使用遠心光學器件成像螢光信號的製作方法
2023-10-05 19:35:39
專利名稱：使用遠心光學器件成像螢光信號的製作方法
技術領域：
本發明涉及DNA分析領域。尤其是，本發明涉及用於在多個位點(site)並行成像螢光強度的設備。
背景技術：
本領域的技術人員已知使用螢光技術來分析生物樣本的各種應用。在電泳技術的情況下用螢光探針標記蛋白或DNA以在膠體中或在柱中顯現它們的電泳譜帶。另外，到目前為止多數生物晶片應用基於螢光讀出，其中螢光標記靶分子對固定到固體載體上的探針分子的特異性結合被監視。液相中DNA分析的應用包括象雙鏈DNA結合染料SybrGreenI這樣的螢光雜交探針或利用兩個螢光探針和能量轉移的FRET(螢光共振能量轉移)探針。液相中螢光技術的一個非常重要的應用是PCR產物的實時量化，也稱為實時PCR。
在所有這些情況下，需要一種螢光讀取設備來提供某個波長的光以激發化驗物的螢光標記並且能夠檢測以稍微不同的波長發出的、形成所述標記的螢光。所有螢光讀取設備的一個主要問題是激發光與染料發出的螢光相比的巨大強度，因此為了精確地監視螢光信號，人們必須保證激發光束不會擊中檢測器。也就是說，激發光的光程必須至少部分地不同於螢光的光程。
當必須在例如毛細管的液相中僅僅監視一個螢光探針時，螢光原理的實現很簡單。在此，例如一個白光源連同一組分色鏡和濾光器足以滿足所述要求。然而，如果一個以上的螢光標記存在於樣本中，則必須監視固體載體上斑點的橫向分布或微量滴定板的螢光，因此螢光讀取設備的要求更加難以滿足。
原則上，存在兩種不同的策略來激發和監視各位點的橫向分布的螢光。第一種策略是掃描各位點的橫向分布，由此相繼地一次分析一個個體位點。第二種策略是同時照射各位點的整個分布並且例如在CCD晶片上成像相應的螢光。掃描策略具有的明顯缺陷在於要麼必須在二維中移動載體(WO 03/069391，DE 10200499)，要麼檢測器必須相對於載體移動(US 2002/159057)。另一方面，同時照射整個載體的策略的主要困難是保證對各位點的整個分布的均勻照射。各位點的整個分布的均勻照射的另一替代方案是使用光源陣列，由此每個位點被它自己的光源照射。DE 10131687描述了用於在帶有多個井的熱循環器中使用射束分裂器和用於照射的LED陣列來評價PCR的該策略。DE 10155142描述了螢光信號的暗場監視，其中微陣列也被LED陣列照射，但是在該實施例中不需要射束分裂器。
考慮到要求至少部分地分離激發光束的光程和螢光的光程，再次存在兩種不同的可能性。第一種可能性被稱為表面照射(epi-illumination)，由此射束分裂器被利用並且激發光束和螢光共享至少一部分光具組。第二種可能性是使用傾斜照射。在此，激發光束以一種方式被布置，使得它與載體表面的法線成某個角度並且激發光束的相應反射在檢測系統的接受角之外(例如US 2002/0005493 A1，EP1275954A2)。
US 2003/0011772 A1描述了一種光學裝置，該光學裝置使用射束分裂器同時觀察探針中的多個螢光染料。DE 19748211 A1公開了一種系統，該系統同時使用射束分裂器、場鏡和將光聚焦到每個井中的透鏡陣列來監視微量滴定板的井中所產生的螢光信號。通過將光成像在光電二極體陣列或CCD晶片上而執行所述檢測。在該系統的該實施例中收集的螢光由聚焦透鏡的光錐所激發的染料的數量指定，因此取決於所述井的充填水平。WO 99/60381提出了一種用於同時在溫度循環塊中多個管瓶中監視PCR反應的器械。該器械的光學部件再次包括射束分裂器，場鏡，將單個光束聚焦到每個管瓶中的管瓶透鏡陣列，和將發射光聚焦到例如CCD檢測器上的檢測機構。由於管瓶透鏡陣列的必要性，個體位點的尺寸和橫向密度被限制。JP 2002014044描述了一種螢光裝置，該螢光裝置用於監視在多個井中產生的螢光。所述光學部件包括射束分裂器和透鏡系統以使用平行於所述井的深度方向的光集體地照射所述井。然而，所述圖像形成光學系統將所述光聚集到檢測機構。US 6,498,690 B1公開了一種使用包括遠心透鏡的物鏡來成像化驗物的方法。US 6,246,525 B1提供了一種用於成像樣本載體的成像設備，該成像設備包括菲涅耳(Fresnel)透鏡。
因此，本發明的目標是提供一種改進的設備，該設備通過朝著均勻照射和精確檢測來優化光程而同時監視來自各位點的橫向分布的螢光信號。在本發明的一個方面，待解決的問題涉及在監視微量滴定板形式的多路復用的實時PCR中的改進。
發明內容
因此，本發明涉及一種光學器械，該光學器械用於成像多個個體位點的組裝(assembly)的螢光，其包括橫穿整個所述組裝區域的激發以及相應螢光信號的精確成像。
更準確而言，本發明涉及一種光學器械，該光學器械用於同時實時地分析發生在微量滴定板的井中的多個PCR擴增，或者成像微陣列的螢光強度作為特異性靶/探針相互作用的測度。
本發明的一個主題是一種用於成像來自多個個體位點的螢光信號的光學器械，其包括保持機構1，其用於保持帶有多個個體位點3的組裝的平面載體2，至少一個發光的光源4，其包括至少一個激發頻率，換能器5，其被布置成接收來自所述多個個體位點3的組裝的螢光信號，其中該換能器5產生可計算的原始數據，場鏡6，其將來自所述光源4的激發光轉移到所述多個個體位點3的組裝和並且將來自所述多個個體位點3的組裝的螢光信號轉移到所述換能器5，激發透鏡裝置10，其將來自所述光源4的激發光轉移到所述場鏡6，和成像透鏡裝置11，其將來自所述場鏡6的螢光信號轉移到所述換能器5，其中所述激發光和來自多個個體位點的螢光信號的所述成像在所述場鏡6的物體側是遠心的。
在本發明的上下文中，多個個體位點的組裝概括了由兩個或多個在空間上分離且橫向分布的位點所組成的物體。位點例如可以是微量滴定板的井或載玻片的功能化表面區域。在多數情況下所述多個個體位點的組裝將以一致的方式被布置並且為了執行多路復用的分析，每個位點將具有不同的內容。在本發明的範圍內，所述組裝的所述平面載體是平面固相。在微陣列的情況下，所述組裝的所述平面載體是在所述位點被布置處的該平面固相的表面。在微量滴定板的情況下，所述組裝的所述平面載體是在所述井的開口被布置處的平面。為了將每個個體位點的位置穩定在光程內的期望位置，所述組裝的所述平面載體被保持機構固定。
在本發明的範圍內短語光源(LS)包括發出單一頻率或多個不同頻率的光的發光體。附加地，所述光源可以是一個以上所述發光體的布置。
在本發明的上下文中，換能器(Det)是一種能夠將可見光轉換成可由諸如CCD晶片這樣的計算機處理的電信號的設備。
在本發明的範圍內，遠心光學器件是具有非常小的孔徑的光學器件，因此提供高聚焦深度。也就是說，因為在物體和/圖像空間中橫穿物體的所有點都平行於光軸，因此遠心光學器件的遠心光準平行於主光線。所以，利用物體空間中的遠心性的激發光學器件或成像光學器件的品質對某個物點離所述光學器件的距離不敏感。遠心光學器件的孔徑在無窮遠處被成像。另外，使用遠心光保證了跨光束的良好的橫向一致性，並且位於所述組裝的中心的位點與位於所述組裝的邊界的位點相當。在整個本發明中，遠心光學器件總是包括場鏡。在本發明的上下文中場鏡是最接近於物鏡的單透鏡，其確定了該器械的視場，所述場鏡包括一個或多個部件(消色差透鏡)，並且與所述裝置的附加光學部件組合有助於物體和/或圖像空間中的遠心性。
本發明的所述場鏡將來自所述光源的激發光轉移到所述多個個體位點的組裝並且將來自所述多個個體位點的組裝的螢光信號轉移到所述換能器。這並不排除附加光學部件被引入到例如在所述光源和所述場鏡之間、在所述場鏡和所述換能器之間或在所述場鏡和所述多個個體位點的組裝之間的射束徑跡中。
本發明的另一個方面是一種實時PCR器械，其包括根據本發明的光學器械，和加熱和冷卻帶有一個或多個井的載體的機構，每個井包含能夠執行PCR反應的反應混合物。
在本發明的範圍內，用於加熱和冷卻的所述機構包括為了執行核酸的循環PCR擴增而能夠以循環方式控制和更改所述多個個體位點的組裝的溫度的任何機構。優選地，所述保持機構可以與所述多個個體位點的組裝的所述平面載體熱接觸地被加熱和冷卻。
本發明的又一方面是一種用於成像多個化驗物的螢光信號的系統，其包括平面載體2，其包括多個個體化驗物的組裝，
至少一個發光的光源4，其包括至少一個激發頻率，換能器5，其被布置成接收來自所述多個化驗物的螢光信號，其中該換能器產生可計算的原始數據，和從所述光源4到所述換能器5的射束徑跡，其特徵在於，所述多個個體化驗物的組裝的遠心激發和在所述多個個體化驗物的組裝的每一個單個化驗物處產生的所述螢光信號的遠心成像。
多個個體化驗物的組裝概括了由兩個或更多個在空間上分離以實現並行分析的化驗物組成的物體。這些化驗物例如可以在微量滴定板的井中或載玻片的功能化表面區域上被執行。
短語射束徑跡在整個本發明中被使用以概括光束從所述光源至少通過所述場鏡到達所述多個個體化驗物的組裝和從所述多個個體化驗物的組裝至少通過所述場鏡到達所述換能器的途中所穿越的所有區域。
本發明的另一個主題是一種用於同時實時地執行和監視多個PCR反應的系統，其包括多井板，其帶有多個個體位點，每個位點包含能夠執行PCR反應的反應混合物，螢光DNA結合體，和根據本發明的實時PCR器械，其包括根據本發明的光學器械，該光學器械用遠心光照射整個所述多井板，並且通過換能器檢測來自所述多井板的每一個井的螢光信號，為了產生可計算的原始數據，所述換能器被布置成接收相應的螢光信號。
在整個本發明中，所述螢光DNA結合體都是本領域一些技術人員已知的螢光染料或螢光染料的組裝，其可以用於檢測擴增的DNA，即例如為雙鏈DNA結合染料、TagMan探針、分子信標、單標記探針或FRET雜交探針。
本發明的又一主題是一種用於擴增、檢測和/或量化多個靶DNA序列的方法，其包括提供一種能夠執行PCR反應的組合物或反應混合物，使所述反應混合物受熱循環方案支配，從而可以發生所述多個靶DNA序列的擴增，以及在多個擴增循環過程之後至少使用螢光DNA結合體和根據本發明的實時PCR器械監視每個DNA序列的存在和數量一次。
能夠執行PCR反應的所述組合物或反應混合物在整個本發明中包括緩衝劑、核苷酸、酶、引物和螢光DNA結合體。
熱循環方案是定義所述PCR組合物的序時溫度處理、解鏈和退火溫度、擴增循環的數量以及加熱和冷卻的時間的方案。
圖1是根據本發明的光學器械的一個實施例的示意圖。
圖2是根據本發明的光學器械的另一個實施例的示意圖。
具體實施例方式
本發明的一個方面是一種用於成像來自多個個體位點的螢光信號的光學器械，其包括保持機構1，其用於保持帶有多個個體位點3的組裝的平面載體2，至少一個發光的光源4，其包括至少一個激發頻率，換能器5，其被布置成接收來自所述多個個體位點3的組裝的螢光信號，其中該換能器5產生可計算的原始數據，場鏡6，其將來自所述光源4的激發光轉移到所述多個個體位點3的組裝和並且將來自所述多個個體位點3的組裝的螢光信號轉移到所述換能器5，激發透鏡裝置10，其將來自所述光源4的激發光轉移到所述場鏡6，和成像透鏡裝置11，其將來自所述場鏡6的螢光信號轉移到所述換能器5。
其中所述激發光和來自多個個體位點的螢光信號的所述成像在所述場鏡6的物體側是遠心的。
本領域的技術人員知道大量的器械能夠用於成像螢光信號。如果所述光學器械應能夠同時成像多個個體位點的組裝的螢光信號，例如微量滴定板的井或微陣列的斑點，則人們必須保證在所述組裝的中心以及在所述組裝的邊界處的染料的激發以及螢光信號的成像是相當的。而且，即使滿足了跨所述光束的強度分布均勻的要求，為了保證所述載體作為一個整體是在所述成像光學器件和在所述激發光學器件的焦平面中，所述平面載體的對準仍很重要。當類似於微量滴定板的情況、所述載體具有深度時，另外產生了一些特殊問題。
解決上述問題的一個方案是使用遠心光學器件。在一個遠心光學器件中，焦平面位於無窮遠並且從每個物點發出的主光線平行於光軸。因此，有限視場內的所有物點被觀察到具有相同的透視和相同的強度，換句話說，所述遠心光學器件具有大的場深度和均勻的激發或成像型面。
遠心光學器件可以由其數值孔徑(NA)表徵，該數值孔徑應當儘可能地小以實現高的聚焦深度NA＝n·sin A，其中n是介質的折射率，A是孔徑角。如果類似於微量滴定板的情況，個體位點的組裝具有某個深度，那麼高的聚焦深度是極其重要的。
為了設計一種用於各位點的橫向分布的遠心激發和來自所述位點的螢光信號的遠心成像的光學器械，人們必須考慮幾個方面。單獨從聚焦深度的方面來看，NA值應當儘可能地小。另一方面，用於成像光學器件的小NA值對應於低劣的成像解析度，而用於激發光學器件的小NA值對應於用於激發的照射功率的浪費。
如果所述遠心光學器械應當可用於整個頻率範圍，那麼所述光學器件必須也是消色差的。對於螢光成像自身，由於螢光成像必須具有合適的縮放比例以在所述換能器上正確地再生各位點的橫向分布，因此甚至必須應付更多的要求。另外，類似球面像差或色差、彗差、散光或像場彎曲這樣的像差必須被控制。
存在創建遠心光學器件的幾種方式。通常，遠心光學器件是多元件透鏡設計，其中一個以上的透鏡被連續地布置在射束徑跡中。遠心光學器件可以被準備成在物體平面中是遠心的或者在圖像平面中是遠心的，或者同時在這兩個平面中是遠心的，一個所謂的雙遠心光學器件。而且，有可能用遠心光照射物體和/或以遠心方式監視物體。通常提供一種在物體平面中具有遠心性的光學器件就足夠了，因為這已經保證了整個物體在橫向以及在第三維中的均勻照射和從所述物體輻射的光的精確收集。
從現有技術水平來看，已知器械使用用於成像螢光信號的遠心光學器件，但是通常例如通過背面照射、傾斜照射或通過漸逝場而以非遠心方式執行激發。在整個本發明中，多個個體位點的激發以及來自多個個體位點的螢光信號的成像都是以遠心方式執行的。
圖1和圖2顯示了根據本發明的優選實施例的兩個光學器械的示意圖，其將在下面進行詳細說明。
所有遠心光學器件的中心部分是場鏡。該透鏡最接近於物體並且確定該器械的視場的直徑。所以，當多個個體位點的組裝在一個大面積上分布時，該透鏡的直徑傾向於尺寸增大。場鏡以單件式(一個單透鏡)或例如包括粘在一起的兩個透鏡的消色差透鏡的形態存在。可以用於本發明的特殊場鏡是菲涅耳透鏡。菲涅耳透鏡具有特殊的複數曲率，在至少一個光學有效表面上具有多個錐形區域，其提供了與場鏡相同的遠心屬性。在多數情況下，菲涅耳透鏡僅僅具有一個帶有多個錐形區域的表面，所述表面被垂直於光軸的平面表面支撐，因此與正常的場鏡相比它們更薄。在特殊情況下，菲涅耳透鏡被提供為附加地具有彎曲支承表面或者在所述透鏡的兩側上具有多個錐形區域。另外，菲涅耳透鏡有時由塑料製造，因此它們比玻璃製造的大場鏡更便宜。但是另一方面，尤其考慮對比度和串擾時，這些菲涅耳透鏡的圖像質量低於正常的場鏡，這是因為在帶有不連續曲率的透鏡的那些點處發生光散射。
在一個優選的實施例中，根據本發明的光學器械進一步包括對於至少一個激發頻率是透明的而對於所述螢光信號的頻率是反射的射束分裂器7，或者包括對於至少一個激發頻率是反射的而對於所述螢光信號的頻率是透明的射束分裂器。
射束分裂器通常是分色鏡，其取決於光的波長而通過或反射所述光，因此它可以被用於將光束的兩個成分在空間上分離成不同的方向。如果必須帶有某些旋光塗層，則這樣的分色鏡可以由玻璃或塑料製造。它們以薄箔或稜鏡的形式存在。
為了應用於光學器械中以成像螢光信號，該分色鏡必須對於激發光是反射的而對於螢光是透明的(圖2)或者相反(圖1)。從所述光源發出的光分離成包含一個或多個激發頻率的光束和帶有具有它頻率的光束有助於保證螢光染料不會被短波長破壞並且例如由所述載體的激發而產生的不期望背景輻射被減小。來自所述多個個體位點的光分離成包含至少一個激發頻率的成分和包含螢光信號的成分避免了帶有高強度的激發光的反射擊中所述換能器。這極大地提高了信噪比。
在本發明的另一個優選的變型中，所述場鏡產生垂直於所述多個個體位點的組裝的載體的激發光束。
激發光束垂直於所述多個個體位點的組裝的載體也產生了垂直於所述組裝的載體的反射光束。但是由於所述射束分裂器，該反射光束與螢光信號分離並且不會擊中所述換能器。在例如多滴定板作為所述多個個體位點的組裝的情況下，所述垂直激發光束具有的優點是它能夠穿透所述井的深度。另一方面，如果激發光束以大於0°的入射角到達所述載體，那麼所述井的壁將隱藏所述井內部的全部照射並且僅僅一部分螢光染料可以被激發。而且，當使用傾斜的激發光束時，所述井內螢光染料激發的量取決於充填水平。
在進一步優選的變型中，根據本發明的光學器械進一步包括激發濾光系統8，該系統能夠將來自所述光源的至少一個激發頻率轉移到所述多個個體位點的組裝，同時阻止多個其它頻率。
這樣的附加激發濾光系統甚至可以在射束分裂器之前阻止來自光源的某些頻率。如果所述光源包括其頻率不能通過所述射束分裂器與所述激發頻率分離的光，那麼這是必要的。一種合適的激發濾光系統例如被稱為濾光輪，其包括一定數量的、具有不同光學性質的單個濾光器。使用這樣的濾光輪提供了一種簡單的手段來改變激發頻率。特殊的激發濾光系統例如是吸收紅外(IR)頻率或紫外(UV)光的濾光器。這樣的特殊激發濾光系統可以以諸如薄膜濾光器這樣的分離的光學部件的形式實現或者以所述裝置的其它光學部件上的旋光塗層的形式實現。
在進一步優選的實施例中，根據本發明的光學器械進一步包括成像濾光系統9，該系統能夠將來自所述多個個體位點的組裝的螢光信號轉移到所述換能器，而同時阻止具有激發頻率的光。
這樣的附加成像濾光系統還可以在射束分裂器之後阻止在所述多個個體位點產生的或者來自所述激發反射的某些頻率。如果在所述多個個體位點產生其頻率不能通過所述射束分裂器來與所述激發頻率分離的光，那麼這是必要的。再次，一種合適的成像濾光系統是一個包含不同濾光器的濾光輪。與激發濾光系統的情況類似，特殊的成像濾光系統可例如是紅外(IR)濾光器或紫外(UV)濾光器。該特殊成像濾光系統可以以諸如薄膜濾光器這樣的分離的光學部件的形式實現或者以所述裝置的其它光學部件上的旋光塗層的形式實現。另一種成像濾光系統是避免檢測器檢測到散射光的濾光系統。
如上所述，根據本發明的光學器械包括激發透鏡裝置10，所述激發透鏡裝置將來自所述光源4的光轉移到所述場鏡6。
這意味著，使用包括場鏡6和激發透鏡裝置10的激發光學器件，來自所述光源的光被成像在所述多個個體位點的組裝上。所述激發光學器件在場鏡6的物體側提供遠心激發光，因此是遠心激發光學器件。所述激發透鏡裝置包括至少一個透鏡，優選地至少有三個透鏡，以便朝著更好地利用光源功率而增加激發的孔徑。如果透鏡的數量應當被減小，則所述激發透鏡裝置可以包括非球面。優選地，為了獨立於激發波長而實現跨所述多個個體位點的組裝的均勻強度分布，所述遠心激發光學器件被設計成是消色差的。
在本發明的另一個實施例中，所述光源發出包括多個頻率的光，優選地所述光源是白光源，最優選地所述光源是氣體放電燈，例如氙燈或汞燈，或者諸如鎢絲燈這樣的白熾燈。
在本發明的又一個實施例中，所述光源發出帶有單一頻率的光，優選地所述光源是雷射器，最優選地所述光源是LED。
使用發出具有不同頻率的光的光源所具有的優點在於僅僅通過改變濾光組，所述光源可以用於不同的螢光染料，所述濾光組由射束分裂器組成，且如果需要，也包括激發濾光系統和/或成像濾光系統。為了容易地從一個螢光染料切換到另一個，優選地使用濾光輪作為包含一定量的濾光器的激發濾光系統和/或成像濾光系統。在另一方面，如果所述光源發出僅僅具有單一頻率的光，該濾光器組的要求容易滿足，但是所述光學器械被固定到有限量的螢光染料。
在本發明的一個實施例中，光源窗具有旋光塗層，該旋光塗層用作特殊的激發濾光系統以吸收IR和/或UV光。
在本發明的進一步優選的變型中，所述光源包括一個以上的發光體的組合，優選地一個以上的雷射器的組合，最優選地一個以上的LED的組合。
在該優選的實施例中，為了提供帶有一個以上的激發頻率的根據本發明的光學器械，不同發光體的組裝被使用。帶有兩個不同光源的根據本發明的一個實施例在圖2中示出，其中每個光源具有其自己的激發濾光系統8、激發透鏡裝置10和射束分裂器7。
在根據本發明的另一變型中，所述光源進一步包括用於選擇一個或多個所述發光體的設備。
用於選擇所述發光體中的一個的設備可以以不同的方式實現。一種可能性是使用可轉動鏡使被選擇的發光體的光注入到所述光程中。另一種可能性是為了將被選擇的發光體的光注入到所述光程中而移動所述發光體的布置。
除了場鏡6、激發濾光系統8、激發透鏡裝置10和射束分裂器7外，根據本發明的遠心激發光學器件還可以包括幾個附加的部件。在一個實施例中所述遠心激發光學器件附加地包括光導，並且為了將來自所述光源的光轉移到所述光學系統的光學部件，來自所述光源的光被耦合到所述光導。使用光導便可能耦合來自不同光源的光並且同時將該組合的光轉移到所述光學部件。所有類型的光導可應用於本發明的目的。可能的光導例如為流體光導、纖維光導或纖維光導束。在本發明的一個實施例中，所述光導的一端或兩端具有用作特殊激發濾光系統以吸收IR和/或UV光的旋光塗層。
在根據本發明的又一實施例中，所述遠心激發光學器件進一步包括混光器以混合來自於所述光源的光並且將所述混光器的被照射表面成像到所述多個個體位點的組裝上。
混光器是帶有非常均勻地照射的表面的設備，其可以被用作光源以提供在整個橫截面上具有均勻強度分布的光。混光器是由光學透明材料製造的稍長的實體，其中所述實體的邊界平行於所述光程。也就是說，混光器是一種光纖。被注入所述混光器的光在所述光學透明材料的內表面上經歷多次全反射，所述內表面在所述光纖的一端產生非常均勻地被照射的橫截面積。所述光學透明材料的內界面的全反射簡單地基於在所述界面處折射率的改變或者可由折射塗層支持。所述混光器的長度對其橫截面積的比率對於照射均勻性來說是重要的。所述比率優選地大於2。
來自所述光源的光，尤其來自所述混光器的一端的橫截面積的光通過使用包括場鏡6和激發透鏡裝置10的遠心激發光學器件而被成像在所述多個個體位點的組裝上。所以，在本發明的該實施例中，用激發光學器件執行所述多個個體位點的激發，所述激發光學器件在所述場鏡6的物體位點是遠心的。
根據本發明的光學器械也適於化學發光和生物發光的成像。由於在這些情況下不需要激發光，因此可以省略光源4、激發透鏡裝置10和激發濾光系統8。
在進一步優選的變型中，根據本發明的光學器械進一步包括光束摺疊單元，所述單元包含一個、兩個或更多的摺疊式反射鏡，所述摺疊單元摺疊來自所述光源的光和來自所述多個個體位點的組裝的螢光信號。
在本發明的範圍內光束摺疊單元是提供一個長光程、而同時僅僅需要有限量空間的單元。為了從所述激發光學器件調整所述數值孔徑，可以修改的一個參數是光必須經過的光程。擴大該光程會減小所述數值孔徑。所以，如果期望小孔徑滿足場深度要求和均勻強度分布，則所述光程將較長。由於大型器械不符合條件，所述摺疊式反射鏡可以用於實現一個長的光程並且同時限制器械尺寸。
如之前所述，根據本發明的光學器械包括成像透鏡裝置11，所述成像透鏡裝置11將來自所述場鏡6的光轉移到所述換能器5。
這意味著在所述多個個體位點的組裝處產生的螢光信號被包括場鏡6和成像透鏡裝置11的遠心成像光學器件成像在換能器5上。在本發明的其它實施例中，所述遠心成像光學器件例如進一步包括光束摺疊單元和/或特殊成像濾光系統9。
所述遠心成像光學器件必須在所述換能器的尺寸和所述多個個體位點的組裝的空間尺寸上進行優化。與激發透鏡裝置11的情況一樣，成像透鏡裝置11包括至少一個透鏡，優選地為至少5個透鏡的組裝。所述成像透鏡裝置需要大量的透鏡，因為與所述激發光學器件相比，成像光學器件必須應付甚至更高的要求。所述螢光成像必須具有合適的縮放比例以便在所述換能器上正確再生各位點的橫向分布。另外，類似球面像差或色差、彗差、散光、像場的特殊錯誤或彎曲這樣的像差必須被控制。由於螢光信號成像到所述換能器上，因此用一種成像光學器件執行所述螢光成像，所述成像光學器件僅僅在場鏡6的物體位點是遠心的。
在根據本發明的光學器械的進一步的優選變型中，所述成像透鏡裝置11耦合到所述換能器5以形成成像單元12。
注意在本發明的該優選實施例中，所述遠心成像光學器件不同於標準物鏡，其中所有透鏡以限定方式被布置和固定以形成物鏡並且所述物鏡作為整體放置在所述換能器和所述物體之間。恰恰相反的是，在本發明的該優選的實施例中，所述成像透鏡裝置11耦合到所述換能器5，從而形成成像單元12。為了滿足關於成像解析度和精度的要求，成像透鏡裝置和換能器的定位尤其重要。在該實施例中，在優化位置被固定之前通過優化所述成像透鏡裝置和所述換能器之間的位置而滿足這些要求。所述成像透鏡裝置和所述換能器之間的所述耦合在整個預定的使用中被保持並且僅僅當所述定位的重新優化成為必要時被釋放。
在根據本發明的光學器械的實施例中，所述換能器包括半導體器件或優選地電荷耦合器件。
在本發明的上下文中，換能器是能夠將光轉換成可由計算機處理的電信號的一種設備。這可以由半導體設備實現，該半導體設備所具有的帶隙小於與待檢測的螢光信號對應的能量。通過所述設備的照射在所述半導體的傳導帶中產生的電子產生可測量的信號，該信號可以被轉化成可計算的數據。這些半導體設備的例子是光電二極體或電荷耦合器件(CCD)。
根據本發明的光學器械的進一步優選的變型是一種光學器械，其中所述組裝的個體位點是井，所述激發光平行於所述井的側壁並且充填所述井的溶液包括螢光染料。
所述光學器械的進一步優選變型的例子是用於同時監視發生在微量滴定板的單個井中的PCR(聚合酶鏈式反應)擴增的設備。為了獨立於所述井內的充填高度而照射所述井的整個內部，激發光平行於所述井的側壁。由於用於激發以及用於螢光成像的遠心光學器件被使用，所以從所述板的中心的井得到的結果與從所述板的邊界處的井得到的結果相當。
在單個井中執行PCR擴增的情況下，所有螢光體可作為特異性地結合到雙鏈核酸的螢光染料而被應用。在本發明的上下文中，這些螢光染料被稱為螢光DNA結合體，其中如果它們結合到雙鏈DNA，則所述螢光DNA結合體是提供特徵螢光的分子或一對分子。在實時PCR監視的領域中以下的檢測形式是公知的DNA結合染料形式(例如SybrGreenI)、TaqMan探針、分子信標、單標記探針(SLP)形式或FRET雜交探針。
根據本發明的光學器械的又一優選實施例是一種光學器械，其中所述組裝的所述個體位點是平面載體上的斑點並且螢光染料附著到所述斑點。
光學器械的該優選實施例的例子是用於同時成像來自平面陣列的不同斑點的螢光信號的設備。在一個特定實施例中這樣的陣列是DNA陣列，其中橫向限制區域被具有不同序列的DNA探針功能化。在該情況下，如果例如互補DNA鏈被螢光染料標記，則根據本發明的光學器械可以監視與包含核酸的樣本的雜交事件。作為樣本中DNA分子的標記的替代，也可以通過雙鏈核酸結合螢光染料來顯現雜交事件。
本發明也涉及實時PCR器械，其包括
根據本發明的光學器械，和加熱和冷卻具有一個或多個井的載體的機構，每個井包含能夠執行PCR反應的反應混合物。
在本發明的範圍內，用於加熱和冷卻的所述機構包括為了執行核酸的循環PCR擴增而能夠以循環方式控制和改變所述多個個體位點的組裝的溫度的任何機構。每個PCR循環包括幾個不同的步驟降低溫度的退火步驟，在相對低溫的酶擴增步驟連同使用螢光染料的檢測步驟和在高溫的解鏈步驟。
本發明進一步涉及一種用於成像多個化驗物的螢光信號的系統，其包括平面載體2，其包括多個個體化驗物的組裝，至少一個發光的光源4，其包括至少一個激發頻率，換能器5，其被布置成接收來自所述多個化驗物的螢光信號，其中該換能器產生可計算的原始數據，和從所述光源4到所述換能器5的射束徑跡，其特徵在於，所述多個個體化驗物的組裝的遠心激發和在所述多個個體化驗物的組裝的每一個單個化驗物處產生的所述螢光信號的遠心成像。
多個個體化驗物的組裝概括了由兩個或更多在空間上分離以實現並行分析的化驗物組成的物體。這些化驗物例如可以在微量滴定板的井中或載玻片的功能化表面區域上被執行。在多數情況下所述多個個體化驗物的組裝將以一致的方式被布置並且為了執行多路復用的分析，每個化驗物將具有不同的內容。在DNA微陣列的情況下，所述陣列的每個斑點用具有某個序列的寡聚物進行功能化，其中在免疫測定的情況下所述陣列的每個斑點例如用具有不同親合力的蛋白進行功能化。在微量滴定板的情況下在每個井中例如執行不同的PCR。
在根據本發明的用於成像多個化驗物的螢光信號的系統的一個優選實施例中，所述系統進一步包括場鏡，其中所述射束徑跡兩次通過所述場鏡。
在根據本發明的用於成像多個化驗物的螢光信號的系統的另一個優選實施例中，所述系統進一步包括成像透鏡裝置11，其中所述成像透鏡裝置11耦合到所述換能器5以形成成像單元12。
在根據本發明的用於成像多個化驗物的螢光信號的系統的又一個優選實施例中，所述系統進一步包括對於至少一個激發頻率是透明的而對於所述螢光信號的頻率是反射的射束分裂器7，或者包括對於至少一個激發頻率是反射的而對於所述螢光信號的頻率是透明的射束分裂器7。
根據本發明的用於成像多個化驗物的螢光信號的系統的又一個優選實施例進一步包括激發濾光系統和/或成像濾光系統，所述激發濾光系統能夠將來自所述光源的至少一個激發頻率轉移到所述多個個體位點的組裝並且同時阻止多個其它頻率，所述成像濾光系統能夠將來自所述多個個體位點的組裝的螢光信號轉移到所述換能器並且同時阻止具有激發頻率的光。
本發明的另一個方面涉及一種用於同時實時地執行和監視多個PCR反應的系統，其包括多井板，其帶有多個個體位點，每個位點包含能夠執行PCR反應的反應混合物，螢光DNA結合體，和實時PCR器械，其包括根據本發明的光學器械，該光學器械用遠心光照射整個所述多井板，並且通過換能器檢測來自所述多井板的每一個井的螢光信號，所述換能器被布置成接收相應的螢光信號，以便產生可計算的原始數據。
通常，存在用於實時檢測擴增的DNA的螢光DNA結合體的兩種形式，其中以下是本領域中公知和常用的a)DNA結合染料形式由於雙鏈擴增產物的數量通常超過原始存在於待分析的樣本中的核酸的數量，因此可以使用雙鏈DNA特異性染料，僅僅當它們結合到雙鏈DNA時，在用合適波長進行激發後其表現出增強的螢光性。優選地，僅僅可以使用那些類似於SybrGreen I這樣的不影響PCR反應效率的染料。
現有技術中已知的所有其他方式要求設計一個螢光標記的雜交探針，其僅在結合到它的靶核酸後發出螢光。
b)TaqMan探針單鏈雜交探針用兩個成分標記。當用合適波長的光激發第一成分時，根據螢光共振能量轉移的原理，吸收的能量被轉移到被稱為淬火劑的第二成分。在PCR反應的退火步驟期間，所述雜交探針結合到靶DNA並且在隨後的延長期被Taq聚合酶的5』-3』核酸外切酶活性降解。結果受激螢光成分和淬火劑在空間上彼此分離，因此可以測量第一成分的螢光發射(US 5,538,848)。
c)分子信標這些雜交探針也用第一成分和淬火劑標記，所述標記優選地位於所述探針的兩端。作為所述探針的二級結構的結果，兩種成分在溶液中在空間接近。當雜交到靶核酸之後兩種成分彼此分離，從而在用合適波長的光激發之後，可以測量第一成分的螢光發射(US 5,118,801)。
d)單標記探針(SLP)形式該檢測形式由用單個螢光染料在5』-或3』-端標記的單個寡核苷酸構成(WO 02/14555)。兩個不同的設計可以用於寡標記G-淬火探針和硝基吲哚去淬火探針。
在G-淬火探針實施例中，螢光染料在寡5』-或3』-端連接到C。如果兩個G’s位於與C相反的靶鏈上並且處於互補寡核苷酸探針旁側的位置1，則當探針被雜化到靶時，螢光顯著減弱。
在硝基吲哚去淬火探針實施例中，螢光染料在寡核苷酸的5』-或3』-端連接到硝基吲哚。硝基吲哚在某種程度上減小了自由探針的螢光信令。當所述探針被雜交到靶DNA時螢光由於去淬火作用而增加。
e)FRET雜交探針FRET雜交探針測試形式尤其有用於所有類型的同質雜交化驗(Matthews，J.A.，和Kricka，L.J.，Anal.Biochem.《分析生物化學》169(1988)1-25頁)。其特徵在於一對兩個單鏈雜交探針，它們同時被使用並且與擴增的靶核酸的相同鏈的相鄰位點互補。兩個探針都用不同螢光成分標記。當用合適波長的光激發時，根據螢光共振能量轉移的原理，第一成分將吸收的能量轉移到第二成分，使得當兩個雜交探針結合到待檢測的靶分子的相鄰位置時，可以測量第二成分的螢光發射。
當退火到靶序列時，所述雜交探針的位置必須以頭接尾的布置，彼此非常接近。通常，第一探針的被標記3』-端和第二探針的被標記5』-端之間的間隙儘可能地小，即1-5鹼基。這允許FRET供體化合物和FRET受體化合物緊密接近，其典型地為10-100埃。
替代監視FRET受體成分的螢光增加，也可能作為雜交事件的定量測量而監視FRET供體成分的螢光減小。
尤其是，為了檢測擴增的靶DNA，FRET雜交探針形式可以用於實時PCR。在實時PCR領域的所有已知檢測形式中，FRET雜交探針形式已被證明是高靈敏度、精確且可靠的(WO 97/46707；WO 97/46712；WO97/46714)。然而，合適的FRET雜交探針序列的設計有時候可受到待檢測的靶核酸序列的特殊特徵限制。
作為利用兩種FRET雜交探針的另一選擇，也可能使用螢光標記的引物和僅僅一個被標記的寡核苷酸探針(Bernard，P.S.等，Anal.Biochem.《分析生物化學》255(1998)101-107頁)。在這一點上，它可以任意選擇，而無論所述引物是否用FRET供體或FRET受體化合物標記。
本發明進一步涉及一種用於擴增、檢測和/或量化多個靶DNA序列的方法，其包括提供一能夠執行PCR反應的組合物或反應混合物，使所述反應混合物受熱循環方案支配，從而可以發生所述多個靶DNA序列的擴增，以及在多個擴增循環之後至少使用螢光DNA結合體和根據本發明的實時PCR器械監視每個DNA序列的存在和數量一次。
在下面提供例子、參考文獻和附圖以幫助理解本發明，本發明的實際範圍在後附的權利要求中闡述。應當理解可以在所述的過程中進行修改而不脫離本發明的精神。
例子在具體描述中說明以及在圖2(僅僅帶有一個光源)中示出的一種光學器械按如下被配置。所述遠心激發光學器件被調整以處理450-650nm的頻率並且所述遠心成像光學器件處理500-740nm的頻率。所述光源是氙燈，且作為換能器，使用了有1024×1344像素的冷卻式2/3」CCD晶片。所述光學器械被設計成成像83mm×117mm的面積，從而可以使用帶有96個井(距離9mm；直徑5mm)和384個井(距離4.5mm；直徑3mm)的微量滴定板(MTP)。對於某些螢光染料，用於激發和成像的合適波長由濾光輪調整。
所述遠心激發光學器件在所述光源的側面上具有0.35的數值孔徑，在所述MTP的側面上具有0.014的數值孔徑。所述光源被布置成垂直於所述CCD晶片並且所述激發光束必須通過一射束分裂器而朝向所述MTP，該射束分裂器對必要的激發頻率是反射的而對包含在來自所述光源的光中的其它頻率是透明的。來自所述射束分裂器的激發光束垂直於所述MTP並且跨所述物場(88mm×122mm)具有10％以下的強度變化。所述成像光學器件在物體側也具有0.014的孔徑，和對800mm物像距離具有-0.075的再生比例。使用兩個摺疊式反射鏡實現了該大距離。所述成像光學器件具有+/-3mm的場深度。由於激發，所使用的射束分裂器對於在所述MTP井中產生的螢光信號是透明的。
參考文獻列表Bernard，P.S.等的Anal.Biochem.《分析生物化學》255(1998)101-107頁DE 10131687DE 10155142DE 10200499DE 19748211 A1EP 1275954 A2JP 2002014044Matthews，J.A.和Kricka，L.J.的Anal.Biochem.《分析生物化學》169(1988)1-25頁US 2002/0005493 A1US 2002/159057US 2003/0011772 A1US 5,118,801US 5,538,848US 6,246,525 B1US 6,498,690 B1WO 02/14555WO 03/069391WO 97/46707WO 97/46712WO 97/46714WO 99/6038權利要求
1.一種用於成像來自多個個體位點的螢光信號的光學器械，其包括保持機構(1)，其用於保持帶有多個個體位點(3)的組裝的平面載體(2)；至少一個發光的光源(4)，其包括至少一個激發頻率；換能器(5)，其被布置成接收來自所述多個個體位點(3)的組裝的螢光信號，其中該換能器(5)產生可計算的原始數據；場鏡(6)，其將來自所述光源(4)的激發光轉移到所述多個個體位點(3)的組裝和並且將來自所述多個個體位點(3)的組裝的螢光信號轉移到所述換能器(5)；激發透鏡裝置(10)，其將來自所述光源(4)的激發光轉移到所述場鏡(6)；成像透鏡裝置(11)，其將來自所述場鏡(6)的螢光信號轉移到所述換能器(5)，其中所述激發光和來自多個個體位點的螢光信號的所述成像在所述場鏡(6)的物體側是遠心的。
2.根據權利要求1所述的光學器械，進一步包括對於至少一個激發頻率是透明的而對於所述螢光信號的頻率是反射的射束分裂器(7)，或者包括對於至少一個激發頻率是反射的而對於所述螢光信號的頻率是透明的射束分裂器。
3.根據權利要求1-2所述的光學器械，其中所述成像透鏡裝置(11)耦合到所述換能器(5)以形成成像單元(12)。
4.根據權利要求1-3所述的光學器械，其中所述組裝的所述個體位點是井，所述激發光平行於所述井的側壁，並且充填所述井的溶液包括螢光染料。
5.根據權利要求1-3所述的光學器械，其中所述組裝的所述個體位點是平面載體上的斑點並且螢光染料附著到所述斑點。
6.一種實時PCR器械，其包括根據權利要求1-5的光學器械；加熱和冷卻帶有一個或多個井的載體的機構，每個井包含能夠執行PCR反應的反應混合物。
7.一種用於成像多個化驗物的螢光信號的系統，其包括平面載體(2)，其包括多個個體化驗物的組裝；至少一個發光的光源(4)，其包括至少一個激發頻率；換能器(5)，其被布置成接收來自所述多個化驗物的螢光信號，其中該換能器產生可計算的原始數據；從所述光源(4)到所述換能器(5)的射束徑跡，其特徵在於所述多個個體化驗物的組裝的遠心激發和在所述多個個體化驗物的組裝的每一個單個化驗物處產生的所述螢光信號的遠心成像。
8.根據權利要求7所述的系統，進一步包括成像透鏡裝置(11)，其中所述成像透鏡裝置(11)耦合到所述換能器(5)以形成成像單元(12)。
9.根據權利要求7-8所述的系統，進一步包括場鏡，其中所述射束徑跡兩次通過所述場鏡。
10.根據權利要求7-9所述的系統，進一步包括對於至少一個激發頻率是透明的而對於所述螢光信號的頻率是反射的射束分裂器(7)，或者包括對於至少一個激發頻率是反射的而對於所述螢光信號的頻率是透明的射束分裂器(7)。
11.一種用於同時實時地執行和監視多個PCR反應的系統，其包括多井板，其帶有多個個體位點，每個位點包含能夠執行PCR反應的反應混合物；螢光DNA結合體；根據權利要求6的實時PCR器械，其包括根據權利要求1-5的光學器械，該光學器械用遠心光照射整個多井板，並且通過一換能器檢測來自所述多井板的每一個井的螢光信號，所述換能器被布置成接收相應的螢光信號，以便產生可計算的原始數據。
12.一種用於擴增、檢測和/或量化多個靶DNA序列的方法，其包括提供一能夠執行PCR反應的組合物或反應混合物；使所述反應混合物受熱循環方案支配，從而可以發生所述多個靶DNA序列的擴增；在多個擴增循環之後至少使用螢光DNA結合體和根據權利要求6的實時PCR器械監視每個DNA序列的存在和數量一次。
全文摘要
本發明涉及DNA分析領域，尤其是，本發明針對用於在多個位點並行成像螢光強度作為DNA雜交的測度的設備。更特別地，本發明針對一種用於成像多路復用實時PCR或讀出DNA微陣列的設備。
文檔編號G01N21/64GK1808204SQ20061000505
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月17日 優先權日2005年1月18日
發明者M·古特昆斯特 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司