通過質譜法檢測雌二醇的方法

2023-10-26 19:08:02 5

專利名稱：通過質譜法檢測雌二醇的方法
技術領域：
本發明涉及雌二醇的檢測。在具體的方面，本發明涉及通過質譜法檢測雌二醇的 方法。
背景技術：
本發明的下列背景技術的描述僅作為輔助理解本發明而提供，並且不被認為是描 述或構成了本發明的現有技術。雌二醇[17β-雌二醇或雌-1，3，5 (10)-三烯-3，17-二醇，(17_β)]或 Ε2 是分 子量為272. 38道爾頓的C18甾體激素。它是性激素，稱為「雌性」激素(也存在於雄性中)， 其是一組內源留體中最有效的雌激素，其包括雌酮(El)和雌三醇(Ε3)。在女性中，主要由 卵巢產生雌二醇，由腎上腺次級產生，並在脂肪組織中將留體前體轉化至雌激素。雌二醇負 責乳腺和生殖上皮的生長以及第二性徵的發育。除了促進健康的骨結構和調節女性膽固醇 水平外，雌二醇的正常水平提供適當的排卵、受孕和妊娠。在男性中，睪丸和腎上腺是雌二 醇的主要來源。雌二醇被需要用於維持激素平衡和其他腺體的功能。採用質譜法檢測具體雌二醇離子的方法已被描述。例如，Nelson R, et al., Clinical Chem 2004,50(2) 373-84 ；MelIon-Nussbaum S, et al.，J Biol Chem 1982， 257(10) :5678-5684 ；和 Xu X，et al.，Nature Protocols 2007,2(6) :1350_1355 公開了 使用液相層析和質譜法檢測多種雌二醇離子的方法。這些方法在通過質譜法檢測前衍生雌 二醇。通過液相層析/質譜法檢測未衍生的雌二醇的方法被公開在Guo T，et al. , Arch Pathol Lab Med 2004,128 469-475 ；Sun Y, et al. , J Am Soc Mass Spectrom 2005， 16(2) :271-279 JPDiaz-Cruz S，et al. ,J Mass Spectrom 2003,38 :917_923 中。通過氣相 層析/質譜法檢測雌二醇的方法被公開在Nachtigall L，et al. ,Menopause J of N. Amer. Menopause Society 2000,7(4) :243_250 ；Santen R，et al.，Steriods 2007,72 :666_671 ； Dorgan J, et al. , Steriods 2002,67 :151-158 ；Biancotto G, et al. , J Mass Spectrom 2002,37(12) : 1266-1271 ；Fedeniuk Rff,et al.，J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2004，802 (2) :307_315 ；和 Biddle S, et al.，Anal Chim Acta，2007，586 (1-2)； 115-121 中。

發明內容
本發明提供通過包括在串聯質譜法內的質譜法檢測樣品中雌二醇的量的方法。一方面，提供了測定測試樣品中雌二醇的量的方法。所述方法可包括(a)通過液 相層析純化測試樣品中的雌二醇；(b)電離測試樣品中的雌二醇；和(c)通過質譜法檢測雌 二醇離子(或多種)的量並且將檢測的雌二醇離子(或多種)的量關聯到測試樣品中的雌 二醇的量。在這方面某些優選的實施方式中，所述方法量化極限是小於或等於80pg/mL ；以 及優選地，雌二醇在質譜法之前沒有進行衍生。在某些優選的實施方式中，所述方法包括產 生雌二醇的一種或多種前體離子，其中至少一種前體離子具有271. 14士. 5或255. 07士. 5
4的質/荷比。在相關優選的實施方式中，所述方法可包括產生雌二醇前體離子的一種 或多種碎片離子，其中至少一種碎片離子具有183. 10士.5、159. 20士.5、145. 10士. 5或 133. 20士. 5的質/荷比；優選地，一種或多種碎片離子選自具有183. 10士· 5和133. 20 + . 5 的質/荷比的離子。在這方面某些優選的實施方式中，測試樣品是體液。在某些優選的實 施方式中，所述方法可包括將試劑以足以將雌二醇從可能存在於測試樣品中的蛋白分離的 量添加至測試樣品。在相關優選的實施方式中，所述方法可包括酸化測試樣品；優選地在電 離前酸化；更優選地在純化前酸化；優選地用甲酸酸化。在不同的優選實施方式中，所述方 法可包括將鹽以足以將雌二醇從可能存在於測試樣品中的蛋白分離的量添加至測試樣品； 優選地在電離前添加；更優選地在純化前添加；優選地添加硫酸銨。在特別優選的實施方 式中，IOOmM硫酸銨添加至測試樣品以使測試樣品中硫酸銨終濃度為 57mM。如本文所用，除非另有所述，單數形式「一」 (「a」、「an」和「the」)包括複數指代。 因此，例如，「一個蛋白」的指代包括多個蛋白分子。如本文所用，術語「純化(purification) 」或「純化(purifying)，，不是指將除感 興趣分析物(或多種)之外的所有物質從樣品中去除。而是，純化是指相對於樣品中可幹 擾感興趣分析物檢測的其他組分，富集一種或多種感興趣分析物的量的方法。樣品在本文 中通過多種方法純化以使得一種或多種幹擾物質——例如可幹擾通過質譜法檢測所選擇 的雌二醇母離子和子離子的一種或多種物質——去除。如本文所用，術語「測試樣品」是指可能含有雌二醇的任何樣品。如本文所用，術 語「體液」是指可從個體的身體上分離的任何液體。例如，「體液」可包括血液、血漿、血清、 膽汁、唾液、尿液、淚液、汗液等。如本文所用，術語「衍生」是指使兩個分子反應以形成一個新分子。衍生化試劑可
包括異硫氰酸酯基團、二硝基-氟代苯基基團、硝基苯氧基羰基基團和/或苯二醛基團和類 似物。如本文所用，術語「層析」是指這樣的方法，其中由液體或氣體攜帶的化學混合物 當它們在固定液相或固相周圍或之上流動時由於化學實體的微分分布而被分成各種組分。如本文所用，術語「液相層析」或「LC」是指當流體均一地通過細微分開的物質的柱 或者通過毛細管道過濾時流體溶液的一種或多種組分選擇性滯留的方法。滯留是由於當該 流體相對於固定相(或多個)移動時混合物的組分在一個或多個固定相和本體流體(bulk fluid)(即流動相)之間的分布。「液相層析」的實例包括反相液相層析(RPLC)、高效液相 層析(HPLC)和高湍流液相層析(HTLC)。如本文所用，術語「高效液相層析」或「HPLC」是指這樣的液相層析，其中分離程度 通過使流動相在壓力下穿過固定相——通常為緊密填充柱——而增加。如本文所用，術語「高湍流液相層析」或「HTLC」是指這樣的層析形式，其利用要 分析物質通過柱填充的湍流作為進行分離的基礎。HTLC已經被用於在通過質譜法分析之 前含有兩種未命名藥物的樣品的製備。參見例如Zimmer，et al. , J. Chromatogr. A 854 23-35(1999)；也可參見美國專利號 5，968，367,5, 919，368,5, 795，469 和 5，772，874，其進 一步解釋HTLC。本領域普通技術人員理解「湍流」。當流體緩緩並平穩地流動時，這種流 動稱為「層流」。例如，以低流速穿過HPLC柱運動的流體是層狀的。在層流中，流體顆粒 的運動以一般以直線運動的顆粒順序進行。在更快的速度下，水的慣性克服了流體摩擦
5力並且形成湍流。不與不規則邊界接觸的流體「超過」(「outruns」)由於摩擦而減慢或 不均勻表面而偏斜的流體。當流體湍急流動時，它以渦流和漩渦(或旋流)流動，比流體 平流時具有更多的「牽引」。許多參考可用於當流體流動是層流或湍流時輔助測定(例如 Turbulent Flow Analysis -Measurement and Prediction,P.S.Bernard & J. M. Wallace, John Wiley& Sons，Inc. ， (2000) :An Introduction to Turbulent Flow,Jean Mathieu & Julian Scott，Cambridge University Press (2001))。如本文所用，術語「氣相層析」或「GC」是指這樣的層析，其中樣品混合物被汽化並 且被注射到穿過包含由液體或顆粒固體組成的固定相的柱而移動的載氣(如氮氣或氦氣) 流中，並且根據化合物對固定相的親和力被分離成其組分化合物。如本文所用，術語「大顆粒柱」或「提取柱」是指含有平均顆粒直徑大於約35 μ m的 層析柱。如該上下文中所用，術語「約」意思是士 10%。在優選的實施方式中，柱含有直徑 約60 μ m的顆粒。如本文所用，術語「分析柱」是指這樣的層析柱，其具有足夠的層析板以進行從柱 中洗脫的樣品中物質的分離得以測定分析物的存在或量。這種柱通常區別於「提取柱」，提 取柱具有從未保留的物質中分離或萃取保留的物質的一般目的以獲得純化的樣品用於進 一步分析。如該上下文中所用，術語「約」意思是士 10%。在優選的實施方式中，分析柱含 有直徑約4μπι的顆粒。如本文所用，術語「在線」(「on-line」)或「線上」(「inline」)，例如用在「在 線自動方式」或「在線提取」中，是指不需要操作者介入而進行的步驟。相反，術語「離 線」(「off-line」)如本文所用是指需要操作者人工介入的步驟。因此，如果樣品進行沉 澱，然後上清液人工地裝載至自動取樣器，沉澱和裝載步驟對於後續步驟是離線的。在該方 法的多個實施方式中，一個或多個步驟可以在線自動方式進行。如本文所用，術語「質譜法」或「MS」是指通過它們的質量鑑定化合物的分析技術。 MS是指基於它們的質荷比或「m/z」過濾、檢測和測量離子的方法。MS技術一般包括(1)使 化合物電離以形成帶電化合物；和(2)檢測帶電化合物的分子量並計算質荷比。化合物可 通過任何合適的方式電離並檢測。「質譜儀」一般包括電離器和離子檢測器。通常，感興趣的 一個或多個分子被電離，然後離子被引入質譜儀器，其中由於磁場和電場的組合，離子在空 間上沿著取決於質量(「m，，)和電荷("ζ")的路徑而行。參見例如美國專利號6，204，500， 發明名稱為 「Mass Spectrometry From Surfaces」 ；6，107，623，發明名稱為 「Methods and Apparatus for Transerm Mass Spectrometry，，;6, 268，144,發明名禾爾為"DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry」 ;6, 124，137，發明名稱為 「Surface—Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes，，；Wright, et al. , Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2 264-76 (1999)；以 & Merchant 禾口 Weinberger, Electrophoresis21 :1164-67 (2000)。如本文所用，術語「負離子模式運行」是指產生並檢測負離子的那些質譜法。如本 文所用，術語「正離子模式運行」是指產生並檢測正離子的那些質譜法。如本文所用，術語「電離」(「ionization」)或「電離」(「ionizing」)是指產生 具有等於一個或多個電子單位的淨電荷的分析物離子的過程。負離子是具有一個或多個電 子單位的淨負電荷的離子，而正離子是具有一個或多個電子單位的淨正電荷的離子。
如本文所用，術語「電子電離」或「EI」是指這樣的方法，其中氣態或蒸汽相中的感 興趣分析物與電子流相互作用。電子與分析物的相互作用產生分析物離子，其然後可用於 質譜法技術。如本文所用，術語「化學電離，，或「Cl，，是指這樣的方法，其中試劑氣體(例如氨) 經歷電子碰撞，並且分析物離子通過試劑氣體離子與分析物分子相互作用而形成。如本文所用，術語「快速原子轟擊」或「FAB」是指這樣的方法，其中高能原子束(通 常為Xe或Ar)碰撞非揮發性樣品，使樣品中包含的分子解吸並電離。測試樣品被溶解在粘 性液體基質諸如甘油、硫代甘油、間硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、環丁碸、二乙 醇胺和三乙醇胺。對於化合物或樣品適合的介質的選擇是經驗過程。如本文所用，術語「基質輔助雷射解吸電離」或「MALDI」是指這樣的方法，其中非揮 發性樣品被暴露至雷射照射，其通過包括光致電離、質子化作用、去質子化作用和群集衰變 在內的多種電離方式解吸並電離樣品中的分析物。對於MALDI，樣品與能量吸收基質混合， 所述能量吸收基質促進分析物分子的解吸。如本文所用，術語「表面增強雷射解吸電離」或「SELDI」是指另一種方法，其中非 揮發性樣品被暴露至雷射照射，其通過包括光致電離、質子化作用、去質子化作用和群集衰 變在內的多種電離方式解吸並電離樣品中的分析物。對於SELDI，樣品通常結合至優選地保 留一種或多種感興趣分析物的表面。如在MALDI中，該過程也可使用能量吸收物質以促進 電離。如本文所用，術語「電噴霧電離」或「ESI」是指這樣的方法，其中溶液沿短長度的 毛細管穿過至被施加高正電壓或負電壓的末端。到達管末端的溶液被蒸發(被霧化)至在 溶劑蒸汽中溶液微小液滴的噴射或噴霧。這種霧滴流經蒸發室——其被略微加熱以防止冷 凝並蒸發溶劑。隨著液滴變小，電錶面電荷密度增加直至相同電荷之間的自然排斥引起離 子以及中性分子被釋放的時間。如本文所用，術語「大氣壓化學電離」或「APCI」是指與ESI相似的質譜法；但是， APCI通過在大氣壓下發生在等離子體中的離子-分子反應產生離子。等離子體通過噴射毛 細管與對電極之間的放電維持。然後，離子通常通過使用一系列差動泵抽的撇油器階段被 提取至質量分析儀。乾燥並預熱的N2氣反流可用於提高溶劑的去除。APCI中的氣相電離 可以比ESI更有效地用於分析更小極性的種類。如本文所用，術語「大氣壓光致電離」或「APPI」是指這種形式的質譜法，其中分 子M光致電離的機理是光子吸收和電子射出以形成分子的離子M+。由於光子能量通常僅 在電離電壓之上，所以分子的離子解離的可能性較小。在許多情況下，可能的是在不需層 析下分析樣品，從而節省明顯時間和費用。在水蒸汽或質子溶劑存在的情況下，分子的離 子可吸取H以形成MH+。如果M具有高質子親和力，這可能發生。這不影響量化精確度，原 因在於M+與MH+的總數是恆定的。質子溶劑中的藥物化合物通常觀察到為MH+，而非極性 化合物諸如萘或睪酮通常形成M+。Robb, D. B.，Covey, Τ. R.和Bruins，Α. P. (2000)參見 例如，Robb,et al. ,Atmospheric pressure phtoionization :An ionization method for liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 72(15) :3653_3659。如本文所用，術語「感應耦合等離子體」或「ICP」是指這樣的方法，其中樣品與部 分電離的氣體在足夠高的溫度下相互作用以使大部分元素原子化和離子化。
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如本文所用，術語「場致解吸」是指這樣的方法，其中非揮發性測試樣品被置於電 離表面上，並且強電場被用於產生分析物離子。如本文所用，術語「解吸」是指將分析物從表面的去除和/或分析物進入氣相。如本文所用，術語「定量極限」(「limit of quantification」)、「量化極限」(「limit of quantitation")或「LOQ」是指測量變得在數量上有意義的點。在該LOQ的分析物反應 是可以確認的、離散的以及可重複的，精密度為20%以及精確度為80%至120%。如本文所用，術語「檢測極限」(「limit of detection")或「L0D」是測量值大於 與之相關的不確定性的點。LOD被獨斷地定義為零濃度的2倍標準差(SD)。如本文所用，體液樣品中雌二醇的「量」 一般是指反映體液體積中可檢測的雌二醇 質量的絕對值。但是，量還可理解為與另一種雌二醇的量比較的相對量。例如，體液中雌二 醇的量可以是大於對照或正常存在的雌二醇正常水平的量。在第二方面，提供了通過串聯質譜法測定體液樣品中雌二醇的量的方法，其包 括(a)通過液相層析純化體液樣品中的雌二醇；(b)產生質/荷比為255. 07士.5的雌 二醇的前體離子；(c)產生前體離子的一種或多種碎片離子，其中至少一種碎片離子具有 133. 20士. 5的質/荷比；和(d)檢測步驟(b)或(c)或兩者中產生的一種或多種離子的量 並且將檢測的離子關聯到體液樣品中的雌二醇的量。在某些優選的實施方式中，所述方法 的量化極限小於或等於80pg/mL。在其他優選的實施方式中，雌二醇在質譜法之前沒有進行 衍生。在某些優選的實施方式中，所述方法可進一步包括產生雌二醇前體離子的一種或多 種碎片離子，其中至少一種碎片離子具有159. 20士. 5的質/荷比。在某些優選的實施方式 中，所述方法可包括將試劑以足以將雌二醇從可能存在於體液樣品中的蛋白分離的量添加 至體液樣品。在相關優選的實施方式中，所述方法可包括酸化體液樣品；優選地在電離前酸 化；更優選地在純化前酸化；優選地用甲酸酸化。在第三方面，提供了通過串聯質譜法測定體液樣品中雌二醇的量的方法，其包 括(a)通過液相層析純化體液樣品中的雌二醇；(b)產生質/荷比為271. 14士.5的雌 二醇的前體離子；(c)產生前體離子的一種或多種碎片離子，其中至少一種碎片離子具有 183. 10士. 5的質/荷比；和(d)檢測步驟(b)或(c)或兩者中產生的一種或多種離子的量 並且將檢測的離子關聯到體液樣品中的雌二醇的量。在某些優選的實施方式中，所述方法 的量化極限小於或等於80pg/mL。在其他優選的實施方式中，雌二醇在質譜法之前沒有進行 衍生。在某些優選的實施方式中，所述方法可進一步包括產生雌二醇前體離子的一種或多 種碎片離子，其中至少一種碎片離子具有145. 10士. 5的質/荷比。在某些優選的實施方式 中，所述方法可包括將試劑以足以將雌二醇從可能存在於體液樣品中的蛋白分離的量添加 至體液樣品。在相關優選的實施方式中，所述方法可包括將鹽添加至體液樣品；優選地在電 離前添加；更優選地在純化前添加；優選地添加硫酸銨。在特別優選的實施方式中，IOOmM 硫酸銨添加至體液樣品以使體液樣品中硫酸銨終濃度為 57mM。第四方面，提供測定測試樣品中的雌二醇的量的方法，其包括(a)用試劑以足以 將雌二醇從可能存在於測試樣品中的蛋白分離的量酸化測試樣品；(b)通過液相層析純化 測試樣品中的雌二醇；(c)電離測試樣品中的雌二醇以產生一種或多種通過串聯質譜法可 檢測的離子；和(d)通過串聯質譜法以正離子模式檢測雌二醇離子(或多種)的量並且 將檢測的雌二醇離子(或多種)的量關聯到測試樣品中的雌二醇的量。在某些優選的實施方式中，測試樣品是體液。在某些優選的實施方式中，所述方法的量化極限小於或等於 80pg/mL。在其他優選的實施方式中，雌二醇在質譜法之前沒有進行衍生。在某些優選的實 施方式中，所述方法包括產生雌二醇的一種或多種前體離子，其中至少一種前體離子具有 255. 07士.5的質/荷比。在相關優選的實施方式中，所述方法可包括產生雌二醇前體離子 的一種或多種碎片離子，其中至少一種碎片離子具有159. 20士. 5或133. 20士. 5的質/荷 比。在某些優選的實施方式中，所述方法可包括在電離前酸化測試樣品；更優選地在純化前 酸化；優選地用甲酸酸化。第五方面，提供測定測試樣品中的雌二醇的量的方法，其包括(a)將試劑以足以 將雌二醇從可能存在於測試樣品中的蛋白分離的量添加至測試樣品；(b)通過液相層析純 化測試樣品中的雌二醇；(c)電離測試樣品中的純化的雌二醇以產生一種或多種通過串聯 質譜法可檢測的離子；和(d)通過串聯質譜法以負離子模式檢測雌二醇離子(或多種)的 量並且將檢測的雌二醇離子(或多種)的量關聯到測試樣品中的雌二醇的量。在某些優選 的實施方式中，測試樣品是體液。在某些優選的實施方式中，所述方法的量化極限小於或等 於80pg/mL。在其他優選的實施方式中，雌二醇在質譜法之前沒有進行衍生。在某些優選的 實施方式中，所述方法包括產生雌二醇的一種或多種前體離子，其中至少一種前體離子具 有271. 14士.5的質/荷比。在相關優選的實施方式中，所述方法可包括產生雌二醇前體離 子的一種或多種碎片離子，其中至少一種碎片離子具有183. 10士. 5或145. 10士. 5的質/ 荷比。在其他優選的實施方式中，所述方法可包括將鹽試劑添加至體液樣品，優選地在電離 前添加；更優選地在純化前添加，優選地添加硫酸銨。在特別優選的實施方式中，IOOmM硫 酸銨添加至測試樣品以使測試樣品中的硫酸銨終濃度為 57mM。在某些優選的實施方式中，雌二醇可在質譜法之前進行衍生；但是，在某些優選的 實施方式中，樣品製備排除了衍生的使用。 在上述方面某些優選的實施方式中，使用HTLC和HPLC進行液相層析，優選地HTLC 與HPLC結合使用，但是可使用其他方法，包括例如與HPLC結合的蛋白質沉澱和純化。優選的實施方式單獨利用高效液相層析(HPLC)或與一種或多種純化方法例如 HTLC或蛋白質沉澱結合以純化樣品中的雌二醇。在本文公開的方法的某些優選的實施方式中，質譜法以負離子模式進行。可選地， 質譜法以正離子模式進行。在特別優選的實施方式中，雌二醇使用正離子模式和負離子模 式測量。在某些優選的實施方式中，雌二醇使用APCI或ESI以正模式或負模式測量。在上述方面優選的實施方式中，體液樣品中存在的葡萄糖醛酸化的和非葡萄糖醛 酸化的雌二醇被檢測並測量。在優選的實施方式中，在質譜儀中可檢測的雌二醇離子選自質/荷比(m/z)為 271. 14士· 5,255. 07士· 5,183. 10士· 5,159. 20士· 5,145. 10士· 5 和 133. 20士· 5 的離子; 後四種為前體離子的碎片離子。在特別優選的實施方式中，前體離子具有271. 14士. 5或 255. 07士.5的質/荷比，以及碎片離子具有183. 10士.5或133. 20士.5的質/荷比。在優選的實施方式中，在樣品中提供分離的可檢測的雌二醇內標，其量也在樣品 中測定。在這些實施方式中，樣品中存在的內源雌二醇和內標二者的全部或一部分被電離 以產生質譜儀可檢測的多種離子，並且從各個產生的一種或多種離子通過質譜法檢測。優選的雌二醇內標是2，4，16，16，17_d5雌二醇。在優選的實施方式中，質譜儀
9可檢測的雌二醇內標離子選自具有276. 15士. 5,260. 10士. 5,187. 10士. 5,161. 10士. 5、 147. 10士. 5和135. 10士. 5的質/荷比的離子。在特別優選的實施方式中，雌二醇內標的前 體離子選自具有276. 15士.5和260. 10士. 5的質/荷比的離子；以及一種或多種碎片離子 選自具有 187. 10士.5、161. 10士.5、147. 10士.5 禾口 135. 10士. 5 的質 / 荷比的離子。在優選的實施方式中，雌二醇離子的存在或量通過比較參考諸如2，4，16，16， 17-d5雌二醇被關聯到測試樣品中的雌二醇的存在或量。在一個實施方式中，所述方法包括液相層析與質譜法的組合。在優選的實施方式 中，液相層析是HPLC。優選的實施方式單獨利用HPLC或與一種或多種純化方法例如HTLC 或蛋白質沉澱結合以純化樣品中的雌二醇。在另一個優選的實施方式中，質譜法是串聯質 譜法(MS/MS)。在本文公開的方面的某些優選的實施方式中，雌二醇的量化極限(LOQ)小於或 等於80pg/mL ；優選地小於或等於75pg/mL ；優選地小於或等於50pg/mL ；優選地小於或等 於25pg/mL ；優選地小於或等於10pg/mL ；優選地小於或等於5pg/mL ；優選地小於或等於 4. 5pg/mL ；優選地小於或等於4pg/mL ；優選地小於或等於3. 5pg/mL ；優選地小於或等於 3pg/mL ；優選地小於或等於2. 5pg/mL ；優選地2pg/mL。如本文所用，術語「約」在提及不包括離子質量測量的定量測量時，是指所示值加 上或減去10%。質譜儀可在測定給定分析物的質量中輕微變化。術語「約」在離子質量或 離子質/荷比的上下文中是指+/-0. 5原子質量單位。上述的發明內容是非限制性的，並且本發明的其他特徵和優勢將從以下的具體實 施方式和權利要求書中顯而易見。


圖1顯示了使用LC-MS/MS分析在連續稀釋的儲存樣品中雌二醇定量的線性。在 實施例6中進行詳細描述。
具體實施例方式檢測和量化測試樣品中雌二醇的方法被描述。所述方法採用液相層析(LC)一-最 優選為HTLC與HPLC結合——來進行所選分析物的最初純化，並且將該純化與質譜法(MS) 的獨特方法組合，由此提供高通量測試系統用於檢測並量化測試樣品中的雌二醇。優選的 實施方式特別適於大的臨床實驗室應用。雌二醇方法被提供，其具有提高的特異性並且以 比其它雌二醇測試所需的更少的時間和更少的樣品製劑實現。在優選的實施方式中，測試樣品中雌二醇的檢測極限(LOD)小於或等於80pg/mL ； 優選地小於或等於75pg/mL ；優選地小於或等於50pg/mL ；優選地小於或等於25pg/mL ；優 選地小於或等於10pg/mL ；優選地小於或等於5pg/mL ；優選地小於或等於4. 5pg/mL ；優選 地小於或等於4pg/mL ；優選地小於或等於3. 5pg/mL ；優選地小於或等於3pg/mL ；優選地小 於或等於2. 5pg/mL ；優選地2pg/mL。合適的測試樣品包括任何可包含感興趣分析物的測試樣品。例如，在製備合成雌 二醇期間獲得的樣品可以進行分析以測定組成和製備方法的產率。在某些優選的實施方 式中，樣品是生物學樣品；即，從任何生物來源諸如動物、細胞培養物、器官培養物等獲得的樣品。在某些優選的實施方式中，樣品從哺乳動物諸如狗、貓、馬等獲得。特別優選的哺乳 動物是靈長類，最優選地是男性人類或女性人類。特別優選的樣品包括血液、血漿、血清、頭 發、肌肉、尿液、唾液、淚液、腦脊髓液或其它組織樣品。這樣的樣品可從例如患者——即有 生命的個人，男性或女性，其將自己置於臨床環境中以診斷、預測或治療疾病或病症——中 得到。測試樣品優選地從患者中得到，例如血清。質譜法的樣品製備在女性中，大約1. 3%的雌二醇以游離形式循環，其餘的雌二醇結合性激素結合球 蛋白(SHBG)以及結合白蛋白。雌二醇以高親和力(大約40%)結合SHBG或以較低的親和 力結合白蛋白。可採用的以相對於樣品中的其它組分(例如蛋白)富集雌二醇的方法包括例如 過濾、離心、薄層層析(TLC)、包括毛細管電泳在內的電泳、包括免疫親和分離在內的親和分 離、包括乙酸乙酯提取和甲醇提取在內的提取法以及離液劑的應用或上述或類似方法的任 何組合。多種方法可用於在層析和/或MS樣品分析前破壞雌二醇與蛋白之間的相互作用 以使分析可涉及樣品中雌二醇的總量(例如游離的雌二醇和結合蛋白的雌二醇)。蛋白質 沉澱是製備測試樣品特別是生物學測試樣品諸如血清或血漿的一種優選的方法。這樣的蛋 白質純化方法在本領域中是熟知的，例如，Poison，et al.，Journal of Chromatography B 785:263-275(2003)描述了適合用於所述方法的蛋白質沉澱技術。蛋白質沉澱可被用於從 樣品中去除大部分蛋白質，留下在上清液中的雌二醇。樣品可被離心以將液態上清液與沉 澱的蛋白質分開。所得上清液然後可應用於液相層析和後來的質譜法分析。在某些實施方 式中，蛋白質沉澱諸如例如乙腈蛋白質沉澱的應用消除了在HPLC和質譜法之前對高湍流 液相層析(HTLC)或其他在線提取的需要。因此，在這樣的實施方式中，所述方法涉及(1) 進行感興趣樣品的蛋白質沉澱；和(2)在沒有使用在線提取或高湍流液相層析(「HTLC」) 的情況下將上清液直接加樣到HPLC-質譜儀上。在其他優選的實施方式中，雌二醇可從該蛋白中釋放而不必沉澱蛋白。例如，甲酸 或水中40%乙醇可添加至樣品以破壞蛋白和雌二醇之間的相互作用。可選地，硫酸銨可添 加至樣品破壞載體蛋白和雌二醇之間的離子相互作用，而沒有沉澱載體蛋白。在某些優選的實施方式中，HTLC，單獨地或與一種或多種純化方法組合，可被用於 在質譜法之前純化雌二醇。在這樣的實施方式中，樣品可採用捕獲分析物的HTLC提取筒進 行提取，然後在離子化之前在第二 HTLC柱或分析用HPLC柱上洗脫並層析。因為包含在這 些層析方法中的步驟可以自動方式連接，所以對分析物純化期間操作者參與的需求可最小 化。該特徵可引起時間和費用的節省並排除操作者錯誤的可能性。應當認為，湍流——諸如HTLC柱和方法提供的——可增強傳質速率，改進分離特 徵。HTLC柱以高層析流速的方式通過含有硬顆粒的填充柱分離組分。通過應用高流速(例 如3-5mL/min)，在柱中發生湍流，其引起固定相和感興趣分析物(或多種)之間幾乎完全的 相互作用。使用HTLC柱的優勢是由於高分子量的種類在湍流條件下不被保留，消除了與生 物流體基質相關的大分子結構。將多個分離組合在一個步驟的HTLC方法減小了對過多樣 品製備的需要並且以明顯高的速度運行。這些方法還獲得優於層流(HPLC)層析的分離性 能。HTLC允許生物樣品(血漿、尿液等)的直接注射。直接注射在傳統層析形式中很難獲
11得，原因在於變性的蛋白和其他生物碎片迅速堵塞分離柱。HTLC也允許小於ImL的極低的 樣品體積，優選地小於.5mL，優選地小於.2mL，優選地.lmL。在質譜法分析前應用於樣品製備的HTLC的實例已另外描述。參見例如Zimmer， et al.，J. Chromatogr. A 854:23-35(1999)；也可參見美國專利號 5，968，367、5，919，368、 5，795，469和5，772，874。在所述方法的某些實施方式中，樣品在加樣至HTLC柱前經歷如 上所述的蛋白質沉澱；在可選的優選實施方式中，樣品可直接加樣至HTLC而不經歷蛋白沉 澱。優選地，HTLC與HPLC結合使用以提取並純化雌二醇而使樣品不經歷蛋白沉澱。在相 關優選的實施方式中，純化步驟包括(i)將樣品應用至HTLC提取柱，(ii)在雌二醇被柱保 留的條件下洗滌HTLC提取柱，(iii)從HTLC提取柱上洗脫保留的雌二醇，(iv)將保留的 物質應用至分析柱，以及(ν)從分析柱上洗脫純化的雌二醇。HTLC提取柱優選地是大顆粒 柱。在多種實施方式中，所述方法的一個或多個步驟可以在線自動方式進行。例如，在一個 實施方式中，步驟(i)-(v)以在線自動方式進行。在另一個實施方式中，電離和檢測步驟在 步驟(i)-(v)後在線進行。包括高效液相層析(HPLC)在內的液相層析(LC)依賴於相對慢的層流技術。傳統 的HPLC分析依賴於柱填充，其中樣品穿過柱的層流是將感興趣分析物從樣品中分離的基 礎。本領域普通技術人員會理解這種柱中的分離是擴散過程。HPLC已經成功地用於生物 學樣品中化合物的分離；但是，在分離和隨後的用質譜儀(MS)分析之前需要大量的樣品制 備，使得該技術需密集勞動。此外，大部分HPLC系統沒有盡其最大可能地利用質譜儀，使得 僅僅一個HPLC系統連接到單一的MS儀器，導致進行大量測定需要過長的時間。已經描述了各種方法，其使用HPLC用於質譜法分析之前的樣品清理(clean-up)。 參見例如 Taylor，et al.，Therapeutic Drug Monitoring 22 :608_12 (2000)禾口 Salm，et al. , Clin. Therapeutics 22 Supl· B :B71_B85 (2000)。本領域普通技術人員可以選擇適合雌二醇使用的HPLC儀器和柱。層析柱通常包 括便於分離化學物部分(即分餾)的介質(即填充物質)。介質可包括微小顆粒。顆粒包 括結合表面，其與各種化學物部分(chemical moieties)相互作用以促進化學物部分的分 離。一個合適的結合表面是疏水性結合表面諸如烷基結合表面。烷基結合表面可包括C-4、 C-8或C-18結合烷基基團，優選地C-18結合基團。層析柱包括接收樣品的入口和排出包括 分餾的樣品的流出物的出口。在一實施方式中，樣品(或預先純化的樣品)在入口處被施 加到柱，用溶劑或溶劑混合物進行洗脫，並且在出口處排出。可選擇不同的溶劑模式用於洗 脫感興趣分析物(或多種)。例如，液相層析可採用梯度模式、等度模式或多型(即混合) 模式進行。在層析期間，物質的分離受到變量諸如洗脫液(也稱為「流動相」)、洗脫模式、 梯度條件、溫度等的選擇的影響。在某些實施方式中，分析物可在感興趣分析物被柱填充物質可逆地保留而一種或 多種其它物質沒有被保留的條件下通過將樣品施加到柱中進行純化。在這些實施方式中， 可應用第一流動相條件，其中感興趣分析物被柱保留，並且一旦未保留的物質被洗滌穿過， 隨後可應用第二流動相條件以從柱中去除保留的物質。可選地，分析物可在相比一種或多 種其它物質感興趣分析物以不同的速度洗脫的流動相條件下通過將樣品施加到柱中進行 純化。這種方法可相對於樣品的一種或多種其它組分富集一種或多種感興趣分析物的量。在一個優選的實施方式中，HTLC後可在疏水柱層析系統上進行HPLC。在某些優選的實施方式中，使用的是來自Cohesive Technologies基於TurboFlow Cyclone ρ 聚合物 的柱(60 μ m粒子大小，50 X 1.0mm柱尺寸，100 A孔大小)。在相關優選的實施方式中，使用 的是具有疏水封端來自Phenomenex Inc的連接Synergi Polar-RP 酯的苯基分析柱(4 μ m 粒子大小，150X 2. Omm柱尺寸，80 A孔大小)。在某些優選的實施方式中，使用HPLC Grade Ultra Pure水和100%甲醇作為流動相進行HTLC和HPLC。通過仔細選擇閥門和連接器管道，兩個或多個層析柱可按需要連接以使物質從一 個穿至下一個而不需任何手動步驟。在優選的實施方式中，閥門和管道的選擇通過預編程 序的計算機進行控制以進行必要步驟。最優選地，層析系統也以這種在線方式連接至檢測 器系統，例如，MS系統。因此，操作者可將一盤樣品置於自動取樣器中，並在計算機控制下 進行剩餘的操作，實現全部所選樣品的純化和分析。在某些優選的實施方式中，測試樣品中存在的雌二醇可在電離前被純化。在特別 優選的實施方式中，層析不是氣相層析。優選地，所述方法可在質譜分析前不將雌二醇進行 氣相層析而進行。通過質譜法的檢測和量化在多種實施方式中，測試樣品中存在的雌二醇可通過本領域普通技術人員已知的 任何方法進行電離。質譜法採用質譜儀進行，所述質譜儀包括離子源，用於電離分餾的樣品 並產生帶電分子用於進一步分析。例如樣品的電離可通過電子電離、化學電離、電噴霧電離 (ESI)、光子電離、大氣壓化學電離(APCI)、光致電離、大氣壓光致電離(APPI)、快速原子轟 擊(FAB)、液體二次電離(LSI)、基質輔助雷射解吸電離(MALDI)、場致電離、場致解吸、熱噴 霧/等離子噴霧電離、表面增強雷射解吸電離(SELDI)、感應耦合等離子體(ICP)和粒子束 電離進行。本領域普通技術人員應理解電離方法的選擇可根據要測量的分析物、樣品類型、 檢測器類型、正_負模式的選擇等進行確定。在優選的實施方式中，雌二醇通過電噴霧電離(ESI)以正模式或負模式進行電 離。在相關優選的實施方式中，雌二醇離子是氣態並且惰性碰撞氣體是氬或氮。在可選的 優選實施方式中，雌二醇通過大氣壓化學電離(APCI)以正模式或負模式進行電離。樣品已經電離後，由此產生的帶正電或帶負電的離子可進行分析以測定質荷比。 用於測定質荷比的合適分析器包括四極分析器、離子阱分析器和飛行時間分析器。離子 可採用幾種檢測模式進行檢測。例如，所選離子可以進行檢測，即採用選擇離子監測模式 (SIM)，或者可選地，離子可採用掃描模式例如多反應監測(MRM)或選擇反應監測(SRM)進 行檢測。優選地，質荷比採用四極分析器進行測定。例如，在「四極」或「四極離子阱」儀器 中，振蕩射頻場中的離子經歷與電極之間施加的DC電壓、RF信號的振幅和質/荷比成比例 的力。可以選擇電壓和振幅，以致於只有特定質/荷比的離子傳播四極的長度，而所有其它 離子是偏離的。因此，四極儀器可對注入到儀器的離子起到「質量過濾器」和「質量檢測器」 的作用。技術人員可通過利用「串聯質譜法」或「MS/MS」提高MS技術的解析度。在該技術 中，從感興趣分子中產生的前體離子(也稱為母體離子)可在MS儀器中進行過濾，並且前 體離子隨後成碎片以產生一種或多種碎片離子(也稱為子離子或產物離子)，其然後在第 二 MS程序中進行分析。通過仔細選擇前體離子，僅僅由某些分析物產生的離子通過至碎裂 室，其中與惰性氣體原子的碰撞產生子離子(daughter ions)。因為前體和碎片離子都是在給定系列的電離/破裂條件下以可再生方式產生的，所以MS/MS技術可提供極其強大的分 析工具。例如，過濾/破裂組合可被用於消除幹擾物質，並且可特別用於複雜樣品諸如生物 學樣品。質譜儀一般給用戶提供離子掃描；即，在給定範圍(例如100至IOOOamu)內具有 特定質荷比(m/z)的各個離子的相對豐度。分析物測試的結果，即質譜，可通過本領域已知 的許多方法關聯到原始樣品中分析物的量。例如，假定取樣和分析參數進行仔細控制，可將 給定離子的相對豐度與將相對豐度轉化成原始分子的絕對量的表進行比較。可選地，分子 標準可與樣品一起運行，並且基於從那些標準中產生的離子構建標準曲線。利用這種標準 曲線，給定離子的相對豐度可被轉化成原始分子的絕對量。在某些優選的實施方式中，內標 被用於產生計算雌二醇的數量的標準曲線。產生和利用這種標準曲線的方法在本領域中是 熟知的，並且本領域普通技術人員能選擇合適的內標。例如，雌二醇的同位素可被用作內 標；在某些優選的實施方式中，所述標準是d5-雌二醇。將離子的量與原始分子的量關聯的 許多其它方法對本領域普通技術人員應是熟知的。所述方法的一個或多個步驟可採用自動儀器進行。在某些實施方式中，一個或多 個純化步驟在線進行，並且更優選地所有純化和質譜法步驟可以在線的方式進行。在某些實施方式中，諸如MS/MS，其中前體離子被分離以進一步破裂，碰撞活化分 裂通常被用於產生碎片離子以進一步檢測。在CAD中，前體離子通過與惰性氣體碰撞獲得 能量，並且隨後通過被稱為「單分子分解」的過程產生碎片。足夠的能量必須儲蓄在前體離 子中以致於離子內的某些鍵可由於增加的振動能而斷開。在特別優選的實施方式中，雌二醇如下採用MS/MS進行檢測和/或量化。樣品經 歷液相層析，優選地HTLC接著HPLC，來自層析柱的液體溶劑流進入MS/MS分析儀的加熱噴 霧器界面，並且溶劑/分析物混合物在界面的加熱管中被轉化為蒸汽。包含在霧狀溶劑中 的分析物(例如雌二醇)被界面的冠狀放電針電離，其將大的電壓施加到霧狀溶劑/分析 物混合物。離子例如前體離子穿過儀器的孔並且進入第一個四極。四極1和3(Q1和Q3) 是質量過濾器，允許根據它們的質荷比(m/z)選擇離子(即「前體」和「碎片」離子)。四極 2(Q2)為碰撞單元，其中離子被破裂。質譜儀的第一個四極(Ql)選擇具有雌二醇的質荷比 的分子。具有雌二醇的正確質/荷比的前體離子被允許穿到碰撞室(Q2)中，而具有任何其 它m/z的多餘離子與四極的側面碰撞並且被除去。進入Q2的前體離子與中性氬氣分子和 碎片碰撞。該過程被稱為碰撞活化分裂(CAD)。所產生的碎片離子穿到四極3(Q3)，其中雌 二醇的碎片離子被選擇而其它離子被除去。所述方法可包括在正離子模式或負離子模式下進行的MS/MS。採用本領域熟知的 標準方法，本領域普通技術人員能鑑定可用於在四極3(Q3)中選擇的雌二醇的特定前體離 子的一種或多種碎片離子。如果雌二醇的前體離子包括醇或胺基團，通常形成分別代表前體離子的脫水或去 氨基的碎片離子。在包括醇基團的前體離子的情況下，通過脫水形成的這些碎片離子通過 從前體離子中失去一個或多個水分子而形成(即，其中前體離子與碎片離子之間的質荷比 差對於失去一個水分子來說是大約18，或者對於失去兩個水分子來說大約36等)。在包 括胺基團的前體離子的情況下，通過去氨基形成的這些碎片離子通過失去一個或多個氨分 子而形成(即，其中前體離子與碎片離子之間的質荷比差對於失去一個氨分子來說是大約
1417,或者對於失去兩個氨分子來說大約34等)。同樣，包括一個或多個醇和氨基的前體離子 常常形成代表失去一個或多個水分子和/或一個或多個氨分子的碎片離子(即其中前體離 子與碎片離子之間的質荷比差對於失去一個水分子和失去一個氨分子來說是大約35)。一 般地，代表脫水或去氨基的碎片離子不是對特定分析物的特定碎片離子。因此，在本發明優 選的實施方式中，進行MS/MS以使檢測到雌二醇的至少一種碎片離子，其不只表現為從前 體離子中失去一個或多個水分子和/或失去一個或多個氨分子。隨著離子與檢測器碰撞，它們產生轉化成數位訊號的電子脈衝。所獲得的數據被 傳遞到計算機，其將所收集的離子數對時間作圖。所產生的質量層析圖類似於在傳統HPLC 方法中產生的層析圖。測量對應於特定離子的峰下面的面積或這些峰的振幅，並且面積或 振幅被關聯到感興趣分析物(雌二醇)的量。在某些實施方式中，對碎片離子(或多種) 和/或前體離子來說的曲線下面積或峰的振幅進行測量以測定雌二醇的量。如上所述，給 定離子的相對豐度可基於內部分子標準諸如d5-雌二醇的一種或多種離子的峰採用校準標 準曲線轉化成原始分析物例如雌二醇的絕對量。下列實施例起到闡明本發明的作用。這些實施例絕對沒有意圖限制所述方法的範圍。實施例實施例1 樣品和試劑製備血液收集在不含添加劑的Vacutainer中並使其在室溫18°C至25°C凝結30分鐘。 顯示嚴重溶血和/或脂血的樣品被排除。製備甲醇中的lmg/mL雌二醇儲存標準並進一步在甲醇中稀釋以製備 1，000, 000pg/mL雌二醇中間儲存標準，其用於製備兩種10，000pg/mL雌二醇工作標準，對 於標準A稀釋在甲醇中或對於標準B稀釋在汽提的血清中(stripped serum)。含重氫的甲醇(甲基-Cl1醇；Fisher目錄號AC29913-1000或等同物)用於製備 lmg/mL d5-雌二醇儲存標準(2，4，16，16，17-d5雌二醇)，其用於製備含重氫的甲醇中的 1，000, 000pg/mL中間儲存標準。d5-雌二醇中間儲存標準用於製備DI水中的5000pg/mL工 作d5-雌二醇內標lmL的d5-雌二醇中間儲存標準在200mL容量瓶中用DI水稀釋至體積。20%甲酸溶液通過將50mL的甲酸( 98%純Aldrich目錄號06440或等同物) 添加至250mL容量瓶製備，其用超純HPLC級水稀釋至體積。DI水中的IOOmM硫酸銨溶液通 過添加13. 2克的硫酸銨粉末(CAS# 7783-20-2 Fisher目錄號A702_500)至IOOOmL容量 瓶製備，其用DI水稀釋至體積。用於各次運行的所有校準/標準從10，000pg/mL雌二醇標準的冷凍等分試樣在汽 提的血清中連續稀釋每周新鮮製備。製備的標準從最高濃度至最低濃度，各個標準最終總 體積為10mL。實施例2 =使用液相層析從血清中提取雌二醇通過吸取200 μ L的標準、對照或患者樣品至96孔板製備液相層析(LC)樣品。如 果以正離子模式運行，300yL的20%甲酸被遞送至各個孔至 11% (V/V)的終濃度。如果 以負離子模式運行，300 μ L的IOOmM硫酸銨溶液被添加至各個孔至 57mM硫酸銨的終濃 度。另外，25yL的5000pg/mL d5-雌二醇標準被添加至各個孔。在LC前樣品在室溫被溫 育30至45分鐘。
液相層析用Cohesive Technologies Aria TX-4HTLC 系統使用 Aria OS V 1.5 或 更新的軟體進行。自動取樣器洗滌溶液使用30%乙腈、30%甲醇、30%異丙醇和10%丙酮 (ν/ν)製備。HTLC系統自動注射如上製備的75 μ L樣品至用大顆粒填充的TurboFlow柱(來自 Cohesive Technologies 的 50 X 1. 0mm，60 μ m Cyclone P 柱)。樣品以高流速加樣(5mL/ min，加樣試劑100% DI)以在提取柱內部產生湍流。該湍流確保雌二醇與柱中大顆粒的最 優化結合，以及殘留蛋白和碎片通過至廢物。加樣後，流動方向被倒轉，樣品用迴路(loop)中200μ L的100%甲醇洗脫至分析 柱(Phenomenex 分析柱，Synergi Polar-RP 150 X 2. 0mm，4 μ m 柱)。二元 HPLC 梯度被應用 至分析柱以將雌二醇從樣品中含有的其他分析物分離。流動相A是超純水(HPLC^l)以及 移動相B是100%甲醇。HPLC梯度起始於40%有機梯度，其在大約5. 33分鐘內斜線上升至 100%。分析物在77%甲醇梯度從HPLC柱洗脫。然後，分離的樣品進行MS/MS以量化雌二為了測定其他分子的幹擾，空白血清被摻加有各個相同重量的1000pg/mL甾體諸 如16-β雌二醇和17-α雌二醇以及下列留體雌酮、雌三醇、睪酮、17-α羥基孕酮、孕酮、 雄烯二酮、17-β雌二醇葡糖苷酸、17-β雌二醇硫酸鹽以及二羥基睪酮。樣品進行LC。除 了 17-α雌二醇，留體不與雌二醇共洗脫，所述17-α雌二醇部分幹擾17_β雌二醇但具有 足夠不同的保留時間以使操作者容易測定它的存在。實施例3 :MS/MS對雌二醇的檢測和量化MS/MS M Finnigan TSQ Quantum Ultra MS/MS % 統(Thermo Electron Corporation)進行。下列均來自ThermoElectron的軟體程序用於本文所述的實施例中 Tune Master V 1. 2 或更新的、Xcalibur V 2. 0 SRl 或更新的、TSQ Quantum 1.4或更新的、 LCQuan V 2. 0或更新的以及XIteport 1.0或更新的。流出分析HPLC柱的液體溶劑/分析 物流至Thermo Finnigan MS/MS分析儀加熱的霧化器界面。溶劑/分析物混合物在界面的 加熱管中被轉化至蒸汽。霧化的溶劑中的分析物通過被界面的冠狀放電針電離，其將電壓 施加到霧化溶劑/分析物混合物。離子穿過第一個四極(Ql)，其選擇具有質荷比為271. 14士.5m/z或255. 07士.5m/ ζ的離子。進入四極2(Q2)的離子與氬氣碰撞以產生離子碎片，其穿過四極3(Q3)用於進一 步選擇。同時，使用同位素稀釋質譜法的相同方法用內標——5-含重氫的雌二醇分子—— 進行。下列質量轉換用於在正極性確認過程中檢測並量化。表1.雌二醇質量轉換(正極性)
分析物前體離子(m/z)產物離子(m/z)雌二醇255. 07133. 20 與 159. 202,4,16，16，17-d5 雌二醇260.10135. 10 與 161. 10 下列質量轉換用於在負極性確認過程中檢測並量化。
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表2雌二醇質量轉換(負極性) 實施例4 測試內和測試間的精密度和精確度三個質量控制(QC)區由活性炭汽提的血清製備，所述活性炭汽提的血清被摻加 有雌二醇至10、200和800pg/mL的濃度。來自三個QC區每一個的十個等分試樣在單個測試中分析以測定在一個測試內樣 品的重複性(CV)。測定下列值表3.測試內變化和精確度 來自三個QC區每一個的十個等分試樣測試五天以測定測試之間的重複性 (RSD% )。測定下列值表4.測試間變化和精確度 實施例5 分析靈敏度檢測極限(LOD)和量化極限(LOQ)雌二醇零標準以10個重複運行以測定測試的檢測極限，其是測量值大於與之相 關的不確定性的點。LOD被獨斷地定義為零濃度的2倍標準差(SD)。產生的零標準的峰面 積比進行統計學分析，其平均值為.021和SD為.006。雌二醇測試的LOD為2. Opg/mL。為了測定具有精密度為20%和精確度為80%至120%的量化極限，測試濃度接 近於所期望LOQ的的五個不同樣品並且對各個測定重複性。雌二醇測試的LOQ被確定為 2. 0pg/mLo實施例6 測試報告的範圍和線件為了建立測試中雌二醇檢測的線性，製備被設定為零標準的一個空白以及11個 摻料的血清標準並在不同的5天分析。五個連續運行的二次回歸產生0. 995或更大的相關 係數，具有士20%的正確度，其顯示2至2000pg/mL的可定量的線性範圍。實施例7 基質特異件基質特異性使用水、汽提的血清和混合的血清評估以測定患者樣品是否能夠以線 性方式被稀釋。在校準運行後，樣品以兩個重複運行。精確度如下表5.基質特異性精確度 實施例8 回收為了測定從摻料的樣品中回收雌二醇的能力，已知濃度的兩個患者樣品被摻加有 3個水平(低、中、高)的雌二醇。回收通過摻加的量除以期望的濃度來計算。平均回收對 低、中和高水平分別為92%、108%和98%。本文提到或引用的文章、專利和專利申請以及所有其它文件或電子可得到的信息 的內容以其全部內容通過引用併入本文至這樣的程度，如同每一單獨的出版物被具體且單 獨地顯示通過引用併入。申請人保留將任何和所有的來自任何這些文章、專利、專利申請或 其它物理和電子文件的物質和信息物理上併入本申請的權利。本文例證性描述的方法可在本文沒有具體公開的任何元素或多個元素、限制 或多個限制不存在的情況下合適地實施。因此，例如術語「包括(comprising)」、「包括 (including) 」、「包含(containing) 」等應當廣義且非限制性地理解。此外，本文所用的術語 和表達已經作為描述性術語而不是限制性術語使用，並且沒有意圖使用這種將所示和所述 特徵的等價形式或其部分排除的術語和表達。應當認識到在所請求保護的發明範圍內各種 改變是可能的。因此，應當理解，儘管本發明通過優選的實施方式和任選特徵具體地公開， 但是本領域普通技術人員可訴諸於本文公開的其中實施的本發明的改變和變化，並且這種 改變和變化被認為在本發明的範圍內。
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本發明在本文中已經作了廣泛且一般性的描述。落入上位公開內容中的每一個較 窄類別和亞組也構成所述方法的部分。這包括本發明的一般描述，條件是或者否定性的限 制是從種類中去除了任何主題內容，無論排除的物質是否在本文中具體描述。其它實施方式在下列權利要求之內。此外，在所述方法的特徵或方面按照馬庫什 組進行描述的情況下，本領域普通技術人員應認識到本發明也因此按照馬庫什組的任何單 個成員或成員的亞組進行描述。
權利要求
測定測試樣品中雌二醇的量的方法，所述方法包括(a)用試劑以足以將雌二醇從可能存在於所述測試樣品中的蛋白分離的量酸化所述測試樣品；(b)通過液相層析從所述測試樣品中純化雌二醇；(c)電離來自所述測試樣品的所述純化的雌二醇以產生一種或多種通過串聯質譜法可檢測的離子；以及(d)通過串聯質譜法以正離子模式檢測所述雌二醇離子(或多種)的量，其中所述雌二醇離子(或多種)的量被關聯到所述測試樣品中的雌二醇的量。
2.權利要求1的方法，其中所述液相層析是高效液相層析(HPLC)。
3.權利要求1的方法，其中所述純化進一步包括高湍流液相層析(HTLC)，之後進行高 效液相層析(HPLC)。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述雌二醇離子包括一種或多種離子，其選自具 有 271. 14士· 5,255. 07士· 5,183. 10士· 5,159. 20士· 5,145. 10士. 5 和 133. 20士· 5 的質 / 荷比的離子。
5.權利要求1-3任一項的方法，其中所述電離包括產生選自具有271.14士. 5和 255. 07士. 5的質/荷比的離子的前體離子，以及產生一種或多種碎片離子，其選自具有1 83. 10士· 5、1 59. 20士· 5,145. 10士· 5 和 133. 20士· 5 的質 / 荷比的離子。
6.權利要求1-3任一項的方法，其中所述電離包括產生具有271.14士. 5的質/荷比 的前體離子，以及產生一種或多種碎片離子，其選自具有183. 10士. 5和145. 10士. 5的質/ 荷比的離子。
7.權利要求1-3任一項的方法，其中所述電離包括產生具有271.14士.5的質/荷比的 前體離子，以及產生具有183. 10士. 5和145. 10士. 5的質/荷比的碎片離子。
8.權利要求1-3任一項的方法，其中所述電離包括產生具有255.07士. 5的質/荷比 的前體離子，以及產生一種或多種碎片離子，其選自具有159. 20士.5和133. 20士.5的質/ 荷比的離子。
9.權利要求1-3任一項的方法，其中所述電離包括產生具有255.07士.5的質/荷比的 前體離子，以及產生具有159. 20士. 5和133. 20士. 5的質/荷比的碎片離子。
10.權利要求1-9任一項的方法，其中所述試劑是甲酸。
11.權利要求1-10任一項的方法，其中所述測試樣品中存在的葡萄糖醛酸化的和非葡 萄糖醛酸化的雌二醇通過所述方法檢測並測量。
12.權利要求1-11任一項的方法，其中所述測試樣品是體液。
13.權利要求1-12任一項的方法，其中所述方法的量化極限小於或等於80pg/mL。
14.權利要求1-13任一項的方法，其中所述雌二醇在質譜法之前沒有進行衍生。
15.通過串聯質譜法測定體液樣品中雌二醇的量的方法，所述方法包括(a)通過液相層析從所述體液樣品中純化雌二醇；(b)產生質/荷比為271.14士. 5的所述雌二醇的前體離子；(c)產生所述前體離子的一種或多種碎片離子，其中所述一種或多種碎片離子的至少 一種具有183. 10士. 5的質/荷比的離子碎片；以及(d)檢測步驟(b)或(c)或兩者中產生的一種或多種所述離子的量並且將檢測的離子 2關聯到所述體液樣品中的所述雌二醇的量。
16.權利要求15的方法，其中所述方法的量化極限小於或等於80pg/mL。
17.權利要求15-16任一項的方法，其中所述雌二醇在質譜法之前沒有進行衍生。
18.權利要求15-17任一項的方法，其中所述液相層析是高效液相層析(HPLC)。
19.權利要求15-18任一項的方法，其中所述純化進一步包括高湍流液相層析(HTLC)， 之後進行高效液相層析(HPLC)。
20.權利要求15-19任意一項的方法，其中所述前體離子具有271.14士.5的質/荷比， 以及所述一種或多種碎片離子包括具有145. 10士. 5的質/荷比的碎片離子。
21.權利要求15-20任一項的方法，其中在所述電離步驟之前，試劑以足以將雌二醇從 可能存在於所述體液樣品中的蛋白分離的量添加至所述體液樣品。
22.權利要求21的方法，其中所述試劑是鹽。
23.權利要求22的方法，其中所述鹽是硫酸銨。
24.權利要求21的方法，其中所述試劑以足以酸化所述體液樣品的量添加。
25.權利要求24的方法，其中所述試劑是甲酸。
26.權利要求15-25任一項的方法，其中所述體液樣品中存在的葡萄糖醛酸化的和非 葡萄糖醛酸化的雌二醇通過所述方法檢測並測量。
27.測定測試樣品中的雌二醇的量的方法，所述方法包括(a)將試劑以足以將雌二醇從可能存在於所述測試樣品中的蛋白分離的量添加至所述 測試樣品；(b)通過液相層析從所述測試樣品中純化雌二醇；(c)電離來自所述測試樣品的所述純化的雌二醇以產生一種或多種通過串聯質譜法可 檢測的離子；以及(d)通過串聯質譜法以負離子模式檢測所述雌二醇離子(或多種)的量，其中所述雌二 醇離子(或多種)的量被關聯到所述測試樣品中的雌二醇的量。
28.權利要求27的方法，其中所述方法的量化極限小於或等於80pg/mL。
29.權利要求27-28任一項的方法，其中所述雌二醇在質譜法之前沒有進行衍生。
30.權利要求27-29任一項的方法，其中所述液相層析是高效液相層析(HPLC)。
31.權利要求27-30任一項的方法，其中所述純化進一步包括高湍流液相層析(HTLC)， 之後進行高效液相層析(HPLC)。
32.權利要求27-31任一項的方法，其中所述試劑是鹽。
33.權利要求32的方法，其中所述鹽是硫酸銨。
34.權利要求27-33任一項的方法，其中所述雌二醇離子包括選自具有271.14士. 5、 83. 10士.5和145. 10士.5的質/荷比的離子的一種或多種離子。
35.權利要求27-34任一項的方法，其中所述電離包括產生具有271.14士. 5的質/荷 比的前體離子，以及產生一種或多種碎片離子，其選自具有183. 10士. 5和145. 10士. 5的質 /荷比的離子。
36.權利要求27-35任一項的方法，其中所述測試樣品中存在的葡萄糖醛酸化的和非 葡萄糖醛酸化的雌二醇通過所述方法檢測並測量。
37.權利要求27-36任一項的方法，其中所述測試樣品是體液。
全文摘要
本發明提供的是採用質譜法檢測樣品中雌二醇的量的方法。方法一般包括電離樣品中的雌二醇以及檢測和定量離子的量以確定樣品中雌二醇的量。
文檔編號H01J49/26GK101918098SQ200880125151
公開日2010年12月15日 申請日期2008年11月24日 優先權日2007年11月27日
發明者M·M·戈爾德曼, N·J·克拉克, R·E·賴茨 申請人:奎斯特診斷投資公司