用於免疫測定方法的綴合物的製作方法

2023-12-06 13:18:46

用於免疫測定方法的綴合物的製作方法
【專利摘要】通過在涉及使用其上固定有抗體或抗原的膠態金屬的免疫測定方法中的簡單程序來根據待檢測的對象調節檢測靈敏度和擴大測量範圍。利用兩種組分，即生物來源的組分和非生物來源的組分對其上固定有抗體或抗原的膠態金屬粒子的表面進行封閉處理能夠利用例如所述兩種組分的種類和濃度來調節測量靈敏度，並且能夠使用所述非生物來源的組分，所述非生物來源的組分由於膠態金屬的聚集還不是單獨可用的。
【專利說明】用於免疫測定方法的綴合物
【技術領域】
[0001]本發明涉及用於免疫測定方法如免疫層析法(下文中有時簡稱為1C)的綴合物(conjugate)，所述綴合物包含用抗體或抗原敏化的膠態金屬。更具體地，本發明涉及用非生物來源的組分和生物來源的組分封閉的綴合物。本發明還涉及各自使用所述綴合物的1C檢測方法和用於免疫層析法的測試條，以及用於所述綴合物的製備方法。
【背景技術】
[0002]用於免疫測定方法的充當綴合物(如標記的抗體)的組分的標記的一個實例是膠態金粒子(下文中有時簡稱為膠態金)，並且由所述膠態金粒子所致的顯色使得能夠確認測量結果。此外，基於顯色的程度，還有可能定量檢測樣品中的待檢測物質。
[0003]當將膠態金用作充當標記抗體的組分的標記時，膠態金的表面具有易於非特異性地吸附來源於樣品的蛋白質和其他物質以及有意結合的抗體的性質。為了抑制這樣的非特異性吸附，通常進行封閉處理，所述封閉處理涉及用含有牛血清清蛋白(BSA)、酪蛋白等作為活性組分的生物來源的封閉劑(下文中有時簡稱為生物來源的封閉劑)來塗覆膠態金沒有被抗體結合的表面部分。含有非生物來源的組分作為活性組分的封閉劑(下文中有時簡稱為非生物來源的封閉劑)也可商購獲得。然而，當本發明的發明人簡單地用非生物來源的封閉劑替代生物來源的封閉劑和單獨使用前者時，在封閉處理後綴合物自身發生聚集，並且因此不能夠被再混懸，或者非生物來源的封閉劑趨於自然地聚集，並且因此例如其作為試劑的穩定性受損。因此，本發明的發明人未能夠發現任何商購獲得的非生物來源的封閉劑能夠投入到實際應用中。
[0004]另一方面，在使用標記的抗體的定量免疫測定中，當待檢測物質是多價抗原時，產生以下問題。由於抗原經由所述標記的抗體的相繼交聯，測量信號隨著抗原濃度的增加而快速增加，並且因此在抗原濃度高的範圍內觀察不到取決於待檢測物質的濃度的靈敏度的差異，這導致不能進行精確的定量。在此情況中，進行稀釋樣品的操作不是優選的，因為測量誤差變得易於發生並且增加用於稀釋操作的步驟使得該方法變得複雜。首先，預測哪個樣品具有高的抗原濃度本身就不實際。
[0005]作為用於擴大其中待檢測物質可以被測量的濃度範圍的技術，例如，提供了描述在專利文獻1中的技術。在專利文獻1中，公開了這樣的技術，所述技術涉及在用於免疫層析法的、包含通過在膠態金上固定抗體獲得的標記抗體的測試條中，使用至少兩種類型的具有不同粒度分布的膠態金粒子組的混合物作為綴合物。然而，由於所需的時間和成本，製備多種具有取決於待檢測物質和目的的不同粒度分布的膠態金的混合物是不實際的。相關技術文獻
[0006]專利文獻
[0007]專利文獻1:JP2010_32396A
【發明內容】
[0008]發明要解決的問題
[0009]為了解決相關技術的問題，本發明要實現的一個目的是:在使用其上固定有抗體或抗原的膠態金屬進行免疫測定的情況中，通過簡單的方法，根據待檢測的對象調節檢測靈敏度和擴大測量範圍，同時抑制在封閉處理後綴合物之間的聚集。另一個目的是在實現上述目的的同時防止雜質等在膠態金屬表面的非特異性吸附。
[0010]解決問題的方式
[0011]本發明的發明人進行了廣泛的研究以實現這樣的目的，並且作為結果，已發現在其上固定有抗體的膠態金屬粒子的表面的封閉中，組合地使用非生物來源的組分和生物來源的組分能夠調節測量靈敏度和/或擴大測量範圍。因此，本發明的發明人完成了本發明。即，儘管迄今由於當單獨使用非生物來源的組分作為封閉劑時膠態金屬發生聚集，還不可能使用非生物來源的組分作為封閉劑，本發明的發明人已首次發現其與生物來源的組分的組合使用不僅能夠用作封閉劑而且還展現出新的效果，即，調節檢測靈敏度和/或擴大測量範圍。
[0012]具體地，本發明具有以下構成。
[0013]〈1> 一種綴合物，所述綴合物包含具有用抗體或抗原敏化的表面的膠態金屬，其中所述膠態金屬的表面用非生物來源的組分和生物來源的組分封閉。
[0014]根據構成〈1>所述的綴合物，其中所述生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:BSA;酪蛋白；絲膠蛋白(sericin);對應於作為大腸桿菌來源的熱休克蛋白(HSP)的DnaK的胺基酸序列的胺基酸419至607的多肽；NE0 PROTEIN SAVER ；StartingBlock?(PBS)封閉緩衝液；和 Stabil Coat。
[0015]根據構成〈1>或〈2>所述的綴合物，其中所述非生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:甲基丙烯酸聚氧化烯酯(methacrylic acidpolyoxyalkylene ester) ；NB4025 ；SN100 ；Stabil Guard ;和 Protein-Free 封閉緩衝液(無蛋白封閉緩衝液)。
[0016]根據構成〈1>至〈3>中任一項所述的綴合物，其中甲基丙烯酸聚氧化烯酯包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:聚氧乙烯單甲基丙烯酸酯(polyoxyethylenemonomethacrylate);聚氧乙烯聚四氫呋喃單甲基丙烯酸酯(polyoxyethylenepolyoxytetramethylene monomethacrylate);聚氧乙烯聚氧丙烯單甲基丙烯酸酯(polyoxyethylene polyoxypropylene monomethacrylate);和辛基聚氧乙烯聚氧丙烯單甲基丙稀酸酉旨(octylpolyoxyethylene polyoxypropylene monomethacrylate)。
[0017]根據構成〈1>至〈4>中任一項所述的綴合物，其中所述膠態金屬是膠態鉬或膠態金。
[0018]〈6>—種用於樣品中的待檢測物質的檢測方法，所述檢測方法包括使所述樣品與包含具有用抗體或抗原敏化的表面的膠態金屬的綴合物接觸，所述膠態金屬的表面用非生物來源的組分和生物來源的組分封閉。
[0019]〈7>根據構成〈6>所述的檢測方法，其中所述綴合物被攜帶(保持，carry)在用於免疫層析法的測試條上。
[0020]根據構成〈6>或〈7>所述的檢測方法，其中所述生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:BSA ;酪蛋白；絲膠蛋白；對應於作為大腸桿菌來源的熱休克蛋白(HSP)的DnaK的胺基酸序列的胺基酸419至607的多肽；NEO PROTEIN SAVER ；StartingBlock?(PBS)封閉緩衝液；和 Stabil Coat。
[0021]根據構成〈6>至〈8>中任一項所述的檢測方法，其中所述非生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:甲基丙烯酸聚氧化烯酯；NB4025 ；SN100 ；Stabil Guard ;和 Protein-Free 封閉緩衝液。
[0022]根據構成〈6>至〈9>中任一項所述的檢測方法，其中甲基丙烯酸聚氧化烯酯包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:聚氧乙烯單甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚四氫呋喃單甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚氧丙烯單甲基丙烯酸酯；和辛基聚氧乙烯聚氧丙烯單甲基丙烯酸酯。
[0023]〈11>根據構成〈6>至〈10>中任一項所述的檢測方法，其中所述待檢測物質包括多價抗原。
[0024]根據構成〈11>所述的檢測方法，其中所述待檢測物質包括D- 二聚體。
[0025]〈13>根據構成〈6>至〈12>中任一項所述的檢測方法，其中所述膠態金屬是膠態鉬或膠態金。
[0026]〈14> 一種用於免疫層析法的測試條，其包括以下組分(組件，component):
[0027](1)綴合物墊(conjugate pad),所述綴合物墊攜帶綴合物,所述綴合物包含具有用第一抗體或抗原敏化的表面的膠態金屬，所述膠態金屬的表面用非生物來源的組分和生物來源的組分封閉；和
[0028](2)不溶性膜(insoluble membrane),所述不溶性膜包含與所述綴合物和待檢測物質的複合物結合的第二抗體，所述不溶性膜被設置在作為組分(1)的所述綴合物墊的下遊。
[0029]根據構成〈14>所述的測試條，其中所述膠態金屬是膠態鉬或膠態金。
[0030]檢測設備，其包括:根據構成〈14>或〈15>所述的用於免疫層析法的測試條；和外殼(housing)。
[0031]〈17> —種用於包含用抗體或抗原敏化的膠態金屬的綴合物的製備方法，所述製備方法包括以下步驟:
[0032](a)用抗體或抗原敏化膠態金屬以提供綴合物的步驟；
[0033](b)通過使所述綴合物與非生物來源的組分和生物來源的組分接觸，從而對所述膠態金屬的表面進行封閉處理的步驟；和
[0034](c)通過離心對經過所述封閉處理的所述綴合物進行濃縮的步驟。
[0035]根據構成<17〉所述的綴合物的製備方法，其中所述生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:BSA;酪蛋白；絲膠蛋白；對應於作為大腸桿菌來源的熱休克蛋白(HSP)的DnaK的胺基酸序列的胺基酸419至607的多肽；ΝΕ0 PROTEINSAVER ；StartingBlock?(PBS)封閉緩衝液；和 Stabil Coat。
[0036]根據構成所述的綴合物的製備方法，其中所述非生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:甲基丙烯酸聚氧化烯酯；NB4025 ；SN100 ；Stabil Guard ;和 Protein-Free 封閉緩衝液。
[0037]根據構成<17〉所述的製備方法，其中所述步驟(b)包括以下步驟:通過使所述綴合物與所述非生物來源的組分接觸，然後使所述綴合物與所述生物來源的組分接觸，從而對所述膠態金屬的表面進行所述封閉處理。
[0038]根據構成中任一項所述的製備方法，其中所述膠態金屬是膠態鉬或膠態金。
[0039]發明效果
[0040]在涉及使用包含在其上固定有抗體或抗原的膠態金屬的綴合物的免疫測定方法中，儘管迄今將非生物來源的封閉劑單獨用於封閉已引起膠態金屬粒子之間的聚集，並且所得物不能用作綴合物，而通過用生物來源的組分和非生物來源的組分封閉膠態金屬粒子的表面能夠實現用作所述綴合物。此外，用生物來源的組分和非生物來源的組分兩者來封閉膠態金屬粒子的表面使得能夠根據待檢測對象來調節靈敏度或擴大測量範圍。此外，用生物來源的組分和非生物來源的組分兩者來封閉膠態金屬粒子的表面能夠使用於濃度校準的參比物質和樣品中的待檢測物質的反應行為彼此相同，以及能夠改善定量和與參比測量方法的相關性。
[0041]根據上述效果的實現，例如，可以通用地設計測試條以致適於檢測器的檢測性能，並且有利於利用一個樣品和一個測試條同時檢測處於不同濃度區的兩種以上待檢測物質。此外，可以通過比以往更簡單的操作製備所需的綴合物，這導致良好的經濟效率。本發明還可以滿足即時(point-of-care) (P0C)檢驗領域中的多種需要。
[0042]附圖簡述
[0043]圖1是本發明的測試條的示意結構圖。
[0044]圖2是曲線圖，其顯示在利用根據本發明的各種製劑和單獨的BSA製劑封閉膠態金的情況中取決於抗原濃度的測量靈敏度的比較。
[0045]圖3是曲線圖，其顯示在利用根據本發明的各種製劑和單獨的BPF製劑封閉膠態金的情況中取決於抗原濃度的測量靈敏度的比較。
[0046]圖4是曲線圖，其顯示對封閉劑添加次序的研究的結果。
[0047]圖5是曲線圖，其顯示對不同封閉劑的可用濃度範圍的研究的結果。
【具體實施方式】
[0048](綴合物)
[0049]本發明的綴合物包含用(已固定在其上)特異性結合樣品中的待檢測物質的物質如抗體或抗原敏化的膠態金屬，所述綴合物的特徵在於所述膠態金屬的表面用非生物來源的組分和生物來源的組分封閉。
[0050]本發明的綴合物可以用於基於固定在粒子表面上的抗體或抗原和樣品中的待檢測物質之間的抗原-抗體反應的測量方法，如1C法或比濁免疫測定法(TIA法)。在以下描述中，以其中抗體被固定在膜上的1C法為例。本領域技術人員可以容易地理解，當待檢測物質是抗體時，其足以將能夠捕獲該抗體的物質(針對充當待測對象的抗體的抗原或抗體)固定在膠態金屬或不溶性膜上。在以下描述中，以其中特異性結合樣品中的待測物質的物質是抗體或抗原的情形為例。
[0051](膠態金屬)
[0052]用於本發明的膠態金屬可以是任何膠態金屬，只要該膠態金屬可以通過用抗體或抗原敏化來構建綴合物，並且可以通過與樣品接觸而在用於樣品中的待檢測物質(抗原或抗體)的檢測方法中起作為標記的作用。
[0053]所述膠態金屬可以是，例如，膠態金，膠態鉬，膠態銀，膠態鈕，膠態銅，膠態鎳，膠態銦，或它們的複合膠體。這之中，膠態金或膠態鉬是合適的。此外，當在本文中提及時，膠態金屬還涵蓋具有用金屬加工過的表面的細粒子，如其中非金屬粒子如乳膠粒子或二氧化娃粒子充當核心粒子而其表面塗覆有金的細粒子。
[0054]下文中，通過以膠態金作為膠態金屬的典型實例來描述本發明。已知膠態金的粒徑極大地影響檢測靈敏度。例如，當綴合物通過被攜帶在用於免疫層析法的測試條上使用時，膠態金的粒徑優選為20至60nm,更優選為30至50nm,尤其優選為30nm。膠態金可以通過通常已知的方法製備，所述方法涉及例如在攪拌下向四氯金(III)酸的加熱的水溶液中逐滴加入檸檬酸三鈉的水溶液或檸檬酸三銨的水溶液。膠態金在本文中有時被稱為膠態金粒子，並且這些術語具有相同的含義。
[0055](抗體或抗原在膠態金上的固定)
[0056]針對待測對象的抗體或抗原在膠態金上的固定通常通過在由所述膠態金與所述抗體或抗原混合所獲得的溶液中的物理吸附進行。當作為實例描述抗體的固定時，抗體的濃度優選被調節至1 μ g/mL至5 μ g/mL,並且緩衝液及其pH優選為10mmol/L磷酸鹽緩衝液(pH6 至 7)或 10mmol/LTris-HCl 緩衝液(pH7 至 9)，更優選為 10mmol/L Tris-HCl 緩衝液(pH7.5)，但是不限於此，包括使用其他緩衝液。本文中，不僅是如上所述的其上固定有針對待測對象的抗體或抗原的膠態金，而且在其上固定有對照抗體的膠態金也被稱為"綴合物"。
[0057](封閉)
[0058]本發明的綴合物的特徵在於膠態金表面中沒有結合抗體的區域用非生物來源的組分和生物來源的組分封閉。
[0059]迄今，對於膠態金的封閉，通常單獨使用生物來源的蛋白質如BSA、酪蛋白或明膠，並且非生物來源的封閉劑如用於其他載體如乳膠粒子的非生物來源的封閉劑還未被用於膠態金。這是因為將非生物來源的封閉劑用於封閉膠態金可能導致膠態金的非特異性聚集。在這樣的情況下，本發明的發明人使用非生物來源的組分和生物來源的組分作為用於膠態金的封閉劑，以利用非生物來源的組分和生物來源的組分封閉膠態金的表面，並且因此成功地調節了檢測靈敏度並擴大了測量範圍。
[0060]S卩，根據待測對象的所需測量可以通過以下方式來進行:預先研究用於每個待測對象的非生物來源的組分和生物來源的組分的每種組合的測量靈敏度和測量範圍，並且根據目的選擇組合。
[0061]應當注意的是，在本文中，"調節檢測靈敏度"是指:與通過一般技術在特定測量系統中測量具有特定濃度的待測物質的情況相比，增大或減小測量值。此外，"擴大測量範圍"是指:與常規方法相比，在低濃度或高濃度區中以濃度依賴性方式擴大其中可以測量樣品中的待測物質的範圍。
[0062]不希望受制於任何具體理論，可想到的是，在吸附到膠態金屬的表面上方面，生物來源的組分和非生物來源的組分具有不同的趨勢，並且因此處於這樣的關係使得兩種組分相互填補空白。此外，還預期，吸附在表面上的兩種組分控制例如固定在金屬表面上的抗體和各種非特異性吸附的物質之間的三維關係。據估計，這些機制中的一個或多個起作用使得能夠根據相應組分的組合調節檢測靈敏度和擴大測量範圍。
[0063](非生物來源的組分)
[0064]用於本發明的封閉的非生物來源的組分可以是任何組分，只要該組分不來源於有機體並且具有封閉作用。其實例是甲基丙烯酸聚氧化烯酯。其具體實例包括:合成的聚合物如聚氧乙烯單甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚四氫呋喃單甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚氧丙烯單甲基丙烯酸酯；和辛基聚氧乙烯聚氧丙烯單甲基丙烯酸酯。其更具體的實例包括可商購獲得的封閉劑如N101 (含有聚氧乙烯聚四氫呋喃單甲基丙烯酸酯作為主要組分)；N102(含有聚氧乙烯聚氧丙烯單甲基丙烯酸酯作為主要組分)；SN100(都是由NOF CORPORATION生產)；NB4025 (由 COSMO BIO C0.，LTD.生產)；Stabil Guard (由 SurModics Inc.生產)；和 Protein-Free 封閉緩衝液(由 Thermo Fisher Scientific Inc.生產)。這之中，ΝΙΟΙ、Ν102和ΝΒ4025是優選的。
[0065]除了以上實例以外，可以用於本發明的非生物來源的封閉劑可以通過在後面描述的試驗例1和試驗例2中所述的試驗方法進行選擇。
[0066]使用的非生物來源的組分的濃度僅需要根據要使用的組分來適當地確定。例如，封閉可以通過以下方式進行:在調節至10D/mL的膠態金溶液中添加和混合抗體溶液，然後向該混合溶液中加入上述商購獲得的產品以具有0.1至15%的終濃度(當未稀釋的封閉劑被定義為100%時)。此外，該終濃度的下限不限於0.1%，以致可以選擇任何濃度如0.2、0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9或1 %作為終濃度的下限。此外，該終濃度的上限不限於15%,以致可以選擇任何濃度如14、13、12、11或10%作為終濃度的上限。此外，它們的組合例如是上述上限和下限的任意組合，如0.2至14,0.3 Μ 13、0.4至12、0.5至11、0.6至10,0.7至9、0.8至8、0.9至7或1至6%。這之中，可以優選使用0.5至10%的終濃度。
[0067]非生物來源的組分可以通過化學合成獲得，並且可以通過根據其結構的合適量化方法進行量化，如在甲基丙烯酸聚氧化烯酯的情況中通過滴定來源於甲基丙烯酸的羧基的量化，通過NMR對乙烯基的量化，或基於通過MS或GPC的分子量測量的量化。
[0068](生物來源的組分)
[0069]用於本發明的封閉的生物來源的組分可以是任何組分，只要該組分來源於有機體並且具有封閉作用。其實例包括:動物或植物蛋白質；和來源於動物或植物蛋白質的肽。其具體實例包括:BSA,其表示牛血清白蛋白；酪蛋白；Blocking Peptide Fragment (封閉肽片段，BPF:由Τ0Υ0Β0生產)，其是對應於DnaK的胺基酸序列的胺基酸419至607的多肽，DnaK是大腸桿菌(Escherichia coli)來源的熱休克蛋白(HSP);絲蛋白來源的ΝΕ0PROTEIN SAVER(由Τ0Υ0Β0生產)(絲膠蛋白的水解產物);StartingBlock?(PBS)封閉緩衝液(由 PIERCE 生產);和 Stabil Coat (由 SurModics, Inc.生產)。
[0070]生物來源的組分的濃度僅需要根據要使用的組分來適當地確定。例如，封閉可以通過以下方式進行:在調節至10D/mL的膠態金溶液中添加和混合抗體溶液，然後向該混合溶液中加入生物來源的組分以具有0.1至10%的終濃度。此外，該終濃度的下限不限於0.1%，以致可以選擇任何濃度如0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9或1%作為終濃度的下限。此外，該終濃度的上限不限於10%，以致可以選擇任何濃度如9、8、7、6、5、4、3或2%作為終濃度的上限。此外，它們的組合例如是上述上限和下限的任意組合，如0.2至9、0.3至8、0.4至7、0.5至6、0.6至5、0.7至4、0.8至3、0.9至2或1至1.5%。這之中，可以優選使用0.5至5%的終濃度。
[0071](封閉方法)
[0072]作為用兩種組分，S卩，非生物來源的組分和生物來源的組分來封閉膠態金表面中沒有結合抗體的區域的方法，包含在本發明範圍內的不僅有涉及單獨地製備非生物來源的組分和生物來源的組分的混合物，以及將所述混合物與綴合物混合以立即進行封閉的方法，而且還有涉及將任一組分與綴合物混合，然後將所得物與另一組分混合從而用兩個階段進行封閉的方法。
[0073]前一種方法的實例通過例如以下步驟(1)至(3)進行:
[0074](1)用抗體敏化膠態金以提供綴合物的步驟；
[0075](2)將非生物來源的組分和生物來源的組分混合以提供混合物的步驟；和
[0076](3)通過將所述混合物與綴合物混合而對膠態金的表面進行封閉處理的步驟。
[0077]此外，後一種方法的實例通過例如以下步驟㈧至(C)或(a)至(c)進行:
[0078](A)用抗體敏化膠態金以提供綴合物；
[0079](B)通過將非生物來源的組分與綴合物混合而對膠態金的表面進行第一次封閉處理；和
[0080](C)通過將生物來源的組分添加到步驟(B)中的第一封閉處理的產物中而對膠態金的表面進行第二次封閉處理；
[0081]或者
[0082](a)用抗體敏化膠態金以提供綴合物；
[0083](b)通過將生物來源的組分與綴合物混合而對膠態金的表面進行第一次封閉處理；和
[0084](c)通過將非生物來源的組分添加到步驟(B)中的第一封閉處理的產物中而對膠態金的表面進行第二次封閉處理。
[0085](檢測試劑)
[0086]在本發明中，術語"檢測試劑"具體是指至少含有綴合物的溶液。
[0087]檢測試劑可以包含，例如，穩定劑、溶解助劑等中的一種或多種用於將綴合物保持在穩態並且當綴合物與樣品混合時促進固定在綴合物上的抗體與待測對象的特異性反應，或者快速且有效地使綴合物溶解或流化的目的。穩定劑、溶解助劑等的實例可以包括牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、酪蛋白和胺基酸。
[0088]此外，檢測試劑可以包含如用於提高檢測靈敏度目的所需的已知的敏化劑，如2-甲基丙烯醯氧乙基磷酸膽鹼、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖或聚乙烯醇。
[0089]此外，檢測試劑可以根據需要包含用於Ca2+離子等的金屬螯合劑，如EDTA或EGTA。
[0090]應當注意的是，當在本文中使用時，術語"檢測"或"測量"應當以最寬泛含義解釋，包括，例如，證明待測對象的存在和/或定量，並且不應當以任何限制性的方式解釋。
[0091](用於本發明的抗體)
[0092]用於本發明的針對待檢測物質的抗體僅需要是與待檢測物質特異性反應的抗體，並且在其製備方法方面絕不受限制。此外，所述抗體可以是多克隆抗體或可以是單克隆抗體。通常，製備抗體的雜交瘤可以通過以下方式產生:依照Kohler和Milstein的方法(參見Nature，Volume256，p495 (1975))，對用作為待測物質的抗原免疫化的動物的脾細胞和相同物種的骨髓瘤細胞進行細胞融合。備選地，單克隆抗體可以通過DNA免疫化法製備，並且可以參考Naturel992Marl2 ;356 152-154 或 J.1mmunol.Methods Mar 1 ；249 147-154來製備。
[0093]作為用於本發明的抗體，代替如上所述的通過免疫化動物的步驟獲得的抗體或通過DNA免疫化方法獲得的抗體，可以使用通過利用遺傳重組技術獲得的抗體(例如，嵌合抗體)，並且代替抗體的整個分子，可以使用具有抗原-抗體反應活性的抗體的功能片段。抗體的功能片段的實例包括F(ab' )2和？&13'，並且這些功能片段可以通過用蛋白酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)處理如上所述獲得的抗體來製備。
[0094]在本文中，當所用的抗體是單克隆抗體時，在其中用於綴合物的抗體(第一抗體)的表位是一價的情況中，與該第一抗體的表位不同的表位被用作固定在不溶性膜上的抗體(第二抗體)的表位，並且在其中第一抗體的表位是多價的情況中，第二抗體可以是具有與第一抗體的表位相同的表位的抗體，或者第一抗體和第二抗體可以是相同的抗體。
[0095]在後面要描述的實施例中使用抗-D-二聚體單克隆抗體。用於本發明的抗-D-二聚體單克隆抗體的製備方法如下一節中所述，但是本發明不限於此，並且可以使用商購獲得的抗-D- 二聚體單克隆抗體。商購獲得的抗-D- 二聚體單克隆抗體的實例包括:Hytest Ltd.的克隆#DD1 至#DD6 ;和 Fitzgerald Industries International, Inc 的克隆#M01102704ο此外，可以使用由American Diagnostica Inc.生產的克隆#DD3B6。應當注意的是，為了方便，由克隆產生的抗體在本文中有時通過克隆編號或符號表示(克隆#編號或符號)。
[0096](抗-D-二聚體單克隆抗體的製備例)
[0097](1)雜交瘤的製備
[0098]將通過對溶解在PBS中的純化的人纖維蛋白原進行巴曲酶(batroxobin)處理產生的可溶性纖維蛋白用作免疫原。該免疫原與弗氏完全佐劑(由GIBC0生產)以1: 1混合併乳化，並且將0.lmg/0.lmL的所得物(乳液)皮下施用至6周齡雌性BALB/C小鼠，6次，以1周為間隔。然後，在最終免疫後3天，收穫脾。將獲自所收穫的脾的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0-Agl4以6: 1的比率混合，並且在50%聚乙二醇1540(由Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd.生產)存在下進行細胞融合。將融合的細胞以2.5X 106/mL懸浮在HAT培養基中作為脾細胞，並且將懸浮液以0.2mL/孔分配到96孔培養板(由CORNING生產)的孔中。將所述板在5% C02培養箱中在37°C溫育，並且在約2周後，通過ELISA方法對其中生長有雜交瘤的孔中的培養物上清液進行產生對DD級分有反應性的抗體的細胞株的選擇。具體地，經由山羊抗-小鼠IgG(Fc)抗體(由JACKSON生產)將每個培養物上清液中的IgG在微板(由NUNC生產)上成固相，然後與DD級分反應。此外，使所得物與過氧化物酶標記的抗-纖維蛋白原兔多克隆抗體(由DAK0生產)反應。之後，加入含有鄰苯二胺(由Tokyo Chemical Industry C0.,Ltd.生產)的過氧化物酶底物溶液以顯色，並且加入1.5N硫酸以終止顯色。之後，利用微板讀數器進行測量(Abs.492nm)，並且選擇對DD級分顯示高反應性的細胞珠。通過有限稀釋方法克隆雜交瘤以建立兩種產生抗-D-二聚體單克隆抗體的雜交瘤。
[0099](2)單克隆抗體的製備
[0100]向2周前已經腹膜內注射0.5mL的姥鮫烷(pristane)的12周齡雌性BALB/C小鼠，以0.5X 106個細胞的量腹膜內施用以上(1)中獲得的雜交瘤。約2周後，收集腹水並離心以得到上清液。將該上清液與等量的用於吸附的緩衝液(3mol/L NaCl-1.5mol/L甘氨酸-NaOH，pH8.5)混合,然後過濾該混合物。使濾液通過用用於吸附的緩衝液平衡的蛋白質A柱(由Pharmacia生產)以將抗體吸附到所述柱上，然後用0.lmol/L檸檬酸鹽緩衝液(pH3.0)將抗體從柱上洗脫從而純化抗-D-二聚體單克隆抗體(克隆#672102和克隆#672101)。
[0101](樣品墊)
[0102]在本發明中，"樣品墊"是用於接收測量樣品的部分(part)，並且涵蓋當模塑成墊時可以吸收液體測量樣品並且允許該液體和待測對象的組分通過的任何材料和形狀的墊。適於樣品墊的材料的具體實例包括，但不限於，玻璃纖維，丙烯酸纖維，親水聚乙烯材料，幹紙，紙漿和織物。合適地使用由玻璃纖維製成的墊。樣品墊也可以充當後面將描述的綴合物墊。此外，根據需要，通常使用的封閉試劑可以結合到樣品墊中，只要該結合不背離本發明的目的並且不影響反應系統。
[0103](綴合物墊)
[0104]在本發明中，"綴合物墊"通過以下方式獲得:用與待檢測物質特異性反應的檢測試劑浸潰適於之後將描述的綴合物墊的材料，之後乾燥。綴合物墊具有這樣的功能，即當測量樣品通過綴合物墊時，允許綴合物和待檢測物質形成複合物。綴合物墊可以單獨設置成與固定抗-待測物質抗體的膜接觸。備選地，綴合物墊可以設置成與樣品墊接觸以致綴合物墊可以接收通過毛細流動已經通過樣品墊的樣品並隨後通過毛細流動將樣品轉移到另一個墊(下文中被稱為"第3墊")，以此使綴合物墊在與接觸樣品墊的表面不同的表面處進行接觸。應當注意的是，可以適當地改變對用於樣品墊和綴合物墊中的一種或多種的部分的選擇，以及如何將所選的部分設置在固定抗體的膜上。
[0105]適於綴合物墊的材料例如，但不限於，紙，纖維素混合物，硝化纖維素，聚酯，丙烯腈共聚物，玻璃纖維，或無紡纖維如人造纖維。合適地使用由玻璃纖維製成的墊。
[0106]當需要時，綴合物墊可以包含用於保護免疫層析法的可靠性的"對照試劑"，如不與樣品的組分反應的標記的抗體，或標記的高抗原性蛋白如鑰孔血藍蛋白(keyholelimpet hemocyanin) (KLH)。這些對照試劑是不可能存在於樣品中的組分(物質)，並且可以被適當地選擇。
[0107](第3墊)
[0108]在本發明中，可以設置第3墊以用於從樣品的組分中除去對於待檢測物質的檢測以及檢測試劑不必要的組分，以允許對於固定抗體的膜中的反應必要的組分的平穩前進。例如，理想的是除去作為對於檢測不必要的組分的血細胞、不溶的被破壞的血細胞等。此夕卜，所述第3墊還可以具有以下額外效果:從由抗原-抗體反應產生的聚集體中預先除去變得太大而不能移動至並且在固定抗體的膜中平穩前進的聚集體除去。所述第3墊涵蓋所述液體和待測對象的組分可以通過的任何材料和形狀的墊。其具體實例包括，但不限於，玻璃纖維，丙烯酸纖維，親水聚乙烯材料，幹紙，紙漿和織物。合適地使用血細胞分離膜或類似的膜。
[0109](抗體在不溶性膜上的固定)
[0110]在本發明的1C試劑中的針對待檢測物質的抗體在不溶性膜上的固定可以通過已知方法進行。例如，在流動通過(flow-through)形式的情況中，所述抗體被製備成具有預定濃度的溶液，並且將一定量的該溶液以特定符號如點或+的形狀施加到不溶性膜上。此夕卜，在此情況中，為了保證免疫層析法的可靠性，能夠結合綴合物的蛋白質或化合物通常被固定在與針對待測對象的抗體的位置不同的位置處以充當"對照線"。此外，針對對照試劑的抗體可以被固定在與針對待測對象的抗體的位置不同的位置處以充當"對照線"。
[0111]在橫向流動(lateral-flow)形式的情況中，固定如下進行:將抗體製備成具有預定濃度的溶液，並且通過使用例如具有能夠水平移動噴嘴同時以恆定速率將溶液從噴嘴釋放的機構的設備，將所述溶液以線形狀施加到不溶性膜上。在此情況中，抗體的濃度優選為
0.lmg/mL至5mg/mL,更合適地為0.5mg/mL至2mg/mL。此夕卜，固定在不溶性膜上的抗體的量可以通過調節滴加在不溶性膜上的溶液的量(在流動通過形式的情況中)來優化，並且可以通過調節溶液自設備噴嘴的釋放速率(在橫向流動形式的情況中)來優化。特別地，在橫向流動形式的情況中，所述量合適地為0.5 μ L/cm至2 μ L/cm。應當注意的是，在本發明中，術語"流動通過形式膜測定"是指這樣的形式，其中樣品液體等前進以垂直地通過不溶性膜，而術語"橫向流動形式膜測定"是指這樣的形式，其中樣品液體等前進以與不溶性膜平行地移動。
[0112]此外，在本發明中，關於針對待檢測物質的抗體在不溶性膜中施加的位置，在橫向流動形式的情況中，該位置僅需這樣設置成使樣品液體可以通過毛細作用從綴合物墊前進，並且相繼通過其中針對待檢測物質的抗體和對照抗體分別施加的線。所述位置優選設置成其中施加針對待檢測物質的抗體的線可以位於其上遊，而其中施加對照抗體的線可以位於其下遊。在此情況中，各個線之間的距離理想地被設置成足以允許檢測來自標記的信號。而且在流動通過形式的情況中，施加針對待檢測物質的抗體的位置僅需要設置成允許檢測來自標記的信號。
[0113]要施加到不溶性膜上的抗體溶液通常可以通過使用預定的緩衝液來製備。緩衝液的種類可以是例如常用的緩衝液如磷酸鹽緩衝液，Tris緩衝液或GoocT s緩衝液。緩衝液的PH，優選落在6.0至9.5的範圍內，僅需要根據所用的抗體的性質適當地設定。例如，pH為9.0的緩衝液可以用於後面將要描述的抗-D- 二聚體單克隆抗體。緩衝液還可以含有，例如，鹽如NaCl,穩定劑或防腐劑如鹿糖，或殺菌劑如ProClin。所述鹽包括添加用於調節離子強度的鹽，如NaCl，以及在調節緩衝液pH的步驟中添加的鹽，如氫氧化鈉。在將抗體固定在不溶性膜上後，可以通過將常用封閉劑變成溶液或蒸汽態並且用所述封閉劑塗覆除固定有抗體的部分以外的部分來進一步進行封閉。如上所述的其上固定有抗體的不溶性膜在本文中有時被稱為"固定抗體的膜"。
[0114](不溶性膜)
[0115]在本發明中，作為不溶性膜(下文中有時簡稱為膜)，可以使用由任何材料製成的膜。其實例包括，但不限於，聚乙烯，聚對苯二甲酸乙二醇酯，尼龍，玻璃纖維，多糖如纖維素和纖維素衍生物，以及陶瓷。其具體實例可以包括由Millipore,Toyo Roshi Kaisha,Ltd.、Whatman等銷售的玻璃纖維濾紙，纖維素濾紙等。此外，通過適當地選擇不溶性膜的孔徑和結構，可以控制膠態金-標記的抗體和待檢測物質的免疫複合物在膜中流動的速率。通過控制在膜中的流速，可以調節要與固定在膜上的抗體結合的標記的抗體的量。因此，考慮其與用於本發明的免疫層析法的測試條的其他組成材料的組合來理想地優化膜的孔徑和結構。
[0116](吸收墊)
[0117]在本發明中，吸收墊是具有液體吸收性以通過吸收已經移動到不溶性膜中或已經通過不溶性膜的測量樣品來控制測量樣品的前進的部分。在橫向流動形式中，吸收墊僅需要被設置在條結構的最下遊部分，而在流動通過形式中，其僅需要被設置在例如固定有抗體的膜的下遊。例如，濾紙可以被用作吸收墊，而吸收墊不限於此。合適地使用Whatman的740-E 等。
[0118](用於免疫層析法的測試條)
[0119]本發明的用於免疫層析法的測試條至少包括以下組分:
[0120](1)綴合物墊，所述綴合物墊攜帶綴合物，所述綴合物包含膠態金，所述膠態金具有用第一抗體敏化的表面，所述膠態金的表面用兩種組分，即，非生物來源的組分和生物來源的組分封閉；和
[0121](2)不溶性膜，所述不溶性膜包含與綴合物和待檢測物質的複合物結合的第二抗體，所述不溶性膜被設置在綴合物墊的下遊。除了上述構造以外，用於免疫層析法的測試條還涵蓋其上還設置和安裝有樣品墊、吸收墊和第3墊中的任一個或多個的構造。測試條的組分通常被布置在固相支持物如塑料壓敏粘合劑板上。明顯的是，不僅固相支持物用不妨礙測量樣品的毛細流動的物質構建，而且將不妨礙測量樣品的毛細流動的物質被用作粘合劑組分。應當注意的是，聚酯膜等可以用於層壓用於增強固定有抗體的膜的機械強度並防止測定期間的水蒸發(乾燥)的目的。
[0122](檢測裝置)
[0123]本發明的用於免疫層析法的測試條可以通過將其封裝/安裝在考慮例如，條的尺寸，添加測量樣品的方法和添加測量樣品的位置，固定有抗體的膜中固定抗體的位置，和用於信號的檢測方法而設計的合適容器(外殼)中來使用，並且處於這樣的封裝/安裝狀態的測試條被稱為"裝置"。
[0124](其他)
[0125]本文中，"不溶性膜"有時被稱為"固相"，並且物理或化學地將抗原或抗體負載在不溶性膜上的行為或這樣負載的抗原或抗體的狀態有時用術語"固定"、"固定化"、"固相"、"敏化"、"吸附"或"攜帶"來描述。
[0126](樣品)
[0127]在本發明的檢測方法中，含有待檢測物質的"樣品"可以例如是，但不限於，血液，血清，血漿，尿液，唾液，痰，胰腺提取物，淚液，耳液溢(otorrhea)，和前列腺液。通常，全血、血清或血漿是優選的。術語"樣本"在本文中以與"樣品"相同的含義使用。
[0128](待測對象)
[0129]本發明的待測對象是存在於血液，血清，血漿，尿液，唾液，痰，胰腺提取物，淚液，耳液溢，前列腺液等中的物質。其實例包括:炎症相關標記物如C-反應性蛋白(CRP)，IgA，IgG,和IgM ;凝血和纖維蛋白溶解標記物如纖維蛋白降解產物(例如，D- 二聚體)，可溶性纖維蛋白，凝血酶-抗凝血酶複合物(TAT)，纖溶酶-纖溶酶抑制劑複合物(PIC)，和纖溶酶原(PLG);心血管相關標記物如氧化的LDL，腦鈉肽(BNP)，和脂蛋白(a) (Lp(a));代謝相關標記物如脂連蛋白和血紅蛋白Ale (HbAlc);腫瘤標記物如癌胚抗原(CEA)，α-胎蛋白(AFP), CA19-9，CA125，和前列腺特異性抗原(PSA);傳染病相關標記物如B肝病毒(HBV)，C肝病毒(HCV),沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis),和淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae);變應原特異性免疫球蛋白E (IgE);激素；和藥物。這之中，多價抗原如D-二聚體、CRP、Lp (a)和PLG以及痕量組分如BNP是更優選的。
[0130](稀釋液體)
[0131]在本發明中，當樣品需要根據樣品中的待測對象的濃度來稀釋時，可以使用稀釋液體。作為稀釋液體，可以使用具有任何組成的稀釋液體，只要所述稀釋液體具有以下作用:不會通過例如顯著抑制抗原-抗體反應或者相反顯著地促進該反應造成由於標記的過度聚集而不能通過毛細作用前進從而使得不可能檢測取決於抗原濃度的抗原-抗體反應的信號。具有這樣的作用的稀釋液體的實例包括淨化水，生理鹽水，以及各自pH為6.0至10.0的低濃度緩衝液，如10mmol/L至20mmol/L磷酸鹽緩衝液，10mmol/L至20mmol/LTris-HCl緩衝液，和lOmmol/L至20mmol/L甘氨酸-HC1緩衝液。此外，為了控制樣品液體在測試條中的前進速率，可以向任何這樣的稀釋液體中加入表面活性劑。
[0132](測量)
[0133]作為量化來源於膠態金的信號的方法，它足以依據已知方法測量吸光度或反射光強度。通過從吸光度或反射光強度的變化的量外推至具有已知濃度的樣品的校準曲線，也可以測量待檢測物質的濃度。
[0134]實施例
[0135]接下來，通過實施例的方式具體描述本發明，但是本發明的範圍不限於此。
[0136](試驗例1)對封閉劑1的研究
[0137]利用商購獲得的生物來源或非生物來源的封閉劑對抗體敏化後的膠態金進行膠態金表面的封閉處理。
[0138](1)試驗材料
[0139](i)膠態金溶液
[0140]向被加熱至65°C的500mL的淨化水中加入0.7mL的其中各以7% (w/v)的比率溶解有檸檬酸三銨和檸檬酸三鈉二水合物的水溶液，並將整體通過攪拌混合。隨後，加入lmL的7% (w/v)的四氯金(III)酸水溶液，使混合物反應10分鐘同時攪拌，然後將反應溶液煮沸。之後，將所得物在冰水中冷卻以製備平均粒徑為30nm的膠態金溶液。用20mmol/LTris緩衝液(pH7.5)將平均粒徑為30nm的膠態金溶液調節至10D/mL。
[0141](ii)待測試的封閉劑
[0142]非生物來源的組分
[0143].N101 (由 NOF CORPORATION 生產)
[0144].N102 (由 NOF CORPORATION 生產)
[0145].SN100 (由 NOF CORPORATION 生產)
[0146].NB4025 (由 C0SM0 BIO C0.，LTD.生產)
[0147].Stabil Guard (由 SurModics Inc.生產)
[0148].Protein-Free 封閉緩衝液(Thermo Fisher Scientific Inc.)
[0149]生物來源的組分
[0150].BSA(由 Desert Biologicals 生產)[0151] .Blocking Peptide Fragment (由 Τ0Υ0Β0 C0., LTD.生產)
[0152].Neo Protein Saver (由 Τ0Υ0Β0 C0.，LTD.生產)
[0153].StartingBlock?(PBS)封閉緩衝液(由 PffiRCE 生產)
[0154].酪蛋白(由 VWR International, LLC.生產)
[0155](2)試驗方法
[0156]向20mL的10D/mL膠態金溶液(pH7.5)中加入被製備成在10mmol/LTris-HCl緩衝液(pH7.5)中的溶液的lmL的抗-D- 二聚體單克隆抗體(克隆#672102)，並將該混合物在室溫攪拌10分鐘。在"非生物來源"的封閉劑的情況中，以以下量將其未稀釋的溶液添加到膠態金和抗體的混合溶液中。此外，在"生物來源"的封閉劑的情況中，封閉劑被溶解在20mmol/L Tris緩衝液中從而被製備成10% (w/v)溶液，然後將2mL的該溶液添加到膠態金和抗體的混合溶液中。將混合物攪拌5分鐘,然後在10°C並且11，900Xg下離心45分鐘。
[0157]除去上清液，然後向所得的殘餘物添加800 μ L的20mmol/L Tris緩衝液(pH7.2)以懸浮每種情況的綴合物。測量懸浮液在最大吸收波長(λ max)的吸光度和在波長600nm的吸光度，並計算它們的比值(Α,^/Α λ max)。
[0158]〈非生物來源的封閉劑的添加量〉
[0159]N101、N102、Stabil Guard、Protein-Free 封閉緩衝液…2mL
[0160]SN100、NB4025、Protein-Free 封閉緩衝液…0.2mL
[0161](3)檢驗結果和討論
[0162]表1顯示試驗結果。從結果中明顯的是，當用N101或N102對抗體敏化的膠態金進行封閉處理，然後離心以收集抗體敏化的膠態金，並且嘗試將膠態金再懸浮在20mmol/LTris緩衝液(pH7.2)中時，膠態金髮生聚集並且不能被再懸浮，導致不能進行吸光度測量。此外，在用NB4025、SN100、Stabil Guard或Protein-Free處理的情況中，離心後的再懸浮同樣較差，儘管程度比上述兩種要輕，並且吸光度也顯示高的值。另一方面，在用生物來源的組分，即，BSA、Blocking Peptide Fragment、Neo Protein Saver、Starting Block 或酪蛋白處理的每種情況中，膠態金不發生聚集並且能夠被再懸浮，並且吸光度也顯示低的值。
[0163]如從以上可看出的，用生物來源的組分封閉處理過的膠態金當在對抗體敏化的膠態金進行離心後再懸浮時的可分散性優異，並且可用作綴合物。另一方面，用非生物來源的組分封閉處理過的膠態金具有的問題在於:通過離心，抗體敏化的膠態金聚集，並且因此，不能被再懸浮或顯著缺乏穩定性。
[0164][表 1]
[0165]
【權利要求】
1.一種綴合物，所述綴合物包含具有用抗體或抗原敏化的表面的膠態金屬，其中所述膠態金屬的表面用非生物來源的組分和生物來源的組分封閉。
2.根據權利要求1所述的綴合物，其中所述生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:BSA;酪蛋白；絲膠蛋白；對應於作為大腸桿菌(Escherichia coli)來源的熱休克蛋白(HSP)的DnaK的胺基酸序列的胺基酸419至607的多肽；NE0 PROTEINSAVER ；StartingBlock?(PBS)封閉緩衝液；和 Stabil Coat。
3.根據權利要求1或2所述的綴合物，其中所述非生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:甲基丙烯酸聚氧化烯酯；NB4025 ；SN100 ；Stabil Guard ;和Protein-Free封閉緩衝液。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的綴合物，其中所述甲基丙烯酸聚氧化烯酯包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:聚氧乙烯單甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚四氫呋喃單甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚氧丙烯單甲基丙烯酸酯；和辛基聚氧乙烯聚氧丙烯單甲基丙烯酸酯。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的綴合物，其中所述膠態金屬是膠態鉬或膠態金。
6.一種用於樣品中的待檢測物質的檢測方法，所述檢測方法包括使所述樣品與綴合物接觸，所述綴合物包含具有用抗體或抗原敏化的表面的膠態金屬，所述膠態金屬的表面用非生物來源的組分和生物來源的組分封閉。
7.根據權利要求6所述的檢測方法，其中所述綴合物被攜帶在用於免疫層析法的測試條上。
8.根據權利要求6或7所述的檢測方法，其中所述生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:BSA;酪蛋白；絲膠蛋白；對應於作為大腸桿菌(Escherichiacoli)來源的熱休克蛋白(HSP)的DnaK的胺基酸序列的胺基酸419至607的多肽；ΝΕΟPROTEIN SAVER ；StartingBlock?(PBS)封閉緩衝液；和 Stabil Coat。
9.根據權利要求6至8中任一項所述的檢測方法，其中所述非生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:甲基丙烯酸聚氧化烯酯；NB4025 ；SN100 ；StabilGuard ;和 Protein-Free 封閉緩衝液。
10.根據權利要求6至9中任一項所述的檢測方法，其中所述甲基丙烯酸聚氧化烯酯包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:聚氧乙烯單甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚四氫呋喃單甲基丙烯酸酯；聚氧乙烯聚氧丙烯單甲基丙烯酸酯；和辛基聚氧乙烯聚氧丙烯單甲基丙烯酸酯。
11.根據權利要求6至10中任一項所述的檢測方法，其中所述待檢測物質包括多價抗原。
12.根據權利要求11所述的檢測方法，其中所述待檢測物質包括D-二聚體。
13.根據權利要求6至12中任一項所述的檢測方法，其中所述膠態金屬是膠態鉬或膠態金。
14.一種用於免疫層析法的測試條，其包括以下組分:(1)綴合物墊，所述綴合物墊攜帶綴合物，所述綴合物包含具有用第一抗體或抗原敏化的表面的膠態金屬，所述膠態金屬的表面用非生物來源的組分和生物來源的組分封閉；和(2)不溶性膜，所述不溶性膜包含與所述綴合物和待檢測物質的複合物結合的第二抗體，所述不溶性膜被設置在作為組分(1)的所述綴合物墊的下遊。
15. 根據權利要求14所述的測試條，其中所述膠態金屬是膠態鉬或膠態金。
16.檢測設備，其包括:根據權利要求14或15所述的用於免疫層析法的測試條；以及外殼。
17.一種用於包含用抗體或抗原敏化的膠態金屬的綴合物的製備方法，所述製備方法包括:(a)用抗體或抗原敏化膠態金屬以提供綴合物；(b)通過使所述綴合物與非生物來源的組分和生物來源的組分接觸，從而對所述膠態金屬的表面進行封閉處理；和(c)通過離心對經過所述封閉處理的所述綴合物進行濃縮。
18.根據權利要求17所述的綴合物的製備方法，其中所述生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:BSA ;酪蛋白；絲膠蛋白；對應於作為大腸桿菌來源的熱休克蛋白(HSP)的DnaK的胺基酸序列的胺基酸419至607的多肽；NEO PROTEIN SAVER ；StartingBlock?(PBS)封閉緩衝液；和 Stabil Coat。
19.根據權利要求17或18所述的綴合物的製備方法，其中所述非生物來源的組分包括選自由以下各項組成的組中的一種或多種:甲基丙烯酸聚氧化烯酯；NB4025 ；SN100 ；Stabil Guard ;和 Protein-Free 封閉緩衝液。
20.根據權利要求17所述的製備方法，其中所述步驟(b)包括通過使所述綴合物與所述非生物來源的組分接觸，然後使所述綴合物與所述生物來源的組分接觸，從而對所述膠態金屬的表面進行所述封閉處理。
21.根據權利要求17至20中任一項所述的製備方法，其中所述膠態金屬是膠態鉬或膠態金。
【文檔編號】G01N33/553GK103635804SQ201280032686
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年6月29日 優先權日:2011年6月30日
【發明者】橫川伸也, 山本光章, 清水知 申請人:積水醫療株式會社