在植物中控制關鍵乙烯激素信號傳導途徑蛋白的目標周轉率以調節乙烯敏感性的製作方法

2023-11-11 20:29:07

專利名稱：在植物中控制關鍵乙烯激素信號傳導途徑蛋白的目標周轉率以調節乙烯敏感性的製作方法
在植物中控制關鍵乙烯激素信號傳導途徑蛋白的目標周轉
率以調節乙烯敏感性
背景技術：
植物激素乙烯是調節植物生命周期中的許多生理學過程的信號傳導分子，這些生理學過程包括發芽期間、花和果實發育過程中，以及植物對各種環境應激源的反應，例如乾旱、熱、鹽度過量以及疾病的反應(參見例如，Chen等，2005，Annals of Botany, 95 901-915 ；Czarny 等，2006 Biotechnol. Adv.，24 :410-419)。乙烯生物合成途徑和信號傳導/調節途徑及網絡是公知的。例如，參見

圖1和2，Wang等，「乙烯生物合成和信號傳 ^ Mt^" (Ethylene Biosynthesis and Signaling Networks)，《才直__·》(The Plant Cell)，2002(美國植物生物學家協會(American Society of Plant Biologists)編著)， 第 S131-S151 頁。在植物中，乙烯信號傳導途徑中的幾個關鍵步驟受到高度調節。就EIN2(乙烯不敏感幻和EIN3(乙烯不敏感幻蛋白而言，它們的表達受乙烯誘導，其導致乙烯應答增加。 此外，ETP1(EIN2靶向蛋白1)和ETP2(EIN2靶向蛋白2)或EBFI (結合EIN3的F盒蛋白1) 和EBF2(結合EIN3的F盒蛋白幻分別靶向EIN2和EIN3蛋白的周轉。在不存在乙烯激素的情況下，這些關鍵應答信號傳導蛋白的周轉幫助將植物維持在抑制或「關閉」狀態。在轉基因擬南芥(Arabidopsis)中組成型過表達 ETPl 或 ETP2 (Qiao 等，Genes Dev. ,23 :000-000, 2008 年 2 月 12 日在線公開)或 EBFl 或 EBF2 (Guo 和 Ecker，2003 Cell, 115 :667-677)分別導致部分乙烯不敏感和EIN2或EIN3蛋白的蓄積減少。商業上，調節包括水果、蔬菜和花卉等植物中的乙烯效應的常規途徑涉及將化學物質施用於植物、水果、花卉或蔬菜，例如1-甲基環丙烯(1-MCP ；農新有限公司(AgroFresh he.))。I-MCP是可用作植物生長調節劑，防止乙烯與其在植物組織中受體結合的化合物。 其應用增加了植物對乙烯的不敏感性。乙烯敏感性的短暫消除可能增加植物對應激的抵抗力或耐受、延遲成熟、枯萎或開花，以及進行其他有商業價值的植物生長操縱。近來，提出了用修飾的乙烯效應受體或參與植物中乙烯效應的其他蛋白質遺傳轉化植物細胞的建議，例如參見美國專利6四4716 ；美國專利申請公開2006/0200875、 2005/0066389、2005/0060772和2004/0128719等。這些系統針對乙烯途徑中的各種突變基因的表達。這些系統通常採用各種建議的啟動子來啟動蛋白質的表達，包括組成型啟動子和組織特異性啟動子。雖然已經提出將化學調節的基因表達系統用於植物物種(M. Padidim 2003 Curr. Opin Plant Biol. ,6(2) 169-77)，但許多這些系統僅僅是實驗性的，或者已經報導存在一些缺陷。這些缺陷包括使用毒性或揮發性誘導劑、誘導水平低、在植物中易位/移動差、 「關閉」基因表達的能力慢、或者對植物非毒性誘導劑的特異性不夠，等等。這些基因表達系統未能在所有植物中普遍使用，操作性組件及其組合件的選擇常常充滿挑戰。在現有技術的例子中，乙烯途徑基因常常總是在植物的所有組織和部件上或者總是在植物的特定組織上表達。然而，組織特異性啟動子或低水平組成型啟動子可能有漏洞或者由不希望的誘導劑誘導。這些常規啟動子不能嚴格調節植物中的激素表達。乙烯途徑基因的表達時機、表達持續時間和表達水平是正常生理學功能的關鍵。隨意誘導乙烯不敏感性並且保持預定的時間範圍在現有技術中尚未成功實現。本領域仍然需要能夠時間可控地調節乙烯敏感性的組合物和方法。這對於存在乙烯時直接誘導其表達的基因產物特別重要。需要將這種組合物和方法安全和有效地應用於農作物和食品，以及其它植物。附圖簡要說明圖1是稱為p201的質粒的一個例子的示意圖，該質粒同時具有基因表達系統(G10 -90p-VGE-N0sT-5xGAL-M35S-ETPl-35ST)的激活盒和靶標盒，盒中各組件如實施例1和SEQ ID NO :1所示，括號中是以核酸位置表示的切割位點。該質粒的盒部分在SEQ ID NO :1中報導。序列表或圖中未提供市售可得的質粒主鏈，這些主鏈可以容易地被其他質粒主鏈代替。圖2是稱為P202的質粒的一個例子的示意圖，該質粒包含激活盒和靶向盒(G10-90p-GVE-NosT-5xGAL-M35S-ETP2-35ST)，利用GVE受體-介導的ETP2的誘導性表達來表達 ETP2。該質粒的盒部分在SEQ ID NO :2中報導。序列表或圖中未提供市售可得的質粒主鏈，這些主鏈可以容易地被其他質粒主鏈代替。圖3A是稱為ρ 1004的質粒的一個例子的示意圖[G10-90p-VGE-N0sT-5xGAL_M35S -ETPl 和 MMVp-def-rbcS-E9t]，其組件如 SEQ ID NO 3 和圖!3B-3I 所示，即 G10-90 組成型啟動子，VP16激活域和GAL4DNA結合域，以及與NOS終止子序列相連的野生型蛻皮激素受體配體結合域，由五個拷貝的GAL4效應原件和最小35S啟動子組成的誘導型啟動子，ETPl 基因，35S終止子序列，MMV啟動子，P-DEF標記基因和rbcS_E9終止子。圖!3B-3I是顯示pl004的組件的序列圖。圖4A是稱為ρ 1005的質粒的一個例子的示意圖[G10-90p-GVE-NosT-5xGAL_M35S -ETP2 和 MMVp-def-rbcS-E9t]，其組件如 SEQ ID NO 4 和圖 4B-4I 所示，即 G10-90 組成型啟動子，GAL4 DNA結合域，VP16激活域，以及與NOS終止子序列相連的野生型蛻皮激素受體配體結合域，由五個拷貝的GAL4效應原件和最小35S啟動子組成的誘導型啟動子(SEQ ID NO 4的核苷酸M93-2M8)，ETP2基因，35S終止子序列，MMV啟動子，P-DEF標記基因和 rbcS-E9終止子。圖4B-4I是其顯示pl005的組件的序列圖。

發明內容
本文所述組合物和方法通過提供能夠以時序、定性和/或定量方式可靠而安全地控制乙烯敏感性調節的轉基因植物、植物細胞、組織、器官、果實或花而滿足了本領域的需要。這些組合物和方法能夠嚴格調節基因表達和激素表達，可安全應用於農作物和食物以及其他有商業價值的植物。在一個方面，提供一種可控地抑制某些乙烯誘導性蛋白在植物細胞中蓄積的基因表達系統。該系統包括激活盒和靶標盒，激活盒和靶標盒可以位於一個或多個質粒上。激活盒包括合適的啟動子、DNA-結合域(DBD)、蛻皮激素受體配體結合域(EcRLBD)；和激活域 (AD)。靶標盒包括化學誘導的啟動子(可以是化學誘導性組織特異性啟動子)，該啟動子包括操作性相連的效應元件和最小啟動子，DBD結合該效應元件，最小啟動子對AD起反應。該化學誘導性啟動子控制著編碼所選的調控蛋白或其片段的靶核酸序列的表達，表達時操作降低EIN2或EIN3基因產物的表達。植物細胞中兩個盒中各組件與誘導組合物的相互作用能可控地增加調控蛋白的表達，並抑制存在乙烯時EIN2或EIN3基因產物在植物中的蓄積。 可通過調節施加誘導組合物的時機、濃度和持續時間來控制對EIN2或EIN3基因產物蓄積的抑制作用。誘導組合物可被植物細胞吸收和易位到植物細胞內，在細胞內與激活域相互作用以啟動靶標盒的化學誘導型啟動子。因此，該系統允許以可控和選擇性方式調節植物細胞的乙烯敏感性，通過使調控蛋白的表達水平足夠高，以克服植物對乙烯的正常反應，即增加乙烯誘導性蛋白，如EIN2或EIN3的表達，進而在植物中導致乙烯信號傳導途徑下遊的激活。在另一方面，提供了一種瞬時或穩定地表達上述基因表達系統的植物細胞。在另一方面，提供了一種瞬時或穩定地表達上述基因表達系統的植物組織或器官。在另一方面，提供了一種瞬時或穩定地表達上述基因表達系統的轉基因植物。在另一方面，一種製備這種轉基因植物或其部分的方法，該方法包括用本文所述的基因表達系統轉化至少一個植物細胞；由轉化的植物細胞產生植物細胞、組織、器官或完整植株；和當植物細胞、組織、器官或完整植株在乙烯存在下接觸誘導組合物時選擇顯示能抑制或降低EIN2或EIN3的蓄積的植物細胞、組織、器官或完整植株。如上所述，可通過施加誘導組合物的時機、濃度和持續時間來控制對EIN2/EIN3蛋白蓄積的調控，導致調節性蛋白表達增加到足夠高的水平。誘導組合物可以被植物細胞、組織、器官或完整植株吸收和易位到這些植物細胞、組織、器官或完整植株內。在又一方面，一種控制植物中由乙烯誘導蛋白如EIN2或EIN3表達導致的乙烯敏感性的方法，該方法包括將誘導組合物施加於轉基因植物或其部分的細胞，所述植物包含能夠穩定或瞬時表達本文所述基因表達系統的細胞。誘導組合物可以被植物細胞吸收和易位到植物細胞內。在誘導組合物存在下，植物細胞對乙烯的反應，即EIN2或EIN3的正常增加，以及乙烯信號傳導途徑下遊的進一步激活在所選時間上受到抑制或降低；在所選時間過後通過去除植物中的誘導劑提高植物細胞對乙烯的反應。可通過施加誘導組合物的時機、濃度和持續時間，以及高水平表達調控蛋白使該植物對乙烯不敏感的能力，來控制 EIN2/EIN3蛋白表達的調控。在一個實施方式中，誘導組合物的時機、濃度或持續時間允許過度表達調控蛋白，以降低或抑制乙烯存在下乙烯誘導性信號蛋白在植物細胞中的蓄積。下面的發明詳述中將進一步描述這些方法和組合物的其他方面和優點。發明詳述本文所述組合物和方法解決了本領域對於可控調節植物中乙烯敏感性的組合物和方法的需要。更具體說，本文所述的組合物和方法能夠基於選定量化學誘導劑的使用和 EIN2/EIN3調控蛋白(分別對應於ETPl和ETP2或EBFl和EBF2)的高水平表達，有意改變乙烯誘導蛋白如EIN2或EIN3的表達水平，以使該植物對乙烯不敏感。這種操控植物激素調節的能力提供了農作物的生長和成熟的農業優勢以及以下所述的其他優點。本發明人已確定，實現實踐中乙烯不敏感性的關鍵在於獲得足夠水平的靶向關鍵乙烯誘導性信號蛋白周轉的調控蛋白，以克服乙烯誘導的信號蛋白的量。使植物對乙烯不敏感能夠為植物提供某些益處，例如本文所述的應激耐受性。然而，在植物正常生長和發育的某些時間點，需要乙烯敏感性。因此，本文所述的組合物和方法可用於精確控制植物對乙烯不敏感的時機和水平，以便能夠使該植物回復到對乙烯敏感的狀態，從而保證該植物進一步的正常生長和發育。I.基因表達系統利用基因表達或調節系統在植物細胞中穩定或瞬時表達。該系統的組件包括至少兩個基因表達盒，每個盒能夠在植物細胞中表達。在一個實施方式中，第一基因表達盒稱為激活盒，其包括可以在與其操作性相連的合適啟動子控制下在植物細胞中表達的多核苷酸，該多核苷酸編碼以下組件(a) DNA-結合域(DBD)，DBD識別與準備調節其表達的基因，即編碼靶向關鍵乙烯誘導性信號蛋白如EIN2和EIN3的周轉的調控蛋白，如ETP1/ETP2或EBF1/EBF2的基因相關的效應元件； (b)配體結合域(LBD)，LBD包括蛻皮激素受體配體結合域(EcRLBD)或其功能片段；和(c) 激活或反式激活域(AD)，AD在適用於植物的誘導組合物的存在下激活。在一個實施方式中，激活盒中的組件採用以下5 『到3 『的順序存在LBD位於DBD下遊，而DBD在AD下遊。 在另一實施方式中，激活盒中的組件採用以下5'到3'的順序存在LBD位於AD下遊，而 AD在DBD下遊。在另一實施方式中，激活盒中的組件採用以下5'到3'的順序存在DBD 位於LBD下遊，而LBD在AD下遊。在另一實施方式中，激活盒中的組件採用以下5『到3' 的順序存在DBD位於AD下遊，而AD在LBD下遊。在另一實施方式中，激活盒中的組件採用以下5'到3'的順序存在AD位於LBD下遊，而LBD在DBD下遊。在另一實施方式中， 激活盒中的組件採用以下5 『到3 『的順序存在AD位於DBD下遊，而DBD在LBD下遊。激活盒還包括優選位於盒3』末端的終止子。下面將描述這些組件的具體特徵。第二基因表達盒即靶標盒，其包括編碼以下組件的多核苷酸。一個組件是化學誘導的啟動子，其包括操作性相連的效應元件(RE)和最小啟動子，激活盒編碼的蛋白質的 DBD結合RE，而最小啟動子對激活盒的AD起反應。另一個組件是靶核酸序列，該序列編碼靶向關鍵乙烯誘導性信號蛋白如EIN2和EIN3的周轉的調控蛋白，如ETP1/ETP2或EBFl/ EBF2，或其功能片段。在一個實施方式中，核酸序列是正義取向。誘導型啟動子控制選定調控蛋白質的編碼序列的表達。在另一實施方式中，激活盒和/或靶標盒還包含終止子序列，例如在編碼蛋白質序列的核酸序列下遊，以及任選的可選標記物。這種標記物是眾所周知的，用於選擇在抗生素或其他化學物質的存在下攝取基因的細胞。下面將更詳細地描述這些任選組件。植物細胞中與誘導組合物協同作用時，基因表達系統發揮作用，使得激活盒和靶標盒的各組件能夠調節選定調控蛋白的表達。選定調控蛋白的調控或調節能夠選擇性地調節植物細胞的乙烯敏感性。例如，一種調控方式包括通過降低調控蛋白的表達提高植物細胞的乙烯敏感性。在另一實施方式中，通過將調控蛋白的表達水平提高到足夠高，以克服植物在存在乙烯時的競爭性正常反應，即正常操作提高信號蛋白EIN2或EIN3的基因產物的表達和蓄積，從而降低植物細胞的乙烯敏感性。通過基因表達系統中各組分與誘導組合物的相互作用(特別是存在乙烯時)來控制植物細胞中調節乙烯途徑的調控蛋白的表達。誘導組合物可以被植物細胞吸收和/或易位到植物細胞內。提到調節信號蛋白周轉的調控蛋白的表達水平時，術語「足夠高的表達水平」指能改變細胞或植物對IOppm乙烯或10 μ M ACC(1-氨基環丙基羧酸)的反應的表達水平。在一個實施方式中，調控蛋白的表達水平足夠高，以克服乙烯或ACC存在時通常導致的信號蛋白表達增加。在另一實施方式中，調控蛋白的表達水平足夠高，以降低乙烯或ACC存在時信號蛋白的表達水平。在另一實施方式中，調控蛋白的表達水平足夠高，以克服應激植物中應激誘導的信號蛋白介導的乙烯生產，從而使植物對乙烯不敏感並克服應激對植物造成的不良影響。在該系統的一個實施方式中，第一盒和第二盒位於同一個質粒上，例如圖1和2所示。在另一實施方式中，第一和第二盒位於不同質粒上。在基因表達系統的另一個實施方式中，第一基因表達盒可包含DBD和第一 LBD ；第二盒可包含AD和第二不同的LBD ；第三盒可包含編碼效應元件的多核苷酸、啟動子和需要調節表達的靶調控基因，第一多肽的DBD結合該效應元件，第二盒的AD激活該啟動子。在該系統中，AD和DBD操作性連接於兩個不同的蛋白質，在誘導組合物的存在下可激活靶基因的表達。在一個實施方式中，第一 LBD可以是EcR LBD，第二 LBD可以是來自類視黃醇X 受體的LBD。在另一實施方式中，第二 LBD可以是EcR LBD，而第一 LBD可以是來自類視黃醇X受體的LBD。這種結構在美國專利7091038或2005年12月1日公開的美國專利公開 US 2005/0266457 中描述。術語「操作性連接」或「可操作地連接」表示單一核酸片段上核酸序列的結合，使得一個核酸序列的功能受到另一個核酸序列的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達(即編碼序列在啟動子的轉錄控制下)時，啟動子操作性連接於編碼序列。編碼序列以有義或反義取向操作性連接於調控序列。本文所用術語「表達」表示源自核酸或多核苷酸的有義(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩定累積。在一個實施方式中，表達表示mRNA翻譯形成蛋白質或多肽。在另一實施方式中，基因表達系統的組件可以在植物細胞中瞬時表達。在另一實施方式中，基因表達系統的組件可以通過整合入植物細胞的染色體內而穩定表達。瞬時或穩定整合表達的選擇可以由產生和使用本文所述基因表達系統領域中的技術人員進行選擇。術語「盒」、「表達盒」和「基因表達盒」表示能夠在特定限制位點或者通過同源重組插入核酸或多核苷酸的DNA區段。該DNA區段包括編碼感興趣多肽的多核苷酸，盒和限制位點被設計成能夠確保盒插入適當讀碼框以合適方向進行轉錄和翻譯。這些載體或質粒可任選地包含編碼感興趣多肽的多核苷酸並具有除有利於特定宿主細胞轉化的多核苷酸之外的元件。在某些實施方式中，這些盒還包含使得編碼感興趣多肽的多核苷酸在宿主細胞中表達提高的元件。這些元件包括但不限於啟動子、最小啟動子、增強子、效應元件、終止子序列、聚腺苷酸化序列等。本文使用的所有其他術語採用本領域的常規涵義，除非另有說明。參見例如，美國專利7，091，038中的術語定義。A.激活盒的啟動子在所述系統的一個實施方式中，激活盒的啟動子是能夠控制轉化的植物細胞內 DBD、LBD和AD序列的表達的核酸序列(DNA或RNA)。通常，這三種激活盒的主要組件位於選定啟動子序列的3'端。啟動子序列包括稱為增強子的近端或較遠端的上遊元件。「增強子」是能夠刺激啟動子活性的DNA序列，可以是啟動子的先天元件或是插入以增強啟動子的水平或特異性的異源元件。本文中有用的啟動子可完全源自天然基因，或者由源自天然存在的不同啟動子的不同元件組成，或者甚至包含合成的DNA區段。在一個實施方式中，激活盒的啟動子是組成型啟動子，例如導致基因大多時候在大多數細胞類型中表達的啟動子，使得用該盒轉化的植物細胞不斷產生激活盒組件。例如， 適用於所述激活盒的某些組成型啟動子包括但不限於示例性的G10-90啟動子、花椰菜花葉病毒35S啟動子、木薯花葉病毒啟動子、玄參花葉病毒啟動子、杆狀DNA病毒啟動子、紫茉莉花葉病毒啟動子、核酮糖-1，5-二磷酸羥化/加氧酶啟動子(Rubisco啟動子)、肌動蛋白啟動子或泛素啟動子。在其他實施方式中，可採用介導基因在不同組織或細胞類型中表達的啟動子(「組織特異性」、「細胞特異性」或「植物器官特異性啟動子」)。理想情況下，這種啟動子是植物組織和植物細胞固有或有功能的啟動子，或者是植物組織和植物細胞固有或有功能啟動子的突變形式。然而，也可使用在植物細胞中起作用的諸如哺乳動物、無脊椎動物等其他來源的其他組織和細胞的啟動子。其他實施方式採用在發育的不同階段表達組分的啟動子 (「發育特異性啟動子」或「細胞分化特異性啟動子」)，或者響應不同環境或生理學條件的啟動子。組織特異性啟動子的詳細列表可參見Gal 1 ie，美國專利申請公開2005/0066389， 其描述了源自以下基因的種子特異性啟動子來自玉米的MACI (Sheridan, 1996Genetics 142 :1009-1020)；來自玉米的 Cat3 (GenBank No. L05934, Abler 1993Plant Mol. Biol. 22 10131-10138)；來自擬南芥屬(Arabidopsis)的 vivparous-1 (Genbank No. U93215)；來自擬南芥屬的 atmycl ⑴rao，1996 Plant Mol. Biol. 32 :571-576 ；Conceicao 1994 Plant 5 493-505)；來自甘藍型油菜(Brassica napus)的 napA 和 BnCysPl (GenBank No. J02798, Josefsson, 1987 JBL26 :12196_12201，Wan 等，2002 Plant J 30 :1-10)；來自甘藍型油菜(Brassica napus)的 napin 基因家族(Sjodahl，1995Planta 197:264-271)。果實特異性啟動子包括來自CYP78A9基因的啟動子(Ito和Meyerowitz，2000Plant Cell 12:1541-1550)。其他組織特異性啟動子包括 Reiser，1995Cell 83:735-742，GenBank No. U39944 ；Ray, 1994Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :5761-5765 中描述的胚珠特異性 BELl 基因，以及卵和中央細胞特異性FIEl啟動子。萼片和花瓣特異性啟動子包括擬南芥屬花同源異形基因 APETALA1 (API) (Gustafson Brown, 1994Cell76 :131-143 ；Mande 1, 1992Nature 360 :273-277)，AP2 的相關啟動子(例如參見 Drews，1991Cell 65:991-1002; Bowman, 1991Plant Cell 3:749-758)。另一種有用的啟動子是控制擬南芥的罕見花器官 (ufo)基因表達的啟動子(Bossinger, 1996Development 122:1093-1102)。其他組織特異性啟動子包括玉米花粉特異性啟動子(Guerrero，1990Mol. Gen. Genet. 224 :161-168)； 也可參見 Wake ley, 1998Plant Mol. Biol. 37 187-192 ；Ficker, 1998Mol. Gen. Genet. 257 132-142 ；Kulikauskas, 1997Plant Mol. Biol. 34 :809-814 ；Treacy, 1997Plant Mol. Biol. 34 :603-611描述的啟動子)。有用的啟動子包括來自FUL基因的啟動子(Mandel和 Yanofsky, 1995Plant Cell, 7 :1763-1771)以及來自 SHPl 和 SHP2 基因的啟動子(Flanagan 等，1996Plant J 10 :343-353 ;Savidge 等，1995Plant Cell 7(6) :721-733)。啟動子可源自 TA29 基因(Goldberg 等，1995Philos Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350 :5-17)。其他合適的啟動子包括來自以下基因的啟動子編碼甘藍型油菜的2S儲存蛋白的基因(Dasgupta，1993Gene 133 =301-302)；來自擬南芥屬的k種子儲存蛋白基因家族； 編碼甘藍型油菜的油質蛋白20kD的基因，GenBank編號M63985 ；編碼大豆油質蛋白A的基因，Genbank編號U09118，和編碼大豆油質蛋白B的基因，Genbank編號U09119 ；編碼擬南芥屬油質蛋白的基因，Genbank編號Z17657 ；編碼玉米油質蛋白18kD的基因，GenBank 編號J05212和Lee, 1994Plant Mol. Biol. 26 :1981-1987 ；編碼大豆低分子量富硫蛋白的基因(Choi，1995Mol Gen，Genet. 246 :266-268)。來自番茄的組織特異性E8啟動子和來自 ATHB-8、AtPINl、AtP5Kl 或 TED3 基因的啟動子(Baima 等，2001Plant Physiol. 126 643-655, Galaweiler 1998Science 282 :2226-2230 ；Elge ^,2001Plant J. 26 561-571 ；Igarashi 等，1998Plant Mol. Biol. 36 :917-927)也是有用的。也可使用果實熟化、葉片枯萎和脫落期間以及在較小程度上花的枯萎和脫落期間有活性的番茄啟動子(Blume，1997Plant J. 12 :731-746)。其他示例性的啟動子包括編碼雌蕊特異性鹼性內切殼多糖酶的馬鈴薯(Solanum tuberosum L.) SK2基因中的雌蕊特異性啟動子(Ficker，1997Plant Mol. Biol. 35,425 =425-431)；轉基因苜蓿滋養和花柄尖的表皮組織中有活性的豌豆阿拉斯加栽培品種(Pisum sativum cv. Alaska)的Blec4基因。 可使用在滋養型組織中有活性的各種啟動子，包括控制土豆的主要儲存蛋白patatin的啟動子(例如，Kim, 1994Plant Mol. Biol. 26 :603-615 ；和 Martin, 1997Plant J. 11 :53-62) 和毛根農桿菌的 ORF 13 啟動子(Hansen，1997Mol. Gen. Genet. 254 :337-343)。其它有用的滋養型組織特異性啟動子包括編碼主要的芋頭(Colocasia esculenta L. Schott)球蓮蛋白家族的球蛋白tarin的基因的tarin啟動子(Bezerra，1995Plant Mol. Biol. 28 137-144)；仙茅甜蛋白(curculin)啟動子(de Castro, 1992Plant Cell 4:1549-1559)和菸草根部特異性基因TobRB7的啟動子(Yamamoto，1991Plant Cell 3:371-382)。葉特異性啟動子包括二磷酸核酮糖氫羧化酶(RBCQ啟動子、番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因 (Meier, 1997FEBS Lett. 415 :91-95)。幾乎只在葉片和葉鞘的葉肉細胞中高水平表達的二磷酸核酮糖羧化酶啟動子(Matsuoka，1994Plant J. 6 :311-319)，集光葉綠素a/b結合蛋白基因啟動子(Shiina，1997Plant Physiol. 115 :477-483 ；Casal, 1998Plant Physiol. 116 1533-1538)，擬南芥 myb-相關基因啟動子(Atmyb5 ；Li, 1996FEBS Lett. 379 :117-121)，和 Atmyb5 啟動子(Busk, 1997Plant J. 11 :1285-1295)都是有用的啟動子。有用的滋養型組織特異性啟動子包括分生組織(根尖和苗端)啟動子，如 「SH00TMERISTEMLESS」 和 「SCARECROW」 啟動子(Di Laurenzio, 1996Cell 86 :423-433 ；和 Long, 1996Nature 379 :66-69)。另一種有用的啟動子控制3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶HMG2基因的表達(例如參見Enjuto，1995Plant Cell. 7 :517-527)。有用的還有來自玉米和其他物種的具有分生組織特異性表達的knl相關基因，例如參見Granger，1996Plant Mol.Biol.31 :373-378 ；Kerstetter,1994Plant Cell 6 :1877-1887 ；Hake,1995Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350 :45-51，例如擬南芥KNATl 或 KNAT2 啟動子(例如參見 Lincoln,1994Plant Cell 6:1859-1876)。在激活盒的某些實施方式中，啟動子可以是誘導型或調節型的，例如在細胞接觸試劑、生物分子、化學物質、配體、光或一些其他刺激物或用這些物質處理細胞後可引起核酸序列的表達。這種誘導型啟動子的非限制性列表包括PRl_a啟動子、原核阻抑子-操縱子系統和高等真核轉錄激活系統，例如美國專利7091038中詳述。這種啟動子包括來自大腸桿菌的四環素("Tet")和乳糖(「Lac")阻抑子_操縱子系統。其他誘導型啟動子包括玉米乾旱誘導型啟動子；馬鈴薯的寒冷、乾旱和高鹽誘導型啟動子，擬南芥屬枯萎誘導型啟動子，SAG12，以及LECl、LEC2、FUS3、AtSERKl和AGLI5的胚胎發生相關啟動子，都是本領域技術人員已知的。接觸植物激素如植物生長激素或細胞激肽類後可誘導的其他植物啟動子是也有用的，例如在美國專利申請公開US2005/0066389和美國專利6，294, 716中所述。在激活盒中，能夠啟動序列DBD、LBD和AD的表達的任何啟動子基本都是合適的， 包括但不限於病毒啟動子、細菌啟動子、植物啟動子、合成啟動子、組成型啟動子、組織特異性啟動子、發育特異性啟動子、誘導型啟動子、光調節的啟動子；發病或疾病相關啟動子、 花椰菜花葉病毒19S、花椰菜花葉病毒35S、CMV35S最小、木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)、玄參花葉病毒、杆狀DNA病毒、紫茉莉花葉病毒、葉綠素a/b結合蛋白、核酮糖1-二磷酸羧化酶、 苗特異性、根特異性、殼多糖酶、應激誘導型、水稻東格魯杆狀病毒、植物超-啟動子、馬鈴薯亮氨酸氨基肽酶、硝酸還原酶、醇脫氫酶、蔗糖合酶、甘露鹼合酶、膽脂鹼合酶、真蛸鹼合酶、泛素、玉米醇溶蛋白、肌動蛋白和花色苷啟動子。在本發明優選的實施方式中，啟動子選自下組花椰菜花葉病毒35S啟動子、木薯葉脈花葉病毒啟動子和花椰菜花葉病毒35S最小啟動子、玄參花葉病毒啟動子、杆狀DNA病毒啟動子、紫茉莉花葉病毒、泛素⑴be)啟動子和肌動蛋白啟動子。B. DBD本文所用術語「DNA結合域」包括DNA結合蛋白的最小多肽序列，最長至整個DNA 結合蛋白長度，只要該DNA結合域能夠與特定效應元件結合。在有或沒有配體的存在下， DNA結合域結合RE的DNA序列以啟動或抑制受RE調控的下遊基因的轉錄。在基因表達單元的某些實施方式中，DBD位於激活盒中，而效應元件位於靶標盒中。DNA結合域可以是具有已知效應元件的任何DNA結合域，包括合成和嵌合的DNA 結合域，或其類似物、或組合、或修飾形式。在某些實施方式中，DBD是GAL4DBD、LexA DBD、 轉錄因子DBD、H類核受體成員DBD、留體/甲狀腺激素核受體超家族成員DBD或細菌LacZ DBD0更優選地，DBD是昆蟲蛻皮激素受體DBD，GAL4 DBD (參見本文所述實施例的質粒中所示的序列)，或LexA DBD。這種DBD的序列公開可得，在諸如美國專利7091038或美國專利申請公開2005/(^66457中描述。在其它實施方式中，盒中的DBD包括但不限於由cl啟動子或Iac啟動子獲得的DNA結合域，這也是公開可得的序列。C.蛻皮激素LBD和任選的第二 LBD在基因表達系統的某些實施方式中，蛻皮激素受體(EcR)LBD包括無脊椎動物蛻皮激素受體或其突變體的全部或其一部分。EcR是核留體受體超家族成員，表現為特徵DNA和配體結合域，以及激活域(Koelle等，1991，Cell,67 :5977 ；也可參見美國專利 6245531 (Stanford)。蛻皮激素受體對許多留體化合物有響應，例如松留酮A和莫瑞甾酮 A(muristerone A)和非甾體化合物。EcR具有5個模塊域，A/B (反式激活)，C(DNA結合， 異源二聚化)，D (鉸鏈，異源二聚化)，E (配體結合，異源二聚化和反式激活)和F (反式激活)結構域。這些結構域中的一些，例如A/B、C和E在與其他蛋白融合後保留功能。可以用作本文所述基因表達系統中的LBD的EcR的合適部分包括D、E和F。例如，野生型EcR LBD的序列可參見SEQ ID NO 1中的核苷酸990-1997。優選地，EcR是鱗翅類EcR、雙翅類EcR、節肢類EcR、同翅類EcR和半翅類EcR。更優選地，使用的EcR是雲杉捲葉蛾(Choristoneura fumiferana)EcR(〃 CfEcR")、黃粉蟲甲(〃 TmEcR")、菸草天蛾(Manduca sexta)EcR(〃 MsEcR「)、綠棉鈴蟲(Heliothies virescens)EcR(// HvEcR「)、家蠶蛾(Bombyx mori)EcR(// BmEcR")、 黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)EcR( 「 DmEcR 「)、埃及伊蚊(Aedes aegypti) EcR(" AaEcR 「)、綠蠅(Lucilia capitata)EcR( 〃 LcEcR 〃)、地中海果蠅 keratitis capitata)EcR(" CcEcR 「 )(Locusta migratoria)EcR( 「 LmEcR 「 )
蚜(Myzus persicae)EcR(// MpEcR「)、招潮蟹(Uca pugilator)EcR(〃 UpEcR「)、美洲純目艮蝶(Amblyomma americanum)EcR( 〃 AmaEcR 「)、銀葉粉風(Bamecia argentifoli) EcR(" BaEcR")、或黑尾葉蟬(^photetix cinctic印s)EcR(〃 NcEcR「)等。甚至更優選地，LBD來自雲杉捲葉蛾EcR(「 CfEcR")或黑腹果蠅EcR(" DmEcR")。各種野生型或突變型EcR的序列公開可得，例如美國專利7091038 ；國際專利申請TO 97/38117以及美國專利6333318、6265173和5880333中所描述的。雖然下述實施例採用了野生型EcR序列，但預計本領域技術人員可選擇突變序列進行類似應用。例如，在一個實施方式中，突變型蛻皮激素受體包含上文引用的美國專利申請
發明者J·L·羅西尚 申請人:羅門哈斯公司