淋巴細胞核化學染色表面分析方法
2023-10-04 08:24:09
專利名稱：淋巴細胞核化學染色表面分析方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞核表面分析方法，特別是一種淋巴細胞核化學染色表面分析方法。
背景技術：
人體血細胞染色後核表面的紋理結構是細胞核內在物質結構的一種反映，正常情況下，不同類型的血細胞和同類型的血細胞在不同分化階段，都有不同的核紋理結構，如細網狀、細沙粒狀、緊密條塊狀等等。而當細胞受病理影響時，核染色質則會出現輕微排列紊舌L、方向性發生稍許改變、染色質略為變粗、出現微細裂紋以及細胞黏附異常等等肉眼不易觀察到的細微改變。所以通過分析核表面紋理結構，可以獲得細胞內部重要的生命活動信息。因此可以說細胞核表面紋理的變化為疾病的診斷及治療觀察提供了重要的分析依據。 但是，由於人眼對色彩、粗糙度等分辨能力有較大的局限性，對其細胞核表面的細微變化 (如顏色、粗糙度、粒度、網度和染色質方向性等)不能進行準確的量化分析，而且人眼的觀察識別還帶有很大的主觀性和隨意性。因此應用計算機圖像處理和模式識別技術對血細胞核表面進行分析，給出一定的客觀量化數據和進行細胞核紋理的分類識別，對疾病的診斷和治療觀察具有十分重要的意義。另外，目前廣泛應用的血細胞染色檢查方法，一般不考慮載玻片表面的光學和化學性質，在載玻片的選取上比較隨意。從生物表面化學知識可知，實際上血液中的蛋白質在載體表面的吸附會影響白細胞、血小板等的黏附，從而會影響其形態，普通的載玻片一般不能很好地滿足細胞化學染色微量定量分析的要求。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術，而提供一種能滿足細胞化學染色微量定量分析的要求，且準確性和重複性較高的淋巴細胞核化學染色表面分析方法。實現淋巴細胞核紋理的分類識別。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案淋巴細胞核化學染色表面分析方法，其特徵在於包括如下步驟(1)、血細胞化學染色載體選擇；(2)、外周血淋巴細胞標本提取；(3)、小波變換和經驗模式分解用顯微鏡隨機攝取分散在標本中的淋巴細胞，獲取淋巴細胞圖像，對淋巴細胞圖像中的細胞核表面圖像作小波變換，提取小波係數矩陣，再用經驗模式分解法獲取固有模式函數；(4)、數據融合選取所述固有模式函數組成矩陣，對該矩陣作奇異值分解得到所述細胞核表面圖像的紋理特徵值，把該紋理特徵值與測得的細胞核表面圖像光學特徵數據相融合，構成一多維特徵向量；(5)、採用模式識別方法對所述的多維特徵向量進行分類識別。
考慮到在作血液塗片細胞分析時載體表面化學性質的一致性以及載體光學性質的一致性，選用分光光度計石英玻璃比色杯的透明面作為所述的血細胞化學染色載體，這樣可以滿足細胞化學染色微量定量分析的要求。所述的 外周血淋巴細胞標本提取包括以下步驟a、取定量的外周血液塗片，乾燥後放入已經配置好的混合固定液中進行固定，然後取出，乾燥。b、滴加配好的染色液於血液塗片上，對血細胞進行染色，其染色的基本原理為染色液能與聚合程度不同的DNA、RNA及蛋白質等結合，因染色液與生物大分子的結合強度不同而表現出不同的染色效果；C、用蒸餾水對血液塗片進行衝洗；d、用乙醇溶液對血液塗片進行分色處理，處理完畢後晾乾，然後用顯微鏡檢查並攝取淋巴細胞圖像。所述的圖像光學特徵數據包括圖像的光密度和圖像的能量。具體地，圖像光密度可以用紅光光密度、綠光光密度、藍光光密度、平均光密度、最大光密度和累積光密度來表示。各光密度值可代表或反映細胞核內著色的深淺及顏色結構，用於了解核內物質的構成與相對含量。同時測定圖像的能量，能量用於分析圖像灰度分布均勻程度和圖像表面紋理粗細度，圖像表面紋理越細，能量就越小，紋理越大，能量就越大。可以採用多種模式識別的方法對所述的組合特徵多維向量進行分類識別，作為優選方案，本發明採用的是支持向量機方法。所述的外周血淋巴細胞標本提取中的步驟a中所述的固定液組分及體積配比為冰醋酸8 10 ；甲醇 28 31;無水乙醇59 62。可以用多種化學染料對血液塗片進行染色，作為優選方案，本發明採用的是甲基綠-派羅林染色液。與現有技術相比，本發明的優點在於該分析方法能滿足淋巴細胞化學染色微量定量分析的要求，同時把圖像的光密度、圖像能量和圖像的紋理特徵相融合，並用計算機圖像處理和模式識別技術對淋巴細胞核表面圖像進行分析處理，解決了人眼對淋巴細胞核染色表面微小變化不能進行定量識別的問題，實驗結果的準確性和重複性較高，對疾病診斷和治療觀察具有重要意義。實驗結果表明，該方法較好地區別了正常人與肝硬化、肝癌病人以及肝硬化與肝癌病人的外周血淋巴細胞。
圖1為正常淋巴細胞的染色顯微圖像；圖2為肝癌淋巴細胞的染色顯微圖像；圖3為肝硬化淋巴細胞的染色顯微圖像；圖4為肝癌淋巴細胞的另一幅染色顯微圖像；圖5為圖1經小波變換後再經經驗模式分解後的第一分量；圖6為圖1經小波變換後再經經驗模式分解後的第二分量；
圖7為圖1經小波變換後再經經驗模式分解後的第三分量；圖8為圖1經小波變換後再經經驗模式分解後的第四分量。
具體實施方式
以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。血細胞化學染色載體的選擇對實施效果有著顯著影響。從生物表面化學知識可知，血液中蛋白質在載體表面的吸附會影響白細胞、血小板等的黏附從而會影響其形態，為儘量減少白細胞在載體上黏附時發生形態的細微變化，在選擇載體時，需同時考慮載體表面光學性質的一致性和載體化學性質的一致性。特別重要的是載體光學性質的一致性，推導如下設M為被測物質質量；S為象素點面積；A為圖像背景灰度；r為象素點變化量；由 Lambert-Beer 定律知M =^rfj /(Olg-
r = 0r式中，λ為入射光波長，單位nm ；而;￡/W丨就是積分光密度Σ 0D。Ελ則為給
r=0r
定波長時吸光物質的吸光係數，在一定狀態和條件下為一常數。這個一定狀態和條件包括顯微鏡光程、入射光波長、染色劑和血細胞塗片載體(載片)，所以當顯微鏡光程和入射光波長給定及染色劑確定後，剩下所要考慮的應當就是載片了。但一般血細胞染色所用的載玻片，其每張玻璃片的表面化學性質和其光學性質都不是一樣的，因此普通載玻片一般不能很好滿足細胞化學染色微量定量分析的要求，所以我們選用分光光度計石英玻璃比色杯的透明面作血細胞塗片的載體(載片)，滿足上式的分析條件，取得較好效果。載體選擇完畢，接下來進行外周血淋巴細胞標本提取，具體步驟如下首先採集血液樣本推製成血液塗片，等血液塗片乾燥後放入提前配製好的混合固定液中，固定10分鐘後取出，乾燥；然後滴加配好的甲基綠-派羅林染液在血液塗片上，對血細胞進行染色，染色時間為15分鐘；本實施例中，固定液的組分及體積配比如下冰醋酸8 10，甲醇28 31及無水乙醇59 62混合成固定液，作為最佳，用冰醋酸9，甲醇29. 5及無水乙醇61. 5混合成固定液。本實施例中，甲基綠_派羅林染液的配製如下(1)0. 2mol/L 乙酸緩衝液A.冰乙酸1. 2ml加蒸餾水到100ml。B.乙酸鈉2. 27g溶於IOOml水中。A B = 2 3比例混合使用。(2)甲基綠-派羅林染液甲液2g甲基綠加0. 2mol/L乙酸緩衝液到100ml。乙液1. Og派羅林加0. 2mol/L乙酸緩衝液到IOOml。臨用時，甲乙=5 2混合。染色完成後，用蒸餾水衝洗血液塗片；最後，用乙醇溶液對血液塗片進行分色並晾乾，晾乾後，用OLYMPUS CX31攝像顯微鏡檢查血液塗片並攝取其中的淋巴細胞圖像，獲取的淋巴細胞圖像存儲在計算機硬碟以便進行處理。這裡選取三類不同淋巴細胞標本，正常淋巴細胞的染色圖像如圖1所示，肝癌淋巴細胞標本取自經臨床確診為病毒性肝炎肝硬化病人外周血，其染色圖像如圖2和圖4所示，肝硬化淋巴細胞標本取自經臨床確診為原發性肝癌病人外周血，其染色圖像如圖3所示。 本實施例中，血液製成血液塗片後，在偏酸性固定液作用下，核內DNA、RNA及蛋白質等大分子結構、表面性質均發生了變化。根據核酸的理化性質，在酸性條件下，嘌呤鹼糖苷健易斷裂，核酸受損，正 常DNA超螺旋結構變得鬆弛，分子大小和分子構象發生改變；核酸解離而帶電。因此染料與DNA的結合，無論是插入方式和溝槽方式，與用乙醇或10%甲醛生理鹽水作固定液的細胞相比，核表面會出現更多的色彩與紋理。在統一的化學染色條件下，肝癌、肝硬化疾病時受損淋巴細胞核中生物大分子物質性質已發生改變，因而與染料結合後所產生的核表面色彩及紋理與正常淋巴細胞比較則出現一定的差異。
對淋巴細胞核圖像的處理有很多數學方法，本實施例採用小波變換 (WaveletTransform)和經驗模式分解(Empirical Mode Decomposition EMD)的方法對淋巴細胞核圖像進行處理。為保證小波變換的有效性和運算速度，首先，從淋巴細胞核圖像分割出40像素X40像素的核表面圖像作為小波變換的處理單元。提取圖像在水平、垂直和對角方向的分量構成小波係數矩陣，取小波係數矩陣的數據做平均運算，得到一個長序列並對該長序列作經驗模式分解。通過經驗模式分解，該長序列被分解成有限個具有不同特徵尺度的數據序列，其中，每一個序列為一個固有模式函數(intrinsic mode function, IMF)。由於經驗模式分解出來的前幾個固定模式函數分量往往集中了原始信號最顯著和最重要的信息，如圖5至圖8所示，是把正常淋巴細胞作為處理樣本所得到的前4個固定模式函數分量。因此這裡選取前面4個固定模式函數分量組成矩陣，對該矩陣作奇異值分解可以得到小波紋理特徵值。為深入考察細胞內生物大分子的表面幾何複雜性及其理化性質的變化與細胞染色後核表面紋理和顏色結構變化之間的關係，進一步地，對淋巴細胞核表面圖像的光密度和能量進行測定。具體地，可以測定紅光光密度(denSity)、綠光光密度 (density)和藍光光密度(density)，平均光密度(density)、最大光密度(density)和累積光密度(I0D Integrated Optical Density累積光密度是測量被測圖像面積內各像素點光密度之和)。光密度值可代表或反映細胞核內物質著色的深淺及顏色結構，用於了解核內物質的構成與相對含量，而能量(energy Ε)用於分析圖像灰度分布均勻程度和圖像表面紋理粗細度，圖像表面紋理越細，能量就越小，紋理越大，能量就越大。將圖像光密度、圖像能量和已經提取的小波紋理特徵值想融合，構成一個圖像組合特徵多維向量，各種不同淋巴細胞核表面的差異性都隱含在該特徵向量當中。最後用支持向量機方法對該組合特徵多維向量進行模式識別，區分出不同類型的淋巴細胞核紋理。另夕卜，在本實施例中，還測定了淋巴細胞核圖像的對比度(contrast C)、均勻性(homogeneity H)、相關性(correlation R)等，但在分類識別測試試驗中，發現它們對提高淋巴細胞核表面圖像的分類識別率影響不是很大，因此最後捨去了。本實施例中，選取了 600多幅淋巴細胞核表面圖像作為處理數據，三類不同淋巴細胞的互相識別率均達到了 85%以上，具體見下表
細胞核表面組合特徵識別結果
權利要求
1.淋巴細胞核化學染色表面分析方法，其特徵在於包括如下步驟(1)、血細胞化學染色載體選擇；(2)、外周血淋巴細胞標本提取；(3)、小波變換和經驗模式分解用顯微鏡隨機攝取分散在標本中的淋巴細胞，獲取淋巴細胞圖像，對淋巴細胞圖像中的細胞核表面圖像作小波變換，提取小波係數矩陣，再用經驗模式分解法獲取固有模式函數；(4)、數據融合選取所述固有模式函數組成矩陣，對該矩陣作奇異值分解得到所述細胞核表面圖像的紋理特徵值，把該紋理特徵值與測得的細胞核表面圖像光學特徵數據相融合，構成一多維特徵向量；(5)、採用模式識別方法對所述的多維特徵向量進行分類識別。
2.根據權利要求1所述的淋巴細胞核化學染色表面分析方法，其特徵在於步驟(1) 中採用分光光度計石英玻璃比色杯的透明面作為所述的血細胞化學染色載體。
3.根據權利要求1所述的淋巴細胞核化學染色表面分析方法，其特徵在於步驟(2) 中所述的外周血淋巴細胞標本提取包括以下步驟a、取外周血液塗片，乾燥後放入混合固定液中進行固定，然後取出，乾燥；b、滴加染色液於上述血液塗片上；c、蒸餾水衝洗；d、乙醇溶液分色，晾乾。
4.根據權利要求3所述的淋巴細胞核化學染色表面分析方法，其特徵在於步驟a中所述的固定液組分及體積配比為冰醋酸8 10 ；甲醇28 31 ；無水乙醇59 62。
5.根據權利要求3所述的淋巴細胞核化學染色表面分析方法，其特徵在於步驟b中所述的染色液為甲基綠_派羅林染色液。
6.根據權利要求1所述的淋巴細胞核化學染色表面分析方法，其特徵在於步驟(4) 中所述的細胞核表面圖像光學特徵數據包括圖像光密度和圖像能量。
7.根據權利要求1所述的淋巴細胞核化學染色表面分析方法，其特徵在於步驟(5) 所述的模式識別方法採用支持向量機。
全文摘要
本發明公開了一種淋巴細胞核化學染色表面分析方法，包括如下步驟血細胞化學染色載體選擇；外周血淋巴細胞標本提取；根據計算機對血細胞圖像分析的要求，採用小波變換和經驗模式分解的方法提取淋巴細胞核圖像的表面紋理特徵，並將表面紋理特徵與光密度值和圖像能量相結合，構成一種多維特徵向量，最後用支持向量機對該多維特徵向量完成分類識別。實驗結果表明，該方法較好地區別了正常人與肝硬化、肝癌病人以及肝硬化與肝癌病人的外周血淋巴細胞，解決了淋巴細胞核染色表面微小變化人眼不能定量分析識別的問題。
文檔編號G01N21/84GK102221548SQ20101014861
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月13日 優先權日2010年4月13日
發明者李大東 申請人:浙江海洋學院