抗逆相關sos3類似鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-10-09 09:43:19

專利名稱：抗逆相關sos3類似鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種抗逆相關S0S3類似鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
土壤鹽潰化、乾旱等逆境是植物生長、發育的主要環境限制因素。植物為了應對逆境，在長期進化過程中演化形成一套感知逆境脅迫、傳導逆境信號，並在分子、細胞和生理水平上響應的精細調控機制(Li Ruifen, Zhang Junwen, Wei Jianhua, Ma Rongcai, 2009.Functions and Mechanisms of the CBL-CIPK signaling system in plant responseto abiotic stresses.Progress in Natural Science，19 (6):667_676)。Ca2+依賴的信號途徑在植物多種生物過程包括逆境脅迫響應中發揮重要作用(Kudla J., Batistic0.&Hashimoto K.,2010.Calcium signals:the lead currency of plant informationprocessing.The Plant Cell，22:541_563)。在解密Ca2+信號、應答植物逆境脅迫的過程中鈣離子感受器是重要的信號傳遞者，調控脅迫響應基因的開與關(Luan S.，KudlaJ.，Rodriguez-Concepcion M.，Yalovsky S.，Gruissem W.，2002.Calmodulins andcalcineurin B-1 ike proteins: calcium sensors for specific signal responsecoupling in plants.The Plant Cell，14，389-400)。根據功能和結構的不同，I丐離子感受器分為響應型和依賴性鈣離子感受器。前者既能結合Ca2+，又具有激酶活性，如鈣離子依賴性蛋白激酶(CDPKs);而後者只能結合Ca2+，並與特異的蛋白激酶互作後才能傳遞鈣信號，如S0S3 類似鈣離子結合蛋白(S0S3-LIKE CALCIUM BINDING PROTEIN,簡稱 SCaBP)。SCaBP型鈣感受器是一類僅存在於植物中與動物鈣調磷酸酶B亞基(calcineurinB, CNB)及中樞神經I丐感受器(neuronal calcium sensors, NCS)極其相似的小分子蛋白，因此被命名為calcineurin B-1ike蛋白，即CBL或CBL鈣感受器。由於SOS途徑發現較早，人們也將該感受 器稱作SCaBPs (Liu J, Zhu JK, 1998.A calcium sensorhomolog required for plant salt tolerance.Science, 280:1943-1945;Kudla J, XuQ, Harfter K,Gruissem ff, and Luan S,1999.Genes for calcineurin B-1ike proteinsin Arabidopsis are differentially regulated by stress signals.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.,96:4718-4723)。目前在擬南芥和水稻中均鑑定出10個SCaBPs,分別與26個AtCIPKs、30個OsCIPKs組成互作複合體，調控下遊基因的表達。迄今，已鑑定出一些SCaBPs參與逆境脅迫應答的調控。如SCaBP5/CBLl和SCaBP7/CBL9參與低K+脅迫的調控(Xu J, Li H-D, Chen L-Q, Wang Y，Liu L-L, He L, and Wu ff-H, 2006.A proteinkinase, interacting with two calcineurin B-1ike proteins regulates K+transporterAKTlin Arabidopsis.Celll25:1347-1360 ；Li L1Kim B-G, Cheong Y H, Pandey G K, andLuan S, 2006.A Ca2+signaling pathway regulates a K channel for low-K+response inArabidopsis.Proc Natl Acad Sci USA, 103(33):12625-12630) ;S0S3/CBL4 和 SCaBP8/CBLlO則參與SOS調控途徑，在SOS途徑中二者分別與AtCIPK24/S0S2互作調控植物根和地上部的耐鹽性(Qiu Q-S, Guo Y, Dietrich M, Schumaker KS, Zhu J-K, 2002.Regulation ofSOSI, a plasma membrane NaVH+ exchanger in Arabidopsis thaliana, by S0S2and S0S3.Proc Natl Acad Sci USA, 99:8436-8441 ；uan RD, Lin HX, Mendoz I,Zhang YG, Cao WH, YangYQ, Shang M, Chen SY, Pardo JM, and Guo Y, 2007.SCABP8/CBL10,a Putative CalciumSensor, Interacts with the Protein Kinase S0S2to Protect Arabidopsis Shoots fromSalt Stress.Plant Cell, 19:1415-1431) ；AtSCaBP4/CBL5 參與乾旱脅迫的響應，但還不清楚具體的調控途徑(Cheong YH, Sung SJ, Kim B-G, Pandey GK, Cho J-S, Kim K-N&LuanS，2010.Constitutive overexpression of the calcium sensor CBL5confers osmotic ordrought stress tolerance in Arabidopsis.Molecules and Cells29, 159-165)。部分SCaBPs還參與植物生長發育的調控。可見，SCaBP作為鈣離子感受器具有多樣化的生物學功能。近年來已開展了部分作物SCaBP/CBL-CIPK功能研究(Mahajan S, Sopory S K, TutejaN，2006.Cloning and characterization of CBL-CIPK signalling components from alegume (Pisum sativum).FEBS Journal, 273 (5): 907-925),並取得了一定進展。由於不同物種同源SCaBP基因可能具有不同功能或新功能，克隆應答各種逆境脅迫的SCaBP基因，有可能解析某種抗逆調控途徑。但目前研究的材料大部分局限於模式植物或甜土植物，非特殊種質。一些特殊生境種質材料可能具有解密逆境Ca2+信號的特殊途徑，挖掘克隆特殊生境植物信號組分基因，對有效利用基因資源改良作物抗逆性具有重要意義。野大麥(Hordeum brevisubulatum(Trin.)Link)是禾本科大麥屬一種多年生兼性鹽生的優良牧草，主要分布在西西伯利亞、蒙古和我國東北、華北、新疆、西藏和內蒙等省區，是鹽化和鹼化草甸草原的建群種，可在含鹽量0.6-1.0%的土地上良好生長，它的耐鹽性可與小花鹼茅等媲美，具有重要的應用和科學研究價值。但前人只局限在形態、解剖、生理等方面的研究，在抗逆調控基因的克隆與功能分析方面研究較少。

發明內容
本發明的目的是提供一種抗逆相關S0S3類似鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的應用，具體為如下A或B:A:由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質(命名為HbSCaBP)在如下al)或a2)中的應用:al)調控植物抗鹽性；a2)選育抗鹽植物品種。B:由序列表中序列I所不的氣基酸序列組成的蛋白質的編碼基因(命名為HbSCaBP)在如下al)或a2)中的應用:al)調控植物抗鹽性；a2)選育抗鹽植物品種。本發明還提供一種培育耐鹽轉基因植物的方法。本發明所提供的培育耐鹽轉基因植物的方法，具體可包括如下步驟:a)向目的植物中導入由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因，得到表達所述編碼基因的轉基因植物；
b)從步驟a)所得轉基因植物中得到與所述目的植物相比耐鹽性提高的轉基因植物。在上述應用或方法中，所述由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因(即HbSCaBP基因)是如下I)至4)中任一所述的DNA分子:I)編碼序列為序列表中序列2自5』末端第85至741位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的DNA分子；4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的DNA分子。在上述方法中，所述由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因具體是通過含有所述蛋白質的編碼基因的重組表達載體導入所述目的植物中的。在上述應用或方法中，所述植物即可為雙子葉植物，也可為單子葉植物。在本發明的一個實施例中，所述植物為雙子葉植物，具體為擬南芥，更加具體為擬南芥野生型品種Columbia或擬南芥突變體sos3。本發明所提供的蛋白質，為S0S3類似鈣離子結合蛋白，名稱為HbSCaBP，來源於野大麥(Hordeum brevisubulatum(Trin.) Link),是如下 a)或 b):a)由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質；

b)將序列I的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗鹽相關的由序列I衍生的蛋白質；序列表中序列I由218個胺基酸殘基組成。為了便於HbSCaBP蛋白的純化，可在由序列表中序列I的胺基酸殘基序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標籤。表:標籤的序列
標籤殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為 5 個)RRRRR
Poly-His2-10 (通常為 6 個)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myclOEQKLISEEDL上述a)中的HbSCaBP蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述b)中的HbSCaBP蛋白可通過如下方法得到:將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上上表所示的標籤的編碼序列得到編碼基因，再進行生物表達得到HbSCaBP蛋白。編碼所述HbSCaBP蛋白的核酸分子也屬於本發明的保護範圍。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。在本發明的一個實施例中，所述核酸分子具體為編碼所述HbSCaBP (野大麥S0S3類似鈣離子結合蛋白)蛋白的基因(命名為HbSCaBP);所述HbSCaBP基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子:I)編碼序列為序列表中序列2自5』末端第85至741位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述HbSCaBP蛋白的DNA分子; 4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼所述HbSCaBP蛋白的DNA分子；上述嚴格條件可為用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65oC下雜交，然後用2XSSC，0.1%SDS 和 1XSSC,0.1%SDS 各洗膜一次。其中，序列2由1159個核苷酸組成，第85至741位為其編碼序列，編碼序列表中序列I所不的蛋白質。含有上述核酸分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬於本發明的保護範圍。所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。所述重組表達載體可用現有的植物表達載體構建。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用於植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。所述植物表達載體還可包含外源基因的3』端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3』端。使用所述基因構建重組表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)、脅迫誘導型啟動子Rd29A等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用重組表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。在本發明的實施例中，所述重組表達載體中啟動所述HbSCaBP基因轉錄的啟動子具體為花椰菜花葉病毒35s啟動子(CaMV35S啟動子)。更為具體的，所述重組表達載體為將所述HbSCaBP基因(序列2的第85至741位)插入到pGreen0029載體的多克隆位點BamH I和EcoR I之間後得到的重組質粒。所述表達盒由能夠啟動所述HbSCaBP基因表達的啟動子，所述HbSCaBP基因，以及轉錄終止序列組成。所述重組載體、所述表達盒、所述轉基因細胞系或所述重組菌在如下al)或a2)中的應用也屬於本發明的保護範圍:a I)調控植物抗鹽性；a2)選育抗鹽植物品種；在上述應用或方法中，所述植物即可為雙子葉植物，也可為單子葉植物。在本發明的一個實施例中，所述植物為雙子葉植物，具體為擬南芥，更加具體為擬南芥野生型品種Columbia或擬南芥突變體sos3。在本發明中，以上所有al)中的所述調控植物抗鹽性均具體為提高植物抗鹽性；以上所有a2)中的所述選育抗鹽植物品種的方法，均具體可包括將所述HbSCaBP蛋白表達量較高的植株作為親本進行雜交的步驟。本發明從特殊種質-鹽生野大麥中克隆鑑定出一個強烈響應鹽脅迫的HbSCaBP基因。該基因編碼一個參與逆境信號傳遞的S0S3類似鈣離子結合蛋白，其主要定位於細胞質膜上。實驗證明，HbSCaBP基因在擬南芥突變體sos3過表後可抑制其敏鹽表型，在擬南芥野生型Columbia過表達可提高植株的耐鹽性。可見，HbSCaBP蛋白是耐鹽調控系統中一個重要的調控因子。


圖1為HbSCaBP與擬南芥、水稻和高粱SCaBP家族的系統進化樹分析。圖2為HbSCaBP基因在不同生物脅迫下的表達分析。其中，a為野大麥根和莖分別在350mM NaCl、350mM甘露醇和10%PEG6000下脅迫6h，4°C冷脅迫12h，及對照(CK，未經處理的野大麥根和莖)條件下的HbSCaBP基因的表達情況；b為野大麥根和莖分別在350mMNaCl、350mM 甘露醇、10%PEG6000 和 150 u M ABA 脅迫 24h, 4°C冷脅迫 48h，及對照(CK，未經處理的野大麥根和莖)條件下HbSCaBP基因的表達情況。圖3為轉HbSCaBP基因擬南芥的PCR檢測結果。其中，a為T2代轉入重組表達載體pGreen0029-HbSCaBP的擬南芥突變體sos3的鑑定結果，s1、s3、s5、s9、sl5和sl7表示6個不同的轉基因株系；b為T3代轉入重組表達載體pGreen0029-HbSCaBP的擬南芥野生型Columbia的鑑定結果，w3、w4、s5、wll、wl6和wl8表不6個不同的轉基因株系。a和b中，「質粒」為以重組表達載體pGreen0029-HbSCaBP作為模板的對照；「空載體」為以載體pGreen0029作為模板的對照；泳道M均為DNA分子量標準。圖4為T2代轉HbSCaBP基因擬南芥突變體sos3的純合株系(s5、s9和sl7)的發芽試驗和幼苗生長試驗的結果。其中，a為轉基因株系(s5、s9和sl7)及擬南芥突變體sos3在含NaCl不同濃度(O、100、125`和150mM)培養基上的發芽率的統計結果；b為轉基因株系(s5、s9和sl7)及擬南芥突變體sos3在含NaCl不同濃度(O、100、125和150mM)培養基上脅迫生長2周後的平均單株鮮重的統計結果；c為轉基因株系(s5、s9和sl7)、擬南芥突變體sos3及未轉基因的擬南芥野生型Columbia(WT)在含NaCl不同濃度(O、100、125和150mM)培養基上脅迫生長2周後的生長表型照片。
圖5為T3R轉HbSCaBP基因擬南芥野生型Columbia的純合株系(W5、W11和W16)的發芽試驗和幼苗生長試驗的結果。其中，a為轉基因株系(W5、W11和W16)及未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)在含NaCl不同濃度(O、100、125和150mM)培養基上的發芽率的統計結果；b為轉基因株系(W5、Wll和W16)及未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)在含NaCl不同濃度(O、100、125和150mM)培養基上脅迫生長2周後平均單株鮮重的統計結果；c為轉基因株系(W5、W11和W16)及未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)在含NaCl不同濃度(O、100、125和150mM)培養基上脅迫生長2周後的生長表型照片。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。擬南芥野生型Columbia 和擬南芥突變體 sos3:http://www.arabidopsis.0rg 網站。其中，擬南芥突變體sos3的編號為CS3864，突變體表型為葉片表面光滑，無或少表皮毛，敏鹽性詳細描述見「Liu J P&Zhu J K J, 1997.An Arabidopsis mutant that requiresincreased calcium fo r potassium nutrition and salt tolerance.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,94:14960-14964」。pGreen0029 載體:在網上 http://www.pgreen.ac.uk/ 訂購。農桿菌Gv3101 (含助手載體pSoup):購自中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心-Biovector Science Lab。MS平板:含4.3g/L MS粉末，20g/L蔗糖，6g/L瓊脂，pH5.8。各濃度為終濃度。其中MS粉末為Sigma公司產品，其產品目錄號為M5519。實施例1、與植物耐鹽性相關的基因HbSCaBP的獲得及鑑定一、與植物耐鹽性相關的基因HbSCaBP的獲得1、野大麥材料培養鹽生牧草-野大麥(Hordeum brevisubulatum(Trin.) Link),採自內蒙古鹽潰化草原。在室溫條件下，將野大麥種子用去離子水浸泡12h後，放入到4°C冰箱中過夜。用滅菌的去離子水衝洗3遍，放於溼潤紗布的培養皿中，25°C萌芽。經過4 5天待其大部分發芽之後，轉到滅菌的盛有l/2Hoagland培養液的玻璃瓶中(用不透光的紙包住)，在溫度22-23°C，光照強度1000-3000ii mol JiT2S'光照12h/天、黑暗12h/天的條件下生長，待長到兩葉一心時，在l/2Hoagland培養液中加入終濃度為430mmo/L的NaCl進行脅迫，脅迫30min後備用。其中，Hoaglan培養液配方:0.51g/L KN03、0.82g/L Ca (NO3) 2、0.49g/LMgSO4 7H20、0.136g/L KH2PO4 ;再加入 ImL Fe EDTA 溶液(配製方法:分別溶解 7.45gNa2EDTA,5.57g FeSO4 7H20於200mL蒸餾水中，加熱。不斷攪拌Na2EDTA溶液與FeSO4溶液混合，定容至 1L);然後加入 ImL A-Z 溶液(配方:2.80mg/L H3BO3,0.08mg/LCuS04 5H20，0.22mg/L ZnSO4 7H20，81mg/L MgCl2 6H20，0.09mg/L HMoO 4H20)。以上各濃度均為相應組分在相應溶液中的終濃度。l/2Hoagland培養液為將上述Hoaglan培養液中各組分的濃度減半後所得的溶液。2、HbSCaBP 基因克隆
(1)5』端序列的獲得
以步驟I中在430mmo/L NaCl脅迫下處理30min的野大麥幼苗的根為實驗材料，同時以未處理的野大麥幼苗的根為對照材料。將實驗材料和對照材料分別用鋁薄紙包好標明，立即投入液氮中固定，-80°C保存備用。根據Trizol (Invitrogen, USA)試劑盒說明，提取經鹽處理野大麥根及對照材料的總RNA，DNase I消化總RNA中殘留的DNA，酚/氯仿/異戊醇混合液(體積比25:24:1)抽提總RNA，分光光度計測定OD26tl和OD28tl,根據OD26tl值計算 RNA 的產量；根據 OD260/OD280 值判斷 RNA 的質量。按照 Superscript III (Invitrogen)試劑盒說明，取200ng總RNA反轉錄為cDNA。根據文獻(Rivandi J., Miyazaki J., HrmovaM.，Pallotta M., Tester M.&Collins N.C., 2011.AS0S3homologue maps to HvNax4, abarley locus controlling an environmentally sensitive Na+exclusion trait.Journal of Experimental Botany, 62:1201-1216)中報導的大麥基因 HvNax4 (Genbank:HM175878)設計同源引物Hb-Fl和Hb-Rl，以上述所得cDNA為模板進行PCR擴增。PCR程序:94°C預變性 2min ;94°C變性 30s，63°C退火 30s，72。。延伸 lmin,30 個循環；72°C延伸 7min，10°C保存。將PCR產物克隆到pGEM-T載體(Promega，USA)，單克隆在於北京博邁德生物技術公司測序。所獲得的5』端序列通過在線NCBI blast分析確認序列的正確性。Hb-Fl:5，-GTAGAGTGCGGAGCTTATTCTCTCGCC-3』 (Genbank:HM175878 的第 262-288位)；Hb-Rl:5，-AGGTGCAGCTCACGCACTTCTGAACG-3，(Genbank:HM175878 的第 1980-2005位的反向互補序列)。(2) 3』端序列的獲得將上述PCR擴增所獲得的5』端序列與大麥模板序列(Genbank:HM175878)進行比對後發現，該序列與大麥模板序列(Genbank:HM175878)在3』非編碼區(3』 UTR)的多個位點有差異。為了獲得正確的3』 UTR序列，在編碼區終止密碼子TAA前約200bp處設計了擴增 3』 端序列的引物 Hb-3RACE-GSPl。根據 BD SMARTTM RACE cDNAAmplification 試劑盒(Clontech，Cat.N0.634914，USA)的操作說明，以上述步驟中的cDNA為模板進行巢式PCR擴增。PCR 程序:94°C預變性 2min ;94°C變性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 lmin,30 個循環；72°C延伸7min，10°C保存。將PCR產物克隆到pGEM_T載體(Promega，USA)，單克隆在北京博邁德生物技術公司測序,獲得3』端序列。Hb-3RACE-GSPl:5』 -CGACCTGTGCCTCTCCGATAGCGCCG-3』 (Genbank:HM175878 的第1204-1229 位，序列 2 的第 510-535 位)(3) HbSCaBP基因全長序列的獲得將步驟(I)所獲得的5』端序列和步驟(2)所得的3』端序列進行拼接，獲得該基因的全長cDNA序列。結果顯示，拼接所得的cDNA全長為1159bp，如序列表中序列2所示，其中第636位核苷酸為a。在多次實驗的擴增過程中，本發明的發明人也得到過序列表中序列2的第636位核苷酸為g的情況。序列2的5』非翻譯區84bp，3』非翻譯區418bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，開放閱讀框657bp (序列2的第85至741位)，將該基因命名為HbSCaBP。所述HbSCaBP基因編碼序列表中序列I所示的蛋白質(HbSCaBP蛋白)。 二、HbSCaBP的進化樹分析在NCBI的Genbank查詢擬南芥、水稻和高粱的S0S3類似鈣離子結合蛋白(SCaBP)家族成員登陸號。其中，10個擬南芥SCaBPs家族成員的Genbank =AtSCaBPI，AAC26009 ；AtSCaBP2, AAG28400 ；AtSCaBP3, AAG10059 ；AtSCaBP4, AAG28401 ；AtSCaBP5,AAC26008 ；AtSCaBP6, AAC26010 ；AtSCaBP7, AAL10301 ；AtSCaBP8, AA072364 ；AtSCaBP9,AAL10300 ;S0S3，AAG28402。10 個水稻 SCaBPs 家族成員的 Genbank:0sSCaBP01,ABA54176 ；0sSCaBP02, NP_001067190 ；0sSCaBP03, NP_001050704 ；0sSCaBP04, NP_001056148 ；0sSCaBP05, NP_001043483 ；0sSCaBP06, NP_001066223 ；0sSCaBP07, Q3HRP0 ；0sSCaBP08,Q3HRN9 ；0sSCaBP09, ABA54184 ；0sSCaBP10, Q3HRN7。8 個高粱 SCaBPs 家族成員的Genbank:SbSCaBPOI, FJ901259 ；SbSCaBP02, FJ901264 ；SbSCaBP03, FJ901265 ；SbSCaBP04,FJ901261 ；SbSCaBP05,FJ901263 ；SbSCaBP06, FJ901262 ；SbSCaBP07, FJ901260 ；SbSCaBP08,FJ901266。採用ClustalX軟體將所有推導的胺基酸序列進行比對，結合鄰位相連法(Neighbor-joining)構建系統進化樹，並採用Bootstraping法對進化樹進行檢驗(bootstrap 值 >1000)。結果顯示，與擬南芥、水稻和高粱SCaBP家族比對和系統進化樹分析表明，HbSCaBP與擬南芥SCaBP家族中S0S3的同源最高(61%);在水稻SCaBP家族中，與0sSCaBP4/0sCBL4的同源性最高為82% ;在高粱SCaBP家族中，分別與SbSCaBP4/SbCBL4、SbSCaBP5/SbCBL5和SbSCaBP8/SbCBL8的同源性為63%、68%和62%。從分子進化樹分析，HbSCaBP與S0S3、0sSCaBP4和SbSCaBP4屬於同一亞族，在進化上它們屬於直系同源體。可見步驟一中所述的序列表中序列I所示的蛋白質(ffiSCaBP蛋白)為S0S3類似鈣離子結合蛋白。實施例2、HbSCaBP基因在不同生物脅迫下的表達分析將野大麥幼苗培養至兩葉一心時，分別進行如下任一處理:350mM NaCl、350mM甘露醇、10%(質量分數)PEG6000或150 ii M ABA處理6h或24h ;4°C處理12h或48h。處理後，分別取根和莖，提取總RNA並消化DNA,根據Superscript III試劑盒(Invitrogen)進行反轉錄得到cDNA。同時以未經處理的野大麥幼苗根和莖作為對照。
米用在線軟體Primer3 (http://frod0.w1.mit.edu/)根據 HbSCaBP 基因全長cDNA (序列2)設計特異引物Hb-F和Hb-R ;通過預試驗確定18S rRNA為穩定表達的內參基因，參考如下文獻「Michael W Christiansen, Preben B Holm and Per LGregersen.Characterization of barley(Hordeum vulgare L.)NAC transcriptionfactors suggests conserved functions compared to both monocots and dicots.BMC Research Notes2011, 4:302」 中引物(正向引物:5』-ACGGCTACCACATCCAAGGA-3』 ；反向引物:5』 -CAGGATTGGGTAATTTGCGC-3』)合成內參基因引物。先通過普通PCR擴增，並在2% (w/v)瓊脂糖凝膠上驗證引物的特異性。然後採用SYBR Premix Ex Taq (PerfectReal Time, Takara，Ca#DRR041A)在 Step One Plus 螢光定量 PCR 儀進行 Real-time PCR反應。PCR擴增程序:95°C預變性30s ;95°C變性5s，60°C退火30s，40個循環。反應體系(20u L):10u L SYBR Premix Ex Taq Master,0.4u L ROX Dye,2u L cDNA，上下遊引物各10 u M,蒸懼水補足至 20 u L。在 MicroAmp Fast 0ptical96-ffell Reaction Plate (ABI,Ca#4346906)板並覆蓋膜 MicroAmp Optical Adhesive Film (ABI, Ca#4311971)後於 PCR儀運行。米用 AGt 方法(參考文獻:「Livak&Schmittgen, 2001.Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the2 A ActMethod.Methods25, 402-408.，，)進行基因相對表達分析。
Hb-F:5』 -CACTGCCCTATCTCCAGGAC-3』(序列 2 的第 653-672 位)；Hb-R:5』 -GTGGCAGGCATGGITCTTAT-3』(序列 2 的第 738-757 位的反向互補序列)。結果如圖2所示，在脅迫早期(6-12h)，350mM甘露醇、10%PEG6000和4°C冷脅迫後野大麥根、莖中HbSCaBP基因的表達量與未經處理的對照(CK)相比，差異均不明顯；僅350mM NaCl脅迫下，HbSCaBP基因在野大麥根中的表達量顯著增強，大約是對照(CK)表達量的18倍，而莖中的表達量變化不明顯(圖2中a)。這表明HbSCaBP基因表達具有時空特點，在各種脅迫早期其僅響應鹽脅迫，說明該基因與耐鹽性有關。在脅迫後期(24-48h)，350mM NaCl、350mM 甘露醇、10%PEG6000 和 150 u M ABA 脅迫 24h 後野大麥根、莖中 HbSCaBP基因表達量與未經處理的對照(CK)相比，差異均不顯著；僅4°C冷脅迫48h後HbSCaBP基因在野大麥根部的表達量有所增加，約達到對照(CK)表達量的2.4倍，但莖葉中的表達量與對照相比仍不顯著(圖2中b)。這些表達分析進一步說明，野大麥HbSCaBP基因對滲透、冷和ABA脅迫響應不明顯；在鹽脅迫早期響應強烈，而在後期不明顯，表明該基因有可能參與早期鹽脅迫的信號傳導或適應性基因的調控。實施例3、轉HbSC aBP基因擬南芥植株的獲得及其抗鹽性鑑定一、轉HbSCaBP基因擬南芥植株的獲得1、重組表達載體pGreen0029_HbSCaBP的構建根據上述實施例1擴增得到的HbSCaBP基因(序列2)設計引物，加入BamH I和EcoR I酶切位點，引物序列如下:HbSCaBP-BamH1-F:5，-TGGATCCATGGGCTGCGTGTCGTCGTC-3，(下劃線部分為 BamH I的識別序列，其後的序列為序列2的第85-104位)HbSCaBP-EcoR1-R:5』 -TGAATTCTTATTTGCTGATTCCGCTGTAATCGTCG-3』 (下劃線部分為EcoR I的識別序列，其後的序列為序列2的第714-741位的反向互補序列)以人工合成的序列表中序列2所示的HbSCaBP基因為模板，用引物HbSCaBP-BamH1-F 和 HbSCaBP-EcoR1-R 進行 PCR 擴增，用限制性內切酶 BamH I 和 EcoR I對PCR產物進行雙酶切，回收酶切產物，與經過同樣雙酶切的pGreen0029載體(含CaMV35S啟動子和Nos終止子)相連，獲得重組質粒。將重組質粒轉入大腸桿菌中，抗性篩選，挑取陽性克隆，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒進行測序驗證。將經測序表明在pGreen0029載體的多克隆位點BamH I和EcoR I之間插入了序列表中序列2的第85-741位所示DNA片段的重組質粒命名為PGreen0029-HbSCaBP。在重組表達載體pGreen0029-HbSCaBP中，啟動HbSCaBP基因表達的啟動子為CaMV35S啟動子。2、轉HbSCaBP基因擬南芥植株的獲得將步驟I所得的重組表達載體pGreen0029_HbSCaBP和空載體pGreen0029分別電擊轉化到農桿菌Gv3101 (含助手載體pSoup)。將轉入重組表達載體PGreen0029-HbSCaBP的農桿菌命名為Gv3101/pGreen0029-HbSCaBP ;將轉入pGreen0029空載體的農桿菌命名為Gv3101/pGreen0029o製備轉化菌液(5%蔗糖，0.05%Silwet L-77，前者為質量百分含量，後者為體積百分比；OD600=0.8 1.2)。按照Clough和Bent提出的蘸花法(參考文獻「Clough
S.J.&Bent A.F., 1998.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journall6, 735-743，，)，用重組農桿菌Gv3101/pGreen0029-HbSCaBP和Gv3101/pGreen0029的轉化菌液分別對擬南芥野生型Columbia和擬南芥突變體sos3進行浸染轉化。收穫Ttl代種子。在含50mg/L Kan的MS平板上篩選轉化子，獲得T1代抗性苗，將T1代抗性苗自交繁殖。一方面，篩選後代分離比為3:1的轉入重組表達載體PGreen0029-HbSCaBP的擬南芥突變體sos3的T1代株系，從其自交後代(T2代)中篩選下一級後代(T3代)全部為Kan抗性的株系，獲得純合的轉HbSCaBP基因擬南芥突變體sos3的T2代抗性苗。另一方面，收穫T1代轉入重組表達載體PGreen0029-HbSCaBP的擬南芥野生型Columbia株系的自交後代(T2代)，將T2代抗性苗通過自交繁殖，篩選後代分離比為3:1的T2代株系，從其自交後代(T3代)中篩選下一級後代(T4代)全部為Kan抗性的株系，獲得純合的轉HbSCaBP基因擬南芥野生型Columbia的T3代抗性苗。進一步對以上T2代或T3代的轉HbSCaBP基因擬南芥苗進行PCR檢測，以轉HbSCaBP基因擬南芥苗的基因組DNA為模板，PCR檢測用的引物為步驟I中的引物HbSCaBP-BamH1-F和HbSCaBP-EcoR1-R。同時設置轉入空載體的擬南芥野生型Columbia和擬南芥突變體sos3植株作為兩個空載體對照，設置未轉基因的擬南芥野生型Columbia和擬南芥突變體sos3植株作為兩個非轉基因對照。PCR檢測結果如圖3所示，轉入重組表達載體PGreen0029-HbSCaBP的擬南芥野生型Columbia和轉入重組表達載體pGreen0029_HbSCaBP的擬南芥突變體sos3的不同T2或丁3代株系均擴增得到了長度約為660bp的片段。而用同樣的引物對兩個空載體對照和兩個非轉基因對照進行PCR檢測，均未得到上述擴增片段。共獲得11個獨立的純合T2代轉HbSCaBP基因擬南芥突變體sos3株系，以及12個獨立的純合T3代轉HbSCaBP基因擬南芥野生型Columbia株系。從中挑選生長健康、種子量較多的3個T2代轉HbSCaBP基因擬南芥突變體sos3純合株系s5、s9和sl7，以及3個T3代轉HbSCaBP基因擬南芥野生型Columbia純合株系W5、W11和W16用於下述步驟二的抗鹽性鑑定分析。二、轉HbSCaBP基因擬南芥植株的抗鹽性鑑定1、實驗方法以步驟一所得的T3代轉HbSCaBP基因擬南芥野生型Columbia純合株系(W5、Wll和W16)和T2代轉HbSCaBP基因擬南芥突變體sos3的純合株系(s5、s9和sl7)為實驗材料，進行如下發芽試驗和幼苗生長試驗分析轉HbSCaBP基因擬南芥植株的抗鹽性。同時設置轉入空載體的擬南芥野生型Columbia和擬南芥突變體sos3植株作為兩個空載體對照(分別記作CKl和CK2)，設置未轉基因的擬南芥野生型Columbia和擬南芥突變體sos3植株作為兩個非轉基因對照(分別記作WT和sos3)。(I)發芽試驗每株系至少選取60粒種子，進行消毒處理，鋪在分別含不同濃度的NaCl(O、100、125、150mM)的MS平板上，4 °C沉積處理2天，在溫度22-23 V，光照強度1000-3000 u mol ^nT 2s'光照時間16h/天的條件下生長2天，垂直放置生長7天，記錄各株系發芽率。實驗重複3次，結果取平均值。(2)幼苗生長試驗將在MS平板上發芽5天的幼苗轉移至含不同濃度的NaCl (O、100、125、150mM)的MS平板上，垂直生長2周後觀察生長狀況，每處理至少記錄30株幼苗的鮮重，用於計算平均單株鮮重。實驗重複3次，結果取平均值。2、結果(I) HbSCaBP基因在擬南芥突變體sos3過量表達可抑制敏鹽表型T2代轉HbSCaBP基因擬南芥突變體sos3的純合株系(s5、s9和sl7)的發芽試驗和幼苗生長試驗的結果如圖4所示。A.發芽試驗在不含NaCl的MS平板上，未轉基因的擬南芥突變體sos3與轉基因株系s5、s9和sl7的發芽率均為100%，沒有差別；在含IOOmM NaCl的MS平板上，轉基因株系s5、s9和sl7的平均發芽率分別為85%、90%和88%，而未轉基因的擬南芥突變體sos3的發芽率下降為20%，轉基因株系與親本對照發芽率呈極顯著差異(p〈0.01)，表明擬南芥突變體sos3具有明顯的敏鹽表型；在含125mM NaCl的培養基上，未轉基因的擬南芥突變體sos3發芽率將至9%，而3個轉基因系發芽率達到約58-69%，轉基因株系與親本對照發芽率呈極顯著差異(p〈0.01)，表明HbSCaBP基因在擬南芥突變體sos3過表達可互補其敏鹽表型；在含150mMNaCl的培養基上擬南芥突變體sos3幾乎不發芽(發芽率低於5%)，而3個轉基因系仍發芽(37-45%)，進一步表明，HbSCaBP基因在擬南芥突變體sos3過表達能夠互補其敏鹽性(圖4中a)。轉入空載體的擬南芥突變體sos3植株(CK2)的實驗結果與未轉基因的擬南芥突變體sos3基本一致,無統計學差異。B.幼苗生長試驗在不含NaCl的MS平板上，未轉基因的擬南芥突變體sos3與轉基因株系s5、s9和sl7，以及未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)的生長表型及單株鮮重沒有差別；隨著鹽濃度的增加，3個轉基因株 系s5、s9和sl7，以及未轉基因的擬南芥野生型Columbia(WT)幼苗生長變慢，單株幼苗鮮重下降，但三個不同的鹽濃度下的測定結果差異不顯著，而未轉基因的擬南芥突變體sos3在含IOOmM NaCl的MS平板上生長2周後變褐，停止生長，其單株鮮重與未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)呈極顯著差異(p〈0.01);在含125_150mMNaCl的培養基上未轉基因的擬南芥突變體sos3在5天後就開始白化，不再生長，而轉基因株系s5、s9和sl7與未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)大部分仍呈綠色，且轉基因株系s5、s9和sl7的鮮重顯著大於未轉基因的擬南芥突變體sos3的鮮重(圖4中b和C)。轉入空載體的擬南芥突變體sos3植株(CK2)的實驗結果與未轉基因的擬南芥突變體sos3基本一致，無統計學差異。以上發芽試驗和幼苗生長試驗的結果充分表明，HbSCaBP基因能夠互補擬南芥突變體sos3的敏鹽表型。(2) HbSCaBP基因在擬南芥野生型Columbia過量表達可提高抗鹽性T3代轉HbSCaBP基因擬南芥野生型Columbia的純合株系(W5、W11和W16)的發芽試驗和幼苗生長試驗的結果如圖5所示。A.發芽試驗在不含NaCl的MS平板上，未轉基因的擬南芥野生型Columbia(WT)與3個轉基因株系W5、W11和W16的發芽率均為100%，沒有差別，表明3個轉基因株系在發芽方面均正常；在含IOOmM NaCl的MS平板上，未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)和3個轉基因株系W5、W11和W16的發芽率均降低，但野生型(WT)與3個轉基因株系發芽率的差異不明顯；當NaCl濃度增加至125mM時，未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)發芽率降低的幅度大於3個轉基因株系，3個轉基因株系W5、W11和W16發芽率均顯著高於野生型(WT)發芽率(p<0.01);特別是在含150mMNaCl的MS平板上，未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)基本不能發芽，而3個轉基因株系仍能夠發芽，發芽率約為11-16% (圖5中a)。轉入空載體的擬南芥野生型Columbia植株(CKl)的實驗結果與未轉基因的擬南芥野生型Columbia基本一致，無統計學差異。B.幼苗生長試驗在不含NaCl的MS平板上，未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)與3個轉基因株系W5、Wll和W16的生長表型及單株鮮重均沒有差別；隨著鹽濃度的增加，3個轉基因株系W5、Wll和W16，以及未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)幼苗生長變慢，單株鮮重下降，但轉基因株系下降的幅度比野生型(WT)小；在150mMNaCl的MS平板上未轉基因的擬南芥野生型Columbia (WT)植株脅迫2周後開始白化，而3個轉基因株系W5、W11和W16幼苗的生長速率顯著高於野生型，主要表現在轉基因株系的平均單株鮮重顯著大於野生型(WT)的平均單株鮮重(圖5中b和C)。轉入空載體的擬南芥野生型Columbia植株(CKl)的實驗結果與未轉基因的擬南芥野生型Columbia基本一致,無統計學差異。以上發芽試驗和幼苗生長試驗的結果充分表明，HbSCaBP基因能夠提高擬南芥野生型Columbia的抗鹽性。總之，HbSCaBP基因不論在擬南芥敏鹽突變體(擬南芥突變體sos3)還是在擬南芥野生型Columbia中過表 達,均可提高植株的耐鹽性。
權利要求
1.由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質在如下al)或a2)中的應用: al)調控植物抗鹽性； a2)選育抗鹽植物品種。
2.由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因在如下al)或a2)中的應用: al)調控植物抗鹽性； a2)選育抗鹽植物品種。
3.培育耐鹽轉基因植物的方法，包括如下步驟: a)向目的植物中導入由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因，得到表達所述編碼基因的轉基因植物； b)從步驟a)所得轉基因植物中得到與所述目的植物相比耐鹽性提高的轉基因植物。
4.根據權利要求1或2所述的應用，或權利要求3所述的方法，其特徵在於:所述由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子: 1)編碼序列為序列表中序列2自5』末端第85至741位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I) 或2)限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的DNA分子； 4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的DNA分子。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於:所述由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因是通過含有所述蛋白質的編碼基因的重組表達載體導入所述目的植物中的。
6.根據權利要求1-5中任一所述的應用或方法，其特徵在於:所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
7.下述任一生物材料: (I)蛋白質，是如下a)或b): a)由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質； b)將序列I的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗鹽相關的由序列I衍生的蛋白質； (II)編碼(I)中所述蛋白質的核酸分子；所述核酸分子是如下I)至4)中任一所述的DNA分子: 1)編碼序列為序列表中序列2自5』末端第85至741位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1中所述蛋白質的DNA分子； 4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼權利要求1中所述蛋白質的DNA分子； (II)含有(II)中所述核酸分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
8.根據權利要求7所述的生物材料，其特徵在於:所述重組載體為重組表達載體或重組克隆載體。
9.根據權利要求5所述的方法，或權利要求8所述的生物材料，其特徵在於:所述重組表達載體中啟動所述蛋白質的編碼基因轉錄的啟動子是花椰菜花葉病毒35s啟動子。
10.權利要求7中所述的重組載體、所述的表達盒、所述的轉基因細胞系或所述的重組菌在如下al)或a2)中的應用: al)調控植物抗鹽性； a2)選育抗鹽植物品種； 所述植物具體為雙子 葉植物或單子葉植物。
全文摘要
本發明公開了一種抗逆相關鈣調磷酸酶B類似蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的應用具體為由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質在如下a1)或a2)中的應用a1)調控植物抗鹽性；a2)選育抗鹽植物品種。實驗證明，由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因在擬南芥突變體sos3過表後可抑制其敏鹽表型，在擬南芥野生型Columbia過表達後可提高植株的耐鹽性。
文檔編號C12N15/82GK103172719SQ20131007062
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月6日 優先權日2013年3月6日
發明者李瑞芬, 陳亞娟, 魏建華, 王宏芝 申請人:北京農業生物技術研究中心