtgggtagcacccgaagccggtggcccaa1358鑑定結論青春雙歧桿菌 Bifidobacterium adolescentis本實施例中，受試樣品按本發明方法操作步驟進行接種、培養、計數和菌種鑑定， 活菌數計數結果為2. lX106cfu/mL。為了驗證本實施例中計數結果的可靠性，提取本次檢 測中培養基上生長的菌落，採用生理生化和分子生物技術鑑定方法對培養菌落進行鑑定， 鑑定結論表明培養物為青春雙歧桿菌Bifidobacterium adolescentis,與本實施例樣品 中所添加的雙歧桿菌為同一種屬菌種，表明受試樣品按本發明方法操作步驟進行培養和計 數，可準確計數雙歧桿菌活菌數數量。
權利要求
一種酸牛奶中雙歧桿菌的檢測方法，包括以下步驟1)稀釋液、MRS培養基、抗生素溶液和培養液配製；2)樣品稀釋；3)接種培養；4)菌落計數；5)顯微鏡檢查、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗；其特徵在於所述抗生素溶液包含硫酸新黴素和硫酸巴龍黴素。
2.如權利要求1中所述的方法，步驟1)所述的稀釋液為0.9%滅菌生理鹽水，培養液 由滅菌MRS培養基和抗生素溶液組成，抗生素溶液的組成為硫酸新黴素80 120mg，硫酸巴 龍黴素35 65mg，LiCl 1. 5 4. 5g，丙酸鈉15 45g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 25 0. 75g，蒸 餾水50mL。
3.如權利要求1所述的檢測方法，所述的步驟1)中培養液是將通過0.45μπι微孔濾膜 過濾後的抗生素溶液加入到滅菌的47°C MRS培養基中混勻製備的。
4.如權利要求1所述的檢測方法所述的步驟2)包括通過無菌操作，將充分混勻的檢 樣酸牛奶25mL放入含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌錐形瓶內製成1 10的均勻稀釋液； 用ImL滅菌吸管吸取1 10稀釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內， 振搖均勻，做成1 100的稀釋液；另取ImL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋 液，如此操作，每遞增一次，換用1支ImL滅菌吸管，製成幾個適當倍數的均勻稀釋液。
5.如權利要求4所述的檢測方法所述步驟3)包括選擇其中2個 3個稀釋度，分別 注入滅菌培養皿中，然後將融化並冷卻至45°C左右的培養液傾注於平皿中，培養液的用量 恰好覆蓋平皿底部一薄層，迅速與稀釋菌液混勻，凝固後培養，同時作滅菌生理鹽水空白對 照，待瓊脂表面幹後，翻轉平皿，放在厭氧罐內，加入厭氧產氣包並快速關緊厭氧罐，或關緊 厭氧罐後抽充高純氮氣三次。
6.如權利要求5所述的檢測方法所述步驟4)和5)包括選取菌落數在30 300之 間的平板對可疑菌落進行計數，隨機挑取五個可疑菌落進行顯微鏡檢查、革蘭氏染色和過 氧化氫酶試驗，過氧化氫酶陰性，革蘭氏染色陽性，無芽孢，顯微鏡下出現「Y」或「V」型的分 叉狀或棒狀形態的桿菌為雙歧桿菌。
7.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於所說培養液是在無菌條件下，在IOOOmL 470C MRS培養基中加入50mL抗生素溶液，混勻後製成的。
全文摘要
本發明涉及一種酸牛奶中雙歧桿菌的檢測方法，包括稀釋液、培養基和抗生素溶液配製；樣品處理培養物培養；菌落計數；顯微鏡檢查、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗。所述抗生素溶液包含硫酸新黴素和硫酸巴龍黴素。本發明方法能夠有效的排除其他乳酸菌的幹擾，準確檢測出含有4種乳酸菌酸牛奶中雙歧桿菌的活菌數量，降低檢測成本，提高檢測效率。
文檔編號C12Q1/04GK101851664SQ20091026538
公開日2010年10月6日 申請日期2009年12月30日 優先權日2009年12月30日
發明者代青梅, 劉愛萍, 牛天嬌, 蔣菁莉, 趙紅峰 申請人:內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司