測定異質性細胞群中的小細胞群的方法和裝置的製作方法

2023-12-10 02:21:01

專利名稱：測定異質性細胞群中的小細胞群的方法和裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於測定異質性細胞群中的小細胞群的方法。所述方法適於濃縮和定量測定異質性細胞群中的小細胞群，例如在胎母輸血中；用於平行地測定多種細胞結合分析物，並且因此可在胎母輸血情形或嵌合體情形中(beichimaren)用於在輸血之後測定混合場及應(Mischfeldreaktionen)中的細胞群；用於檢測以低濃度存在於細胞上的分析物；和/或用於測定血細胞比容值。本發明還提供適於所述方法的裝置。
背景技術：
FMH
在妊娠過程中，血液有規律地從胎兒循環流入母體循環(胎母輸血(fetomaternal hemorrhage), FMH)。根據文獻資料記載，這一輸血量為0.1ml至大約30ml;在大約96_98%的妊娠中，FMH小於2ml，但是在0.3%的妊娠中，超過30ml。估計母體血液量為5000ml，這就意味著有0.002%至0.6%抗原性質與母體不同的另一種紅細胞進入母體循環，如果由此產生免疫反應則可能變成臨床問題。最為顯著的例子是一個D型母親懷有一個D+型胎兒。如果母親產生抗-D抗體，那麼再次懷上D+型胎兒時可能產生致命的結果(新生兒溶血病，HDN)。由於這一原因，在這些情況下需對母親實施"抗-D預防"。儘管如此，人們對能夠由此估計FMH量仍有極大的興趣，因為，例如在FMH〉30ml時，標準的抗-D療法無法提供足夠的保護。因此，在美國，標準免疫包括250至300嗎的抗-D(IgG)，這足以為自身母體循環接收15ml的胎兒紅細胞也就是25至30mi的胎兒血液的妊娠婦女提供足夠保護。歐洲的標準劑量通常低些，即100至150叱抗-D(IgG)，這能為FMH為8 —10ml的妊娠婦女提供保護。每個實施抗-D預防的機構都必須設法檢測超過標準的FMH(Issitt PD禾a AnsteeDJ.在應用血型血清(Applied Blood Group Serology)[第4版]，蒙哥馬利科學出版社(Montgomery Scientific Publication),第41章新生兒溶血病(HemoIyticdisease of the newborn)， 第1045-1050頁)。傳統的血型一血清分析，例如用於檢測D抗原的分析，根本不能檢測如上所述如此小量的異質細胞群。
因此，曾開發了許多專門用於檢測FMH的不同的分析方法。這些分析方法檢測胎兒紅細胞，血型抗原D或血紅蛋白F。
FMH檢測測試 FMH檢測限
Rosette測試 大約10ml
這一測試方法基於對紅細胞聚集的檢測及顯微鑑定。胎兒D抗原檢測。(Jones A.R.,SliverS. Blood 1958; 13: 763
SebringE.S.，Polesky H.F,Transfusion 1982; 22: 468Sebring E.S.in: Hemolytic disease of the newborn.Arlington,VA; Am Assoc Blood Banks 1984: 87.)
Kleihauer-Betke測試 大約5ml
這一測試方法基於胎兒紅細胞對酸性洗提的較高的抵抗力及對其進行的顯微鑑定。胎兒細胞檢測。
(KleihauerE,，BraunH,，BetkeK.Klein Wschr 1957; 35: 637.)
流式細胞儀 大約1ml
D抗原或血紅蛋白F用相應的抗體標記，用發螢光的第二抗體檢測。胎兒D抗原/血紅蛋白檢測。
Garratty G.,ArndtP.Transfusion 1995; 35: 157.David B,H.Clin Lab Med 2001; 21: 829.
抗體消耗測試 大約15ml
這一測試方法是一種基於常規血型測定方法(凝膠技術)的FMH測定法。它是基於胎兒紅細胞對抗-D試劑的消耗。反應上清液用D-陽性測試細胞孵育，然後象在凝膠測試中那樣離心。胎兒D抗原檢測。
Lapierre Y.,Rigal D,，Adam J.,Josef D.,Meyer F.,Greber S.,Drot C. Transfusion1990; 30: 109.David M.,Stelzer A.,Wittmann G.，Dudenhausen J.W.,Salama A.Z.GeburtshilfeNeonatol 1999; 203: 241.
這些方法用於檢測紅細胞抗原、胎兒紅細胞或者胎兒紅細胞的特徵性血紅蛋白F。所有這些方法的共同點在於這些方法需要大量試劑，且費時費事。而且，這些方法都需要諸多儀器來實施，其中的一些儀器是非常昂貴的(例如顯微鏡，離心分離機，流式細胞儀)。這些方法的共同點還在於需要經特別培訓的人員才能實施。此外，Kleihauer-Betke法的缺點還在於鑑定結果非常主觀。
弱D(Dweak〗特徵表達，特別是DEL
供血者和接受者血清的另一個挑戰是D抗原的微弱或部分表達(不完全表達)。依賴於單克隆抗體和間接Coomb試驗確認，即使是對這樣弱的血型進行的鑑定曾一度被視為是可靠的，直到發現DEL表型，該表型具有特別弱的D型表達("常規"D:每紅細胞10 — 30000抗原(RBC);弱D型400至1000; DEL:
<30)。
在血清學上，DEL僅能通過使用可多達10個清洗步驟的極複雜的吸收一洗提測試間接測定。輸血需要考慮DEL，因為一個接受DEL型庫存血的D型受血者會形成抗-D抗體。這一問題如此嚴重以致於目前專家間就是否應當對所有(血清學)D型供血者的D型狀況用分子學方法進行確認存在爭論。
Wagner T.，K6rm6czi G.F.,Buchta C.，Vadon M.,Lanzer G.，Mayr W.R"LeglerT丄Transfusion 2005; 45: 520
混合場反應，異體輸血，血液回輸
輸血應當總是在相同的或相容的ABO型和相容的D型之間進行。在某些情況下，例如對於輸過血的患者(vortransfimdierten)，臨床要求輸就其它抗原而言亦為同型的同型血。然而，尚不可能做到所有血型全同的同型血(自體輸血除外)。這常會導致這樣的輸血後現象，即，患者被診斷為對某些血型特徵即有陽性又有陰性。在診斷中，"混合場反應"是存在的，就像採用高靈敏度方法-特別是能夠在檢測過程中空間分離單個紅細胞和紅細胞凝聚體的那些方法-也能看到的那樣。例如，將300ml(67。/。)的紅細胞濃縮液輸給一個K-陰性的人(血型kk)，他的血液循環量為5000ml(45。/c)的血細胞比容)，所述濃縮液為K+(血型Kk或KK)，於是，此人大約8n/。(公稱值)的紅細胞是K+， 92。/。的紅細胞是K-。
這種情況也可用例如現在被廣泛使用的DiaMed和Bio-Rad的凝膠系統檢測到。這一技術包括離心被檢者的紅細胞稀釋懸浮液，令其通過一凝膠-層析柱，該層析柱底部封閉，並且可包含不同特性的抗體試劑。未凝集游離細胞能夠通過凝膠並在反應容器的底部形成沉澱物，而紅細胞凝集體則被截留在凝膠上或凝膠內(Lapierre Y., Rigal D., Adam J., Josef D., Meyer F.， Greber S,, Drot C.,Transfusion 1990; 30: 109)。如果前述示例中的紅細胞通過一個包含抗-K的柱離心，與前文所述混合場檢測結果相對應，大多數細胞將沉澱在底部，因為它們是K-， 一小部分會被截留在凝膠上和凝膠內(K+)。如果將上述紅細胞上樣在MDmulticard(Medion診斷)上，同樣可檢測到一條位於抗-K處的弱帶。然而，與凝膠技術相比，W02005005991所述的方法不能同時顯現反應陰性的細胞群。
背景技術：
中所有其它方法，就檢測混合場反應而言，不具有任何可與凝膠系統和MDmulticard相比的特性。
異體輸血和血液回輸
Nelson M., Popp H., Sharpe K.， Ashenden M.Haematologica 2003; 88: 1284
輸血後的混合場反應
IssittPD禾Q AnsteeDJ.在應用血型血清(A卯lied Blood Group Serology)[第4版]，蒙哥馬利科學出版社(Montgomery Scientific Publication),第41章新生J L溶血疾病(Hemolytic disease of the newborn)，第1045-1050頁。
血細胞比容
紅細胞的血細胞比容或總容量指紅細胞的容量和全血的總容量的比率，以百分比表達。紅細胞與全血的容量比率受到紅細胞的容量和數量影響。
血細胞比容 一 般可通過離心裝有血液的毛細管來測定(StrumiaM,M.,Samble A.B.,Hart E.D.,1954; Am J Clin Path; 24: 1016)，離心後就可得出沉澱細胞成分與總容量的比率。血細胞比容的測定也可以藉助於電阻抗方法。該方法中，電解溶液中陽極和陰極之間的電流受到引入其中的不同傳導率的顆粒的影響。電流的變化以脈衝記錄。因此，根據特定的脈衝幅度可推斷出 特定的顆粒尺寸，由此推定特定的血清學細胞類型，例如紅細胞。細胞數量和
血細胞比容可通過單位測定量的脈衝量累加推導得出(Sysmex KX-21N Operator's, 1999)。
因此，本發明的一個目標是提供簡單、經濟、可自動化的方法，該方法能 夠快速檢定異質性細胞群中的小細胞群，例如在胎母輸血或嵌合體情形中。本 發明還意在提供用於檢測以低濃度存在於細胞上的分析物，用於測定血細胞比 容值和/或用於平行測定混合場反應中的多種細胞結合分析物的簡單、快速、靈 敏的方法。與現有方法相比，這些方法具有更高的靈敏度。
發明概述
本發明提供了一種用於測定液體樣品中一種或多種細胞結合分析物的方
法，由此實現了上述目標，實施所述方法使用的裝置包括 -至少一個進樣區域(5)，用於施加液體樣品，
-適於各種細胞成分透過的多孔膜(2)，膜上包括至少一個指示劑區域，所
述指示劑區域能夠與細胞結合分析物相互作用並含有至少一種針對細胞結合 分析物的結合元素，以及
一至少一個位於膜上的吸收區域(3)，該區在液體通過指示劑區域後吸收液
體，
其中，所述至少一個指示劑區域位於進樣區域(5)和吸收區域(3)之間，並且， 所述方法被用於濃縮和定量測定異質性細胞群中的小細胞群，例如在胎母輸血 或嵌合體情形中，用於檢測以低濃度存在於細胞上的分析物，用於測定血細胞 比容值和/或用於平行測定混合場反應中的多種細胞結合分析物。
在一個優選實施方式中，該方法包括以下步驟
a) 將包含細胞的液體樣品加至進樣區域；
b) 施加稀釋劑；
C)進行測試；並且
d)通過檢測細胞是否結合於指示劑區域來評定測試。 根據這一優選實施方式的方法優選用於濃縮和用於定量測定異質性細胞 群中的小細胞群，例如在胎母輸血中，或者用於檢測以低濃度存在於細胞上的分析物。
所述實施方式在下文亦稱"孵育法"。
DE10330982A1和WO2005/005986已經披露了 一種橫向流動裝置 (Lateral-Fluss-Vorrichtung)。本文中，後者被用於同時測定紅細胞抗原和血清成 分例如抗體。在這一已出版公開中披露的橫向流動裝置適用於本發明的方法。 本文在此納入DE10330982A1和WO2005/005986的全部內容。
在本發明中，所述橫向流動裝置被用作流式細胞計，為的是能夠最大限度 濃縮少量存在於異質性細胞混合物中的另一種(或第二)細胞群。所述濃縮優選 大量地進行，這可以通過使用最大總量的血液來實施，還可以利用容量增加引 起的孵育效應。所述橫向流動裝置的讀數域(Ablesefeld)與流動式細胞計中的流 量池(Durch-flusszelle)類似。通過洗清高濃度存在的細胞類型和在讀數窗固定低 濃度細胞類型保持低背景。
結果，即使是一個低比例群也有足夠大的數量通過抗體帶，從而使這一群 得以顯現。這是通過洗去大量顯著高比例群來實現的。
用於測定FMH的本方法高度靈敏，並且能夠檢出母體血液中大約0.1%至 0.2。/。的胎兒D+細胞。
根據另一個優選實施例，方法中使用的裝置包括至少兩個在流動方向上依 次前後設置的指示劑區域，設置的方式使得樣品液體在每一條流動路徑上通過 超過一個指示劑區域，其中，所述指示劑區域含有針對細胞結合分析物的結合 劑，並且該方法包括
a) 將包含紅細胞的血液樣品加至進樣區域；
b) 將稀釋劑施加至進樣區域；
c) 進行所述測試；
d) 通過檢測紅細胞是否被結合至指示劑區域來評定測試； 其中，所述方法被用於在胎母輸血(FMH)中平行測定多種細胞結合分析物，
用於混合場反應中的測定，用於檢測異體輸血或者用於測定血細胞比容值。 該實施例在下文中亦稱"兩-指示劑區域法"。
根據本發明的另一項內容，本發明提供一種用於直接測定液體樣品中的細 胞結合分析物的裝置，該裝置包括.-
一用於施加液體樣品的進樣區域(5)，一適於被細胞成分透過的多孔膜，該膜上具有至少兩個指示劑區域，所述 指示劑區域能夠與細胞結合分析物相互作用並且含有針對細胞結合分析物的 結合劑，以及
-至少一個在液體通過指示劑區域後吸收液體的吸收區域(3)，
其中，所述指示劑區域位於進樣區域(5)和吸收區域(3)之間，其中所述至少 兩個指示劑區域沿流動方向依次前後設置，設置方式使得樣品液體能夠在每一 條流動路徑上通過至少一個指示劑區域。
本發明的橫向流動裝置不同於WO2005/005991的，根據本發明，在此所 述的優選實施方式中，兩個指示劑區域依次前後設置，為的是能夠使得混合場 (Mischfelder)中的兩個細胞群能同時顯現。用於檢測混合場的靈敏度高於此前 檢測混合場的僅有的常規方法，即凝膠技術(DiaMed)。本發明方法的靈敏度能 夠檢出約佔總群1-2%的小細胞群。
該方法和裝置能夠高靈敏度地檢出混合場凝集。這一用途也是出人意料 的，因為本領域技術人員原本會假定第一指示劑區域在分析物-結合細胞與之 結合之後會成為結合至第二指示劑區域的擴散障礙。
所述橫向流動裝置能夠作為一個流動細胞計用於血細胞比容測定，該裝置 具有至少兩個被依次前後設置的指示位置，目的是能夠檢測血液樣品中的紅細 胞濃度。所述的濃度越高，線上越多點給出正信號。該方法可通過設置多條流 動路徑而被擴展為一個2D陣列，例如，每次，5個抗-紅細胞點並列，每條流 動路徑的紅細胞濃度依次遞增或遞減。
橫向流動裝置的使用還能夠平行地測定血型和血細胞比容。


圖1所示為適於實施前述孵育法的裝置的圖解。附圖標記具有下述含義
(l)支持層；(2)多孔膜；(3)吸收區域；(4)密封部件；(5)進樣區域；(6)指示劑區域。
圖2所示為用於檢測混合-場反應的可能的應用模式。 圖3所示為適於檢測混合-場反應的圖2所示應用模式在膜上的可能尺寸。 圖4A和4B所示為藉助本發明所述兩-指示劑區域法進行的混和-場反應檢 領ij。圖4A顯示含有100%A CC D.ee和0% B CC D.EE的血液樣品的檢查結果。圖4B顯示含有98%A CC D.ee和2% B CC D.EE的血液樣品的檢査結果。 圖5所示為藉助於根據本發明的方法進行的血細胞比容值測定。
發明詳述 定義
在本發明中，下述術語應當按照下面闡述的內容理解。
術語"異質性細胞群中的小細胞群"是指相比存在於該異質性細胞群中的一 個或多個其它細胞群以低數量或低濃度存在的細胞群。基於異質性細胞群全 體，小細胞群的濃度在此小於50%，優選小於10%，特別優選小於1%，尤其 是小於0.1%。
術語"異體輸血(homologe transfusion)，，是指必要特徵相容的輸血；這樣輸血 後核査的特徵越多，越可能通過混合場測出進行過輸血。測出的概率可通過選 擇被測特徵來儘可能提高。這種測定可用於認定通過異體輸血進行的非法血液回輸。
術語"自體輸血"是指自捐血液，捐獻者和接受者在所有特徵上相同。 術語"混合場"因為除自體輸血外的輸血不可能做到在所有抗原上的全部
同型，於是在血清學上產生了儲存血液與接受者血液之間存在抗原差異的混合場。
術語"DEL":這是一個表達特別弱的D特徵，小於30抗原/細胞。不能通 過市售血清學方法測出。
術語"血細胞比容"是指總血量中的紅細胞比例[。/。]。下面的平均值為測得
值男性44-52%;女性37-47%。
術語"嵌合體(chimare)"指這樣的有機體，其細胞代表兩個或更多的合子。 橫向流動裝置的準備
從原則上說，在DE10330982A1和WO2005/005986中所述的各種橫向流 動裝置都是合適的。
根據本發明使用的裝置的膜是多孔膜。膜材料優選的示例是硝化纖維(例如 Sartorius 生產的 UniSart ， Millipore ， Whatman 生產白勺 HiFlow ， WhatmanSchleicher—Schuell生產的AE99和FF85/100 )，聚乙烯(Porex公司生產的Lateral Flo)或者尼龍(CUNO生產的Novylon)。膜以具有非常大孔徑的為 佳，因為膜的高多孔性有益於向多孔結構內的滲透，特別是待測樣品中的細胞 成分(例如紅細胞)向多孔結構內的滲透。特別好的是使用吸收性膜。然而，本 發明的裝置並不局限於這些特性。優選各種具有高毛細流動速度(毛細作用速度) 的膜，毛細流動速度是指染料溶液在給定的膜上移行40mm所需的時間。特別 優選的是毛細流動速度<100的膜。
在本發明的一個優選實施方式中，在多孔膜上，沿流動方向，在該裝置的 進樣區域的下遊設置密封部件。使用兩維或三維密封部件，將它們放置於多孔 膜上，用於形成與多孔膜的其餘表面隔開的樣品進樣區域。根據本發明，密封 部件的主要作用是作為液體屏障和使得樣品液體和測試試劑以制導方式分散 到多孔膜內。而且，根據本發明，密封部件將樣品進樣區域封阻隔開，從而防 止不希望發生的液體進入橫向流動裝置的其它區域。
在優選的實施方式中，密封部件是網狀或槽狀和/或漏鬥形狀的。密封部件 由用於製造密封部件的材料切割而成。如果是漏鬥和槽狀，密封部件具有內部 開口，該開口的性狀不限，優選圓型，正方形或矩形，在漏鬥形密封部件中， 該開口向密封部件的底部(膜接觸一側)逐漸收窄。
密封部件的優選材料是不吸水的材料(疏水材料)。在一特定實施方式中， 材料的一面塗有一層膠黏膜，例如壓敏性或自粘性丙烯酸酯膠粘劑。這樣，密 封部件能夠直接粘合到多孔膜的表面。或者，密封部件可連接至例如結合 (verklebt sein)在橫向流動罩殼上(Lateral-Fluss-Gehause)，在這一實施方式中，
橫向流動罩殼將密封部件壓在多孔膜的表面上，從而實現密封部件的功能。
製造二維密封部件的優選材料是各種形式的膠粘帶或膠黏膜(例如 Beiersdorf AG生產的Tesa， Adhesives Research生產的ARcare 7815)。
用於製造三維密封部件的優選材料是具有不同的材料厚度的柔性、閉孔彈 性體材料或柔性矽酮材料(sUikon-matedaUen)，優選厚度為3-5mm(例如Pitzner 生產的閉孔橡膠EPDM140， Castan生產的矽橡膠或密實橡膠(Vollkautschuk)， Castan硬度40°或以下)。
在另一個優選實施方式中，在膜上設置多個連成一體的多個密封部件，多 個密封部件連成的整體具有例如20個單獨的腔體(槽狀)。
由於本發明的這一設計，本發明的裝置能夠接收包含細胞的液體樣品，例如全血，所述細胞不會在處理過程中被濾掉。密閉部件還允許將大量的樣品施 加至多孔膜(進樣區域)而不至於溢出。密封部件因此支持多孔膜的吸收屬性的 功用。密封部件還確保樣品的定向流動。然而，不論有或沒有密封部件，本發 明的裝置都能夠有效工作。
至於本發明裝置的吸收區域(吸收墊)，優選機械性能穩定的材料，優選水
吸收容量為20-30g/100cm2的那些(例如Whatman Schleicher和Schull生產的 WickingPaper， 300型)。本發明裝置的吸收墊和橫向流動膜之間的接觸是通過 下壓併疊合在多孔膜上實現的。吸收墊在膜上的精確定位是通過將吸收墊粘結 (Verkleben)到支持橫向流動膜的支持層(背襯片)上來實現。
在另一個實施方式中，本發明裝置的部件安裝在背襯片或支持層上，目的 在於機械加固。然而，不論有或沒有支持層，本發明裝置都能夠有效運作。優 選這樣的材料機械性能穩定，不吸水，厚度以10(^m或以上為佳，並在一面 或兩面覆蓋有粘結膜(例如壓敏性或自粘性丙烯酸酯膠粘劑，例如， 0.005"Polyester W/GL-187，G & L)。多孔膜和吸收墊被固定在支持層。在採用 雙面膠粘支持層的情形中，第二膠粘面用於將該多層組件固定到其它表面上， 例如固定到橫向流動罩殼內的表明上。
在另一個實施方式中，本發明裝置，有或沒有支持層，在裝配了本發明的 各部件後，被整合到一罩殼內，於是，所述膜部件相互擠壓，所述罩殼支持密 封部件功能。然而，不論有或沒有所述罩殼，本發明的裝置都能良好的發揮其 功能。
孵育法
優選實施方式之一中，本發明方法被用於測定胎母輸血(FMH)，其中，樣 品包含紅細胞，指示劑區域優選包含抗體或抗體混合物。
含細胞的樣品可以是各種樣品。細胞優選血液中的細胞，例如紅細胞，白 血球或血小板。優選細胞是紅細胞的樣品。本發明中，包含紅細胞的樣品可以 選自全血或者血細胞濃縮液。本發明中，血液細胞濃縮液可以是紅細胞沉澱物 的重懸液。
優選使用超過200pl的全血，這顯著超過了橫向流動裝置的常規細胞添加 量。由於進入系統的細胞數量大，通過流式細胞計的小細胞群的總數也增加，由此提高了檢測能力。
稀釋劑原則上可以是現有技術中的各種已知稀釋劑。稀釋劑優選生理鹽
水，稀釋劑l，稀釋劑2(DiaMed),稀釋劑F(Medion Diagnostics)。稀釋劑用於稀 釋細胞，優選用lOOpl至200M1。與以前公開的方法不同，總懸浮液中稀釋劑 的比例以低於使用的全血或紅細胞沉澱物中的稀釋劑的比例為佳，從而形成較 高的細胞濃度和較低的紅細胞流量。
測試的進行包括孵育足夠長的時間段，為的是讓所加的樣品從進樣區域經 過指示劑區域遷移至吸收區域。
該測試可以通過肉眼評定，也可以用自動化方法進行評定。
本發明裝置的指示劑區域被設置於膜上並且包含捕獲或者結合樣品中待 測分析物的結合元素。分析物和結合元素之間的結合反應在指示劑區域檢測。 較好的是，附著於多孔膜上的結合元素是抗體或抗體片斷或[外源]凝集素。較 好的是，指示劑區域在各種情形下含有針對待研究分析物的結合元素。指示劑 區域可以是點狀，線狀和/或楔狀。優選沿流動方向的線狀設計。較好的是，小 細胞群用楔狀設計的指示劑區域檢測，這能夠獲得更高的識別率。
根據另一個優選實施方式，本發明方法被用於測定以低濃度存在於細胞上 的分析物，優選血型DEL，指示劑區域優選包含抗體或抗體混合物。
本發明方法還可以在步驟a)之前包括通過離心血液樣品來預備紅細胞沉 澱物的步驟.，通過菠蘿蛋白酶，木瓜蛋白酶或無花果蛋白酶溶液孵育沉澱物的 步驟以及將經酶處理的沉澱物重懸的步驟(參見AABB技術手冊(Technical Manual),第14版，2003， 693ff)。孵育時間為5分鐘至60分鐘的。所使用的 酶通常是可購得的。酶預處理的優點之一是D抗體更多地曝露出來與紅細胞相 互作用，由此提高了檢測的靈敏度。
本發明方法(不同的孵育方法)中，優選的是，在步驟a)中施加大約lOOpl 至500|al的血液樣品或紅細胞沉澱物重懸液。這顯著超過了通常向橫向流動裝 置施加的顆粒數量及容量。
在本發明的方法中，優選的是，在步驟b)中施加100W至20(^l的稀釋劑。 擴大的液體總量減慢了流速，由此形成分析物在指示劑區域的準-孵育。
如果指示劑區域包含抗-D抗體，則後者以選自RUM-1， LDM-3， ESD1M， TH-28, MS-201, MS-26和LDM-1為佳，這些抗體能夠從Millpore或AlbaBioscoence購得。但是，也可以使用抗體混合物或經親合純化的多克隆抗血清。 兩-指示劑區域法和裝置
以上關於孵育法的說明也適用於兩-指示劑區域法，除了下面特別說明的不 同之處。
在一優選實施方式中，本發明方法被用於測定血細胞比容值，所述指示劑 區域優選包括抗體或抗體混合物，紅細胞結合於指示劑區域的總體模式在步驟 d)中測定。
在本發明方法的另一個優選實施方式中，所述裝置包括至少兩個設置在一 條流動路徑上的指示劑區域，所述指示劑區域包含針對同一細胞結合分析物的 相同結合元素。
本發明的這一實施方式包括超過一個這樣的指示劑區域系列。指示劑區域 可以是點狀，線狀和/或楔狀。優選在流動方向上的線狀設計。有利的是，小細 胞群採用楔狀設計的指示劑區域檢測，這能夠獲得超高的識別率。兩指示劑區 域法能夠在顯示主細胞群之外也顯示小細胞群，小細胞群顯示在針對小細胞群
的指示劑區域內相對靠近進樣區域的位置。特別優選的設置是各種情形下， 一條流動路徑上的兩個指示劑區域中的近端指示劑區域是流動方向上的線狀， 而遠端指示劑區域為點狀。
在一優選實施方式中，膜上有至少兩個流動路徑，所述流動路徑在各種情 形下有至少兩個含不同結合元素的指示劑區域。
在本方法的另一個優選實施方式中，本發明裝置具有至少兩個流動路徑， 所述流動路徑包括至少兩個指示劑區域，結合元素的濃度從相對於進樣區域而 言的近端至遠端遞增或遞減。由此可以定量檢測樣品中的相比總容量的紅細胞 的數量，由此可估算出血細胞比容。
此外，優選這樣的裝置其具有至少兩個流動路徑，所述流動路徑包含至 少兩個指示劑區域，並且，第一條流動路徑上抗體點的濃度不同於第二條流動 路徑中抗體點的濃度。
另一個優選實施方式中，本發明的方法被用於平行地測定混合-場反應中的 多種細胞結合分析物，或者用於檢測異體輸血，其中，所用裝置包含至少兩個 指示劑區域，它們在流動方向上依次前後設置，設置方式使得樣品液體在每一條流動路徑中能夠通過超過一個指示劑區域，所述指示劑區域包含針對不同細 胞結合分析物的結合元素。
較好的是，細胞結合分析物選自血型抗原，例如A， B， AB， D， C， c， E， e， Cw， K， k, Jka和/或Jkb。特別優選的是能夠通過反應對A， B; D+， D-; K， k; C， c和/或E， e測定的血型抗原。
針對分析物的結合元素，如前文在孵育法中所述，優選抗體，抗體片斷， [外源]凝集素，[外源]凝集素片斷，或其它們的混合物。
本發明還提供用於實施上述兩-指示劑區域法的裝置。
實施例
實施例1:混合場反應的測定
測試條的準備每次採用兩種不同抗體為一系列。
測試條由中心進樣區域，兩個指示劑區域和兩個吸收區域構成。將Millpore HiFlow Plus 075型膜被切割成19x75mm(寬/長；y/x)的條狀，用於10-對的設計 方案，將它們粘在支持層(背襯片，例如用G&L的產品)上。採用中心進樣區域 (雙向流動)，用分送器(例如AD3200(Biodot))將不同血型特異性單克隆抗體溶 液按照0.3^x1的線和O.lpl的點以平行排列的形式加到進樣區域兩側的指示劑區 域，每次採用兩種不同的抗體為一系列， 一種呈點狀，另一種呈線形，它們是。
抗一A —克隆Birma-l(Millipore， TL);抗一B-克隆LB-2(Millpore， TN); 抗-D—克隆 LDM3(Alba Bioscience, Z780100);抗一C一克隆MS — 24(Millipore， KN);抗一E—克隆MS — 80 + MS — 258(Millpore， TA);抗一e 克隆MS — 21+MS — 63(Millpore， FFMU, KL + KQ);抗一K—克隆MS — 56， (Millpore， KO);抗一k(Albalone， Alba Bioscience)。抗一RBC(Rabbit IgG Fraction of anti Human RBC,Rockland， 209—4139)。
點狀加樣的抗體位於x二22mm的位置(距離進樣區域的左邊)或者在x= 53mm的位置(距離進樣區域的右邊)，從距離膜上緣3.5mm處開始，各點之間 沿y軸以3mm為間隔。線狀加樣的抗體位於x二25 — 28mm的位置(距離進樣區 域的左邊)或者在x^37 — 50mm的位置(距離進樣區域的右邊)，從距離膜上緣 3.5mm處開始，各線之間沿y軸以3mm為間隔。抗體以15mM PH 7.5含10% (v/V)甲醇的鉀磷酸鹽緩衝液如下稀釋抗一A抗體1: 3，抗一B抗體h 2，抗一AB抗體1: 4，抗一D抗體1: 4，抗一RBC抗體1: 3。其它抗體溶液 都不預先稀釋，而是與甲醇混合至10%(V/V)。
在分注抗體之後，膜在40。C中乾燥20分鐘，然後儲存在恆溼環境中直至 進行測試。將一個19x20mm的吸收墊(Whatman Schleicher &Schiil, 300)粘貼 至遠離進樣區域的兩端，與膜交疊3mm。在y二32.5—37.5mm處粘貼槽形密封 部件(Pitzner生產的閉孔橡膠EPDM140)，由此將進樣區域在膜的整個寬度上與 其餘膜隔開。
近段(線)遠端(點)
在進樣區域的左邊
抗一A —抗一B
抗一B —抗一A
抗一D —抗一RBC
抗一RBC —抗一D
抗一K —抗一k
在進樣區域的右邊
抗一c —抗一c
抗一c —抗一c
抗一E —抗一c
抗一e —抗一E
抗一k —抗一K
圖2和3圖示適用於檢測混合-場反應的橫向流動裝置設計。合適的尺寸能 夠在圖3中找到，但是這些應理解為僅僅是舉例。
全血測試混合
5(^1的抗凝全血或新鮮採集自然血液(Nativblut)與200W稀釋劑F(Medion Diagnostics)混合。將100^1的所得懸浮液加至進樣區域。當進樣區域"走盡 (trockengelaufen ist)"，施加300^1稀釋劑F。
紅細胞沉澱物測試混合50pl紅細胞沉澱物(抗凝全血以1500rpm離心5分鐘；紅細胞沉澱物位於 下部紅色相)與400^1稀釋劑F混合。將100^1所得懸浮液施加至進樣區域。當 進樣區域"走盡"時，施加300(il稀釋劑F。
結果可在大約5分鐘後讀出，顯示為微紅色楔形("半月"一小細胞群)直至 深紅色帶或深紅色點(主細胞群)。
圖4A和4B圖示藉助本發明兩一指示劑區域法進行的混合一場反應檢測。 圖4A顯示含100^AccD.ee和0% B CC D.EE.的血液樣品的檢查結果。圖4B 顯示含98%A cc D.ee和2% B CC D.EE.的血液樣品的檢查結果。
圖4B顯示，在主細胞群之上，檢測到了小細胞群，呈淺楔形(半月)
實施例2:異體輸血(血液回輸) 測試條比照實施例1的方式準備。
近段(線) 遠端(點)
抗一D — 抗一RBC
抗一RBC — 抗—D
抗一K — 抗一k
抗一k — 抗一K
抗一C — 抗一c
抗一E — 抗一e
抗一e — 抗一E
抗一Jka — 抗一Jkb
抗一Jkb — 抗一Jka
抗一Cw — 抗一RBC
抗一RBC — 抗一Cw
全血測試混合
50^1的抗凝血劑全血或新鮮釆集的自然血液與200^x1稀釋劑F混合。將 100jal所得懸浮液加至進樣區域。當進樣區域"走盡"時，加30(Hil稀釋劑F。
紅細胞沉澱物測試混合50|al紅細胞沉澱物與400|_d稀釋劑F混合。將100^1所得懸浮液加至進樣 區域。當進樣區域"走盡"時，加300^1稀釋劑F。
結果可在大約5分鐘後讀出，顯示為微紅色楔形("半月"一小細胞群)直至 深紅色帶或深紅色點(主細胞群)。
實施例3:胎母輸血檢測(FMH)
測試條以比照實施例1的方式準備，僅加抗一D。優選施加單獨的各抗體 而不是抗體混合物。優選抗體RUM-l(Millpore); LDM-3(Alba Bioscience); 或者ESDlM(AlbaBioscience); TH-28; MS-201; MS隱26(Millpore); LDM-l(Alba Bioscience) o
測試混合a):
400W的抗凝全血或新鮮採集的自然血液與lOOpl稀釋劑F混合。將300^1 所得懸浮液加至進樣區域。當進樣區域"走盡"時，加400nl稀釋劑F。
結果可在大約20分鐘後讀出，顯示為微紅色楔形("半月"一小細胞群)直至 深紅色帶或深紅色點(主細胞群)。
測試混合b):類似於a)，但是血液經過Bromdase預處理。 3ml的抗凝全血或新鮮採集的自然血液以1500rpm離心3分鐘。此後，將 600^1的細胞沉澱物轉移至另一個容器中與600^1購得的菠蘿蛋白酶溶液(例如 來自Medion Diagnostics的Bromelase)混合，在37。C下孵育15分鐘。然後用 0.9X的NaCl清洗3次。
為進行實際測試，以這種方式經菠蘿蛋白酶處理並經清洗的100pl紅細胞 沉澱物與200)id AB —血漿和200(J稀釋劑F(Medion Diagnostics)混合。將300|al
所得懸浮液加至進樣區域。當進樣區域"走盡"，加45(^1稀釋劑F。
結果可在大約15分鐘後讀出，顯示為微紅色楔形(小細胞群)直至深紅色帶 (主細胞群)。
實施例4:以極低的抗原密度存在的紅細胞特徵的檢測DEL測試條以與實施例3中相似的方式準備
優選施加單個的各抗體而不是混合物。優選抗體RUM-l(Millpore); LDM-3(Alba Bioscience)。
測試混合a):
400|il的抗凝全血或新鮮採集的自然血液與lOOpl稀釋劑F混合。將300(il 所得懸浮液被加至進樣區域。當進樣區域"走盡"時，加400nl稀釋劑F。
結果可在大約20分鐘後讀出，顯示為微紅色楔形(小細胞群)直至深紅色帶 (主細胞群)來指示
測試混合b):類似於a)，但是血液經過Bromelase預處理。 3ml的抗凝全血或新鮮採集的自然血液以1500rpm離心3分鐘。然後，將 600^1的細胞沉澱物轉移至另一個容器中與600^1購得的菠蘿蛋白酶混合(例如 來自Medion Diagnostics的Bromelase)，在37。C下孵育15分鐘。然後用0.9% 的NaCl清洗3次。
為了進行實際測試，以這種方式經菠蘿蛋白酶處理並清洗的lOO(il紅細胞 沉澱物與200pl AB —血漿和200)ul稀釋劑F(Medion Diagnostics)混合。將300^1 所得懸浮液被加至進樣區域。當進樣區域"走盡"，加45(^1稀釋劑F。
結果可在大約15分鐘後讀出，顯示為微紅色楔形(小細胞群)直至深紅色帶 (主細胞群)。
實施例5:血細胞比容
測試條的準備如實施例1 ，每種情形下系列應用至少2(優選5)等份(Aliqote) 的相同抗體(抗一RBC)。變化l:抗體濃度從近端至遠端遞減；變化2:每種情 況下有2(5)個抗體點的多條流動路徑，抗體濃度按流動路徑排列遞減；變化3: 變化1和變化2的結合；變化4:近端抗體加樣成線形，其後為多個點。
變化2的應用舉例
流動路徑1抗一RBC抗一RBC抗一RBC 抗一RBC 抗一RBC(c = "1.0")
流動路徑1抗一RBC抗—RBC抗一RBC 抗—RBC 抗—RBC(c ="0.8")
流動路徑1抗一RBC抗一RBC抗一RBC 抗—RBC 抗—RBC(c = "0.6")
流動路徑1抗一RBC抗一RBC抗一RBC 抗一RBC 抗一RBC(c二 "0.4")
流動路徑1抗一RBC抗一RBC抗一RBC 抗—RBC 抗一RBC(c二 "0.2")
全血測試混合
5(^1的抗凝全血或新鮮採集自然血液與200|_il稀釋劑F混合。將100^1所 得懸浮液加至進樣區域。當進樣區域"走盡"，加30C^1稀釋劑F。 結果可在大約5分鐘後讀出(cf.圖5)。
紅細胞沉澱物測試混合
5(^1的紅細胞沉澱物與400|il稀釋劑F混合。將lOOpl所得懸浮液加至進 樣區域。當進樣區域"走盡"，加300(il稀釋劑F。 結果可在大約5分鐘後讀出(cf.圖5)。
權利要求
1.一種用於測定液體樣品中的一種或多種細胞結合分析物的方法，所述方法使用包括以下部件的裝置進行-至少一個用於施加液體樣品的進樣區域(5)，-適於細胞成分透過的多孔膜(2)，所述膜上具有至少一個指示劑區域，所述指示劑區域能夠與細胞結合分析物相互作用並且包含至少一個針對細胞結合分析物的結合元素，以及-至少一個位於膜上的吸收區域(3)，在液體通過指示劑區域後吸收液體，其中，所述至少一個指示劑區域位於進樣區域(5)和吸收區域(3)之間，所述方法用於在例如母嬰輸血或嵌合體等情形中濃縮和定量測定異質性細胞群中的小細胞群，用於檢測以低濃度存在於細胞上的分析物，用於測定血細胞比容值和/或用於測定混合-場反應中的細胞結合分析物。
2. 根據權利要求1所述的方法，包括以下步驟a) 將包含細胞的樣品加至進樣區域；b) 施加稀釋劑； C)進行測試；d)通過測定細胞是否結合於指示劑區域來評定測試。
3. 根據權利要求2所述的方法，所述方法用於測定胎母輸血(FMH)，其中， 樣品包含紅細胞，指示劑區域以包含抗體或抗體混合物為佳。
4. 根據權利要求2所述的方法，所述方法用於測定以低濃度存在於細胞 上的分析物，優選弱D血型，特別是DEL，其中指示劑區域以包含抗體或抗 體混合物為佳。
5. 根據權利要求1一4中任一項所述的方法，進一步包括，在步驟a)之前， 通過離心血液樣品製備紅細胞沉澱物；用菠蘿蛋白酶，木瓜蛋白酶或無花果蛋 白酶孵育沉澱物和重懸經酶處理的沉澱物。
6. 根據權利要求2 — 5中任一項所述的方法，在步驟a)中加大約100(il至 500|al的血液樣品或重懸的紅細胞沉澱物。
7. 根據權利要求2 — 6中任一項所述的方法，其中，步驟b)中加大約lOO)il 至200^1的稀釋劑。
8. 根據權利要求2 — 6中任一項所述的方法，其中，抗一D抗體選自RUM-1 ， LDM-3, ESD1M， TH-28， MS匿201， MS — 26和LDM-1。
9. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述裝置包括至少兩個在流動方 向上依次前後設置的指示劑區域，設置的方式使得樣品液體在每一條流動路徑 上通過超過一個指示劑區域，其中，指示劑區域包含針對細胞結合分析物的結合元素，並且所述方法包括a) 將包含紅細胞的血液樣品加至進樣區域；b) 將稀釋劑加至進樣區域； C) 進行測試；d) 通過測定紅細胞是否結合於指示劑區域來評定測試； 其中，所述方法用於在胎母輸血(FMH)情形中平行測定多種細胞結合分析 物，用於混合場反應中的測定，用於檢測異體輸血或者用於測定血細胞比容值。
10. 根據權利要求9所述的方法，所述方法用於測定血細胞比容值，其中， 所述指示劑區域以包括抗體或抗體混合物為佳，在步驟d)中測定紅細胞與指示劑區域的整體結合模式。
11. 根據權利要求10所述的方法，所述裝置包括至少兩個設置在單條流動路徑中的指示劑區域，所述指示劑區域包含針對相同細胞結合分析物的相同 結合元素。
12. 根據權利要求10或11所述的方法，所述裝置具有至少兩條流動路徑， 所述流動路徑包含至少兩個指示劑區域，並且結合元素的濃度從相對於進樣區 域的近端至遠端遞增或遞減。
13. 根據權利要求10至12中任一項所述的方法，所述裝置具有至少兩條 流動路徑，所述流動路徑包含至少兩個指示劑區域，並且， 一條流動路徑中抗 體的濃度不同於另 一 條流動路徑中抗體的濃度。
14. 根據權利要求9所述的方法，所述方法用於在混合一場反應中平行測 定多種細胞結合分析物，或者用於檢測異體輸血，所述裝置包括至少兩個在流 動方向上依次前後設置的指示劑區域，設置的方式使得樣品液體在每一條流動 路徑中通過超過一個指示劑區域，所述指示劑區域包含針對細胞結合分析物的 結合元素。
15. 根據權利要求1至14中任一項所述的方法，所述細胞結合分析物選自血型抗原，所述血型抗原例如A， B， AB， D， C， c， E， e， Cw， K， k， Jka禾口/或Jkb。
16. 根據權利要求15所述的方法，其中，用反應對A， B; D+， D—； K， k; C， c禾口/或E， e來測定血型抗原。
17. 根據權利要求1至16中任一項所述的方法，其中，針對分析物的結 合元素選自抗體，抗體片段，[外源]凝集素，[外源]凝集素片段，或它們的混合 物。
18. 根據權利要求1至17中任一項所述的方法，其中， 一張或多張膜(2) 以聚乙烯，硝化纖維或尼龍構成的為佳。
19. 根據權利要求1至18中任一項所述的方法，其中，膜(2)上設置至少 一個位於進樣區域(5)下遊和指示劑區域上遊的密封部件(4)。
20. 根據權利要求1至19中任一項所述的方法，所述裝置的部件安裝於 支持層(l)上以進行機械加固。
21. 根據權利要求1至20中任一項所述的方法，所述裝置的部件整合在 一個罩殼內。
22. 以下定義的裝置用於測定胎母輸血或嵌合體，用於測定以低濃度存在 於細胞上的分析物，用於測定血細胞比容值和/或用於在液體樣品中在混合一場 反應中平行測定多種細胞結合分析物的用途，所述裝置包括一至少一個用於施加液體樣品的進樣區域(5)，一適於細胞成分透過的多孔膜(2)，所述膜上具有至少一個指示劑區域， 所述指示劑區域能夠與細胞結合分析物相互作用並且包含至少一個針對細胞 結合分析物的結合元素，以及一至少一個位於膜上的吸收區域(3)，在液體通過指示劑區域後吸收液體， 其中，所述指示劑區域位於進樣區域(5)和吸收區域(3)之間。
23. 根據權利要求22所述的用途，所述裝置被用於測定FMH。
24. 根據權利要求22所述的用途，所述裝置被用於測定以低濃度存在於 細胞上的分析物。
25. 根據權利要求24所述的用途，所述分析物是弱D血型，特別是DEL。
26. 根據權利要求22所述的用途，所述裝置被用於測定血細胞比容值。
27. 用於直接測定液體樣品中的細胞結合分析物的裝置，包括一用於施加液體樣品的進樣區域(5)，一適於細胞成分透過的多孔膜，所述膜上具有至少兩個指示劑區域，所述 指示劑區域能夠與細胞結合分析物相互作用並且包含針對細胞結合分析物的 結合元素，以及一至少一個吸收區域(3)，在液體通過指示劑區域後吸收液體，所述指示劑區域位於進樣區域(5)和吸收區域(3)之間。 其中，所述至少兩個指示劑區域前後依次設置在流動方向上，設置的方式 使得樣品液體在每一條流動路徑中通過超過一個指示劑區域。
28. 根據權利要求27所述的裝置，所述細胞結合分析物選自血型抗原， 所述血型抗原例如A， B， AB， C， c， E， e， Cw， K， k， Jka和/或Jkb。
29. 根據權利要求28所述的裝置，其中，用反應對A， B; D+， D—； K， k; C， c和/或E， e來測定血型抗原。
30. 根據權利要求29所述的裝置，所述膜包括至少兩條流動路徑，所述 流動路徑在每種情形下有至少兩個含不同結合元素的指示劑區域。
31. 根據權利要求28至30中任一項所述的裝置，其中指示劑區域是點狀，線狀和/或楔狀的。
全文摘要
本發明涉及測定液體樣品中的一種或多種細胞結合分析物的方法，實施所述方法使用的裝置包括至少一個用於施加液體樣品的進樣區域(5)；適於使得細胞組分滲透的多孔膜(2)，膜上具有至少一個指示劑區域，所述指示劑區域能夠與細胞結合分析物反應並且包含至少一種針對細胞結合分析物的粘結劑；至少一個位於膜上的吸收區域(3)，在液體通過指示劑區域後吸收液體。所述至少一個指示劑區域位於進樣區域(5)和吸收區域(3)之間。本方法用於濃縮和定量測定異質性細胞群中的小細胞群，例如在胎母輸血或嵌合體等情形中，檢測以低濃度存在於細胞上的分析物，測定血細胞比容值，和/或在混合—場反應中平行測定多種細胞結合分析物。
文檔編號G01N33/558GK101606065SQ200780048573
公開日2009年12月16日 申請日期2007年12月14日 優先權日2006年12月29日
發明者I·阿比斯西爾, P·施溫特 申請人:麥迪奧診斷產品股份公司