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基於Biolog技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法

2023-11-12 04:41:57 1

基於Biolog技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法
【專利摘要】基於Biolog技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,涉及一種降解功能菌群的篩選方法,包括選取含有PAEs降解功能菌群的環境介質作為菌源;將上述菌源製成菌懸液,接種於馴化培養基中進行培養;Biolog生態板接種和培養,確定能夠被菌群利用的優勢碳源;按C:N=25:1分別配製含不同優勢碳源的馴化培養基;檢測菌群對PAEs的降解能力變化,篩選出使菌群保持最高降解能力的培養方案;在培養過程中檢測菌群的PAEs降解功能和菌群結構特徵,若在連續2代培養過程中,菌群對PAEs的降解能力和菌種組成穩定,則獲得了PAEs降解功能菌群。本發明方法得到的PAEs降解功能菌群能夠保持多種菌間的協同作用,具有較高的降解效率。
【專利說明】基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種降解功能菌群的篩選方法,特別是涉及一種基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法。

【背景技術】
[0002]鄰苯二甲酸酯又名酞酸酯(PAEs),是一類普遍使用的化學工業品,主要用作增塑齊[J,也應用於塗料、油漆、醫療產品、汽車玻璃、化妝品、殺蟲劑等產品的生產過程中。近年來,由於PAEs類化合物的大量生產與廣泛應用,導致其大量進入環境,在水、大氣、土壤及生物體等各種環境介質中均有檢出,現已成為最普遍的全球性汙染物之一。PAEs類化合物具有環境雌激素效應,長期接觸可對人類與動物的行為和生殖能力產生不良影響,部分PAEs類化合物(如鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯,DEHP)還具有「三致」效應,對人體健康和生態系統安全構成極大威脅。
[0003]近年來,國內外學者針對PAEs在土壤中的微生物降解、非生物降解、植物吸收與揮發等環境行為開展了大量的研究工作。結果表明,微生物降解是PAEs從土壤環境中消減的主要途徑。因此,篩選獲得PAEs高效降解菌具有重要的實踐意義,可為消除PAEs汙染、保護生態環境、保障農產品安全提供菌種資源和技術支撐。
[0004]目前,已有研究中報導的PAEs降解菌主要為單一菌。然而,單一菌在實際應用中存在一定的弊端。一方面,單一菌在純化過程中失去了與自然條件下長期處於協同關係的其他菌共存的機會,導致降解功能大大降低;另一方面,單一菌孤立生長,容易受到其它菌的汙染和抑制,難以在複雜的環境中正常生長和發揮作用,從而難以成功應用於環境治理和修復中。因此,研究開發PAEs高效降解菌群,建立篩選與培養方法對於PAEs汙染環境的修復治理具有重要意義。
[0005]B1log技術是由美國的B10L0G公司於1989年開發成功的能夠進行95種唯一碳源的生化反應測試技術,最初應用於純種微生物鑑定。1991年,Garland和Mill開始將這種方法應用於土壤微生物群落的研究。B1log技術用於環境微生物群落研究,具有以下特點:①靈敏度高,分辨力強。②無需分離培養純種微生物,可最大限度地保留微生物群落原有的代謝特徵。③微生物對不同碳源代謝能力的測定在一塊微平板上一次完成,大大提高測試效率。


【發明內容】

[0006]本發明的目的在於提供一種基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,該方法以PAEs的降解功能為核心,通過定向馴化獲得高效穩定的PAEs降解菌群。本發明方法得到的PAEs降解功能菌群能夠保持多種菌間的協同作用,具有較高的降解效率。
[0007]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,所述方法包括以下過程:
1)選取含有PAEs降解功能菌群的環境介質作為菌源;
2)將上述菌源製成菌懸液,接種於馴化培養基中進行培養,並逐級進行定向馴化培養;
3)B1log生態板接種和培養,確定能夠被菌群利用的優勢碳源;
4)按C:N=25:1分別配製含不同優勢碳源的馴化培養基,繼續進行馴化培養;
5)檢測菌群對PAEs的降解能力變化,篩選出使菌群保持最高降解能力的培養方案,並進行傳代培養;
6)在培養過程中檢測菌群的PAEs降解功能和菌群結構特徵,若在連續2代培養過程中,菌群對PAEs的降解能力和菌種組成穩定,則獲得了 PAEs降解功能菌群。
[0008]所述的基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,所述含有PAEs降解功能菌群的環境介質為連續多年進行農業生產的塑料蔬菜大棚土壤、塑料製品廠廠區土壤或其廢水處理車間產生的活性汙泥。
[0009]所述的基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,所述馴化培養基為以PAEs為唯一碳源的無機鹽培養基,其配方為:Κ2ΗΡ04.3Η20 l.0g.Γ1, NaCl1.0.ΙΛ (NH4) 2S04 0.5g.ΙΛ MgS04.7H20 0.4g.?Λ CaCl2 0.0755 g.?Λ FeCl3.6H20
0.0143 g.!/1,水 1000 ml, pH 7.0。
[0010]所述的基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,所述每升培養基中加入一種或多種PAEs,如鄰苯二甲酸正二丁酯(DnBP、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP))的丙酮溶液,使培養基中PAEs終濃度分別為50mg七1、100mg噸―1和150mg噸―1,分裝到三角瓶中,20ml/瓶,121 °C滅菌30 min。
[0011]所述的基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,所述B1log生態板接種和培養,確定能夠被菌群利用的優勢碳源的方法為:將菌液依次稀釋至10 3?10 6,向B1log生態板上每孔加入150μ1稀釋液,然後置於25°C恆溫培養箱中培養,每隔24h用B1log Reader進行測定,測定波長為590 nm。根據測定結果分析菌群對不同碳源的利用情況,確定能夠被菌群利用的優勢碳源。

【具體實施方式】
[0012]下面結合實施例,對本發明作進一步詳述。
[0013]本發明的篩選過程,包括:
1.選取含有PAEs降解功能菌群的環境介質作為菌源。
[0014]2.將上述菌源製成菌懸液,接種於馴化培養基中進行培養,並逐級進行定向馴化培養。
[0015]3.B1log生態板接種和培養,確定能夠被菌群利用的優勢碳源。
[0016]4.按C:N=25:1分別配製含不同優勢碳源的馴化培養基,繼續進行馴化培養。
[0017]5.檢測菌群對PAEs的降解能力變化,篩選出使菌群保持最高降解能力的培養方案,並進行傳代培養。
[0018]6.在培養過程中檢測菌群的PAEs降解功能和菌群結構特徵,若在連續2代培養過程中,菌群對PAEs的降解能力和菌種組成穩定,則獲得了 PAEs降解功能菌群。
[0019]含有PAEs降解功能菌群的環境介質為連續多年進行農業生產的塑料蔬菜大棚土壤、塑料製品廠廠區土壤或其廢水處理車間產生的活性汙泥。
[0020]馴化培養基為以PAEs為唯一碳源的無機鹽培養基,其配方為:K2HP04.3H20l.0g.L'NaCl 1.0.?Λ (NH4) 2S04 0.5g.?Λ MgS04.7Η20 0.4g.Γ1,CaCl2 0.0755 g.?ΛFeCl3.6H20 0.0143 g.!/1,水1000 ml, pH 7.0。每升培養基中加入一種或多種PAEs (如鄰苯二甲酸正二丁酯(DnBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)等)的丙酮溶液,使培養基中PAEs終濃度分別為50mg.L'lOOmg.L-1和150mg.L ―1,分裝到三角瓶中,20ml/瓶,121°C滅菌 30 min。
[0021]B1log生態板接種和培養,確定能夠被菌群利用的優勢碳源的方法為:將菌液依次稀釋至10 3?10 6,向B1log生態板上每孔加入150μ1稀釋液,然後置於25°C恆溫培養箱中培養,每隔24h用B1log Reader進行測定,測定波長為590 nm。根據測定結果分析菌群對不同碳源的利用情況,確定能夠被菌群利用的優勢碳源。
[0022]檢測菌群PAEs降解功能的方法為液液萃取-氣相色譜法。向馴化培養液中加入10 ml 二氯甲烷,轉移到分液漏鬥中,振蕩萃取10 min,靜置,收集有機相;水相再分別用10ml色譜純二氯甲烷萃取2次,合併有機相,經無水Na2S04除水後,於40°C下旋轉蒸發至近幹,用色譜純正己烷定容至1.0 mL,備測。用氣相色譜儀測定待測液中PAEs含量,測定條件:DB-5 色譜柱(30m*0.32mm), FID 檢測器,分析程序:柱溫:150°C 0.5min ;5°C.min—1,220V ;3°C.min—1 275°C ;保持5min。檢測器溫度:300°C ;進樣口溫度:275°C ;氮吹速度:
1.2ml.mirT1;進樣體積lul,不分流進樣模式。
[0023]菌種組成的檢測方法為聚合酶鏈式反應一變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術。首先提取複合菌群總DNA,然後其為模板,採用細菌16S rDNA V3區引物F338-GC和R518進行PCR擴增,擴增的目的片段約為230bp。擴增產物進行變性梯度凝膠電泳(DGGE),比較分析各代間菌種組成的變化,當連續2代之間的PCR-DGGE條帶穩定時,說明複合菌群組成穩定。
[0024]實施例1:
一種基於B1log技術的DEHP降解菌群的篩選方法,包括以下過程:
1.選取瀋陽市郊棚齡為20年的塑料蔬菜大棚土壤作為菌源。
[0025]2.將上述菌源製成菌懸液,接種於選擇培養基中進行培養,並逐級進行定向馴化培養,馴化培養基中的DEHP終濃度依次為50mg.L-1,100mg.L-1,150mg.L-1。
[0026]3.B1log生態板接種和培養。將菌液依次稀釋至10_6,向B1log生態板上每孔加入150μ1 土壤稀釋液,然後置於25°C恆溫培養箱中培養,每隔24h用B1log Reader進行測定,測定波長為590 nm。根據測定結果分析菌群對不同碳源的利用情況,確定能夠被菌群利用的優勢碳源。結果發現α-D-乳糖、甘氨醯-L-穀氨酸、腐胺是能夠被菌群利用的優勢碳源。
[0027]4.按C:N=25:1分別配製含不同優勢碳源的馴化培養基,繼續進行馴化培養。
[0028]5.檢測菌群對PAEs的降解能力變化,篩選出使菌群保持最高降解能力的培養方案,並進行傳代培養。結果表明培養基中添加a -D-乳糖時菌群獲得了最高的降解能力。當培養液中DEHP初始濃度為150mg.L—1時,按1%的接種量接種混合菌群,培養24h,DEHP的降解率可達到98.02%。
[0029]6.在培養過程中檢測菌群的PAEs降解功能和菌群結構特徵,結果表明經連續3代培養以後,菌群對PAEs的降解能力和菌種組成穩定,該菌群即可作為DEHP降解功能菌群。
【權利要求】
1.基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,其特徵在於,所述方法包括以下過程: 選取含有PAEs降解功能菌群的環境介質作為菌源; 將上述菌源製成菌懸液,接種於馴化培養基中進行培養,並逐級進行定向馴化培養; B1log生態板接種和培養,確定能夠被菌群利用的優勢碳源; 按C:N=25:1分別配製含不同優勢碳源的馴化培養基,繼續進行馴化培養; 檢測菌群對PAEs的降解能力變化,篩選出使菌群保持最高降解能力的培養方案,並進行傳代培養; 在培養過程中檢測菌群的PAEs降解功能和菌群結構特徵,若在連續2代培養過程中,菌群對PAEs的降解能力和菌種組成穩定,則獲得了 PAEs降解功能菌群。
2.根據權利要求1所述的基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,其特徵在於,所述含有PAEs降解功能菌群的環境介質為連續多年進行農業生產的塑料蔬菜大棚土壤、塑料製品廠廠區土壤或其廢水處理車間產生的活性汙泥。
3.根據權利要求1所述的基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,其特徵在於,所述馴化培養基為以PAEs為唯一碳源的無機鹽培養基,其配方為:K2HPO4.3H20 1.0g.ΙΛ NaCl 1.0.?Λ (NH4)2SO4 0.5g.?Λ MgSO4.7H20 0.4g.?Λ CaCl20.0755 g.ΙΛ FeCl3.6H20 0.0143 g.?Λ水 1000 ml, pH 7.0。
4.根據權利要求3所述的基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,其特徵在於,所述每升培養基中加入一種或多種PAEs,如鄰苯二甲酸正二丁酯(DnBP、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP))的丙酮溶液,使培養基中PAEs終濃度分別為50mg.L \ 10mg.L 1 和 150mg.L1,分裝到三角瓶中,20ml/ 瓶,121°C滅菌 30 min。
5.根據權利要求1所述的基於B1log技術的鄰苯二甲酸酯類降解功能菌群的篩選方法,其特徵在於,所述B1log生態板接種和培養,確定能夠被菌群利用的優勢碳源的方法為:將菌液依次稀釋至1(Γ3?10 _6,向B1log生態板上每孔加入150μ1稀釋液,然後置於25°C恆溫培養箱中培養,每隔24h用B1log Reader進行測定,測定波長為590 nm ;根據測定結果分析菌群對不同碳源的利用情況,確定能夠被菌群利用的優勢碳源。
【文檔編號】C12N1/02GK104480037SQ201410677065
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月21日 優先權日:2014年11月21日
【發明者】李玉雙, 侯永俠, 宋雪英, 胡曉鈞, 郭倩, 楊晶 申請人:瀋陽大學

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