一種低分子透明質酸鹽、其製備方法及用途的製作方法

2023-11-01 01:35:07

專利名稱：一種低分子透明質酸鹽、其製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於酶學和藥物化學領域，涉及一種低分子透明質酸鹽、其製備方法及用途。
背景技術：
透明質酸(hyaluronic acid, HA)是一種酸性黏多糖，由N-乙醯氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖重複單位構成的無分支高分子糖胺聚糖，存在於動物組織細胞間質和某些細菌的莢膜中。透明質酸廣泛用於醫藥、化妝品、食品等領域，分子量一般為IO5 — IO7Da (道爾頓)。研究表明，分子量對透明質酸的活性有很大影響，不同分子量的透明質酸甚至表現出截然相反的活性(郭學平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中國生化藥物雜誌，2003，24 (3):148-150)。目前一般將分子量在IO4Da — IO6Da的透明質酸稱為低分子透明質酸(LMW-HA)。分子量為2萬一 6萬的LMW-HA可刺激體外培養的骨細胞的增生，增加培養基中骨細胞集落的數目和單個集落的面積(US 5646129)。使用含有妥布黴素和分子量為50萬的HA的滴眼液治療細菌性角膜潰瘍，與只含妥布黴素的滴眼液相比，可顯著縮短癒合時間(Gandolfi SA, Massari A,Orsoni JG.Low-molecular-weight sodium hyaluronatein the treatment o f bacterial corneal ulcers s[J].Graefes Arch Clin ExpOphthalmol, 1992, 230(1): 20-23)。韓國專利(KR20080087941)提供了一種含分子量小於10萬的HA的組合物，該組合物易於被人體吸收，口服可有效改善皮膚皺紋、提高皮膚彈性。日本專利(JP2000-103723)提供了一種含分子量20萬一 40萬HA的組合物，該組合物可促進毛髮生長。但是，酶解法製備的低分子透明質酸或其鹽在結構上比化學法製備的要完整，化學法製備的低分子透明質酸或其鹽的結構會發生開環、脫乙醯基等。LMW-HA因其相對分子質量較小，外用時可被皮膚更好的吸收，促進皮膚營養的供給和廢物排洩，從而防止皮膚老化，達到深層保溼和美容養顏的效果，而且還可促進表皮細胞的增殖和分化，清除氧自由基，修復日光或紫外線傷害的皮膚。口服LMW-HA易於吸收，不僅可以活化皮膚細胞，保持表皮溼潤，同時具有良好的增強免疫功能和抗衰老功能。因此化妝品用及保健食品用HA多為LMW-HA。另外，LMW-HA還具有促血管生成、細胞免疫活化和促進骨生成的作用，對治療細菌性角膜潰瘍具也有良好的療效，在醫藥領域應用廣泛。LMW-HA是由高分子量HA降解得到的，降解的方法主要有物理降解、化學降解、生物降解三大類。物理降解法中的超聲降解法雖然不添加化學試劑和酶，但很難將高分子量HA降解至分子量200kDa以下(覃彩鳳，王淼，陳曉峰.透明質酸的降解方法及工藝條件研究[J].2007，4:32-36)。機械研磨法也是一種有效降低HA相對分子量的方法，有專利報導在室溫下研磨時間為0.5h - 12h，振蕩頻率為IOHz - 30Hz，但不適用於大規模生產(CN101942037A)。化學降解法會造成結構破壞，這時不但糖鏈上的糖苷鍵斷裂，而且單糖(葡糖醛酸和乙醯氨基葡糖)殘基的結構也可能遭到破壞，如乙醯基被水解掉、單糖六元環斷裂等。有報導酶解法生產低分子HA的製備過程，先將HA從發酵液中分離純化出來，然後再加入透明質酸酶進行酶解，再經過膜過濾、乙醇沉澱、脫水乾燥得到低分子HA(CN101020724A)，上述製備工藝所用的透明質酸酶為透明質酸酶成品，價格很高，很難實現工業化生產。目前，有文獻報導的微生物來源透明質酸酶發酵液單位酶活較低，發酵液最高酶活是1.3 X 102IU/mL (W02010130810A1)，其餘文獻報導的酶活均低於102IU/mL，因此應用酶切法大規模生產低分子量HA目前很難實現。

發明內容
本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，得到了一種芽孢桿菌和一種透明質酸酶。該透明質酸酶活性高，可達105IU/mL(發酵液)，純化後可以達到8 X IO6 — 1.5 X IO7IU/mg，遠高於目前文獻中報導的最高酶活。該透明質酸酶的分子量為123KDa，最適作用溫度及PH分別為42°C、6.5，熱穩定性和pH穩定性高。該酶可催化裂解透明質酸和硫酸軟骨素，但是不能降解海藻酸鈉，肝素鈉，殼聚糖，幾丁質和羥甲基纖維素鈉。利用該透明質酸酶降解高分子透明質酸，反應速度快、反應條件溫和、環境汙染小，可大規模工業化生產低分子透明質酸，還可生產低分子硫酸軟骨素(本發明中是指分子量為1，000 - 10, 000的硫酸軟骨素，也稱為低分子量硫酸軟骨素)。本發明採用芽孢桿菌發酵得到的透明質酸酶對高分子量透明質酸或其鹽進行降解，酶活高、條件溫和、操作簡單、無環境汙染。由此提供了下述發明:
本發明的一個方面涉及一種芽孢桿菌，其保藏編號為CGMCC N0.5744，保藏日期為2012年2月8日，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。針對現今生物降解透明質酸或其鹽所需降解酶活性低、來源有限、成本高的缺點，發明人從空氣中分離得到了一種產透明質酸酶的芽孢桿菌(Bacillus sp.)A50，該菌種已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了保藏，保藏號為CGMCCN0.5744，保藏時間為2012年2月8日。本發明的另一方面涉及一種製備透明質酸酶的方法，包括使用本發明的芽孢桿菌的步驟；具體地，包括下述步驟:將本發明的芽孢桿菌進行斜面培養、種子培養、發酵培養、離心、硫酸銨分級沉澱、超濾，製得透明質酸酶。根據本發明任一項所述的製備透明質酸酶的方法，包括如下步驟:(I)將本發明的芽孢桿菌進行斜面培養，得斜面菌種；(2)取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養基中，在25 - 400CUOO 一 200rpm的條件下培養10 — 24h,得種子液；(3)將種子液接種到已滅菌的發酵培養基中，在25 - 400CUOO 一 300rpm的條件下培養12 - 24h，得透明質酸酶發酵液；(4)離心分離發酵液，取上清液；(5)將上清液用硫酸銨分級沉澱，過濾(例如採用0.65 μ m的微孔濾膜進行過濾)，得到粗製的透明質酸酶；(6)將步驟(5)沉澱出來的粗製透明質酸酶溶於磷酸鹽緩衝液中，超濾除去小分子雜質，得純化的透明質酸酶。可選地，步驟(6)也可以採用如下的步驟(6 -1)至(6 - 3):(6 -1):將步驟(5)中的粗製透明質酸酶溶於pH4.5-8.0的緩衝溶液中，得粗酶液；將粗酶液裝入截留分子量為3.0X IO3 - 1.4X IO4Da的透析袋，放入pH4.5 — 8.0的緩衝溶液中，4°C下透析過夜；(6 - 2):將透析後的粗酶液進行離子交換色譜分離，色譜柱填料是DEAE瓊脂糖凝膠FF介質，用O — 0.5M NaCl溶液進行梯度洗脫，並收集洗脫峰；(6 - 3):將步驟(6 - 2)得到的透明質酸酶樣品進行冷凍真空乾燥，得到白色粉末，即為透明質酸酶。步驟6 — I至6 — 3是對透明質酸酶的進一步純化。上述分離純化透明質酸酶的方法中，SDS-PAGE電泳檢測步驟(6_2)得到的透明質酸酶純度達到97%以上。上述步驟(I)中，每IOOmL斜面培養基中含有以下成分:蛋白腖0.2 — 2.0g，酵母粉 0.2 — 2.0g，K2HP04.3Η20 0.05 — 0.15g, MgSO4.7Η200.05 — 0.15g，葡萄糖 0.5-1.5g,瓊脂粉2.0g, pH調至6.0 — 8.0，斜面培養的溫度為25 — 40°C。上述步驟(2)中，每IOOmL種子培養基中含有以下成分:蛋白腖0.2 — 2.0g，酵母粉 0.2 — 2.0g，K2HPO4.3Η20 0.05 — 0.15g, MgSO4.7Η200.05 — 0.15g，葡萄糖 0.5 — 1.5g,pH 調至 6.0 - 8.0。上述步驟(3)中，每IOOmL發酵培養基中含有以下成分:蛋白腖0.2 — 2.0g，酵母粉 0.2 — 2.0g，K2HPO4.3Η20 0.05 — 0.15g，MgS04.7Η200.05 — 0.15g，葡萄糖 0.5-1.5g,吐溫 800.05mL, pH 調至 6.0 — 8.0。可採用鹽酸、硫酸或磷酸中的一種或一種以上調節斜面培養基、種子培養基和發酵培養基pH。斜面種子培養和發酵培養的接種量可以通過現有技術得到，不需付出創造性的勞動。種子培養基的接種量能夠達到發酵培養所需接種量的種子液即可，發酵培養基的接種量一般在3 — 15%即可。上述步驟(4)中，發酵液離心的轉速為10000 - 15000rpm，離心時間為10 —20mino上述步驟(5)中，硫酸銨分級沉澱的步驟是:將上清液中加入硫酸銨，使其質量體積濃度為20% — 25%，過濾除去產生的沉澱，然後繼續加入硫酸銨，至其質量體積濃度為35% -40%為止，得到的沉澱即為透明質酸酶。本發明中所述的質量體積濃度的意思是:每mL上清液中含有硫酸銨的質量(g)。上述步驟(6)中，磷酸鹽緩衝液的pH優選為6.0，濃度優選為50mmol/L，在實際應用中可酌情變動。超濾 所用的為超濾膜。超濾膜的截留分子量為3XlO4Da15本發明的再一方面涉及一種透明質酸酶，其由上面任一項所述的製備透明質酸酶的方法製得。本發明芽孢桿菌生產的透明質酸酶在發酵液中的酶活可達到IX IO5 — 3X IO5IU/mL,大大高於文獻報導中的最高酶活(1.3 X 102IU/mL),且該酶熱穩定性和pH穩定性高，用其降解高分子透明質酸，用來製備低分子透明質酸，成本顯著降低，可用於大規模生產，解決了動物來源的透明質酸酶成本高的問題，在生化研究領域及低分子透明質酸的生產方面有廣闊的應用前景。本發明還涉及一種分離的多肽(或蛋白)，其胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示；具體地，所述多肽(或蛋白)為透明質酸酶。一種分離的多核苷酸，其編碼SEQ ID NO:2所示所示的胺基酸序列；具體地，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO: 3所示。一種重組載體，其含有本發明的多核苷酸。一種重組宿主細胞，其含有本發明的重組載體。本發明的再一方面涉及一種製備低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽的方法，包括使用本發明中任一項所述的透明質酸酶或者含有本發明中任一項所述的透明質酸酶的發酵液對分子量大於IOOOkDa的透明質酸或其鹽進行降解的步驟。根據本發明任一項所述的製備低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽的方法，其包含如下步驟:I)配製透明質酸或其鹽溶液:向純化水中加入分子量大於IOOOkDa的透明質酸或其鹽，配製成質量體積濃度為0.1 - 2%的溶液；2)酶解:調節步驟I)中溶液的溫度為20 - 48°C、pH為4 一 9，然後向其中加入芽孢桿菌透明質酸酶，將透明質酸或其鹽酶解至所需分子量，得酶解液；3)滅活:將酶解液在50 — 90°C下保持10 — 60min,對芽孢桿菌透明質酸酶進行滅活； 優選地，還包括如下步驟:4)過濾:向滅活後的酶解液中加入易溶性無機鹽，攪拌至完全溶解，然後用孔徑為0.45 μ m的濾膜過濾，得濾液，每IOOmL酶解液中加入0.1 一 IOg的易溶性無機鹽；5)沉澱:將步驟4)的濾液與濾液體積I 一 10倍的醇或酮混合均勻，析出低分子透明質酸鹽沉澱；6)脫水乾燥:將步驟5)中的低分子透明質酸鹽沉澱分離出來，用有機溶劑脫水，然後真空乾燥，得低分子透明質酸鹽。根據本發明任一項所述的製備低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽的方法，其中，步驟I)中，每Ikg透明質酸或其鹽中加IO6 — IO7IU的芽孢桿菌透明質酸酶。根據本發明任一項所述的製備低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽的方法，其中，步驟2)中，酶解溫度為35 - 45°C，酶解pH為5.5 — 7.5，將透明質酸酶解至分子量為 IOkDa -1OOOkDa ;優選為 IOkDa — 770kDa 或 IOkDa — 700kDa 或 IOkDa — 600kDa 或IOkDa - 500kDa ;更優選為 IOkDa — 400kDa ;進一步優選為 IOkDa — 300kDa、IOkDa —200kDa、IOkDa — 150kDa、IOkDa — lOOkDa、IOkDa — 50kDa 或 IOkDa — 30kDa。根據本發明任一項所述的製備低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽的方法，其滿足如下的A — F中的任一項或多項:A.步驟I)中，透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽或鋅鹽；B.步驟2)中，採用酸或鹼調節pH至4 一 9，所述酸為鹽酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述鹼為氫氧化鈉或氫氧化鉀；C.步驟3)中，將酶解液在55 - 65°C下保持20 — 30min，對芽孢桿菌透明質酸酶進行滅活；D.步驟4)中，所述易溶性無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋅鹽或鎂鹽；優選鈉、鉀、鈣、鋅、鎂的氯化物、硫酸鹽或硝酸鹽；E.步驟5)中，所述醇或酮為乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或異丙醇；F.步驟6)中，脫水所用的有機溶劑為酮或醇。本發明的再一方面涉及一種低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽，其由本發明中任一項所述的製備低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽的方法製得。本發明的再一方面涉及一種低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽，其N-乙醯氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖的含量> 90%或> 95% (w/w);具體地，所述N-乙醯氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖的含量通過HPLC法或咔唑法測得。更具體地，HPLC的條件為:採用糖分析柱進行高效液相色譜測定；流動相為0.4mol/L NaH2PO4溶液；流速為0.6ml/min ;柱溫為35°C ;檢測波長為232nm ;進樣量為20 μ L。咔唑法測定寡聚透明質酸或低分子透明質酸的含量可參考凌沛學等編的《透明質酸》(中國輕工業出版社，2002)的第41頁內容。例如HPLC法可以採用下面的步驟:a.標準對照品溶液:稱取一定量的標準對照品(Hyaluronic acid disaccharideΔ DiHA sodium salt, Η9649, Sigma)用憐酸鹽緩衝液(ρΗ6.0, 5mmol/L)溶解配製成 lmg/mL的溶液，得到標準對照品溶液；b.樣品預處理:稱取一定量的待測樣品，用磷酸鹽緩衝液(pH6.0,5mmol/L)溶解配製成lmg/mL的溶液。取I·mL樣品溶液加入1000IU的透明質酸酶，42°C水浴2h ;酶解結束後，將酶解液煮沸2min使酶失活，得到樣品酶解液。將樣品酶解液轉移至20mL容量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，混勻，過濾即得供試液。c.標準對照品溶液處理:取ImL標準對照品溶液採用流動相稀釋20倍，過濾待用。d.色譜條件:採用糖分析柱進行高效液相色譜測定；流動相為0.4mol/L NaH2PO4溶液；流速為0.6ml/min ;柱溫為35°C ;檢測波長為232nm ;進樣量為20 μ L ;e.結果計算:採用高效液相色譜分別對標準對照品和待測樣品進行色譜分離，按外標法以透明質酸雙糖峰面積計算；具體地，按以下公式計算低分子透明質酸或其鹽的含量(以N-乙醯氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖的含量表示):
低分子逢嚷質酸或其盤的含量CC%)=X.%^°......^Xi00%
Ar X Wx x(100 —h)Ax:待測樣品的透明質酸雙糖峰面積；Ae:標準對照品的透明質酸雙糖峰面積；Wx:待測樣品稱樣量，mg ；Ce:標準對照品溶液濃度，mg/mL ；h(% )為待測樣品乾燥失重。
具體方法也可以參照公開號為CN102323344A的中國專利申請，其全部內容在此通過引用併入本發明。根據本發明的任一項所述的低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽，其分子量為IOkDa -1OOOkDa ;優選為 IOkDa — 770kDa 或 IOkDa — 700kDa 或 IOkDa — 600kDa 或 IOkDa —500kDa ;更優選為 IOkDa — 400kDa ;進一步優選為 IOkDa — 300kDa、IOkDa — 200kDa、IOkDa - 150kDa、IOkDa — IOOkDaUOkDa 一 50kDa 或 IOkDa — 30kDa。具體地，所述低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽為酶解法(酶切法)製得；更具體地，由本發明的透明質酸酶製得。根據本發明的任一項所述的低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽，其通過HPLC法和咔唑法測得的含量的差值小於1%。不拘於理論的限制，在相同酶量的情況下，只要控制不同的酶解時間即可得到不同分子量的透明質酸鹽，即只要控制合適的酶解時間即可得到低分子透明質酸鹽或寡聚透明質酸鹽。但實際上，會出現時間長了酶的活性可能降低、透明質酸鹽的溶液會染菌等問題，所以優選通過控制加不同的酶量來控制得到不同分子量的透明質酸鹽，如製備低分子透明質酸鹽時可加酶量少一些，製備寡聚透明質酸鹽時則需加酶量多一些。可以間隔取樣檢測產物的分子量。低分子透明質酸鹽的分子量測定採用GPC-MALLS法或Laure nt法(GPC-MALLS法更方便一些);本領域技術人員可以根據本領域知識自行選擇合適的檢測時間間隔。本發明的再一方面涉及一種組合物，其包含本發明中任一項所述的透明質酸酶、本發明的多核苷酸、本發明的重組載體、本發明的重組宿主細胞、或者本發明任一項所述的低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽；可選地，其還包含藥學上或食品學上可接受的載體或輔料。具體地，所述組合物為化妝品；更具體地，所述化妝品為防曬、曬後修復、抗衰老、或保溼的化妝品。本發明的再一方面涉及本發明的芽孢桿菌或本發明的多核苷酸或本發明的重組載體或本發明的重組宿主細胞在製備透明質酸酶中的用途。可以利用本領域人員知悉的技術手段，將本發明的編碼透明質酸酶的多核苷酸克隆至表達載體，轉導至合適的宿主細胞，表達本發明的透明質酸酶。本發明還涉及本發明中任一項所述的透明質酸酶在製備低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽或者低分子硫酸軟骨素中的用途。本發明還涉及本發明任一項所述的低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽在製備促血管生成和/或促進創傷癒合或抗氧化或清除自由基或防曬或曬後修復或促進HUVEC細胞增殖或抗腫瘤(例如乳腺癌、肺癌、或神經膠質瘤)或提高免疫力的藥物或者在製備食品或保健品或化妝品中的用途；具體地，所述化妝品為防曬、曬後修復、抗衰老、或保溼的化妝
品O本發明的再一方面涉及一種在體內或體外促血管生成和/或促進創傷癒合或抗氧化或清除自由基或防曬或曬後修復或促進HUVEC細胞增殖或抑制腫瘤細胞(例如乳腺癌細胞、肺癌細胞、或神經膠質瘤細胞)的方法，包括給與受試者或使用有效量的本發明任一項所述的低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽的步驟；具體地，所述受試者為哺乳動物，更具體地，所述受試者為人。
在本發明中，如果沒有特別說明，「低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽」亦簡稱為「低分子透明質酸或其鹽」，低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽的分子量為IOkDa -1OOOkDa ;優選為 IOkDa — 500kDa ;更優選為 IOkDa — 400kDa ;進一步優選為 IOkDa —300kDa、IOkDa — 200kDa、IOkDa — 150kDa、IOkDa — lOOkDa、IOkDa — 50kDa 或 IOkDa —30kDa。低分子透明質酸鹽的種類並不特別限定，包括但不限於:鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋅
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ΠΤΤ.-rf* -rf* O本發明中，對於某個成分的含量的百分比，如果沒有特別說明，均指重量百分比(w/w)。下面還給出了本發明涉及的術語的解釋。表達載體本發明還涉及包含本發明核酸序列、啟動子和轉錄及翻譯終止信號的重組表達載體。可以將上述各種核酸和調控序列連接在一起來製備重組表達載體，該載體可以包括一個或多個方便的限制位點，以便在這些位點插入或取代編碼透明質酸酶的核酸序列。或者，可以通過將核酸序列或包含該序列的核酸構建體插入適當表達載體而表達本發明所述核酸序列。製備表達載體時，可使編碼序列位於載體中以便與適當的表達調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何便於進行重組DNA操作並表達核酸序列的載體(例如質粒或病毒)。載體的選擇通常取決於載體與它將要導入的宿主細胞的相容性。載體可以是線性或閉環質粒。載體可以是自 主複製型載體(即存在於染色體外的完整結構，可獨立於染色體進行複製)，例如質粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體。載體可包含保證自我複製的任何機制。或者，載體是一個當導入宿主細胞時，將整合到基因組中並與所整合到的染色體一起複製的載體。此外，可應用單個載體或質粒，或總體包含將導入宿主細胞基因組的全部DNA的兩個或多個載體或質粒，或轉座子。優選本發明所述載體含有一個或多個便於選擇轉化細胞的選擇標記。選擇標記是這樣一個基因，其產物賦予對殺生物劑或病毒的抗性、對重金屬的抗性，或賦予營養缺陷體原養型等。細菌選擇標記的例子如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因,或者抗生素如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素的抗性標記。優選本發明所述載體包含能使載體穩定整合到宿主細胞基因組中，或保證載體在細胞中獨立於細胞基因組而進行自主複製的元件。就進行自主複製的情況而言，載體還可以包含複製起點，使載體能在目標宿主細胞中自主地複製。複製起點可以帶有使其在宿主細胞中成為溫度敏感型的突變(參見例如，fEhrlich, 1978，美國國家科學院學報75:1433)。可以向宿主細胞插入一個以上拷貝的本發明核酸序列以提高該基因產物的產量。該核酸序列的拷貝數增加可以通過將該序列的至少一個附加拷貝插入宿主細胞基因組中，或者與該核酸序列一起插入一個可擴增的選擇標記，通過在有合適選擇試劑存在下培養細胞，挑選出含有擴增拷貝的選擇性標記基因、從而含有附加拷貝核酸序列的細胞。用於連接上述各元件來構建本發明所述重組表達載體的操作是本領域技術人員所熟知的(參見例如SambiOOk等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)。宿主細胞本發明還涉及包含可用來重組生產透明質酸酶的本發明所述核酸序列(多核苷酸)的重組宿主細胞。可將包含本發明之核酸序列的載體導入宿主細胞,從而使該載體以上述染色體整合體或自我複製的染色體外載體形式得以維持。術語「宿主細胞」涵蓋任何由於複製期間發生的突變而與親本細胞不同的後代。宿主細胞的選擇很大程度上取決於透明質酸酶編碼基因及其來源。宿主細胞可以是原核細胞或者真核細胞，例如細菌或酵母細胞。可以通過本領域技術人員熟知的技術將載體導入宿主細胞。製備方法本發明還涉及重組製備本發明透明質酸酶的方法，該方法包括:(a)在適於產生透明質酸酶的條件下，培養含有核酸構建體的宿主細胞，該核酸構建體包含編碼所述透明質酸酶的核酸序列；和(b)回收該肽。在本發明所述製備方法中，用本領域已知方法在合適透明質酸酶產生的營養培養基中培養細胞。例如，可以在合適的培養基中，在允許透明質酸酶表達和/或分離的條件下，通過搖瓶培養、實驗室或工業發酵罐中小規模或大規模發酵(包括連續、分批、分批加料或固態發酵)來培養細胞。在包含碳源和氮源以及無機鹽的合適的培養基中，採用本領域已知的步驟進行培養。合適的培養基可由供應商提供或者可以參照公開的組成(例如，美國典型培養物保藏中心的目錄中所述)來製備。如果透明質酸酶被分泌到培養基中，則可以直接從培養基中回收。如果透明質酸酶不分泌，可以從細胞裂解物中回收。可以用本領域已知方法回收所產生的透明質酸酶。例如，可以通過常規操作(包括，但不限於離心、過濾、抽提、噴霧乾燥、蒸發或沉澱)從培養基中回收。可以通過各種本領域已知的操作來純化本發明所述透明質酸酶，這些操作包括，但不限於層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、層析聚焦、和大小排阻層析)、HPLC、電泳(例如，製備性等電點聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或抽提(參見例如，蛋白質純化，J.C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers, NewYork, 1989)。發明的有益效果該發明的透明質酸酶是一種新酶，未見報導，該酶酶活高，解決了現有發酵來源的透明質酸酶酶活低、動物來源的透明質酸酶成本高的缺點。本發明生產低分子透明質酸或其鹽的製備方法操作簡單，條件溫和，對產品結構無破壞，無環境汙染，而且發酵來源的透明質酸酶成本低，適合大規模工業化生產。本發明製備的低分子透明質酸鹽具有透皮吸收性好、純度高、無細胞毒性、抗氧化能力強、顏色無褐變等優點，可用在化妝品、食品及醫藥領域。


圖1:SDS-PAGE 電泳圖。其中 ，Marker 為 Unstained Protein Molecular WeightMarker，泳道1、2、3分別為實施例10、11、12製備的透明質酸酶。圖2:溫度對透明質酸酶活性的影響以及透明質酸酶的熱穩定性實驗結果。圖2A，溫度對酶活性的影響；圖2B，透明質酸酶的熱穩定性實驗結果。圖3:pH對透明質酸酶活性的影響以及透明質酸酶的pH穩定性實驗結果。圖3A，pH對酶活性的影響；圖3B,透明質酸酶的pH穩定性實驗結果。圖4A:低分子透明質酸鹽的DPPH自由基清除能力。圖4B:低分子透明質酸鹽的還原能力。圖5A:低分子透明質酸鹽對L929細胞UVA輻照後的修復作用。圖5B:低分子透明質酸鹽對L929細胞UVA輻照的防護作用。本發明涉及保藏的生物材料:本發明芽孢桿菌(Bacillus sp.)A50，其於2012年2月8日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.5744，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，100101。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。下述的實施例或比較例或實驗例中，低分子透明質酸鹽的分子量測定採用GPC-MALLS法；含量測定採用HPLC法或咔唑法。低分子透明質酸與直接發酵製得的透明質酸(結構未被破壞)都是由N-乙醯氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖重複單位構成的，因此它們的含量等於雙糖的含量，可以用芽孢桿菌透明質酸酶將低分子透明質酸或普通透明質酸降解成雙糖，通過HPLC法測定雙糖含量，得到低分子透明質酸鹽的含量；還可採用咔唑法(凌沛學.透明質酸M.北京:中國輕工業出版社，2002)測定低分子透明質酸的含量。如果透明質酸或其鹽的結構受到破壞，則透明質酸酶不會對破壞部分的糖苷鍵進行裂解，這樣會造成雙糖含量降低。而咔唑法的測定原理是通過測定己糖醛酸的含量來推測低分子透明質酸或直接發酵製得的透明質酸的含量。因此，也可用這兩種方法測得的含量的差值來間接地考察透明質酸或其鹽的結構是否受到破壞及破壞的程度。本發明降解透明質酸或其鹽所用的透明質酸酶(即芽孢桿菌透明質酸酶，下同)是由芽孢桿菌A50發酵得透明質酸酶發酵液，然後經離心、硫酸銨分級沉澱、超濾等步驟得到的。其製備過程是:取斜面菌種(芽孢桿菌(Bacillus sp.) A50 CGMCC N0.5744)接種於已滅菌的種子培養基中，25 - 400C UOO - 200rpm下培養10 — 24小時，然後將種子液接種於已滅菌的發酵培養基中，接種量為3 — 15%，25 — 400C >100 — 300rpm下培養12 — 24小時，發酵過程中用酸將PH維持在6.0 — 8.0,發酵結束得透明質酸酶發酵液，發酵液經10000 - 15000rpm離心10 — 20min得上清液，，將上清液中加入硫酸銨，使其質量體積濃度為20% — 25%，過濾產生的沉澱，然後繼續加入硫酸銨，至其質量體積濃度為35% -40%為止，得到的沉澱即為透明質酸酶，溶於磷酸鹽緩衝液中，最後經3 X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得酶解用透明質酸酶。所用的 培養基為:
斜面培養基(IOOmL):蛋白腖0.2 — 2.0g，酵母粉0.2 — 2.0gjK2HPO4.3Η20 0.05 —0.15g，MgSO4.7H20 0.05 — 0.15g，葡萄糖 0.5 - 1.5g，瓊脂粉 2.0g, pH 調至 6.0 — 8.0，水，斜面培養的溫度為25 - 40°C。種子培養基(IOOmL):蛋白腖0.2 — 2.0g，酵母粉0.2 — 2.0gjK2HPO4.3Η20 0.05 —0.15g, MgSO4.7H20 0.05 — 0.15g,葡萄糖 0.5 — 1.5g, pH 調至 6.0 — 8.0。發酵培養基(IOOmL):蛋白腖0.2 — 2.0g，酵母粉0.2 — 2.0gjK2HPO4.3Η20 0.05 —0.15g, MgSO4.7Η20 0.05 — 0.15g，葡萄糖 0.5 - 1.5g，吐溫 800.05mL，pH 調至 6.0 - 8.0。採用中國藥典方法(參照中國藥典2010版附錄YD C玻璃酸酶測定法)測定由以上方案製得的發酵液中的透明質酸酶活力在IXlO5 — 3X105IU/mL，純化後的透明質酸酶比活為 8 X IO6 — 1.5 X 107IU/mg。實施例1:芽孢桿菌(Bacillus sp.) A50的獲得和鑑定1.芽孢桿菌(Bacillus sp.)A50 的獲取將裝有富集培養基的平皿打開蓋，放置於空氣中，收集空氣中沉降菌，約I小時後，蓋上蓋，置於25 — 40°C培養箱中有氧培養,培養24小時後,將分離得到的單菌落接種於篩選培養基中，25 — 40°C，150rpm，有氧培養12 — 16小時，採用中國藥典方法測定透明質酸酶活力，選擇酶活力最高的菌種作為本發明的菌種，菌種酶活力可達105IU/mL。上述所採用的各培養基組成如下:富集培養基(IOOmL):蛋白腖0.2 — 2.0g，酵母粉0.2 — 2.0g，K2HPO4.3Η20 0.05 —0.15g，MgSO4.7H20 0.05 — 0.15g，透明質酸鈉 0.01 — lg，瓊脂粉 2.0g。篩選培養基(IOOmL):蛋白腖0.2 — 2.0g，酵母粉0.2 — 2.0gjK2HPO4.3Η20 0.05 —0.15g，MgSO4.7Η20 0.05 — 0.15g，透明質酸鈉 0.01 — lg。得到芽孢桿菌(Bacillus sp.) A50於2012年2月8日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.5744，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，100101。2.芽孢桿菌(Bacillus sp.)A50的形態特徵菌體杆狀，單個或鏈狀。菌落乳白色，有皺褶。3.芽孢桿菌(Bacillus sp.) A50的分子生物學特徵鑑定按照Weisburg的方法合成細菌16S rDNA通用引物:引物1:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ；(SEQ ID NO:4)；引物2:5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID NO:5)。以菌株A50的總DNA (使用北京天恩澤柱式細菌基因組DNAout試劑盒提取)為模板，擴增其16S rDNA片段，PCR擴增反應體系如下:
權利要求
1.一種製備低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽的方法，包括使用由保藏號為CGMCCNo. 5744的芽孢桿菌製得的透明質酸酶或者SEQID NO 2所編碼的透明質酸酶對分子量大於IOOOkDa的透明質酸或其鹽進行降解的步驟。
2.根據權利要求I所述的方法，其包含如下步驟 1)配製透明質酸或其鹽溶液向純化水中加入分子量大於IOOOkDa的透明質酸或其鹽，配製成質量體積濃度為O. 1% — 2%的溶液； 2)酶解調節步驟I)中溶液的溫度為20- 48°C、pH為4 一 9，然後向其中加入芽孢桿菌透明質酸酶，將透明質酸或其鹽酶解至所需分子量，得酶解液； 3)滅活將酶解液在50— 90°C下保持10 — 60min,對芽孢桿菌透明質酸酶進行滅活； 優選地，還包括如下步驟 4)過濾向滅活後的酶解液中加入易溶性無機鹽，攪拌至完全溶解，然後用孔徑為O. 45m的濾膜過濾，得濾液，每IOOmL酶解液中加入O. I 一 IOg的易溶性無機鹽； 5)沉澱將步驟4)的濾液與濾液體積I一 10倍的醇或酮混合均勻，析出低分子透明質酸鹽沉澱； 6)脫水乾燥將步驟5)中的低分子透明質酸鹽沉澱分離出來，用有機溶劑脫水，然後真空乾燥，得低分子透明質酸鹽。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，步驟I)中，每Ikg透明質酸或其鹽中加IO6-IO7IU的芽孢桿菌透明質酸酶。
4.根據權利要求2所述的方法，其中，步驟2)中，酶解溫度為35- 45°C，酶解pH為5. 5 - 7. 5，將透明質酸酶解至分子量為IOkDa — IOOOkDa0
5.根據權利要求2所述的方法，其滿足如下的A— F中的任一項或多項 A.步驟I)中，透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽或鋅鹽； B.步驟2)中，採用酸或鹼調節pH至4一 9，所述酸為鹽酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述鹼為氫氧化鈉或氫氧化鉀； C.步驟3)中，將酶解液在55- 65°C下保持20 — 30min，對芽孢桿菌透明質酸酶進行滅活； D.步驟4)中，所述易溶性無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋅鹽或鎂鹽；優選鈉、鉀、鈣、鋅、鎂的氯化物、硫酸鹽、或硝酸鹽； E.步驟5)中，所述醇或酮為乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或異丙醇； F.步驟6)中，脫水所用的有機溶劑為酮或醇。
6.一種低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽，其由權利要求I至5中任一項所述的方法製得。
7.一種低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽，其N-乙醯氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖的含量≥ 90%或≥95% (w/w);具體地，所述N-乙醯氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖的含量通過HPLC法測得。
8.根據權利要求6或7所述的低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽，其分子量為IOkDa - IOOOkDa ;優選為 IOkDa — 770kDa 或 IOkDa — 700kDa 或 IOkDa — 600kDa 或 IOkDa —500kDa ;更優選為 IOkDa — 400kDa ;進一步優選為 IOkDa — 300kDa、IOkDa — 200kDa、IOkDa 一 150kDa、IOkDa — lOOkDa、IOkDa — 50kDa 或 IOkDa — 30kDa。
9.一種組合物，其包含權利要求6至8中任一項所述的低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽；可選地，其還包含藥學上或食品學上可接受的載體或輔料。具體地，所述組合物為化妝品；更具體地，所述化妝品為防曬、曬後修復、抗衰老、或保溼的化妝品。
10.權利要求6至8中任一項所述的低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽在製備促血管生成和/或促進創傷癒合或抗氧化或清除自由基或防曬或曬後修復或促進HUVEC細胞增殖或抗腫瘤或提高免疫力的藥物或者在製備食品或保健品或化妝品中的用途；具體地，所述化妝品為防曬、曬後修復、抗衰老、或保溼的化妝品。
11.一種在體內或體外促血管生成和/或促進創傷癒合或抗氧化或清除自由基或防曬或曬後修復或促進HUVEC細胞增殖或抑制腫瘤細胞的方法,包括給與受試者或使用有效量的權利要求6至8中任一項所述的低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽的步驟；具體地，所述受試者為哺乳動物，更具體地，所述受試者為人。
全文摘要
本發明屬於酶學和藥物化學領域，涉及一種低分子透明質酸鹽、其製備方法及用途。具體地，所述製備方法包括使用由保藏號為CGMCC No.5744的芽孢桿菌製得的透明質酸酶或者SEQ ID NO2所編碼的透明質酸酶對分子量大於1000kDa的透明質酸或其鹽進行降解的步驟。本發明利用芽孢桿菌生產的透明質酸酶製備低分子透明質酸或其鹽的方法操作簡單，條件溫和，對產品結構無破壞，無環境汙染，而且發酵來源的透明質酸酶成本低，適合大規模工業化生產。本發明製備的低分子透明質酸鹽具有透皮吸收性好、純度高、無細胞毒性、抗氧化能力強、顏色無褐變等優點，可用在化妝品、食品及醫藥領域。
文檔編號A61K8/73GK103255187SQ20121049937
公開日2013年8月21日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年2月21日
發明者郭學平, 石豔麗, 王冠鳳, 馮寧, 李海娜, 喬莉蘋, 毛華, 欒貽宏, 劉愛華 申請人:華熙福瑞達生物醫藥有限公司