一種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體發酵方法

2023-10-09 21:31:09

專利名稱：一種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體發酵方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，具體涉及一種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量
的液體發酵方法。
背景技術：
桑黃(Phelli墜igniarius)為擔子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌糹岡 (Hymenomycetes)，多孑L菌目(Polyporales) ， f秀革孑L菌禾鬥(Hymenochaetacae)，針層孑L菌屬 (Phellinus)真菌，是一種珍貴的大型藥用真菌。傳統中醫認為桑黃性甘、味苦，用於治療血 崩、脫肛、帶下、閉經、脾虛洩瀉等。現代藥理學研究表明，桑黃具有抗腫瘤、增強免疫力、抗 肝纖維化等功效。桑黃主要活性成分為多糖、三萜類物質和黃酮類物質。其中黃酮類化合 物具有抗氧化、擴張血管、降血脂和抗癌等作用， 一般是從天然植物中提取獲得，桑黃是少 有的含有黃酮類化合物的藥用真菌。在桑黃藥用價值被廣泛揭示的同時，桑黃的產量成為 抑制桑黃應用的限制因素。由於受生理狀態的特殊性和複雜性以及外部環境的制約，造成 桑黃在自然界中形成子實體稀少，特別是形成可用子實體需要多年。而且人工栽培極其困 難，培養條件苛刻，且生長周期長達3 4年，難以滿足日益膨脹的市場需要。因此，需要尋 找出一種有效的生產桑黃黃酮的方法，以克服現有技術和生產需要的矛盾。液體發酵法生 產桑黃有效成分由於生產周期短、勞動力省以及受外部環境影響小等優點被認為是一種有 效的方法。利用真菌誘導子用於桑黃髮酵培養，以提高桑黃黃酮產量等次生代謝產物的研 究目前尚未見報導。因此，通過生物技術途徑建立桑黃液體發酵誘導體系，進一步提高細胞 黃酮類物質的含量，具有重要的理論意義和應用價值。

發明內容
本發明的目的在於克服上述已有技術的不足而提供一種工藝簡單、成本低、效果 顯著，大幅度提高桑黃黃酮產量的利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體發 酵方法，本方法可用於桑黃黃酮的工業化生產。
本發明的目的可以通過如下措施來達到一種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量 的桑黃菌絲體液體發酵方法，其特徵在於包括如下步驟
(1)真菌誘導子的製備 ①真菌誘導子菌株的培養將真菌誘導子菌種接種於PDA斜面培養基上活化後， 轉接到PDA平板培養基上，25 3(TC培養3 5天，取菌塊接種於裝有PD液體培養基的三 角瓶中，於25 30°C、100 180r/min搖床中培養5 7天後，過濾得到真菌誘導子菌絲 體備用； ②製備真菌誘導子將真菌誘導子菌絲體於60 7(TC下烘乾，研磨破碎，按重量 體積比(g : ml)l : 2 1 : 5的比例加入濃度為65 85%乙醇，在室溫下浸泡10
15小時，過濾並收集濾渣，濾渣按重量體積比(g : mi)i : 2 i : 5的比例加入氯仿和正丁醇的混合液衝洗，氯仿與正丁醇的體積比為3 : i 5 : 1，如此反覆衝洗濾渣3 5次，然後將濾渣按重量體積比(g : mi)i : 3 i : 5的比例用丙酮衝洗後，濾渣按重 量體積比(g : mi)i : 3 i : 5的比例再用水衝洗，自然風乾，乾物質按重量體積比
(g : ml)l : 5 1 : 7的比例加入濃度為5 15%三氟乙酸，沸水浴0. 5 2小時，然後 過濾，濾液用NaOH中和至pH為4 7，在3t: 8"下靜置10 15小時，用0. 45 y m微孔 濾膜過濾除菌，製成真菌誘導子，_10°C -2(TC冷凍保存；
(2)桑黃的液體發酵培養 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度25 30°C ，培養時間5 10天，然後取菌塊接種於裝有PD液體發酵培養基的三角瓶中進行發酵 培養，搖床轉速100 180r/min，溫度25 30°C，時間5 8天；
(3)真菌誘導子對桑黃細胞的誘導培養 在桑黃液體發酵培養第1 5天，加入真菌誘導子，使真菌誘導子的濃度達到 40 200 ii g/mL，然後繼續培養2 7天，得到桑黃菌絲體。 為了進一步實現本發明的目的，所述的真菌誘導子菌株的培養步驟中取直徑 0. 3 0. 6cm的菌塊3 5塊，接種於PD液體培養基中，每500mL三角瓶裝PD液體培養基 100 200mL。 為了進一步實現本發明的目的，所述的桑黃的液體發酵培養步驟中取直徑0.3 0. 6cm的菌塊3 5塊，接種於PD液體發酵培養基中，每500mL三角瓶裝PD液體培養基 100 200mL。 為了進一步實現本發明的目的，所述的真菌誘導子對桑黃誘導培養步驟中真菌誘 導子於桑黃髮酵培養的第1天加入，然後繼續培養。 為了進一步實現本發明的目的，所述的真菌誘導子對桑黃誘導培養步驟中真菌誘 導子於桑黃髮酵培養的第3天加入，然後繼續培養。 為了進一步實現本發明的目的，所述的真菌誘導子對桑黃誘導培養步驟中真菌誘 導子於桑黃髮酵培養的第5天加入，然後繼續培養。
本發明同已有技術相比可產生如下積極效果 1、本發明將真菌誘導子用於桑黃黃酮的液體發酵生產，大幅度提高桑黃黃酮產 量，使產量達到340mg/L以上，是對照的4. 5倍。本方法工藝簡單、成本低、效果顯著，桑黃 黃酮含量高，是一種極具工業化前景的生產方法。所生產的桑黃黃酮可用於製備抗氧化、抗 衰老製劑，預防或治療腫瘤的藥物、添加劑。 2、本發明所述真菌誘導子菌株來源廣泛，大多食用菌病原真菌製備的誘導子，均 具有很好的誘導效果，誘導子製備方法簡便，重複性好。 3、本發明所採用的桑黃液體發酵工藝簡單，原材料成本低廉，更為重要的是整個 發酵過程可控，不受外部環境條件限制，非常適合工業化生產。

具體實施例方式下面對本發明的具體實施方式
作詳細說明
實施例1 : 菌種真菌誘導子菌種為枝頂孢屬真菌頂頭孢(Acremoni咖strict咖)，由中國普 通微生物菌種保藏管理中心購買，菌種編號為CGMCC No. 3. 2058。 桑黃菌種為普通栽培品種(Phelli皿s igniarius)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為CGMCC No. 51328。 —種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體發酵方法，其特徵在於 包括如下步驟 (1)真菌誘導子的製備 ①真菌誘導子菌株的培養將真菌誘導子菌種接種於PDA斜面培養基上活化後， 轉接到PDA平板培養基上，25t:培養5天，用打孔器在菌落邊緣打取直徑0. 3cm的菌塊3塊， 接種於PD液體培養基中，每500mL三角瓶裝PD液體培養基(為PDA培養基的組分中去除 瓊脂組分而成)lOOmL，於25°C 、 100r/min搖床中培養7天後，過濾得到真菌誘導子菌絲體備 用； ②真菌誘導子製備將真菌誘導子菌絲體於6(TC下烘乾，研磨破碎，按重量體積
比(g : mi)i : 2(真菌誘導子乙醇)的比例加入濃度為65%乙醇，在室溫下浸泡io小 時，過濾並收集濾渣，濾渣按重量體積比(g : mi)i : 2(濾渣氯仿和正丁醇的混合液) 的比例加入氯仿和正丁醇的混合液衝洗，氯仿與正丁醇的體積比為3 : i，如此反覆衝洗濾 渣3次，然後濾渣按重量體積比(g : mi)i : 3(濾渣丙酮)的比例用丙酮衝洗後，濾渣 按重量體積比(g : mi)i : 3(濾渣水)的比例再用水衝洗，自然風乾，乾物質按重量體 積比(g : mi)i : 5(乾物質三氟乙酸)的比例加入濃度為5%三氟乙酸，沸水浴0.5小
時，然後過濾，濾液用NaOH中和至pH為5. 8，在3t:下靜置10小時，用0. 45 y m微孔濾膜過 濾除菌，製成真菌誘導子，-l(TC冷凍保存；
(2)桑黃的液體發酵培養 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度25°C ， 培養時間10天，然後用打孔器在菌落邊緣打取直徑0. 3cm的菌塊3塊，接種於PD液體培養 基(為PDA培養基去除瓊脂組分而成)中進行發酵培養，每500mL三角瓶裝培養基100mL，， 搖床轉速100r/min，溫度25°C，時間8天;
(3)真菌誘導子對桑黃細胞的誘導培養 在桑黃液體發酵培養第1天，加入真菌誘導子，使真菌誘導子終濃度達到40 i！ g/ mL，然後繼續培養7天，得到桑黃菌絲體。
(4)桑黃黃酮的提取和檢測 將所得桑黃菌絲體烘乾，取桑黃菌絲體粉末100mg，加入2mL 60 %乙醇，於室溫下 封口超聲提取24h，過濾，濾液封口置4t:下冷藏，殘渣重複上述操作3次，合併三次浸提液， 用60%乙醇定容至50ml，作為待測液，比色法測定桑黃黃酮含量為10. 5mg/100mg菌絲(幹 重)，產量270. 2mg/L。
實施例2 : 菌種真菌誘導子菌種為木黴屬真菌木素木黴(Trichodermaviride)，由中國普 通微生物菌種保藏管理中心購買，菌種編號為CGMCC No. 3. 2196。 桑黃菌種為普通栽培品種(Phelli皿s igniarius)，購自中國普通微生物菌種保 藏中心，編號為CGMCC No. 51328。 —種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體發酵方法，其特徵在於 包括如下步驟 (1)真菌誘導子的製備
①真菌誘導子菌株的培養將真菌誘導子菌種接種於PDA斜面培養基上活化後， 轉接到PDA平板培養基上，3(TC培養3天，用打孔器在菌落邊緣打取直徑0. 6cm的菌塊5塊， 接種於PD液體培養基中，每500mL三角瓶裝PD液體培養基(為PDA培養基去除瓊脂組分 而成)200mL，於30°C、180r/min搖床中培養5天後，過濾得到真菌誘導子菌絲體備用；
②真菌誘導子製備將真菌誘導子菌絲體於7(TC下烘乾，研磨破碎，按重量體積 比(g : ml)l : 5(真菌誘導子乙醇)的比例加入濃度為85%乙醇，在室溫下浸泡15小
時，過濾並收集濾渣，濾渣按重量體積比(g : mi)i : 5(濾渣氯仿和正丁醇的混合液) 的比例加入氯仿和正丁醇的混合液衝洗，氯仿與正丁醇的體積比為5 : i，如此反覆衝洗濾 渣5次，然後濾渣按重量體積比(g : mi)i : 5(濾渣丙酮)的比例用丙酮衝洗後，濾渣 按重量體積比(g : mi)i : 5(濾渣水)的比例再用水衝洗，自然風乾，乾物質按重量體 積比(g : mi)i : 7(乾物質三氟乙酸)的比例加入濃度為15%三氟乙酸，沸水浴2小
時，然後過濾，濾液用NaOH中和至pH為4，在8t:下靜置15小時，用0. 45 y m微孔濾膜過濾 除菌，製成真菌誘導子，_201:冷凍保存；
(2)桑黃的液體發酵培養 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度30°C ， 培養時間5天，然後用打孔器在菌落邊緣打取直徑0. 6cm的菌塊5塊，接種於PD液體培養 基(為PDA培養基去除瓊脂組分而成)中進行發酵培養，每500mL三角瓶裝培養基200mL， 搖床轉速180r/min，溫度30°C ，時間5天 ;
(3)真菌誘導子對桑黃細胞的誘導培養 在桑黃液體發酵培養第5天，加入真菌誘導子，使真菌誘導子終濃度達到200 i！ g/ mL，然後繼續培養2天，得到桑黃菌絲體。
(4)桑黃黃酮的提取和檢測 將所得桑黃菌絲體烘乾，桑黃菌絲體粉末100mg，加入2mL 60%乙醇，於室溫下封 口超聲提取24h，過濾，濾液封口置4t:下冷藏，殘渣重複上述操作3次，合併三次浸提液， 用60%乙醇定容至50ml，作為待測液，比色法測定桑黃黃酮含量為8. Omg/100mg菌絲(幹 重)，產量170mg/L。
實施例3 : 菌種真菌誘導子菌種為輪枝菌屬真菌蘑菇輪枝孢(Verticilliumpsalliotae)， 由中國普通微生物菌種保藏管理中心購買，菌種編號為CGMCC No. 3. 4423。
桑黃菌種為普通栽培品種(Phelli皿s igniarius)，購自中國普通微生物菌種保 藏管理中心，編號為CGMCC No. 51328。 —種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體發酵方法，其特徵在於 包括如下步驟 (1)真菌誘導子的製備 ①真菌誘導子菌株的培養將真菌誘導子菌種接種於PDA斜面培養基上活化後， 轉接到PDA平板培養基上，28t:培養4天，用打孔器在菌落邊緣打取直徑0. 4cm的菌塊4塊， 接種於PD液體培養基(為PDA培養基去除瓊脂組分而成)中，每500mL三角瓶裝PD液體 培養基150mL，於28t:、150r/min搖床中培養6天後，過濾得到真菌誘導子菌絲體備用；
②真菌誘導子製備將真菌誘導子菌絲體於65t:下烘乾，研磨破碎，按重量體積
6比(g : mi)i : 4(真菌誘導子乙醇)的比例加入濃度為70%乙醇，在室溫下浸泡12小 時，過濾並收集濾渣，濾渣按重量體積比(g : mi)i : 4(濾渣氯仿和正丁醇的混合液) 的比例加入氯仿和正丁醇的混合液衝洗，氯仿與正丁醇的體積比為4 : i，如此反覆衝洗濾 渣4次，然後濾渣按重量體積比(g : mi)i : 4(濾渣丙酮)的比例用丙酮衝洗後，濾渣 按重量體積比(g : mi)i : 4(濾渣水)的比例再用水衝洗，自然風乾，乾物質按重量體 積比(g : mi)i : e(乾物質三氟乙酸)的比例加入濃度為10%三氟乙酸，沸水浴i小
時，然後過濾，濾液用NaOH中和至pH為7，在5t:下靜置12小時，用0. 45 y m微孔濾膜過濾
除菌，製成真菌誘導子，-151:冷凍保存； (2)桑黃的液體發酵培養 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度28°C ， 培養時間8天，然後用打孔器在菌落邊緣打取直徑0. 4cm的菌塊4塊，接種於PD液體培養 基(為PDA培養基去除瓊脂組分而成)中進行發酵培養，每500mL三角瓶裝培養基150mL， 搖床轉速150r/min，溫度28°C，時間7天;
(3)真菌誘導子對桑黃細胞的誘導培養 在桑黃液體發酵培養第3天，加入真菌誘導子，使真菌誘導子終濃度達到120 i！ g/ mL，然後繼續培養5天，得到桑黃菌絲體。
(4)桑黃黃酮的提取和檢測 將桑黃菌絲體烘乾，桑黃菌絲體粉末100mg，加入2mL 60%乙醇，於室溫下封口超 聲提取24h，過濾，濾液封口置4t:下冷藏，殘渣重複上述操作3次，合併三次浸提液，用60% 乙醇定容至50ml，作為待測液，比色法測定桑黃黃酮含量為15. 5mg/100mg菌絲(乾重)，產 量340mg/L。 本發明真菌誘導子菌種還可採用其他同類菌種，桑黃菌種也可採用其他普通栽培 品種。
權利要求
一種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體發酵方法，其特徵在於包括如下步驟(1)真菌誘導子的製備①真菌誘導子菌株的培養將真菌誘導子菌種接種於PDA斜面培養基上活化後，轉接到PDA平板培養基上，25～30℃培養3～5天，取菌塊接種於裝有PD液體培養基的三角瓶中，於25～30℃、100～180r/min搖床中培養5～7天後，過濾得到真菌誘導子菌絲體備用；②製備真菌誘導子將真菌誘導子菌絲體於60～70℃下烘乾，研磨破碎，按重量體積比(g∶ml)1∶2～1∶5的比例加入濃度為65～85％乙醇，在室溫下浸泡10～15小時，過濾並收集濾渣，濾渣按重量體積比(g∶ml)1∶2～1∶5的比例加入氯仿和正丁醇的混合液衝洗，氯仿與正丁醇的體積比為3∶1～5∶1，如此反覆衝洗濾渣3～5次，然後將濾渣按重量體積比(g∶ml)1∶3～1∶5的比例用丙酮衝洗後，濾渣按重量體積比(g∶ml)1∶3～1∶5的比例再用水衝洗，自然風乾，乾物質按重量體積比(g∶ml)1∶5～1∶7的比例加入濃度為5～15％三氟乙酸，沸水浴0.5～2小時，然後過濾，濾液用NaOH中和至pH為4～7，在3℃～8℃下靜置10～15小時，0.45μm微孔濾膜過濾除菌，製成真菌誘導子，-10℃～-20℃冷凍保存；(2)桑黃的液體發酵培養將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度25～30℃，培養時間5～10天，然後取菌塊接種於裝有PD液體發酵培養基的三角瓶中進行發酵培養，搖床轉速100～180r/min，溫度25～30℃，時間5～8天；(3)真菌誘導子對桑黃細胞的誘導培養在桑黃液體發酵培養第1～5天，加入真菌誘導子，使真菌誘導子濃度達到40～200μg/mL，然後繼續培養2～7天，得到桑黃菌絲體。
2. 根據權利要求1所述的一種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體 發酵方法，其特徵在於所述的真菌誘導子菌株的培養步驟中取直徑0. 3 0. 6cm的菌塊 3 5塊，接種於PD液體培養基中，每500mL三角瓶裝PD液體培養基100 200mL。
3. 根據權利要求1所述的一種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體 發酵方法，其特徵在於所述的桑黃的液體發酵培養步驟中取直徑0. 3 0. 6cm的菌塊3 5塊，接種於PD液體培養基基中，每500mL三角瓶裝PD液體培養基100 200mL。
4. 根據權利要求1所述的一種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體 發酵方法，其特徵在於所述的真菌誘導子對桑黃細胞誘導培養步驟中真菌誘導子於桑黃髮 酵培養的第1天加入，然後繼續培養。
5. 根據權利要求1所述的一種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體 發酵方法，其特徵在於所述的真菌誘導子對桑黃細胞誘導培養步驟中真菌誘導子於桑黃髮 酵培養的第3天加入，然後繼續培養。
6. 根據權利要求1所述的一種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體 發酵方法，其特徵在於所述的真菌誘導子對桑黃細胞誘導培養步驟中真菌誘導子於桑黃髮 酵培養的第5天加入，然後繼續培養。
全文摘要
本發明公開了一種利用真菌誘導子提高桑黃黃酮產量的桑黃菌絲體液體發酵方法，其將真菌誘導子菌種接種活化培養後，取菌塊接種培養過濾得到真菌誘導子菌絲體；然後烘乾研磨破碎加入乙醇浸泡，過濾並收集濾渣，濾渣依次加入氯仿和正丁醇的混合液、丙酮、水衝洗，風乾後乾物質加入三氟乙酸，沸水浴0.5-2小時，然後過濾，取濾液中和、靜置、0.45μm微孔濾膜過濾除菌，製成真菌誘導子，-10℃～-20℃冷凍保存；將桑黃菌種接種活化培養，後取菌塊接種發酵培養；在桑黃液體發酵培養第1～5天，加入真菌誘導子繼續培養得到桑黃菌絲體，本發明工藝簡單、成本低、效果顯著，可大幅度提高桑黃細胞黃酮含量，是一種極具工業化前景的生產方法。
文檔編號C12N1/14GK101702984SQ20091022984
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月11日 優先權日2009年11月11日
發明者劉宇, 圖力古爾, 姚強, 李維煥, 楊樹德, 程顯好, 繆靜, 高興喜, 黃立紅 申請人:魯東大學