按畢赤酵母偏愛密碼子優化的木聚糖酶cxyI1基因及其表達的製作方法

2023-10-10 19:59:39 2

專利名稱：按畢赤酵母偏愛密碼子優化的木聚糖酶cxyI1基因及其表達的製作方法
技術領域：
本發明屬微生物技術領域，具體涉及一種按畢赤酵母偏愛密碼子優化的木聚糖酶 cxyll (Codon bias optimized xyll)基因及其表達。
背景技術：
木聚糖是半纖維素的重要組成部分，廣泛存在於植物細胞壁中，是一種重要的可 再生資源。由於木聚糖結構複雜，要徹底降解木聚糖需要多種酶的共同參與和協同。降解 時起主要作用的酶為2類(1)木聚糖酶(endo-1，4-β-Xylanases，EC 3.2.1.8)可以特異 的切斷β _1，4木糖苷鍵，使木聚糖降解為低聚木糖和木糖，是木聚糖降解過程中最關鍵的 酶。(2)0-0-木糖苷酶(0-0-巧1081(1￡1%工0 3. 2. 1.37)，作用於寡聚木糖的還原端，並釋 放出木糖，屬外切酶。木聚糖酶具有重要的潛在應用價值，自20世紀80年代以來，木聚糖酶的應用領域 不斷擴大。目前，木聚糖酶已成功應用於製漿造紙、食品、飼料、醫藥等工業中。(1)植物纖 維是造紙的主要原料，在造紙工業中，利用木聚糖酶進行紙漿漂白，可以減少氯的用量，降 低環境汙染；( 木聚糖酶的分解產物低聚木糖是一種功能性低聚糖，具有良好的酸鹼穩 定性和耐熱性，適用於不同食品中，其甜度僅為蔗糖的40%，食用後不會導致血漿中葡萄糖 含量大幅度上升，因而可以作為糖尿病或肥胖症患者的甜味劑；C3)飼料中添加木聚糖酶 可以把聚合度較高的木聚糖降解為聚合度較低的小分子片段，破壞細胞壁的結構，將細胞 壁束縛的營養物質釋放出來，和動物消化道內的消化酶充分接觸，從而提高各種養分的消 化率。(4)隨著現代化工業的快速發展，能源短缺問題日益嚴重，尋找新的能源已迫在眉睫。 植物纖維的主要成分是纖維素、半纖維素和木質素，其中半纖維素約佔植物幹質量的35%， 是自然界中僅次於纖維素含量的第二豐富可再生資源。木聚糖酶可與其它酶協同將植物纖 維降解為戊糖和己糖，然後將戊糖和己糖作為發酵底物，進一步通過微生物作用生產乙醇， 作為工業生產直接利用的能源，將產生巨大的經濟效益，並且可減少對環境的汙染，促進自 然界碳素循環。目前木聚糖酶的生產主要依靠真菌、細菌等微生物的發酵。畢赤酵母(Pichia pastoris)系統是近年來發展很快的一個真核表達系統，許多有活性的蛋白質已經在畢赤 酵母系統中大量表達。畢赤酵母在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油時，能以甲醇為唯一碳源 生長。畢赤酵母表達系統是真核表達系統，可以對表達的蛋白質進行加工摺疊和修飾，還 具有發酵方法成熟、發酵密度高、培養簡單廉價、外源蛋白質既可以胞內積累又可分泌；表 達產量高、背景蛋白質少、易於表達產物純化等優點，是生產木聚糖酶的較為理想的表達系 統。而且，偏愛密碼子的使用能夠較大幅度提高基因的表達水平。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種按畢赤酵母偏愛密碼子優化的木聚糖酶cxynll基因及其表達，以使所述基因在畢赤酵母中表達出高比活的木聚糖酶。為了達到上述目的，本發明採用以下技術方案來實現一種按畢赤酵母偏愛密碼子優化的木聚糖酶cxynll基因，採用連續延伸PCR方法 合成，其核苷酸序列SEQ ID NO 1所示。所述優化的木聚糖酶cxynll基因編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQID NO 2所示。本發明按照畢赤酵母偏愛密碼子對原始的xyll進行改造，改造後的基因序列與 原序列(GenBank Accession No. X98518)同源性為76% (參見圖1)，其編碼的蛋白質含 162個胺基酸。本發明的優化的木聚糖酶cxynl 1基因合成採用連續延伸PCR方法製備而成熊 愛生等，A simple, rapid, high fidelity and cost-effective PCR-basedtwo-step DNA synthesis (PTDS)method for long gene sequences,核酸研究，2004，32 :e98。使用的引 物如下Pl:TCTGTCTCCATGAACCTGGCTTCTGGTGGTTCCTACGGTACTTCCTGGACCAACTGTGGCAACTTC GTTGCTGGTAAGGP2 :TGMGGMCCAGAGTAGTTGACAGTTCTTCTAGCACCGTTAGCCCMCCCTTACCAGCMCGMGTTGCP3 :TCMCTACTCTGGTTCCTTCMTCCTTCTGGTMCGCTTACCTGACTTTGTACGGTTGGACTGCTMCCCP4 :AGGTCTGTAGGTTCCCCAGTTGTCMCGATGTAGTACTCMCCAGAGGGTTAGCAGTCCMCCGTACAAP5 :TTGTACGGTTGGACTGCTMCCCACTGGMCCTACMGGGTACTGTCACCTCCGATGGTGGMCCTACGP6 :CTTGGTTCCTTCMCAGMGGAGCGTTGACTCTAGTAGTTTGATAGACATCGTAGGTTCCACCATCGGAP7 :TCCTTCTGTTGMGGMCCMGACCTTCMCCAGTACTGGTCTGTCAGACAGTCCMGAGMCTGGTGP8 :CCGTATCTAGCCCMGCATCGMGTGGTTGCCAGCAGTGATGGMCCACCAGTTCTCTTGGACTGTCTP9 :ACTTCGATGCTT腳CTAGATACOTATGCCTCTGGGTTCCTTCMCTACTACATGATCATGGCTACTGAPlO CGCGAGCTCTTAGGAAACAGAGATGGAAGAGGAACCAGAGGACTGGTATCCTTCAGTAGCCATGA TCATGTAGTAGTT回收PCR擴增產物，使其與pMD18-T載體相連(Takara)，4°C連接過夜，高效轉 化DH5ci感受態中，獲得陽性克隆。抽取該陽性克隆質粒，經BioI和McI雙酶切後，通過 T4DNA連接酶與畢赤酵母表達載體pYPX88 (invitrogen)連接，酶切鑑定和序列測定獲得了 含有目的基因的重組質粒載體pYPX88-CXynIl。包含所述優化的木聚糖酶cxyll基因的重組質粒pYPX88-CXynIl載體，成功應用 於畢赤酵母表達中，可以在畢赤酵母中表達出高比活的木聚糖酶。1.利用電擊法將上述重組質粒pYPX88-CXynIl載體轉入畢赤酵母GS115菌 (Pichia pastoris, strain GS115, invitrogen)中，篩選到的菌株經 lwt% 甲醇搖瓶誘導 7 後，上清中表達量達到0. 05mg/mL,酶活達到254. 9U/mL。最適pH為5. 5，最適反應溫度 為50°C。Km值和最大反應速率分別為llmg/mL、10000U mg-lmin-1。有益效果本發明的按畢赤酵母偏愛密碼子優化的cxyll基因可以在畢赤酵母中表達出高 比活的木聚糖酶，在製漿造紙、食品、飼料、醫藥等工業有廣泛的應用潛力。


圖1為本發明優化的木聚糖酶cxyll基因和原始的xyll基因的序列比對圖。圖2為本發明的用於畢赤酵母表達的pYPXSS-cxynll載體。圖3為本發明優化的木聚糖酶cxyll基因的SDS-PAGE分析，其中M為蛋白分子 量標準；1為表達的Cbo-xynll蛋白。圖4為pH值對本發明優化的木聚糖酶cxyll基因的活性影響。圖5為溫度對本發明優化的木聚糖酶cxyll基因的活性影響。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
來進一步闡述本發明。本發明實施中未註明的實驗方法，如連接、轉化、相關培養基的配製等參照分 子克隆實驗指南第三版(黃培堂等譯，中國，科學出版社，200 和畢赤酵母表達手冊 (invitrogen)中方法進行。未註明的化學藥品為分析純級，購自上海國藥集團有限公司。實施例1密碼子優化木聚糖酶基因的合成本發明根據來源於鏈黴菌(Sti^ptomyces sp. S38)的xyll序列 (GenBankAccession No. X98518)，採取連續延伸PCR方法合成按照畢赤酵母偏愛密碼子優 化的木聚糖酶cxyll基因。由上海生物工程有限公司合成10條引物，用於木聚糖酶cxyll 基因的合成。在50 μ L反應體系中，內側引物(Ρ2-Ρ9)的添加量為10ng，外側引物(P1，P10) 添加量為 lOOng，擴增條件為94°C預熱 IOmin ；94°C, 30s, 54°C, 30s, 72°C, 40s, 35 個循環； 最後72°C延伸lOmin。使用的Taq DNA聚合酶為KOD FX taq酶(Toyobo公司日本)擴增 目的基因。P1TCTGTCTCCATGAACCTGGCTTCTGGTGGTTCCTACGGTACTTCCTGGACCAACTGTGGCAACTTC GTTGCTGGTAAGGP2:TGMGGMCCAGAGTAGTTGACAGTTCTTCTAGCACCGTTAGCCCMCCCTTACCAGCMCGMGTTGC
P3 :TCMCTACTCTGGTTCCTTCMTCCTTCTGGTMCGCTTACCTGACTTTGTACGGTTGGACTGCTMCCC
P4:AGGTCTGTAGGTTCCCCAGTTGTCMCGATGTAGTACTCMCCAGAGGGTTAGCAGTCCMCCGTACAA
P5:TTGTACGGTTGGACTGCTMCCCACTGGMCCTACMGGGTACTGTCACCTCCGATGGTGGMCCTACG
P6:CTTGGTTCCTTCMCAGMGGAGCGTTGACTCTAGTAGTTTGATAGACATCGTAGGTTCCACCATCGGA
P7:TCCTTCTGTTGMGGMCCMGACCTTCMCCAGTACTGGTCTGTCAGACAGTCCMGAGMCTGGTG
P8:CCGTATCTAGCCCMGCATCGMGTGGTTGCCAGCAGTGATGGMCCACCAGTTCTCTTGGACTGTCT
P9 :ACTTCGATGCTT 腳 CTAGATACOTATGCCTCTGGGTTCCTTCMCTACTACATGATCATGGCTACTGA
PlO CGCGAGCTCTTAGGAAACAGAGATGGAAGAGGAACCAGAGGACTGGTATCCTTCAGTAGCCATGA
TCATGTAGTAGTT按畢赤酵母偏愛密碼子優化合成的木聚糖酶cxyll基因的開放閱讀框為489鹼 基，不包含保護鹼基和酶切位點。通過DNAMAN軟體進行同源性比對，結果發現該合成序列 與原序列(GenBank Accession No. X98518)同源性為76% (參見圖1)，其編碼的蛋白質共 162個胺基酸。實施例2
木聚糖酶cxyll基因在畢赤酵母中的分泌表達一、畢赤酵母表達載體的構建1. 5wt%瓊脂糖膠回收實例1中的PCR擴增產物，取10 μ L與pMD18_T載體相連。 4°C連接過夜，高效轉化DH5 α感受態中，獲得陽性克隆。抽取陽性克隆質粒，經BioI和McI 雙酶切後，以正確的閱讀框插入到畢赤酵母表達載體ΡΥΡΧ88中，測序驗證，得到重組質粒 pYPX88-CxyIl載體(參見圖幻。相關的DNA回收試劑盒、載體、連接酶、核酸內切酶均購自 Takara公司，DH5 α感受態由本實驗室保存。二、畢赤酵母的轉化挑取劃線培養的GS115(mut+his-，invitrogen)單克隆接種到 IOmL YPD, 30°C, 225rpm培養過夜，取ImL轉接到IOOmL新鮮YPD中繼續培養，繼續培養3- 至0D600 = 0. 5， 5000rpm離心收集菌體。用等體積重蒸水洗滌兩次後，加入ImL預冷的山梨醇懸浮菌體，即 可作為畢赤酵母感受態。大量抽取重組質粒pYPX88-CxyIl載體DNA，經bglII線性化後，用電擊法轉入感受 態細胞。用Bio-Red GenePulser電擊儀電擊，參數2. 5kV，25 μ F。電擊結束後，立即加入 1. OmL預冷的1. Omol/L山梨醇，取200 μ L塗布於SD_his培養基平板，30°C培養3_4天至轉 化子出現。由於受體酵母為His缺陷型(His-)，在不加His的基本培養基上不生長，只有整 合得到的重組酵母才能正常生長。通過這一標記，篩選得到各質粒大量的His+轉化子。三、畢赤酵母的篩選與誘導表達採用小規模發酵篩選活性高的轉化子，具體操作方法為接種單個轉化子到含 有 50 μ L BMMY(10g/L 酵母提取物、20g/L 蛋白腖、13. 4g/L YNB、0. 4mg/L 生物素、Iwt % 甲 醇)的96孔板中，28°C，225rpm振蕩培養他，加入反應底物樺木木聚糖(sigma)，37°C反應 30min，然後用DNS法測定酶的活性。選取活性相對較高的轉化子，接種到50mL BMGY(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白 腖、13. 4g/L YNB,0. 4mg/L生物素、10g/L甘油)，培養至0D600 = 2_3時，離心收集菌體，然 後加入等體積BMMY誘導72h，其間每隔1 補加甲醇至終濃度lwt%。表達的目的蛋白分泌 在上清液中，因此誘導完成後，12000rpm，離心IOmin收集上清。吸取10 μ L上清用12wt% SDS-PAGE進行電泳檢測，結果參見圖3，分析得到蛋白質的表達量為0. 05mg/mL。上清用pH =5. 5檸檬酸-磷酸二氫鈉稀釋600倍後用於酶活力的測定。實施例3木聚糖酶cxyll基因在畢赤酵母表達產物的酶活測定一、木聚糖酶cxyll基因的活力測定酶活測定採用DNS法。具體實施方法如下取600倍稀釋的酶液50yL，加入Iwt %樺木木聚糖50 μ L，置50°C水浴保 溫lOmin，然後加入DNS試劑150 μ L於沸水浴中顯色反應8min，迅速冷卻至室溫，使用 infiniteM200多功能酶標儀(TECAN)測定MOnm處比色測定光吸收值的變化。根據木糖標 準曲線計算木聚糖酶的活力。相關試劑的配製DNS試劑稱取酒石酸鉀鈉182. 0g，溶於500mL蒸餾水中，加熱(不超過50°C )，於 熱溶液中依次加入3,5- 二硝基水楊酸6. 3g，NaOH 21. 0g，苯酚5. 0g，無水亞硫酸鈉5. Og,攪拌至溶解完全，冷卻後用蒸餾水定容至IOOOmL,用玻璃漏鬥過濾，濾液貯存於棕色瓶中， 室溫放置7天後使用，有效期為6個月。木糖標準曲線吸取Iwt %木糖(sigma)溶液 30 μ L、40 μ L、50 μ L、60 μ L、70 μ L、 80 μ L、90 μ L、100y L，用緩衝液定容到 lmL，配製成濃度為 0. 3mg/mL,0. 4mg/mL,0. 5mg/mL、 0. 6mg/mL、0. 7mg/mL、0. 8mg/mL,0. 9mg/mL、l. Omg/mL木糖標準溶液。分別吸取上述濃度木糖 標準溶液50 μ L，代替酶液參與反應，反應完成後測定540nm的光吸收值。以木糖濃度為Y 軸，光吸收值為X軸，繪製標準曲線。其中，酶活力單位(U)的定義在該反應條件下，以每分鐘產生Iymol還原糖所需 的酶量定義為1個單位。二、木聚糖酶cxyll基因的性質測定最適pH值測定在不同pH緩衝液下進行酶促反應，緩衝液分別為檸檬酸-磷酸二 氫鈉(pH 2. 5-8.0)，甘氨酸-氫氧化鈉(pH> 8.0)，然後按照DNS法測定酶的活性。測得 cxyll木聚糖酶的最適pH值為5. O (參見圖4)。最適反應溫度在最適pH，不同溫度Q0-80°C )下進行酶促反應，然後按照DNS法 測定酶的活性。測得cxyll木聚糖酶的最適反應溫度為50°C (參見圖5)。Km值和最大反應速率的測定分別用不同濃度(5,7. 5，10，12. 5，15，17. 5，20mg/ mL)的樺木木聚糖為底物，50°C、pH 5. 5測定酶活性，利用米氏方程雙倒數法求得Km值和最 大反應速率，分別為 llmg/mL、10000U mg-lmin-1。附本發明涉及到的核苷!酸/胺基酸序列表如下
上海市農業科學院
按畢赤酵母偏愛密碼子優化的木聚糖酶cxyll基因及其表達
1
PatentIn version3. 3
SEQ ID No 1
489
DNA
鏈黴菌(Streptomyces sp. S38)
1
ATGAACCTGGCTTCTGGTGGTTCCTACGGTACTTCCTGGACCAACTGTGG50
CAACTTCGTTGCTGGTAAGGGTTGGGCTAACGGTGCTAGAAGAACTGTCA100
ACTACTCTGGTTCCTTCAATCCTTCTGGTAACGCTTACCTGACTTTGTAC150
GGTTGGACTGCTAACCCTCTGGTTGAGTACTACATCGTTGACAACTGGGG200
AACCTACAGACCTACTGGAACCTACAAGGGTACTGTCACCTCCGATGGTG250
GAACCTACGATGTCTATCAAACTACTAGAGTCAACGCTCCTTCTGTTGAA300
GGAACCAAGACCTTCAACCAGTACTGGTCTGTCAGACAGTCCAAGAGAAC350
TGGTGGTTCCATCACTGCTGGCAACCACTTCGATGCTTGGGCTAGATACG400
GTATGCCTCTGGGTTCCTTCAACTACTACATGATCATGGCTACTGAAGGA450
TACCAGTCCTCTGGTTCCTCTTCCATCTCTGTTTCCTAA489
SEQ ID No 2
162
PRT
鏈黴菌(Streptomyces sp. S38)
2
METAsnLeuAlaSerGlyGlySerTyrGlyThrSerTrpThrAsn15
CysGlyAsnPheValAlaGlyLysGlyTrpAlaAsnGlyAlaArg30
ArgThrValAsnTyrSerGlySerPheAsnProSerGlyAsnAla45
TyrLeuThrLeuTyrGlyTrpThrAlaAsnProLeuValGluTyr60
TyrlleValAspAsnTrpGlyThrTyrArgProThrGlyThrTyr75
LysGlyThrValThrSerAspGlyGlyThrTyrAspValTyrGln90
ThrThrArgValAsnAlaProSerValGluGlyThrLysThrPhe105
AsnGlnTyrTrpSerValArgGlnSerLysArgThrGlyGlySer120
IleThrAlaGlyAsnHisPheAspAlaTrpAlaArgTyrGlyMET135
ProLeuGlySerPheAsnTyrTyrMETIleMETAlaThrGluGly150
TyrGlnSerSerGlySerSerSerIleSerValSer16權利要求
1.一種按畢赤酵母偏愛密碼子優化的木聚糖酶CxyIl基因，其特徵在於，所述基因採 用連續延伸PCR方法合成，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。
2.根據權利要求1所述優化的木聚糖酶cxyl1基因，其特徵在於，其編碼的蛋白質的 胺基酸序列如SEQ ID No 2所示。
3.包含權利要求1所述優化的木聚糖酶cxyll基因的pYPX88-CXynIl載體。
4.權利要求3所述的pYPXSS-cxynll載體在畢赤酵母表達中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述pYPXSS-cxynll載體的蛋白質表達量 為 0. 05mg/mLo
全文摘要
本發明涉及一種按畢赤酵母偏愛密碼子優化的木聚糖酶cxyI1基因及其表達。所述優化的木聚糖酶cxyI1基因採用連續延伸PCR方法合成，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID No 2所示。所述基因全長489bp，編碼162個胺基酸。通過將該基因序列構建到畢赤酵母表達載體並轉化入畢赤酵母中表達，可用於木聚糖酶的生產。
文檔編號C12R1/84GK102108366SQ20091020067
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月24日 優先權日2009年12月24日
發明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生, 田永生, 許晶, 趙偉, 高峰 申請人:上海市農業科學院