基於培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡的製作方法

2023-11-07 04:09:07 2

本發明涉及免疫化學檢測技術領域，具體涉及基於培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡。

背景技術：

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，FQs)是20世紀80年代之後研製並得到廣泛應用的一類人工合成抗生素，具有良好的組織滲透性。氟喹諾酮類藥物的作用機理是抑制細菌的DNA旋轉酶，使酶不能在DNA雙鏈上引入切口，破壞細菌的代謝和繁殖，達到迅速殺滅細菌的目的，其對革蘭氏陽性和陰性桿菌、葡萄球菌和肺炎球菌均有很強的抗菌活性。最初這類藥物用於治療尿道感染，後來發展到治療系統感染性疾病，主要用於泌尿系統感染、皮膚感染、呼吸道感染、消化道炎症、傷寒和敗血症等疾病的治療。由於它們具有吸收好、半衰期長、抗菌譜廣、抗菌活性強、低毒高效、安全價廉，多數品種可以口服等許多優點，因此在臨床中得到了廣泛應用，並且在動物飼養中作為預防和治療藥物普遍使用，有時還作為飼料添加劑促進動物生長，提高生長速度與產量。

氟喹諾酮類藥物在獸醫臨床上長期和大量使用，必然會導致其在動物性食品中的殘留，從而給食品衛生及人類健康帶來潛在的危害。研究表明：長期使用氟喹諾酮類抗生素易導致動物群體體內致病菌產生耐藥性，並且這種耐藥性可能由動物微生物向人類病原菌傳播；而且該類藥物在動物體內代謝緩慢，人體攝入後，會對中樞神經系統及關節部位造成不良反應，嚴重時，可引起食用者產生遠期毒性及潛在的致癌、致畸、致突變效應。因此，氟喹諾酮類藥物殘留問題越來越引起人們的廣泛關注。我國以及世界衛生組織、歐盟、美國、日本等國家和組織都將氟喹諾酮類藥物列入限制使用的獸藥藥物清單中，並制訂出相應的最高殘留限量(maximum residue limit，MRL)和休藥期，而且加大了其殘留監管力度。歐盟規定：動物肌肉、肝臟和腎臟中二氟沙星、恩諾沙星(恩諾沙星+環丙沙星)、沙拉沙星等氟喹諾酮類獸藥最高殘留量為0.01-1.9mg/kg；美國和加拿大規定：氟喹諾酮為養蜂業禁用藥物，蜂王漿中各種氟喹諾酮類藥物MRL為5μg/kg；日本2006年5月29日開始實施「肯定列表制度」後，除有暫定標準的藥物如恩諾沙星、噁喹酸等外，其餘FQs均按10μg/kg的「一律標準」；我國規定FQs在牛奶中的MRL分別為：恩諾沙星(恩諾沙星+環丙沙星)為100μg/L，達氟沙星為30μg/L，氟甲喹為50μg/L。2015年9月9號，中華人民共和國農業部公告(第2292號)，自2016年12月31日起，停止經營、使用用於食品動物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種製劑。

國內外用於FQs藥物殘留檢測的方法較多，主要包括高效液相法(HPLC)以及與此相關的HPLC-UV、HPLC-FD、HPLC-DVD、LC-MS/MS，LC-ESI-MS/MS，另外還有螢光光譜法、高效毛細管電泳法、薄層色譜法、ELISA、膠體金試紙、微生物學方法和電解分析法等。膠體金標記免疫分析法是近年來迅速發展的一種新型分析技術，其特點是簡便快速、成本低、無汙染、無需培訓，非常適合於現場檢測，與ELISA相比，具有樣品前處理簡單，顯色時間短(3-5min)，且所有試劑包含在一根試紙條上，無需儀器等優點，具有廣闊的市場前景和應用價值。但目前，市場上銷售的試紙卡同時檢測的FQs獸藥殘留種類少，檢測效率受到影響。因此，研製檢測種類多的試紙卡對於保障動物性食品安全具有十分重要的意義。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供基於培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡，所述試紙卡操作簡單、快速準確、靈敏度高、成本低、穩定性好，能夠進行13種氟喹諾酮類藥物的定性檢測。

本發明提供了一種基於培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡，包括塑料盒體，所述塑料盒體一端設置有加樣孔，設置在所述塑料盒體中的試紙條，所述試紙條包括支撐層，設置在所述支撐層上的樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述硝酸纖維素膜上設置有檢測線和質控線，所述檢測線處設置有氟喹諾酮類藥物包被抗原，所述質控線處設置有羊抗兔IgG，其特徵在於，所述結合墊上灌注有膠體金標記的抗培氟沙星類多克隆抗體；

所述包被抗原為吡哌酸-雞卵清白蛋白偶聯物，具有式Ⅰ所示結構：

式I中，OVA為雞卵清白蛋白。

優選的是，所述抗培氟沙星類多克隆抗體是由培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯物免疫紐西蘭大白兔製備得到；所述培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯物具有式Ⅱ所示結構：

優選的是，所述包被抗原的濃度為0.1～0.2μg/ml。

優選的是，所述多克隆抗體的濃度為0.22～0.28mg/ml。

本發明還提供了上述技術方案所述試紙卡在檢測氟喹諾酮類藥物殘留中的應用，所述氟喹諾酮類藥物包括培氟沙星、恩諾沙星、達氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、氟羅沙星、環丙沙星、沙拉沙星、馬波沙星和依諾沙星的一種或多種。

本發明提供了基於培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡。利用本發明所述氟喹諾酮類藥物包被抗原和膠體金標記的抗培氟沙星類多克隆抗體得到的檢測試紙卡呈廣譜特異性，能識別13種氟喹諾酮類藥物殘留，靈敏度高，特異性強，操作簡單，方便快捷，成本低，易於大範圍推廣應用。

附圖說明

圖1為本發明實施例7提供的基於培氟沙星類多克隆抗體製備得到的試紙卡的結構示意圖；

圖2為本發明實施例7提供的基於培氟沙星類多克隆抗體製備得到的試紙卡的側視圖；

圖3為本發明實施例7提供的基於培氟沙星類多克隆抗體製備得到的試紙卡的俯視圖；

圖4為本發明實施例2提供的氟喹諾酮類藥物包被抗原合成路線圖；

圖5為本發明實施例1提供的培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯物合成路線圖。

具體實施方式

本發明提供了基於培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡，包括塑料盒體，所述塑料盒體一端設置有加樣孔，設置在所述塑料盒體中的試紙條，所述試紙條包括支撐層，設置在所述支撐層上的樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述硝酸纖維素膜上設置有檢測線和質控線，所述檢測線處設置有氟喹諾酮類藥物包被抗原，所述質控線處設置有羊抗兔IgG，所述結合墊上灌注有膠體金標記的抗培氟沙星類多克隆抗體；

所述包被抗原為吡哌酸-雞卵清白蛋白偶聯物，具有式Ⅰ所示結構：

式I中，OVA為雞卵清白蛋白。

所述試紙卡的結構如圖1、圖2和圖3所示。其中：1為塑料盒體，2為試紙條，3為支撐層，4為樣品墊，5為金標抗體結合墊，6為硝酸纖維素膜，7為吸收墊，8為加樣孔，9為觀察窗，10為質控線(C線)，11為檢測線(T線)，12為膠膜，13為標記線。

本發明提供了一種氟喹諾酮類藥物包被抗原，為吡哌酸-雞卵清白蛋白偶聯物，具有式Ⅰ所示結構：

式I中，OVA為雞卵清白蛋白。

本發明還提供了上述技術方案所述包被抗原的製備方法，包括以下步驟：

1)將3-氨基丁酸溶於氫氧化鈉溶液，得到3-氨基丁酸溶液；

將吡哌酸溶於含N,N-二甲基甲醯胺的甲醇溶液中，得到吡哌酸溶液；

將所述3-氨基丁酸溶液滴加到所述吡哌酸溶液中，進行碳鏈衍伸化反應1.5～3h；

將所述反應得到的產物用乙酸乙酯萃取，將所述萃取得到的中間產物酸洗後用碳酸氫鈉溶液反萃取，得到吡哌酸半抗原；

2)將所述步驟1)得到的吡哌酸半抗原溶於N,N-二甲基甲醯胺中，再與三乙胺混合，4～8℃反應活化1～2h，得到吡哌酸半抗原反應液；

將氯甲酸異丁酯與所述吡哌酸半抗原反應液混合，進行混合酸酐偶聯反應1～2h，得到吡哌酸反應產物；

3)將雞卵清白蛋白溶於碳酸鹽緩衝液中，再與N,N-二甲基甲醯胺反應0.5～1h，得到雞卵清白蛋白溶液；

4)將所述步驟2)得到的吡哌酸反應產物滴加到所述步驟3)得到的雞卵清白蛋白溶液中，4～8℃反應5～8h後透析，得到包被抗原；

所述步驟2)和步驟3)之間、步驟1)和步驟3)之間沒有時間順序的限制。

本發明上述技術方案所述包被抗原的製備方法反應原理圖如圖4所示。

本發明將3-氨基丁酸溶於氫氧化鈉溶液，得到3-氨基丁酸溶液。所述3-氨基丁酸的溶解過程優選在冰浴攪拌的條件下進行，所述3-氨基丁酸溶液的pH值優選為8.5～10.5。用作溶劑的氫氧化鈉溶液的濃度為0.01～0.02mol/L，所述3-氨基丁酸溶液的濃度優選為1～2mol/L，更優選為2mol/L。

本發明將吡哌酸溶於含N,N-二甲基甲醯胺的甲醇溶液中，得到吡哌酸溶液。所述含N,N-二甲基甲醯胺的甲醇溶液中N,N-二甲基甲醯胺的體積百分含量為40～60％，更優選為50％。吡哌酸溶液的質量濃度為10～20mg/ml。

得到3-氨基丁酸溶液和吡哌酸溶液後，本發明將所述3-氨基丁酸溶液滴加到所述吡哌酸溶液中，進行碳鏈衍伸化反應1.5～3h，更優選為2h。所述反應優選在攪拌條件下進行，所述攪拌的轉速優選為50～200rpm。

本發明將所述反應得到的產物用乙酸乙酯萃取，將所述萃取得到的的中間產物酸洗後用碳酸氫鈉溶液反萃取，得到吡哌酸半抗原。在本發明中，所述酸洗優選採用稀鹽酸，更優選為濃度為0.09～0.18mg/ml的稀鹽酸。在本發明中，所述碳酸氫鈉溶液的質量濃度優選為0.01～0.02mol/L；反萃取用反萃劑為質量濃度為2.1～4.2mg/ml的碳酸氫鈉溶液進行，其產物提取到水相中。

得到吡哌酸半抗原後，本發明將所述吡哌酸半抗原溶於N,N-二甲基甲醯胺中，再與三乙胺混合，4～8℃反應活化1～2h，得到吡哌酸半抗原反應液。在本發明中，所述反應溫度優選為4℃，所述反應時間優選為1.5h。吡哌酸半抗原溶解後得到溶液的濃度為12～25mg/ml；在本發明中，所述吡哌酸半抗原的質量和三乙胺的體積比為(1.5～2.5)mg：1μL，更優選為1.8mg：1μL；

得到吡哌酸半抗原反應液，本發明將氯甲酸異丁酯與所述吡哌酸半抗原反應液混合，進行混合酸酐偶聯反應1～2h，更優選為1.2h，得到吡哌酸反應產物。在本發明中，所述吡哌酸半抗原的質量和氯甲酸異丁酯的體積比為(1.5～2.5)mg：3μL，更優選為1.8mg：3μL。反應溫度2～8℃。

本發明將雞卵清白蛋白溶於碳酸鹽緩衝液中，再與N,N-二甲基甲醯胺反應0.5～1h，得到雞卵清白蛋白溶液。在本發明中，所述碳酸鹽緩衝液的濃度優選為0.05mol/L，pH值優選為9.6。雞卵清白蛋白在緩衝溶液中的濃度10～30mg/ml。所述雞卵清白蛋白與N,N-二甲基甲醯胺優選在攪拌條件下進行，所述攪拌轉速優選為50～200rpm。

本發明將得到的吡哌酸反應產物滴加到雞卵清白蛋白溶液中，4～8℃反應5～8h後透析，得到包被抗原。所述滴加反應優選攪拌的條件下進行。在本發明中，所述吡哌酸反應產物的質量以吡哌酸半抗原計，與雞卵清白蛋白的質量比為1：(2～3)，更優選為9：22。所述透析優選為：將反應液裝入透析袋，置於4℃的碳酸鹽緩衝液中透析；所述透析的時間優選為4～6d，更優選為5d；本發明優選5～8h換液一次。所述透析後，本發明將透析後的反應液離心取上清，得到包被抗原。

在本發明中，所述抗培氟沙星類多克隆抗體是由培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯物免疫紐西蘭大白兔製備得到；所述培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯物具有式Ⅱ所示結構：

在本發明中，所述培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯物的製備方法包括以下步驟：

對牛血清白蛋白進行活化；

採用氨基戊酸對培氟沙星進行半抗原衍生化，得到培氟沙星半抗原衍生物；

以所述活化後的牛血清白蛋白與培氟沙星半抗原衍生物為原料，採用碳二亞胺兩步法合成培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯物。

本發明上述技術方案所述培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯物的製備方法反應原理圖如圖5所示。

本發明對牛血清白蛋白進行活化，得到活化後的牛血清白蛋白(cBSA)。本發明所述蛋白質活化，是為了封閉蛋白質上的羧基，提高其氨基偶聯效率。如將BSA和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶於PBS緩衝液中，攪拌條件下，添加乙二胺溶液，37℃振蕩反應1.5～3h；將得到的反應液用PBS緩衝液透析3～5d，得到活化的牛血清白蛋白；所述活化的BSA凍幹保存，在本發明中，所述振蕩反應的時間更優選為2h。本發明所述乙二胺溶液的溶劑為PBS緩衝液和N,N-二甲基甲醯胺的混合液。所述BSA、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和乙二胺的質量比優選為30～60：2～5：1，所述PBS緩衝溶液濃度為0.01mol/L,pH值為7.4；所述乙二胺溶液的滴加速率為30～100滴/min。所述攪拌的轉速優選為50～200rpm。凍幹保存的條件密閉條件下2～8℃凍存。

本發明採用氨基戊酸對培氟沙星進行半抗原衍生化，本發明對所述衍生化的反應條件沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的半抗原衍生化反應即可。如將培氟沙星甲磺酸二水化合物、N-羥基琥珀醯亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶於N,N-二甲基甲醯胺中，室溫下避光攪拌10～15h，離心取上清得到A液；將5-氨基戊酸鹽酸鹽溶於PBS緩衝液中，得到B液；攪拌狀態下將所述B液緩慢滴入A液中，反應3～5h，離心取上清，調節pH值為10.0～12.0，棄沉澱，再調節pH值為4.0～6.0，收集沉澱，即得培氟沙星半抗原衍生物。所述培氟沙星甲磺酸二水化合物、N-羥基琥珀醯亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸的質量比優選為3：(0.8～1.4)：(1.2～2.8)；所述離心的轉速優選為8000～10000rpm；所述pH調節用酸化劑優選為0.1mol/L的稀鹽酸。

本發明採用碳二亞胺兩步法合成培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯物，優選具體為：將培氟沙星半抗原衍生物溶於N,N-二甲基甲醯胺中，加入N-羥基琥珀醯亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，避光振蕩反應24h，得C液。將cBSA溶解於含50％DMF的PBS磷酸鹽緩衝溶液中，得D液。將C液逐滴緩慢加入到D液中，並不斷震蕩，加完後繼續反應3h，獲得培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯物。

在本發明中，所述包被抗原的濃度為0.1～0.2μg/ml。

在本發明中，所述多克隆抗體的濃度為0.22～0.28mg/ml。

本發明還提供了上述技術方案所述試紙卡在檢測氟喹諾酮類藥物殘留中的應用，所述氟喹諾酮類藥物包括培氟沙星、恩諾沙星、達氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、氟羅沙星、環丙沙星、沙拉沙星、馬波沙星和依諾沙星中的一種或多種。

本發明對所述樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊的製備沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊的製備方法即可。

在本發明中，所述試紙卡檢測原理如下：滴加樣品液後，在吸收墊和硝酸纖維素膜的毛細作用下，樣品溶液向上遷移，到達結合墊時，金標抗體將被溶解。當樣品中含有氟喹諾酮類藥物殘留時，它們將和金標抗體結合，並一起向上遷移，到達固定有包被抗原的檢測線位置時，包被抗原將和氟喹諾酮類藥物競爭結合金標抗體上有限的抗原結合位點。樣品中氟喹諾酮類藥物殘留含量越高，檢測抗原和金標抗體結合數量就越少，T線顯色就越弱；當樣品中氟喹諾酮類藥物殘留含量高於一定數值時，包被抗原就無法和金標抗體結合，T線不顯色。無論樣品中是否氟喹諾酮類藥物殘留存在，過量的金標抗體或包被抗原與金標抗體的結合物都將和二抗GaRIgG結合，在C線形成紅色。試紙卡以紅色印跡線「|」或「‖」作為檢測線的陽性和陰性標記，即在硝酸纖維素膜上質控線(C線)顯示一條紅色「|」印跡時，表示被檢測樣品溶液呈陽性；若硝酸纖維素膜上質控線(C線)和檢測線(T線)同時出現兩條紅色「‖」印跡時，表示樣品溶液呈陰性。

本發明提供的試紙卡可用於氟喹諾酮類藥物殘留的檢測，對待測樣品的種類沒有特殊的限制，可以為血樣、尿樣、蜂蜜或組織樣品，具體的在所述檢測前，待測樣品進行前處理，所述前處理的過程優選包括：

(1)動物尿樣：新鮮尿樣放於4℃冰箱中待檢，直接用於試紙卡檢測；若尿液中有汙染和混濁，5000r/min離心10min或過濾後檢測。

(2)動物血液：用加有肝素鈉(20～30單位/ml血樣)的離心管採集血液樣本，5000r/min離心10min；取出血漿2ml加入乾淨的玻璃離心管中，再加入2ml乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液(體積比為40/60)，用振蕩器混勻5min後上樣檢測。

(3)蜂蜜：取5.0g蜂蜜置於50mL聚苯乙烯離心管中，加入5mL PBS緩衝液，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；然後加入乙腈-NaOH溶液10mL，充分混合10min，15℃3000r/min離心10min，取上層液體用於試紙卡檢測。

(4)動物組織：準確稱取5g已絞碎的動物組織樣品於50ml具擰蓋的塑料離心管中。加入10ml乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液(體積比為40/60)，充分混合10min，15℃3000r/min離心10min。取出2mL上清液，加入PBS緩衝液2mL混合均勻，上樣檢測。

下面結合具體實施例對本發明所述的基於培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡做進一步詳細的介紹，本發明的技術方案包括但不限於以下實施例。

實施例1

培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯物的合成，所述偶聯物的合成流程圖如圖5所示。

(1)稱取培氟沙星甲磺酸二水化合物46.5mg(約0.1mmoL)，NHS 12mg(約0.1mmoL)和EDC 19.2mg(約0.1mmoL)溶於2mL的DMF，室溫下避光攪拌12h。反應產物於8000r/min離心10min，取上清稱為A液。5-氨基戊酸鹽酸鹽11mg(約0.1mmoL)溶於2mL PBS中，即B液。攪拌狀態下將B液緩慢滴入A液中，反應4h，然後8000r/min離心10min，取上清液用飽和NaHCO3調至偏鹼性，棄沉澱。上清液再用稀鹽酸(0.1mol/L)調至偏酸性，收集沉澱，即為培氟沙星半抗原衍生物。

(2)將220mg BSA、11.6mg EDC溶於5mL PBS緩衝液中，攪拌條件下，緩慢加入7mg乙二胺溶液(溶於3mL PBS和DMF溶液的乙二胺溶液)，37℃振蕩反應2h。反應液用PBS透析4d，活化的BSA凍幹保存，即為活化後的牛血清白蛋白。

(3)取PEF半抗原衍生物32mg，用3ml N,N-二甲基甲醯胺(DMF)攪拌溶解後，加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)15mg和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)52mg，溶解後室溫條件下避光，搖床振蕩反應24h，稱C液。將活化的cBSA溶解於含50％DMF的PBS磷酸鹽緩衝溶液中，稱D液。將C液逐滴緩慢加入到D液中，並不斷震蕩，加完後繼續反應3h，獲得PEF-cBSA免疫原。反應結束後將反應液裝入透析袋，用PBS緩衝液透析6d，每天換液3次。紫外掃描透析液無小分子吸收峰時分裝於安瓿瓶中，-20℃保存。

實施例2

氟喹諾酮類藥物包被抗原的製備，所述包被抗原的合成流程圖如圖4所示。

(1)稱取2mmol 3-氨基丁酸加入三角燒瓶中，然後用2ml氫氧化鈉溶液調節pH值為9，冰浴攪拌；用含50％N,N-二甲基甲醯胺的甲醇溶解吡哌酸，攪拌狀態下逐滴加入氨基丁酸-氫氧化鈉溶液中，磁力攪拌反應2h；用乙酸乙酯萃取，稀鹽酸洗滌，再用碳酸氫鈉溶液反萃取，製得吡哌酸半抗原。

(2)稱取18mg吡哌酸半抗原溶解在2mLN,N-二甲基甲醯胺中，加入10μL三乙胺，4℃冰浴條件下反應1h。然後加入30μL氯甲酸異丁酯，繼續攪拌反應1h。將44mg的雞卵清白蛋白溶於2mL碳酸鹽緩衝溶液中(CBS，0.05mol/L,pH 9.6)，並加入2mL N,N-二甲基甲醯胺攪拌反應0.5h，得到雞卵清白蛋白溶液。冰浴、攪拌條件下將吡哌酸反應產物逐滴加入雞卵清白蛋白溶液中，加完後在4℃下振蕩反應6h。反應液裝入透析袋，CBS緩衝液4℃透析5d，6h換液1次，離心取上清，得吡哌酸-雞卵清白蛋白包被抗原，-20℃凍存。

實施例3

培氟沙星類特異性多克隆抗體的製備

所述的抗培氟沙星類特異性多克隆抗體的由培氟沙星-牛血清白蛋白(PEF-cBSA)偶聯物免疫紐西蘭大白兔製備而來：

用雌性紐西蘭大白兔2隻，背皮下多點免疫法製備抗PEF多克隆抗體。首免用PBS稀釋的免疫原與等體積氟氏完全佐劑完全乳化，以後每隔3w加強免疫一次，換用氟氏不完全佐劑乳化，免疫劑量為500μg/次，體積為0.5mL。每次免疫後8d耳緣靜脈採血監測抗體效價，5免後10d心臟驅血收集抗血清，4℃過夜後離心(8000rpm,10min)。飽和硫酸銨鹽析法純化抗體，分別採用55％、33％、33％的飽和硫酸銨，分三次純化血清，提取富含IgG的抗體，製得培氟沙星類特異性多克隆抗體。

實施例4

間接ELISA檢測培氟沙星抗體效價

用CBS稀釋的PMA-OVA包被抗原包板，每孔100μL，37℃培養箱內溫育2h。PBS-T洗板三次後用300μL/孔的封閉液37℃封閉1h。再次洗板後加入用PBS倍比稀釋的抗血清，每孔50μL，37℃溫育15min，PBST洗板三次。然後加入經稀釋液1:1000倍稀釋的GaMIgG-HRP，每孔50μL，37℃溫育25min，PBS-T洗板三次。加入60μL/孔新鮮配製的酶底物(A、B液)，室溫下顯色15min，然後加入100μL/孔2M H2SO4終止酶促反應。反應設陰性對照(NC)和PBS空白對照(BC)，每次檢測三個重複。酶標儀測定每孔A450值，以陽性/陰性(P/N)＞2.1，且P－N＞0.2為標準，培氟沙星抗體效價結果為1.28～2.56×104。

實施例5

間接競爭ELISA(ciELISA)檢測培氟沙星抗體的靈敏度和特異性

間接競爭ELISA(ciELISA)操作程序：參照間接ELISA實驗條件包板和封閉，然後加入50μL/孔不同濃度的PEF標準品或其它氟喹諾酮類藥物標準品溶液，同時加入等體積適當稀釋倍數的PEF多克隆抗體(PEF pAb)，37℃溫育15min，其它操作同間接ELISA。以B/B0值(B是不同濃度標準品時A450值，B0是不加標準品時A450值)為縱坐標，以不同濃度標準品的對數值為橫坐標，四參數曲線擬合建立ciELISA標準曲線，進行相關分析。靈敏度用IC50值表示，代表標準品的半數抑制濃度，線性範圍表示最大信號值20-80％的抑制率(IC20-IC80)，最低檢測限(LOD)以IC15值計算。

PEF pAb的交叉反應性決定了抗體的特異性。以氟喹諾酮類藥物同類藥物代替PEF標準溶液，進行交叉反應實驗，計算公式是：(IC50ofPEF)/(IC50of FQs)×100，CR越低，抗體特異性越強，結果見表1。由表1可知，PEF pAb呈現類特異性，與培氟沙星(100％)、恩諾沙星(94.9％)、達氟沙星(88.9％)、氧氟沙星(77.8％)、洛美沙星(75.7％)、二氟沙星(67.5％)、諾氟沙星(62.9％)、左氧氟沙星(58.9％)、氟羅沙星(47.9％)、環丙沙星(43.4％)、沙拉沙星(38.9％)、馬波沙星(30.8％)和依諾沙星(27.3％)有較高的交叉反應率，這說明培氟沙星類特異性多克隆抗體可識別13種氟喹諾酮類藥物獸藥殘留。

表1培氟沙星類特異性多克隆抗體的交叉反應率

實施例6

金標抗體的製備

所述的膠體金標記的抗培氟沙星類特異性多克隆抗體(PEF pAb)，由以下步驟實現：

(1)膠體金溶液的製備：取超純水溶解的0.01％氯金酸溶液100ml，置電爐加熱至沸騰，3min後邊攪拌，邊迅速加入1％的檸檬酸三鈉溶液2ml。繼續加熱，溶液顏色由無色轉為淺黃色，最後變為橙紅色時停止加熱。冷卻後用超純水恢復至原體積，進行透射電鏡掃描，鑑定膠體金質量及顆粒大小。膠體金懸液中加入最終質量濃度為0.05％的疊氮鈉(NaN3)，4℃冰箱中保存備用。

(2)抗體預處理：高濃度的抗體長時間冷凍保存會發生不同程度的聚集，這些聚集物會影響標記的穩定性。因此標記前，將抗培氟沙星類特異性多克隆抗體10000r/min，4℃條件下離心30min，棄沉澱，上清液用0.01mol/L PBS稀釋成1mg/ml。

(3)待標pAb實際用量的確定：酶標板用每孔50μl雙蒸水鋪底，縱排加入倍比稀釋的PEF pAb，每孔50μl，設空白對照(BC)。用0.1mol/L K2CO3調節膠體金溶液至pH 9.0，加入到酶標板中，每孔50μl混勻。室溫孵育15min後，加入10％NaCl溶液100μl，混勻，靜置。對照孔與pAb量不足以穩定金溶膠的各孔呈現由紅變藍的聚沉現象，而pAb量達到或超過最低穩定量的各孔仍保持紅色不變。選擇不聚沉時pAb的最低量，在此基礎上增加20％，即為待標PEF pAb的實際用量。

(4)金標抗體的製備：將事先確定的最佳標記PEF pAb的實際用量與膠體金偶聯，常溫攪拌30min，5000r/min離心20min，棄上清後，加入10％BSA硼酸鈉溶液，使BSA終濃度為1％作為穩定劑。金標抗體溶液10000r/min離心30min，棄上清，用20mmol/L的硼酸鹽稀釋液(含1％BSA和0.1％疊氮鈉)將金標抗體恢復至原體積的1/10，放置在4℃冰箱備用。

實施例7

試紙卡的生產和組裝，試紙卡的結構示意圖如圖1、圖2和圖3所示。其中：1為塑料盒體，2為試紙條，3為支撐層，4為樣品墊，5為金標抗體結合墊，6為硝酸纖維素膜，7為吸收墊，8為加樣孔，9為觀察窗，10為質控線(C線)，11為檢測線(T線)，12為膠膜，13為標記線。

硝酸纖維素膜(NC膜)的製備方法：將硝酸纖維素膜置於X-only單向噴點儀平臺上，檢測抗原放於A池，RaMIgG放於B池，展平壓緊，開機後將PMA-OVA檢測抗原和二抗分別點射於硝酸纖維素膜上，形成檢測線(T線)和質控線(C線)。室溫自然乾燥後，將其浸入封閉液(質量濃度為1％的BSA的PBS緩衝液，pH 7.4)中30min，37℃烘乾後，加入乾燥劑，4℃密封保存。

結合墊的製備方法：將玻璃纖維棉裁成4mm寬的細條，放入含質量濃度為5％的BSA，質量濃度為2％的蔗糖，質量濃度為0.8％的NaCl和質量濃度為0.05％的NaN3的PBS處理液中20min，37℃恆溫烘乾，然後將金標抗體灌注已處理好的玻璃纖維棉上，真空凍幹4h，即為結合墊。

樣品墊的製備方法：玻璃纖維棉要用含質量濃度為2％的BSA，質量濃度為1％的蔗糖，質量濃度為0.5％的硼酸鈉和質量濃度為0.1％的NaN3的PBS處理後，乾燥備用，即為樣品墊。

試紙卡的組裝：在支持板(PVC板)上，將NC膜、結合墊、樣品墊、吸收墊和膠膜等按一定工藝組裝在一起，用CM4000切割機製成4mm寬的試紙條。然後，按一定工藝將試紙條封裝於帶有加樣孔和觀察窗的特製的塑料盒體中，即為本發明的基於培氟沙星類特異性多克隆抗體的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測試紙卡。

實施例8

本發明的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測試紙卡在動物尿液中樣品前處理及實際檢測線

採集新鮮尿液放於4℃冰箱中待檢，一般不需特殊處理，可直接用於試紙卡檢測；若尿液中有汙染和混濁，5000r/min離心10min或過濾後檢測。試紙卡識別尿液中氟喹諾酮類藥物獸藥殘留的檢測線分別為：培氟沙星(5ng/mL)、恩諾沙星(6ng/mL)、達氟沙星(7ng/mL)、氧氟沙星(8ng/mL)、洛美沙星(8ng/mL)、二氟沙星(10ng/mL)、諾氟沙星(10ng/mL)、左氧氟沙星(12ng/mL)、氟羅沙星(15ng/mL)、環丙沙星(15ng/mL)、沙拉沙星(16ng/mL)、馬波沙星(20ng/mL)和依諾沙星(20ng/mL)。

實施例9

本發明的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測試紙卡在動物血液中樣品前處理及實際檢測線

用加有肝素鈉(20-30單位/mL血樣)的離心管採集血液樣本，5000r/min離心10min；取出血漿2mL加入乾淨的玻璃離心管中，再加入2mL乙腈，用振蕩器混勻後上樣檢測。試紙卡識別血液中氟喹諾酮類藥物獸藥殘留的檢測線分別為：培氟沙星(10ng/mL)、恩諾沙星(12ng/mL)、達氟沙星(15ng/mL)、氧氟沙星(15ng/mL)、洛美沙星(15ng/mL)、二氟沙星(20ng/mL)、諾氟沙星(20ng/mL)、左氧氟沙星(25ng/mL)、氟羅沙星(30ng/mL)、環丙沙星(30ng/mL)、沙拉沙星(30ng/mL)、馬波沙星(40ng/mL)和依諾沙星(40ng/mL)。

實施例10

本發明的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測試紙卡在動物組織中樣品前處理及實際檢測線

用均漿器均質動物組織，取5.0g動物組織置於50mL具擰蓋的塑料離心管中，加入10ml乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液(體積比為40/60)，充分混合10min，15℃3000r/min離心10min。取出2mL上清液，加入PBS緩衝液2mL混合均勻，上樣檢測。試紙卡識別動物組織中氟喹諾酮類藥物獸藥殘留的檢測線分別為：培氟沙星(20ng/mL)、恩諾沙星(20ng/mL)、達氟沙星(25ng/mL)、氧氟沙星(30ng/mL)、洛美沙星(30ng/mL)、二氟沙星(40ng/mL)、諾氟沙星(40ng/mL)、左氧氟沙星(50ng/mL)、氟羅沙星(60ng/mL)、環丙沙星(40ng/mL)、沙拉沙星(60ng/mL)、馬波沙星(80ng/mL)和依諾沙星(80ng/mL)。

實施例11

本發明的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測試紙卡在蜂蜜中樣品前處理及實際檢測線

取5.0g蜂蜜置於50mL聚苯乙烯離心管中，加入5mL PBS緩衝液，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；然後加入乙腈-NaOH溶液10mL，充分混合10min，15℃3000r/min離心10min，取上層液體用於試紙卡檢測。試紙卡識別蜂蜜中氟喹諾酮類藥物獸藥殘留的檢測線分別為：培氟沙星(20ng/mL)、恩諾沙星(20ng/mL)、達氟沙星(25ng/mL)、氧氟沙星(30ng/mL)、洛美沙星(30ng/mL)、二氟沙星(40ng/mL)、諾氟沙星(40ng/mL)、左氧氟沙星(50ng/mL)、氟羅沙星(60ng/mL)、環丙沙星(40ng/mL)、沙拉沙星(60ng/mL)、馬波沙星(80ng/mL)和依諾沙星(80ng/mL)。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。