一種POSS‑PEG雜化水凝膠、其製備方法及應用與流程
2023-10-09 16:09:29 1

本發明涉及涉及組織工程領域,更特別地,涉及一種poss-peg雜化水凝膠及其製備方法以及用其製備的組織工程支架。
背景技術:
組織工程技術在生物醫學應用中擁有巨大的潛力,如修復、替換受損或患病組織的生物功能。組織工程技術成功的關鍵因素之一是選擇一個合適的支架材料。為了實現組織重建,支架材料應當具備以下條件:(1)良好生物相容性;(2)較強的機械性能;(3)較高的孔隙率和足夠的孔徑;(4)生物可降解性以及合適的降解速率。
聚乙二醇(peg)水凝膠是一類非常有吸引力的組織工程支架材料,其生物相容性好、無毒、免疫原性低、對蛋白質抗吸附,可通過腎排出體外,在體內不會有積累。peg水凝膠的結構、力學行為及降解性可通過peg的化學和加工條件來控制;其生物功能則可通過在peg水凝膠內部嵌入生物活性分子來獲取,例如嵌入基質金屬蛋白酶(mmp)底物肽(mmp(w)x),使peg水凝膠具有酶敏感性,利用種子細胞自身分泌的蛋白酶(尤其是mmps),促進細胞外基質降解,促使活性分子釋放,有利於種子細胞在支架的生長、粘附。然而,peg水凝膠的機械強度差,其機械強度遠小於生物組織。
多面體低聚倍半矽氧烷(poss)是一種分子水平上的納米雜化材料,分子尺寸在1-3nm之間,由核心的si-o-si鍵組成的無機骨架和外圍的有機取代基組成有機-無機雜化結構,外圍的有機取代基賦予了poss良好的分子可設計。poss納米粒子能增強聚合物韌性、耐溫性能、力學性能,且其無毒無味,具有良好的生物相容性,被認為是新一代生物醫用材料。目前所研究的poss雜化水凝膠都是通過光聚合或使用的六亞甲基二異氰酸酯(hdi)或二苯基甲烷二異氰酸酯(mdi)等作為交聯劑進行縮合反應製備得到。這些製備方法的主要缺點是所用的光引發劑、hdi、mdi等具有毒性,且反應需要在有機溶劑中進行,對材料的體外生物相容性研究只能局限於2d細胞培養中。
因此,需要開發出具有更好力學性能的水凝膠,並且在製備過程中不使用有機溶劑成膠,從而使細胞在保持最大活性的同時被封裝到材料中。
技術實現要素:
為解決以上問題,本發明提供了一種poss-peg雜化水凝膠的製備方法,包括以下步驟:
s1:將馬來醯亞氨基功能化的四臂聚乙二醇(4-arm-peg-mal)與poss-sh進行michael加成反應得到poss-peg預聚物;
s2:使用酶敏感的基質金屬蛋白酶底物肽(mmp(w)x)作為交聯劑與所述poss-peg預聚物通過micheal加成反應交聯成膠,得到所述poss-peg雜化水凝膠。具體反應過程如圖10的反應式所示。
在一個優選實施方案中,mmp(w)x肽的序列為:ac-gcrd-gpqg↓iwgq-dgcg-nh2。
在一個優選實施方案中,所述4-arm-peg-mal的分子量為10kda~40kda。
在一個實施方案中,s1中所述4-arm-peg-mal與所述poss-sh之間的michael加成反應在四氫呋喃中進行。
在一個優選實施方案中,s1中所述poss-sh與所述4-arm-peg-mal之間的摩爾比為0.25-1。
在一個優選實施方案中,s1包括以下步驟:
s11:將所述4-arm-peg-mal與所述poss-sh溶解於四氫呋喃中;
s12:室溫攪拌3.5小時使所述4-arm-peg-mal與所述poss-sh發生michael加成反應;
s13:去除所述四氫呋喃,即得到所述poss-peg預聚物。
在一個實施方案中,s2中所述mmp(w)x與所述poss-peg預聚物之間的交聯反應在乙醇胺的水溶液中進行。
在一個優選實施方案中,所述乙醇胺的濃度為3-10mm。
在一個優選實施方案中,所述乙醇胺溶液的ph為7-8,優選為7.4。
在一個優選實施方案中,s2中所述mmp(w)x與所述poss-peg預聚物之間重量比為1:3-20,更優選地,可將mmp(w)x的功能基與poss-peg預聚物的功能基的比例為1:1。
在一個實施方案中,s2中的反應溫度為37℃。
在一個實施方案中,s2中的乙醇胺水溶液中還添加了藥物或種子細胞。
本發明還涉及上述方法製備的poss-peg雜化水凝膠。
本發明還涉及上述poss-peg雜化水凝膠在製備組織工程支架中的應用。
本發明的poss-peg雜化水凝膠機械強度好,且其機械強度可通過改變馬來醯亞氨基功能化的四臂聚乙二醇(4-arm-peg-mal)分子量、poss-sh與4-arm-peg-mal的摩爾比例進行精細調控,同時只需在低濃度的三乙醇胺緩衝液中製備而成,成膠時間很快,在保證基本的理化性質的前提下儘可能地降低了對其上搭載的種子細胞或藥物的損害或損失。
附圖說明
圖1為poss-peg雜化水凝膠的掃描電鏡照片;
圖2為poss-peg雜化水凝膠的儲能模量(g』)的振蕩應力掃描圖譜;
圖3為poss-peg雜化水凝膠的儲能模量(g』)的動態頻率掃描圖譜;
圖4為poss-peg雜化水凝膠溶脹曲線;
圖5為poss-peg雜化水凝膠的平衡溶脹比柱狀圖;
圖6為poss-peg雜化水凝膠降解率統計圖;
圖7為以4-arm-peg-mal分子量20kda製備的poss-peg雜化水凝膠4周內降解曲線;
圖8為poss-peg雜化水凝膠體外細胞培養cck細胞活力測定圖;
圖9為poss-peg雜化水凝膠體外細胞培養細胞的活死細胞染色照片;
圖10為本發明的方法的化學反應式。
具體實施方式
以下結合實例對本發明的原理和特徵進行描述,所舉實例只用於解釋本發明,並非用於限定本發明的範圍。
1.poss-peg雜化水凝膠的製備
poss-peg雜化水凝膠通過以下方法來製備:將4-arm-peg-mal(北京健凱科技有限公司)和poss-sh(sigma公司)溶解於3ml四氫呋喃中,室溫攪拌3.5小時後除去溶劑得poss-peg預聚物;然後將poss-peg預聚物與基質金屬蛋白酶底物肽(上海吉爾生化科技公司)溶解於3mlph7.4的三乙醇胺中,混合均勻,得預成膠溶液;最後將上述預成膠溶液轉移至5個600μl模具中,37℃生化培養箱中反應,製備得到水凝膠。poss-peg預聚物製備過程中的4-arm-peg-mal的分子量、4-arm-peg-mal、poss-sh的量如表1所示;poss-peg雜化水凝膠製備過程中的poss-peg預聚物和基質金屬蛋白酶底物肽的量、三乙醇胺濃度以及成膠時間如表2所示。
表1實施例1-5中4-arm-peg-mal的分子量、4-arm-peg-mal、poss-sh的量
表2實施例1-5中poss-peg預聚物和基質金屬蛋白酶底物肽的量、三乙醇胺濃度以及成膠時間
在實施例1-5中,都能成膠,並且成膠時間都在20min以內。所得到的poss-peg雜化水凝膠在掃描電鏡下進行觀察,結果如圖1所示,在poss-sh與4-arm-peg-mal的摩爾比為0.25、0.5和1的情況下,所實驗的各分子量的4-arm-peg-mal都能與poss-sh反應,且其反應產物能與基質金屬蛋白酶底物肽交聯形成多孔狀的交聯結構。
2.poss-peg雜化水凝膠的理化性質
1)機械強度
將水凝膠測試樣(n=3)用超純水溶脹至平衡,濾紙擦乾表面水分,採用流變儀解析水凝膠力學性能,3個測試樣取平均值。圖2為水凝膠材料的儲能模量(g』)的振蕩應力掃描圖譜,圖3為儲能模量(g』)的動態頻率掃描圖譜。由圖2和3可看出,採用本發明方法製備的水凝膠材料在所受應力從0.1pa增加到20pa時,儲能模量(g』)隨應力的變化沒有明顯變化,掃描頻率範圍為1hz到2hz時儲能模量(g』)也無明顯變化,表明水凝膠材料交聯良好。相較於未加入poss的純peg水凝膠,poss-peg雜化水凝膠機械強度更大,且機械強度隨poss含量增大而增大。
2)親水性
將水凝膠測試樣(n=3)冷凍乾燥,準確稱取其重量。將幹水凝膠沉浸在0.9%氯化鈉注射液(10ml)中,置於37℃水浴。在預定的時間,取出溶脹的水凝膠,用濾紙擦乾表面水分後稱重,直至水凝膠重量恆定不變。水凝膠的溶脹百分率(%)=(溶脹後水凝膠質量-溶脹前水凝膠質量)/溶脹前水凝膠質量×100%,3個測試樣取平均值。圖4為水凝膠材料溶脹曲線;圖5為水凝膠材料的平衡溶脹比柱狀圖。由圖4和5可看出本發明方法製備的水凝膠材料在前10h已經達到較高的溶脹比,並在168h後達到溶脹平衡。儘管poss-peg雜化水凝膠的平衡溶脹比隨poss含量增大而減小,但本發明方法製備的水凝膠材料平衡溶脹比在12至33之間,表明其仍具有良好的親水性。
3)酶降解性
將水凝膠測試樣(n=3)冷凍乾燥,準確稱取其重量。將幹水凝膠沉浸在0.01m磷酸鹽緩衝液(pbs,ph=7.4,9ml)和重組人類mmp-2(200ng/ml,1ml),純peg水凝膠作為空白組,置於37℃水浴。30天後蒸餾水漂洗,冷凍乾燥,稱重。計算每組水凝膠在溶液中的累計降解百分率(%)=(降解前水凝膠質量-剩餘水凝膠質量)/降解前水凝膠質量×100%,3個測試樣取平均值。圖6中a為降解率圖;圖7為以4-arm-peg-mal分子量20kda製備的poss-peg雜化水凝膠4周內降解曲線。由圖6和7可看出本發明方法製備的水凝膠材料降解率在28%至48%之間,表明水凝膠材料具有酶降解性,並且隨著poss含量的增大,poss-peg雜化水凝膠降解率越低、降解速度越慢。
3.搭載人臍靜脈內皮細胞(huvec)的poss-peg雜化水凝膠
製得的不同poss-sh與4-arm-peg-mal的摩爾比例預成膠液各3ml,與人臍靜脈內皮細胞(huvec)均勻混合,細胞密度為1×106/ml。取64μl置於96孔細胞培養板中,高度為2mm,5%co2恆溫培養箱37℃孵育30min,加入200ul含10%胎牛血清的低糖dmem培養基,繼續孵育,在第1天和第4天取出樣本,進行活死細胞染色測試細胞活性,應用螢光顯微鏡分析圖像,觀察細胞活性及形態;並用cck-8進行細胞活力測試,應用分光光度計檢測吸光度推算活細胞數目。純peg水凝膠為對照組。圖8為cck細胞活力測定圖;圖9為體外細胞培養活死細胞染色圖。結果顯示,細胞在水凝膠內部封裝均勻,培養四天後均有較高的細胞活力,表明poss-peg水凝膠材料無毒且具有良好的生物相容性。
以上所述僅為本發明的較佳實施例,並不用以限制本發明,凡在本發明的精神和原則之內,所作的任何修改、等同替換、改進等,均應包含在本發明的保護範圍之內。