一種評價中草藥對dna氧化損傷保護作用的方法

2023-12-06 08:07:41

專利名稱：一種評價中草藥對dna氧化損傷保護作用的方法
技術領域：
本發明涉及一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法。
背景技術：
自由基、活性氧(ROS) 、 X射線、Y射線、石棉、多環芳烴類物質等物質 經過不同途徑可攻擊DNA，形成共價的DNA加合物，引起DNA鹼基錯配，DNA 單鏈或雙鏈斷裂，導致DNA損傷，最終導致癌變(Poulsen, HE., Oxidative DNA modifications, ￡x/ . rox/co/. PaAo/., 2005, 57, 161-169.) 。 DNA損傷與癌症、阿爾 茨海默氏症和正常衰老過程等人類一切變化均有關聯，DNA氧化損傷產物是指 由ROS損傷DNA而產生的DNA加合物。在現已發現的二十幾種DNA氧化損傷產 物中，鳥嘌呤由於擁有的分子軌道具有較高的能級，因此最容易被氧化損傷， 生成化學性質比較穩定的修飾核苷8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine， 8-OH-dG)。在複製過程中，DNA鏈上8-OH-dG可以與C以外的其它鹼基配對形 成點突變，被認為是氧化應激因素致癌、致突變的主要機理之一。(徐永俊，徐 順清，DNA氧化損傷生物標誌物8-OH-dG的檢測及其在醫學中的應用，膚f驊 ^^■^"， 2002， 14， 50-53)、(王雲南，呂嘉春，曾波航等，8-羥基-脫氧鳥苷在 肺癌發生和人支氣管上皮細胞癌變過程中的作用中的作用，^嵐-祭^/廢床， 2004， 20， 100-103。)。
由於8-OH-dG在體內能穩定存在， 一旦形成不再被機體進一步代謝；而且 8-OH-dG不能由細胞內外的dG通過非DNA氧化途徑形成，組織細胞核DNA 及線粒體DNA中8-OH-dG，可反應體內DNA氧化損傷。因此，8-OH-dG可以 作為反映內源及外源因素對DNA氧化損傷的靈敏和穩定的生物標記物，能夠用 來估計癌症等多種疾病發生的危險性。在體內/外實驗中，通過檢測有害物質處
理後的細胞或動物組織的8-OH-dG水平，可以評價這些物質的致癌性。對人體 組織的研究也提示，分析人體白細胞、器官組織和尿液等標本的8-OH-dG水平 可以評價個體腫瘤發生的危險性和研究與氧自由基有關的疾病。
中草藥是我國的傳統藥物，在我國經過上千年的實踐應用，有其天然性、 多功能性、無毒副作用、無藥殘、無抗藥性的獨特優勢，特別是很多中草藥提 取物在抗氧化、清除自由基保護機體免受傷害等方面具有重要作用。它對許多 疾病有良好的療效，對許多疑難雜症的治療效果遠遠好於西藥，成為了新的研 究熱點。中草藥對DNA的氧化損傷的保護作用已經引起了研究人員的日益關注， 如潘洪志等人發現番茄紅素能抑制肝細胞中DNA的氧化損傷；趙剛等人發現 左歸丸能下調大腦皮質老化過程中的8-OH-dG; Lee等人發現綠茶能阻斷香菸誘 發的外周血淋巴細胞姐妹染色單體互換，保護吸菸誘發DNA損傷。但是，劉斌 等人發現關木通兩種提取液均能直接導致中國倉鼠肺成纖維細胞中的DNA氧化 損傷。因此不同的中草藥在氧化劑對DNA的損傷作用中是起保護作用還是促進 損傷，需要進一步研究。所以開發一種能檢測中草藥對DNA氧化損傷的保護作 用的方法，對開發和利用高效安全的中草藥製劑具有十分重要的意義。

發明內容
本發明的目的是建立一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法。該方 法可以檢測評價中草藥對DNA氧化損傷的保護作用，並可用來篩選研製高效安 全的中草藥製劑保護機體DNA免受氧化損傷。
為了實現上述目的，本發明採用了以下的技術方案
一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法，該方法包括以下的步驟:
① 共價鍵固定DNA在磁珠微球表面；
② 加入中草藥溶液；
③ 體外染毒固定化的DNA;
④ 磁珠分離氧化組分，保留氧化損傷的DNA;
加入8-OH-dG抗體，與氧化損傷產生的8-OH-dG發生免疫反應；
⑥ 加入酶標第二抗體，與上述得到的產物反應；
⑦ 加入發光底物，高靈敏度化學發光法檢測DNA損傷產生的8-OH-dG;
⑧ 檢測結果與對照組的檢測結果進行分析，判斷中草藥是否具有抑制導致 DNA氧化損傷產生8-OH-dG的功能。
作為優選，上述的步驟(D體外染毒固定化的DNA釆用Fenton型產羥自由 基系統、X射線、y射線、巻煙煙氣、巻煙焦油、巻煙煙氣中的多環芳烴、煙 草咀嚼殘渣、石棉、氧化不飽和脂肪酸、柴油廢氣顆粒、化學致癌物、黃曲酶 毒素Bl或N-亞硝基-乙胺。
作為再優選，上述的步驟(D體外染毒固定化的DNA採用Fenton型羥基自 由基系統，其中Fe2+的濃度為0.1 0.5mM， H202的濃度為0.01 0.6 M。
作為再優選，上述的步驟③體外染毒固定化的DNA採用煙氣吸收液，煙氣 吸收液的製備方法為煙氣通過濾片後氣相部分用磷酸鹽緩衝液-吐溫溶液吸收； 粒相物收集到濾片，然後將收集粒相物的濾片放入磷酸鹽緩衝液-吐溫溶液中， 超聲，離心，取上清液後待用。
作為優選，上述的步驟①為取羧基修飾的磁珠用咪唑緩衝液洗滌，磁座分 離，吸去上清液；將洗滌後的羧基修飾的磁珠分散在溶有EDC的咪唑溶液中， 於恆溫振蕩器中；反應後，將反應混合物平分於離心管中；然後在離心管中加 入DNA，在恆溫振蕩器中反應；取出用洗滌液和水各洗一次後，每管加入封閉 液I,恆溫振蕩器中反應；取出洗滌。
作為優選，上述的步驟②的中草藥溶液的製備方法是先將中草藥配成10—2M 的DMSO溶液，再根據需要用磷酸鹽緩衝溶液或0.04%的HC1水溶液稀釋。
作為優選，上述的8-OH-dG抗體為羊抗8-OH-dG，酶標第一抗體為HRP標 記兔抗羊IgG。羊抗8-OH-dG先與磁珠表面DNA氧化損傷產生的標誌物 8-OH-dG特異性結合，然後磁珠表面結合的羊抗8-OH-dG與HRP標記的兔抗羊 IgG特異性結合進行第二步免疫反應，通過HRP催化的魯米諾與過氧化氫反應 產生的發光信號強度表徵結合在磁珠表面HRP的量，間接檢測與HRP間接相連 的DNA氧化損傷產生的標誌物8-OH-dG。
作為優選，上述的步驟⑤加入羊抗8-OH-dG的PBS溶液，恆溫振蕩器中反應； 步驟⑥為洗滌液洗滌，再加入HRP標記兔抗羊IgG的PBS溶液，同樣於恆溫振 蕩器中反應，洗滌液洗滌。
作為優選，上述的羊抗8-OH-dG的稀釋倍數為75000 150000倍。HRP標 記兔抗羊IgG的稀釋倍數為10000 40000倍。
本發明由於採用了上述的技術方案，可以檢測氧化劑對DNA的損傷，並研究 了損傷產生8-OH-dG的信號與氧化劑量的關係。該方法可以檢測評價中草藥對 DNA氧化損傷的保護作用，並可用來篩選研製高效安全的中草藥製劑保護機體 DNA免受氧化損傷。


圖l為本發明的原理圖。
圖2為羊抗8-OH-dG稀釋度對檢測信號強度的影響圖表。
圖3為不同F^+的濃度對化學發光強度的影響圖表。
圖4為槲皮素和丹參酮對Fenton試劑引起DNA損傷的影響圖表。
具體實施例方式
實施例l Fenton試劑導致DNA氧化損傷的測定
一、 試劑與儀器
所有試劑均為分析純，實驗用水為去離子超純水。pH6.0的咪唑緩衝液；0.1M 的PBS,pI^7.2-7.4;洗滌液為含有0.1。/。的吐溫20的PBS;封閉液I為40mM甘氨 酸，1。/。BSA的咪唑緩衝液；封閉液n為10n/。BSA的PBS。
N-(3-二甲基氨丙基)-N，-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購於Sigma公司；HRP 標記兔抗羊IgG購於北京博奧森生物技術有限公司；羊抗8-OH-dG購於abcam公 司；HRP化學發光試劑盒購於Milipore公司；羧基修飾的磁性微球(1.5pm， Bangs Laboratories, Inc.) ; DNA(5，-GCC AAC AGC CAG TGG GAA ACA AAA AAA AAA-NH2-3，)，由上海英駿生物技術公司合成。氧化劑FeCb水溶液(含有0.040/。 的HC1防水解)，30%的^02溶液用前稀釋；
BPCL微弱發光測量儀(中國科學院生物物理研究所)；HZ-9211K恆溫振蕩 器(太倉市科教器材廠)。
二、 檢測的方法
1、 中草藥溶液的製備方法
先將中草藥配成10—2M的DMSO溶液，再根據需要用磷酸鹽緩衝溶液或 0.04%的HC1水溶液稀釋，以減低DMSO對DNA的影響。
2、 反應體系及方法 將羧基修飾的磁珠用咪唑緩衝液洗滌，磁座分離，吸去上清液，如此重複
三次。將其分散在溶有EDC的咪唑溶液中，於37。C的恆溫振蕩器中。反應20min 後，將反應混合物平分於12個離心管中，每管中加入lpmol的DNA，在37'C恆溫 振蕩器中反應60min。取出用洗滌液和水各洗一次後，每管加入100pL封閉液I ，
於恆溫振蕩器中反應60min。取出用洗滌液和水各洗滌一次；按實驗目的在樣品 中加入相應的中草藥溶液及氧化劑，對照組只加入氧化劑，Fenton試劑氧化 60min。氧化後的樣品用PBS洗滌三次後，用封閉液II封閉60min，磁座分離，吸 出上清液，加入抗8-0H-dG的PBS溶液(含2。/。BSA) ， 37。C恆溫振蕩器中反應 60min。洗滌液洗滌，再加入HRP標記兔抗羊IgG的PBS溶液(含2。/。BSA)，同 樣於37。C恆溫振蕩器中反應60min，洗滌液洗滌三次。用HRP化學發光試劑盒於 化學發光儀檢測，發光信號由相連的工作站顯示並記錄。 實施例2羊抗8-OH-dG稀釋度的選擇
由於實驗中所用的羊抗8-OH-dG活性較強，對檢測信號影響較大，故需要 選擇合適的稀釋濃度以得到最優化的信噪比，圖2顯示了不同稀釋度對檢測信號 強度的影響。實驗條件為Fe"濃度為0.288mM，H202為0.12M，HRP標記兔抗 羊IgG的稀釋度為1 /20000 。如圖4可知隨著羊抗8-OH-dG稀釋度的增大， 檢測信號呈現先增大後減小的趨勢，並在稀釋100000倍附近達到最大值。稀釋 度太大，濃度過大，使對照組的抗體在磁珠上的非特異性吸附的機率增大；稀 釋濃度過小，濃度過小，使抗體相對氧化產生8-OH-dG量太少，不足以檢測。因 此，本發明羊抗8-OH-dG的最佳稀釋倍數為100000 。 實施例3不同F^+的濃度對化學發光強度的影響
可以產生羥基自由基的Fenton試劑(即？^+介導的1"1202)是比較經典的DNA 損傷氧化劑，其中Fe"的濃度對產生8-OH-dG的量的影響顯著，圖3顯示了不同 Fe"的濃度對發光強度的影響，由圖可知，隨著F^+的濃度的增大，產生8-OH-dG 的量也隨之增大，隨後出現下降，可能是過量的氧化劑會導致DNA鏈斷裂，從 而使產生8-OH-dG的量下降，我們的檢測方法對此種影響的研究也顯示了與文獻 相似的結果。實驗中I代表HRP標記兔抗羊IgG稀釋20000倍，II代表其稀釋
40000倍；a代表羊抗8-OH-dG稀釋100000倍，b代表其稀釋250000倍。從圖中看 出，I+a的結合方法對測定8-OH-dG是最有利的，故後面研究都選用I+a組合。 實施例4中草藥對DNA氧化損傷的保護作用研究
分別考察了幾種中草藥對Fenton試劑弓I起DNA氧化損傷的影響。以槲皮素 和丹參酮為例(如圖4)，對照組中沒有添加中藥，只用Fenton試劑氧化，Ff濃 度為0.288mM, H2O2的濃度為0.12M;中藥組在加入Fenton之前加入中藥，其終 濃度均為10^M。由圖4可以看出，加入槲皮素或丹參酮的DNA反應組，產生的 8-OH-dG均比相應未加中藥的少，說明這兩種中藥對Fenton試劑弓1起的DNA氧化 損傷有較好的保護作用。
權利要求
1. 一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法，其特徵在於該方法包括以下的步驟①共價鍵固定DNA在磁珠微球表面；②加入中草藥溶液；③體外染毒固定化的DNA；④磁珠分離氧化組分，保留氧化損傷的DNA；⑤加入8-OH-dG抗體，與氧化損傷產生的8-OH-dG發生免疫反應；⑥加入酶標第二抗體，與上述得到的產物反應；⑦加入發光底物，高靈敏度化學發光法檢測DNA損傷產生的8-OH-dG；⑧檢測結果與對照組的檢測結果進行分析，判斷中草藥是否具有抑制DNA氧化損傷產生8-OH-dG的功能。
2. 根據權利要求1所述的一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法， 其特徵在於步驟(D體外染毒固定化的DNA採用Fenton型羥基自由基系統、 X射線、Y射線、巻煙煙氣、巻煙焦油、巻煙煙氣中的多環芳烴、菸草咀嚼 殘渣、石棉、氧化不飽和脂肪酸、柴油廢氣顆粒、化學致癌物、黃曲酶毒素 Bl或N-亞硝基-乙胺。
3. 根據權利要求2所述的一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法， 其特徵在於:步驟③體外染毒固定化的DNA採用Fenton型產羥自由基系統， 其中Fe"的濃度為0.1 0.5 mM， H202的濃度為0.01 0.6 M。
4. 根據權利要求2所述的一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法， 其特徵在於步驟③體外染毒固定化的DNA採用煙氣或煙氣吸收液，煙氣 吸收液的製備方法為煙氣通過濾片後氣相部分用磷酸鹽緩衝液-吐溫溶液吸 收；粒相物收集到濾片，然後將收集粒相物的濾片放入磷酸鹽緩衝液-吐溫溶液中，超聲，離心，取上清液後待用。
5. 根據權利要求1 4任意一項權利要求所述的一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法，其特徵在於步驟①為取羧基修飾的磁珠用咪唑緩衝液 洗滌，磁座分離，吸去上清液；將洗滌後的羧基修飾的磁珠分散在溶有EDC 的咪唑溶液中，於恆溫振蕩器中；反應後，將反應混合物平分於離心管中； 然後在離心管中加入DNA，在恆溫振蕩器中反應；取出用洗滌液和水各洗一 次後，每管加入封閉液I，恆溫振蕩器中反應；取出洗滌。
6. 根據權利要求1 5任意一項權利要求所述的一種評價中草藥對DNA氧化損 傷保護作用的方法，其特徵在於步驟②的中草藥溶液的製備方法是先將中 草藥配成10—2M的DMSO溶液，再根據需要用磷酸鹽緩衝液或0.04%的 HC1水溶液稀釋。
7. 根據權利要求1 5任意一項權利要求所述的一種評價中草藥對DNA氧化損 傷保護作用的方法，其特徵在於8-OH-dG抗體為羊抗8-OH-dG，酶標第二 抗體為HRP標記兔抗羊IgG。
8. 根據權利要求7所述的一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法， 其特徵在於步驟⑤加入羊抗8-OH-dG的PBS溶液，恆溫振蕩器中反應；步 驟⑥為洗滌液洗滌，再加入HRP標記兔抗羊IgG的PBS溶液，同樣於恆溫 振蕩器中反應，洗滌液洗滌。
9. 根據權利要求8所述的一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法， 其特徵在於羊抗8-OH-dG的稀釋倍數為75000 150000倍。
10. 根據權利要求8所述的一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法， 其特徵在於HRP標記兔抗羊IgG的稀釋倍數為10000 40000倍。
全文摘要
本發明涉及一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法。一種評價中草藥對DNA氧化損傷保護作用的方法，該方法包括以下的步驟共價鍵固定DNA在磁珠微球表面；加入中草藥溶液；體外染毒固定化的DNA；磁珠分離氧化組分，保留氧化損傷的DNA；加入8-OH-dG抗體，與氧化損傷產生的8-OH-dG發生免疫反應；加入酶標第二抗體，與上述得到的產物反應；加入發光底物，高靈敏度化學發光法檢測DNA損傷產生的8-OH-dG；檢測結果與對照組的檢測結果進行分析，判斷中草藥是否具有抑制導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的功能。本發明可以檢測評價中草藥對DNA氧化損傷的保護作用，並可用來篩選研製高效安全的中草藥製劑保護機體DNA免受氧化損傷。
文檔編號G01N33/543GK101382545SQ20081012185
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月30日 優先權日2008年10月30日
發明者儲國海, 盧建忠, 周國俊, 陳紅君, 黃芳芳 申請人:浙江中煙工業有限責任公司