黃瓜中的白粉病抗性提供基因的製作方法
2023-12-10 06:27:37
黃瓜中的白粉病抗性提供基因的製作方法
【專利摘要】本發明涉及黃瓜屬（Cucumis）科尤其是黃瓜（Cucumis?sativus）的白粉病抗性提供基因，其中所述抗性由本發明的基因的受損提供。此外，本發明涉及包含本發明的受損的抗性賦予基因的植物及其種子、胚或其他繁殖材料。尤其是，本發明涉及白粉病抗性賦予基因，其中被所述抗性賦予基因編碼的胺基酸序列選自由SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.4、SEQ?ID?No.6、SEQ?ID?No.8、SEQ?ID?No.10、SEQ?ID?No.12、SEQ?ID?No.14、SEQ?ID?No.16、SEQ?ID?No.18、SEQ?ID?No.20和SEQ?ID?No.22、以及具有多於70%同一性、優選多於80%同一性、更優選多於90%同一性以及最優選多於95%同一性的胺基酸序列組成的組。
【專利說明】黃瓜中的白粉病抗性提供基因
[0001]描述
[0002]本發明涉及黃瓜(Cucumis sativus)的白粉病抗性提供基因,其中所述抗性由本發明的基因在表達或蛋白水平的受損提供。此外，本發明涉及包含本發明的抗性賦予基因的植物及其種子、胚或其他繁殖材料。
[0003]白粉病(PM)是屬于田地和溫室中的黃瓜屬(Cucumis)科的植物諸如黃瓜(Cucumis sativus)(黃瓜，cucumber)中已知的主要真菌疾病之一。
[0004]白粉病一般由白粉菌目(Erysiphales)的許多不同的真菌種引起。該病以如下區別性症狀為特徵:諸如在葉和莖上的白粉樣斑點。一般地說，較低的葉最易受侵襲，但黴可出現在植物暴露於地面上的任何部分。隨著該病的發展，斑點因大量孢子形成而變大變密，且黴沿著植物長度如在莖甚至在果實上上下傳播。
[0005]被嚴重侵襲的葉可變得乾燥且易碎，或者可以枯萎和死亡。由於這種感染，果實在大小上可以更小，數目更少，不大能夠成功儲存，日燒傷，不完全成熟，且具有不好的口味。它還可能使植物傾向於更易受其他病原體傷害。最終，植物可以死亡。
[0006]除了其他之外，白粉病可以由真菌蒼耳單絲殼(Sphaerotheca fuliginea)(最近重新命名:蒼耳單囊白粉菌(Podosphaera xanthii),還稱為白粉粉孢黴(Oidiumerysiphoides))和 / 或二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum DC)(最近重新命名:菊科白粉菌(Golovinomyces cichoracearum),還稱為菊粉抱菌(Oidium chrysanthemi))弓丨起。
[0007]考慮到黃瓜屬植物物種諸如黃瓜的經濟重要性，在本領域對提供白粉病抗性提供基因存在持續的需要。
[0008]鑑於本領域中的以上需要，除了其他目的之外，本發明的一個目的是滿足這種需要。
[0009]根據本發明，除了其他目的之外，該目的由如所附權利要求1中限定的白粉病抗性賦予基因滿足。
[0010]具體地說，除了其他目的之外，本發明的這個目的由白粉病抗性賦予基因滿足，其中由所述抗性賦予基因編碼的胺基酸序列選自由SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.12,SEQ ID N0.14,SEQ ID N0.16,SEQ ID N0.18、SEQ ID N0.20和SEQ ID N0.22、以及具有多於70%同一性、優選多於80%同一性、更優選多於90%同一性以及最優選多於95%同一性諸如多於96%、97%、98%、99%的胺基酸序列組成的組；且其中所述抗性賦予基因是受損的。
[0011]除了其他目的之外，本發明的目的另外由白粉病抗性賦予基因滿足，其中從所述抗性賦予基因轉錄的CDNA序列選自由SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.17、SEQ IDN0.19和SEQ ID N0.21、以及具有多於70%同一性、優選多於80%同一性、更優選多於90%同一性以及最優選多於95%同一性諸如多於96%、97%、98%、99%的cDNA序列組成的組；且其中所述抗性賦予基因是受損的。
[0012]根據本發明的受損的抗性賦予基因意指提供減少的或甚至不存在的對由真菌引起的表現為葉和莖上的粉樣斑點的白粉病的易感性的基因，所述真菌諸如屬於白粉菌目諸如蒼耳單絲殼(最近重新命名:蒼耳單囊白粉菌，還稱為白粉粉孢黴)和/或二孢白粉菌的真菌。
[0013]根據本發明的受損的抗性賦予基因是突變的基因。本發明的基因的突變可通過不同的機制導致受損。例如，在蛋白質編碼DNA序列中的突變可導致突變的、截短的或無功能的蛋白質。在非編碼DNA序列中的突變可引起可變的剪接、翻譯或蛋白質運輸。可選地，導致改變的基因轉錄活性的突變可導致蛋白的低水平或不存在，基因轉錄活性決定可用於翻譯成蛋白質的mRNA的量。另外，基因功能的受損可在翻譯後即在蛋白質水平上引起。
[0014]根據本發明的受損還通過以下顯示:與本文提供的SEQ ID Nos.相比在含有在蛋白質水平被突變的基因的黃瓜植物中觀察到白粉病抗性，或未觀察到本文提供的SEQ IDNos.的表達。
[0015]受損還在本文顯示為無功能的基因或蛋白質。儘管本發明的基因的功能仍沒有被鑑定，無功能的基因或蛋白質可通過在植物中確立白粉病抗性(無功能的)或白粉病易感性(有功能的)而容易確定。白粉病抗性(無功能的)植物通過以下顯示:與本文提供的SEQ IDNos.相比含有在蛋白質水平被突變的基因，或未觀察到本文提供的SEQ ID Nos.的表達。
[0016]有功能和無功能的基因或蛋白質還可以使用互補實驗確定。例如，用本發明的基因或蛋白中的任何一種轉化抗白粉病的黃瓜植物，在該基因或蛋白有功能時將產生白粉病易感的黃瓜植物，而在該基因或蛋白無功能時該黃瓜植物將仍有抗性。
[0017]根據本發明，本發明的白粉病抗性賦予基因在本發明的基因受損時提供了白粉病抗性。根據本發明的受損可通過以下顯示:在本文被鑑定為SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.16、SEQ ID N0.18、SEQ ID N0.20或SEQ ID N0.22的有功能或非突變的蛋白質的不存在或減少。在本領域中，許多機制已知導 致基因在轉錄、翻譯或蛋白質水平的受損。
[0018]例如，在轉錄水平的受損可以是在轉錄調控序列諸如啟動子、增強子和起始序列、終止序列或內含子剪接序列中的一個或更多個突變的結果。這些序列一般位於由SEQ IDN0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.9,SEQ ID N0.1USEQ ID N0.13、SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.19 或 SEQ ID N0.21 所表示的編碼序列的 5，、3，或這些編碼序列之內。受損還可以由在本發明的基因中的缺失、重排或插入提供。
[0019]在翻譯水平的受損可以由提前終止密碼子或其他的RNA_>蛋白質控制機制(諸如剪接)或影響例如蛋白質摺疊或細胞運輸的翻譯後修飾提供。
[0020]在蛋白質水平的受損可以由截短的、錯誤摺疊的或受幹擾的蛋白質-蛋白質相互作用提供。
[0021]不依賴於背後的機制，根據本發明的受損通過以下顯示:根據SEQ ID N0.2、SEQID N0.4,SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.12,SEQ ID N0.14,SEQ IDN0.16,SEQ ID N0.18,SEQ ID N0.20或SEQ ID N0.22的有功能的蛋白質的減少或不存在。
[0022]根據優選的實施方案，根據本發明的受損由在本發明的基因中導致蛋白質表達產物不存在的一個或更多個突變提供。如所示的，這些突變可引起在轉錄或翻譯水平的缺陷表達。
[0023]根據另一優選的實施方案，根據本發明的受損由在本發明的基因中導致無功能的蛋白質表達產物的一個或更多個突變引起。無功能的蛋白質表達產物可以例如由提前終止密碼子、不正確的翻譯或翻譯後加工或由插入、缺失或胺基酸變化引起。
[0024]利用分子生物學方法，本發明的基因的受損還可以通過基因沉默例如利用本發明的基因的siRNA或敲除完成。在本發明的背景下還考慮了基於EMS或其他能夠隨機改變核酸成為其他核苷酸的致突變的化合物的方法。此類突變的檢測通常涉及高靈敏度解鏈曲線分析或基於核苷酸測序的TILLING程序。
[0025]本發明涉及在核苷酸水平或胺基酸水平具有多於70%、優選多於80%、更優選多於90%以及最優選多於95%序列同一'丨生的核苷酸和胺基酸序列。
[0026]將本文使用的序列同一性定義為在本發明序列的全長上的相同的連續的比對的核苷酸或胺基酸的數目除以本發明序列的全長的核苷酸或胺基酸的數目，再乘以100%。
[0027]例如，與SEQ ID N0.1具有80%同一性的序列在SEQ ID N0.15的1782個核苷酸的總長度上包括1426個相同的比對的連續核苷酸，即1426/1782 X 100%=80%。
[0028]根據本發明，本發明的基因衍生自黃瓜。
[0029]根據另一方面，本發明涉及在其基因組中包含本發明的受損的白粉病抗性賦予基因的黃瓜植物，即不表達選自由以下組成的組的有功能的蛋白質的植物:SEQ ID N0.2、SEQID N0.4,SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.12,SEQ ID N0.14,SEQ IDN0.16、SEQ ID N0.18、SEQ ID N0.20 和 SEQ ID N0.22、及具有多於 70% 同一性、優選多於80%同一'丨生、更優選多於90%同一'丨生以及最優選多於95%同一'丨生的胺基酸序列。
[0030]一般地且優選地，本發明的植物對於本發明的受損基因來說將是純合的，即包含兩個受損的白粉病抗性賦予基因，其中從所述抗性賦予基因轉錄的cDNA序列選自由SEQID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.11、SEQ IDN0.13,SEQ ID N0.15,SEQ I D N0.17,SEQ ID N0.19 和 SEQ ID N0.21、以及具有多於 70% 同一性、優選多於80%同一性、更優選多於90%同一性以及最優選多於95%同一性的cDNA序列組成的組。
[0031]考慮到本發明的植物的益處，即，提供在黃瓜植物中的白粉病抗性，本發明還涉及能夠提供本發明的抗白粉病的黃瓜植物的種子、植物部分或繁殖材料，所述種子、植物部分或繁殖材料包含一個或更多個本發明的白粉病抗性賦予基因，即，受損的白粉病抗性賦予基因，其中從所述抗性賦予基因轉錄的cDNA序列選自由SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQID N0.5,SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.9,SEQ ID N0.1USEQ ID N0.13,SEQ ID N0.15,SEQ IDN0.17、SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.21、以及具有多於70%同一性、優選多於80%同一性、更優選多於90%同一性以及最優選多於95%同一性的cDNA序列組成的組。
[0032]根據又另一方面，本發明涉及選自由以下組成的組的分離的核苷酸序列:SEQ IDN0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.9,SEQ ID N0.1USEQ ID N0.13、SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.19 和 SEQ ID N0.21、以及具有多於 70% 同一性、優選多於80%同一'丨生、更優選多於90%同一'丨生以及最優選多於95%同一'丨生的核苷酸序列。
[0033]根據仍另一方面，本發明涉及選自由以下組成的組的分離的胺基酸序列:SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12、SEQ IDN0.14,SEQ ID N0.16,SEQ ID N0.18,SEQ ID N0.20 和 SEQ ID N0.22、以及具有多於 70% 同一'I"生、優選多於80%同一'丨生、更優選多於90%同一'丨生以及最優選多於95%同一'丨生的胺基酸序列。
[0034]本發明還涉及一個或多個本發明的白粉病抗性賦予基因、一個或多個本發明的分離的核苷酸序列、或一個或多個本發明的分離的胺基酸序列用於提供抗白粉病的黃瓜植物(黃瓜)的用途。如所示的，本發明的用途是基於本文描述的基因在表達或蛋白質水平的受損，且可以通過本發明提供的cDNA和胺基酸序列任選地聯合白粉病抗性的存在或不存在的確定和/或聯合互補測定而容易地確定。
[0035]在本發明的優選實施方案的以下實施例中將進一步描述本發明。在該實施例中，參考附圖，其中:
[0036]圖1:示出了 CsKIP2在黃瓜種質的選擇中的相對表達水平。加入在不存在(_)或存在(+ )轉座子的情況下每組的表達平均值，包括標準誤差棒。棒的顏色指示用來進行計算的參考基因。
[0037]圖2:示出了用引物ID3和ID4擴增並且通過凝膠電泳(2%瓊脂糖，10v/cm，40分鐘)顯現的CsKIP2的DNA片段。
[0038]圖3:示出了在CsKIP2基因組DNA中不存在(上部鏈)和存在(下部鏈)轉座子樣元件的情況下系的cDNA序列比對。此處，在從存在轉座子樣元件的系取得的cDNA中可見72bp缺失。引物結合位置以粗體斜體字符顯示。
[0039]圖4:示出了易感白粉病的CsKIP9等位基因與抗白粉病的CsKIP9等位基因的胺基酸比對。
實施例
[0040]實施例1:黃瓜種質篩 選CsKIP2表達水平和等位基因變體對抗性/易感性的貢獻
[0041]引言
[0042]基因的功能受:損可由不同的機制引起。在蛋白質編碼DNA序列中的突變可以是等位基因功能喪失或基因特性改變的原因。可選地，改變的基因轉錄活性可導致可用蛋白的低水平，基因轉錄活性決定可用於翻譯成蛋白質的mRNA的量。另外，基因功能的受損可在翻譯後即在蛋白質水平上引起。
[0043]本實施例顯示，在CsKIP2的編碼序列中的突變(缺失)提供了白粉病抗性。
[0044]材料和方法
[0045]選擇在白粉病抗性水平上不同的總計十二種黃瓜種質系用於分析。使種子在標準溫室條件下萌發。在播種後7天用本地的白粉病分離株感染下胚軸，接著在播種後14天感染第一真葉。在播種後28天(在感染下胚軸後21天和14天)進行反應表型的評估並以1-9的尺度對表型評分，其中I是完全易感且9是完全抵抗。
[0046]採集被感染的植物的材料用於隨後的根據標準程序的RNA分離(Machery-NagelRNA Plant)。RNA分離之後是利用標準01igo-dT引物聯合反轉錄酶(Finnzymes)與I μ g總RNA輸入的cDNA合成。
[0047]用CsKIP2特異性的PCR引物對(表1，ID1ID2)確定CsKIP2的表達水平，從外顯子5到外顯子7擴增了具有對cDNA特定的大小的DNA片段，與從基因組DNA取得的產物大小十分不同。此外，從三個不同的管家基因擴增作為內參起作用的對照片段，所述管家基因即延長因子l-α (EF-1，擬南芥(A.thaliana)直向同源物Atlg07920.1)、蛋白質磷酸酶2a亞基a2 (PDF2，擬南芥直向同源物At3g25800.1)和包含解旋酶結構域的蛋白I (HEL1，擬南芥直向同源物Atlg58050.1)。
[0048]對於在PCR擴增過程中的dsDNA的特異性實時檢測，將LCGreen (IdahoTechnologies)以0.5 X濃度加入到PCR反應混合物中。使用Δ Δ Ct方法進行計算。
[0049]對於以CsKIP2檢測等位基因變體，在cDNA中靶向特定的區域。這個區域被懷疑容納轉座子樣元件(外顯子11轉座子)。被設計用來特異性擴增CSKIP2的外顯子9(局部)、10和11 (局部)的引物(表1，ID3ID4)用於檢測該片段。
[0050]表1:CsKIP2特異性PCR引物
[0051]
【權利要求】
1.白粉病抗性賦予基因，其中被所述抗性賦予基因編碼的胺基酸序列選自由SEQIDN0.2、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12、SEQ IDN0.14,SEQ ID N0.16,SEQ ID N0.18,SEQ ID N0.20 和 SEQ ID N0.22、以及具有多於 70% 同一'I"生、優選多於80%同一'丨生、更優選多於90%同一'丨生以及最優選多於95%同一'丨生的胺基酸序列組成的組；且其中所述抗性賦予基因是受損的。
2.白粉病抗性賦予基因，其中從所述抗性賦予基因轉錄的cDNA序列選自由SEQIDN0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.9,SEQ ID N0.1USEQ ID N0.13、SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.19 和 SEQ ID N0.21、以及具有多於 70% 同一性、優選多於80%同一性、更優選多於90%同一性以及最優選多於95%同一性的cDNA序列組成的組；且其中所述抗性賦予基因是受損的。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的白粉病抗性賦予基因，其中所述受損是導致蛋白質表達產物不存在的在所述基因中的一個或更多個突變。
4.根據權利要求1或權利要求2所述的白粉病抗性賦予基因，其中所述受損是導致無功能的蛋白質表達產物的在所述基因中的一個或更多個突變。
5.根據權利要求1或權利要求2所述的白粉病抗性賦予基因，其中所述受損是基因沉默。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的白粉病抗性賦予基因，其中所述基因衍生自黃瓜(Cucumis sativus)。
7.在其基因組中包含權利要求1至6中任一項限定的受損的白粉病抗性賦予基因的黃瓜植物，其中所述受損提供白粉病抗性。
8.根據權利要求7所述的在其基因組中包含權利要求1至6中任一項限定的受損的白粉病抗性賦予基因的植物的種子、植物部分或繁殖材料，其中所述受損提供在所述植物中的白粉病抗性。
9.分離的核苷酸序列，選自由SEQ ID N0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.21、以及具有多於70%同一性、優選多於80%同一性、更優選多於90%同一性以及最優選多於95%同一'丨生的核苷酸序列組成的組。
10.分離的胺基酸序列，選自由SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.16、SEQ ID N0.18、SEQ ID N0.20和SEQ ID N0.22、以及具有多於70%同一性、優選多於80%同一性、更優選多於90%同一性以及最優選多於95%同一性的胺基酸序列組成的組。
11.如權利要求1至6中任一項限定的白粉病抗性賦予基因、根據權利要求9的分離的核苷酸序列、或根據權利要求10的分離的胺基酸序列用於提供抗白粉病的黃瓜植物的用途。
【文檔編號】C12N15/82GK103502268SQ201280011363
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年2月20日 優先權日:2011年3月1日
【發明者】P·J·迪爾加得, 利奧諾拉·約翰娜·格爾特魯達·范恩克沃特, 卡琳·英格伯格·波斯楚馬, 馬裡努斯·威廉·普林斯 申請人:安莎種子公司, 科因股份有限公司