利用大腸桿菌用於發酵生產甲萘醌-7的方法

2023-10-10 12:14:39 2

專利名稱：利用大腸桿菌用於發酵生產甲萘醌-7的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用大腸桿菌用於發酵生產甲萘醌-7的方法。
背景技術：
甲萘醌-7是維生素K族的一部分。人體營養中的甲萘醌類主要來源於腸道細菌， 如嗜酸乳桿菌或大腸桿菌。從生物化學角度，甲萘醌類參與特定穀氨酸殘基的羧化作用以產生Y-羧基穀氨酸(GLA)。一種主要的含有3個GLA殘基的蛋白是骨鈣素。骨鈣素是在成骨細胞中形成的並構成了骨骼中15-20%的非膠原蛋白。維生素K的缺乏會導致進入血漿中的非羧化骨鈣素，這成為骨代謝紊亂的一個重要指標。研究表明甲萘醌-7補充劑對人類既有促進骨形成的效果，又有預防動脈硬化的效果。例如，一項研究表明減少維生素K的攝入與骨密度的降低和髖部骨折風險的增大相關(Feskanich et al.，1999，Am. J. Clin. Nutr. 69 :74-79)。另一項研究表明飲食中補充甲萘醌-7可以促進骨鈣素的Y-羧化(Tsukamoto， 2004，BioFactors 22 :5-19)。通常，甲萘醌-7是用一種本來就含有較高含量的甲萘醌-7的枯草芽孢桿菌菌株生產的。在亞洲地區把這種菌株用於生產納豆，因此這種菌株又稱作納豆枯草芽孢桿菌或納豆桿菌(Earl et al.，2007，J. Bacteriol. 189 :1163-1170)。一種可能的生產甲萘醌-7的方法是利用納豆枯草芽孢桿菌使大豆發酵，然後從納豆中分離出甲萘醌_7。在EP 1803820B1中描述了將生產甲萘醌_7的枯草芽孢桿菌菌株的工業發酵作為可替代的生產方案的選擇。接著所述菌株可以直接噴霧乾燥，並作為含甲萘醌-7的生物物質出售。由於具有預防骨質疏鬆和動脈硬化的功能，含維生素K的食品增加。可以在食物中加入這種添加劑，如所描述的甲萘醌-4，或者食品中直接包含產生甲萘醌的乳酸菌(EP 1153M8B1和EP 2076585)。乳酸菌如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(乳脂亞種或乳酸亞種)或乳明串珠球菌(Leoconostoc lactis)主要生產甲萘醌_8和甲萘醌_9 (Morishita et al.，1999，J. Dairy Sci. 82 :1897-1903)。細菌通常產生具有不同長度的類異戊二烯鏈的甲萘醌類，並在一定程度上可以依據這種代謝物來進行分類學區分。正如前面所述，枯草芽孢桿菌主要用來生產甲萘醌_7。與枯草芽孢桿菌相比，在大腸桿菌中發現的甲萘醌類主要是甲萘醌-8和甲萘 Il -9 (Collins and Jones, 1981, Microbiological Reviews 45:316-354)。據了解，該類蛋白質所有的基因都參與大腸桿菌中甲萘醌的生物合成。從最初的代謝產物分支酸 (chorismate)開始，生物合成了一種色氨酸的中間體，和類異戊二烯類的主要代謝產物異戊二烯基焦磷酸酯(IPP)，最初的中間體1，4_ 二羥基-2-萘甲酸(DHNA)就產生了。這涉及到以下幾種酶MenF (異分支酸合成酶)，MenD (2-琥珀醯-6-羥基_2，4-環己二烯-1-羧酸酯合成酶)，MenC(0-琥珀醯苯甲酸酯/鹽合成酶(O-succinylbenzoatesynthase))， MenE (0-琥珀醯苯甲酸酯 / 鹽-CoA連接酶(O-succinylbenzoate-CoA Iigase))和MenB (萘甲酸酯/鹽-CoA合成酶)。由MenA編碼的DNHA異戊烯轉移酶將八異戊烯醇焦磷酸鹽/酯 (octaprenyl pyrophosphate)單元轉移到DHNA，同時釋放出CO2和焦磷酸鹽/酯。去甲基甲萘醌(DMK)就產生了。最後的生物合成步驟包括通過S-腺苷甲硫胺酸依賴的甲基轉移酶，W^iE JfDMK甲基化並產生甲萘醌_8。八異戊烯醇焦磷酸鹽/酯是由IPP用idi、ispA 和ispB基因編碼的三種酶的協助下合成得到的。第一個合成步驟中，IPP通過異戊烯焦磷酸異構酶Idi被異構化；接著在兩步IspA-催化的反應步驟中被拉長以生成C15單元。在下面的四步反應步驟中，所有都被IspB八異戊烯基合成酶催化，C40單元，八異戊烯醇焦磷酸鹽被合成。枯草芽孢桿菌細菌能夠實現相當量的甲萘醌類的生物合成。雖然七異戊烯基轉移酶作為一種關鍵的酶可以將七異戊烯基單元轉移到DHNA，但是這種酶既沒有從基因上識別，也沒有從生物化學角度描述。然而，甲萘醌-7生物合成基因的基因可獲得性對於生產甲萘醌-7的大規模工業方法是必要的。

發明內容
因此，本發明的一個目的是提供一種利用大腸桿菌能夠生產甲萘醌-7的方法。本發明的一個方面是提供一種生產甲萘醌-7的方法，其特徵在於將含有枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的大腸桿菌菌株的細胞在發酵培養基中發酵，同時甲萘醌-7 在發酵的大腸桿菌菌株細胞中累積。優選地，該方法其特徵在於發酵之後，通過發酵培養基的離心以分離出細胞並隨後從所述細胞中提取甲萘醌-7來分離甲萘醌_7，甲萘醌-7的層析提純、濃縮、配製或複合。本發明的另一方面是提供一種利用大腸桿菌進行甲萘醌-7的工業生產的甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於含有枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM1088七異戊烯基轉移酶基因。優選地，該甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於含有同源啟動子或異源啟動子。優選地，該甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於所述異源啟動子是大腸桿菌gapA基因的啟動子或大腸桿菌tufB基因的啟動子，或者是lac、tac、trc、λ、ara或tet啟動子。優選地，該甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於含有操縱子的結構，在所述操縱子結構中枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因受大腸桿菌gapA啟動子的控制。優選地，該甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於所使用的質粒是能夠在大腸桿菌中染色體外複製並含有篩選標記的DNA分子。優選地，該甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於所使用的質粒在大腸桿菌中具有高的細胞拷貝數或在大腸桿菌中具有平均的拷貝數或在大腸桿菌中具有低的拷貝數。本發明的又一方面是提供一種大腸桿菌菌株，包含上述的質粒或枯草芽孢桿菌 DSM 1088hepS基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088hepT基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的多個染色體的拷貝。


圖1示意性地描述了本發明的操縱子構建體。是用於生產甲萘醌-7的操縱子的示意性代表圖。gapAP =大腸桿菌W3110gapA啟動子；RBS =核糖體結合位點；h印S =來自
4DSM1088的h印S基因；h印T =來自DSM1088的h印T基因；HPT =假定的來自DSM1088的七異戊烯基轉移酶基因；(a)、(b)、(c)和(d)=克隆元件。圖2示意性地描述了質粒PKG82，其適於生產甲萘醌_7。
具體實施例方式本發明的一個目的是提供一種利用大腸桿菌能夠生產甲萘醌-7的方法。實現這個目的的方法具有以下特點包含枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的大腸桿菌菌株的細胞在發酵培養基中發酵，同時甲萘醌-7在發酵的大腸桿菌菌株細胞中累積。優選大腸桿菌菌株含有上述三種基因的多個有功能的拷貝。優選它含有上述三種基因的1到700個拷貝。特別優選地，它包含上述三種基因的1到20個拷貝。基因可以在一個或多個質粒上，它們也可以整合到染色體上。因此，本發明還包含一種含有枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌 DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的質粒。這種產品質粒可以使大腸桿菌中的甲萘醌-7有可能工業化生產。三種基因的定義如下優選枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因的特徵在於具有SEQ ID NOl以及這種序列的突變體，這種突變體是由於遺傳密碼的簡併性或編碼具有七異戊烯基合成酶中的HepS 亞基功能的蛋白質。優選枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因的特徵在於具有SEQ ID N02序列以及這種序列的突變體，這種突變體是由於遺傳密碼的簡併性或編碼具有七異戊烯基合成酶中的 H印T亞基功能的蛋白質。特別優選的是所述基因是SEQ ID NO 2序列並且這種序列的變體是由於遺傳密碼的簡併性。優選地，具有七異戊烯基合成酶中的H印S亞單位的功能的蛋白和具有SEQ ID NO 2序列的h印T基因編碼的H印T蛋白一起，如果形成異質二聚體，該異質二聚體具有七異戊烯基合成酶活性，這種七異戊烯基合成酶活性對應至少具有SEQ ID NO 1的基因編碼的 H印S和具有SEQ ID N02的基因編碼的H印T的異質二聚體的七異戊烯基合成酶活性。優選地，具有七異戊烯基中的H印T亞單位功能的蛋白和具有SEQ IDNO 1的h印S 基因編碼的HepS蛋白一起，如果形成異質二聚體，該異質二聚體具有七異戊烯基合成酶活性，這種七異戊烯基合成酶活性對應至少具有SEQ ID NO 2的基因編碼的H印T和具有SEQ ID NO 1的基因編碼的HepS的異質二聚體的七異戊烯基合成酶活性。假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的特徵在於SEQ ID NO 3 以及這種序列的突變體，這種突變體是由於遺傳密碼的簡併性或編碼具有七異戊烯基轉移酶活性的蛋白質。特別優選的是所述基因是SEQ ID NO 3並且由於遺傳密碼的簡併性得到的這種序列的突變體。由於大腸桿菌野生型菌株不產生任何甲萘醌_7，本發明的大腸桿菌中的七異戊烯基合成酶及轉移酶的功能可通過產品，甲萘醌-7間接地表徵。可能用到的檢測方法是在實施例5中描述的HPLC方法。
生產甲萘醌-7優選要求枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因在大腸桿菌中的質粒上表達。這些基因的表達優選是通過同源或異源啟動子獲得的。術語異源涉及由SEQ ID NO USEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3表徵的基因。適合的異源啟動子的實例是大腸桿菌gapA 基因的啟動子或大腸桿菌tufB基因的啟動子。本領域技術人員已知的其它異源啟動子是 lac、tac、trc、lambda ( λ )、ara 禾口 tet 啟動子。優選，枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的表達是通過大腸桿菌gapA基因的啟動子來實現的。因此，本發明中的質粒優選包含上面提到的位於質粒上的啟動子，以使它們指導枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的表達。特別優選的是質粒包含一個操縱子的結構，在該操縱子的結構中枯草芽孢桿菌 DSM 1088hepS基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088hepT基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因受控於大腸桿菌gapA啟動子。這樣一個構建體的實例在圖1中示出了。然而，也可能這些基因天然的(同源)啟動子區用作表達枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的啟動子區。可能使用的併入枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T 基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的質粒可以是任何能夠得到的DNA分子，這些DNA分子能夠很容易地進行遺傳工程改造，在大腸桿菌中進行染色體外複製，並含有一種篩選標記。因此，可以使用例如在大腸桿菌中具有高細胞拷貝數的質粒(如 PUC系列質粒，pQE系列質粒，pBluescript系列質粒)，在大腸桿菌中具有平均拷貝數的質粒(如pBR系列質粒，pACYC系列質粒)或在大腸桿菌中具有低拷貝數的質粒(如PSClOl 或 pBeloBACll)。優先使用的質粒在大腸桿菌中具有平均的拷貝數(如pBR系列的質粒，pACYC系列的質粒)。特別優先使用的是pACYC系列的質粒。將本發明的一種質粒引入到大腸桿菌菌株中以產生甲萘醌_7。例如，通過常用的轉化方法(如電穿孔法或CaCl2法)可以實現。隨後通過抗生素耐藥性選擇攜帶質粒的克隆。本領域技術人員所熟知的篩選標記的實例有賦予氯黴素耐藥性的氯黴素乙醯轉移酶基因，賦予卡那黴素耐藥性的新黴素磷酸轉移酶基因，賦予四環素耐藥性的四環素外排基因，賦予氨苄青黴素和羧苄青黴素耐藥性的內醯胺酶基因。作為用本發明質粒表達的一種可替換方案，枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因也可以整合到大腸桿菌菌株的染色體上，這種整合可以是在現有的甲萘醌類生物合成基因之外的也可以是作為現有的甲萘醌類生物合成基因的替代。優選使用的整合方法是本領域技術人員所熟知的體系，包含溫和的噬菌體、整合型質粒或通過同源重組的整合。因此，本發明還涉及大腸桿菌菌株，該菌株含有本發明的一個質粒或多個(優選每種情況下，1到5個)枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的染色體的拷貝。藉助本發明發酵罐中的大腸桿菌菌株，通過已知的方法可以生產甲萘醌_7。在發酵罐中，大腸桿菌菌株通過連續培養、分批培養、或優選的分批補料培養的方式生長。所使用的碳源優選是糖類、糖醇類或有機酸類。本發明採用的方法中特別優選的是採用葡萄糖、乳糖、蔗糖或甘油作為碳源。優選地，在發酵過程中，碳源的計量供應是保證碳源的含量在發酵罐中保持在 0. lg/L到50g/L的範圍內。特別優選的範圍是在0. lg/L到10g/L的範圍內。優選地，本發明的方法中使用氨、銨鹽或蛋白質水解產物作為氮源。在發酵過程中，如果氨是作為調節劑來控制PH值的話，則可以有規律地持續計量供應這種氮源。加入的其它培養基添加物可以是磷、氯、鈉、鎂、氮、鉀、鈣、鐵等元素的鹽，且是痕量(例如是μ M濃度級)的，也可以是鉬、硼、鈷、錳、鋅、銅和鎳元素的鹽。另外，也可以向培養基中加入有機酸類(如乙酸鹽、檸檬酸鹽)，胺基酸類(如 L-異亮氨酸、D/L-蛋氨酸)和維生素類(如維生素Bi、維生素Β6、維生素Β12)。可以使用的複雜營養源的實例有酵母提取物、玉米漿、大豆粉和麥芽提取物。大腸桿菌的孵化溫度優選是，特別優選的孵化溫度是30_32°C。發酵過程中的發酵培養基的pH值優選範圍是5. 0到8. 5，特別優選pH值是7. 0。大腸桿菌菌株在喜氧的、厭氧的或喜微氧的培養條件下，在1 到150h的一段時間內並在最佳的生長溫度範圍內培養為特定的菌株。特別優選的是4 到的培養時間。發酵優選在喜氧的或喜微氧的生長條件下完成。通過本領域技術人員所熟知的方法可以從培養基中分離出甲萘醌_7，如培養基的離心以從生物質中分離出攜帶有甲萘醌-7的後續提取物的細胞，產品的層析法(色譜法) 提純(純化)、濃縮、配製或複合。通過例如HPLC方法對本方明的方法中生產的甲萘醌-7進行檢測和定量。下面的實施例用以對本發明作進一步說明。實施例1 :pKG82質粒的構建a) h印S基因的擴增根據本領域技術人員公知的通用技術，利用Taq DNA聚合酶(Roche，Mannheim, Germany)，通過聚合酶鏈反應(PCR)可以擴增枯草芽孢桿菌(DSM 1088) h印S基因。所使用的模板是枯草芽孢桿菌菌株DSM 1088的染色體DNA。所使用的引物是M7-操縱子-hepS-正向寡核苷酸(SEQ IDNO 4)和M7-操縱子-h印S-反向寡核苷酸(SEQ ID NO 5)。依據製造商提供的信息，在PCR中獲得的783個鹼基對DNA片段可以用DNA吸收柱 QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Germany)純化。b)h印T基因的擴增依據本領域技術人員所熟知的技術，利用Taq DNA聚合酶(Roche，Mannheim, Germany)，通過聚合酶鏈反應(PCR)可以擴增枯草芽孢桿菌(DSM 1088) h印T基因。所使用
7的模板是枯草芽孢桿菌菌株DSM 1088的染色體DNA。所使用的弓|物是M7-操縱子-hepT-正向寡核苷酸(SEQ IDNO 6)和M7-操縱子-h印T-反向寡核苷酸(SEQ ID NO 7)。依據製造商提供的信息，在PCR中獲得的1075個鹼基對DNA片段可以用QIApr印 Spin Miniprep Kit ^jiagen，Hilden，Germany) DNA 吸收柱純化。c)假定的七異戊烯基轉移酶基因的擴增依據本領域技術人員所熟知的技術，利用Taq DNA聚合酶(Roche，Mannheim, Germany)，通過聚合酶鏈反應(PCR)可以擴增假定的枯草芽孢桿菌(DSM 1088)七異戊烯基轉移酶基因。所使用的模板是枯草芽孢桿菌菌株DSM 1088的染色體的DNA。所使用的引物是M7-操縱子-pHPTG-正向寡核苷酸(SEQ ID NO 8)和M7-操縱子-pHPTG-反向寡核苷酸 (SEQ ID NO 9)。依據製造商提供的信息，在PCR中獲得的966個鹼基對DNA片段可以用QIApr印 Spin Miniprep Kit ^jiagen，Hilden，Germany) DNA 吸收柱純化。d)大腸桿菌gapA啟動子的擴增依據本領域技術人員所熟知的技術，利用Taq DNA聚合酶(Roche，Mannheim, Germany)，通過聚合酶鏈反應(PCR)可以擴增來自大腸桿菌W3110 (ATCC 27325)的gapA啟動子。所使用的模板是大腸桿菌菌株W3110(ATCC 27325)的染色體的DNA。所使用的引物是M7-操縱子-gapA-正向寡核苷酸(SEQ ID NO 10)和M7-操縱子-gapA-反向寡核苷酸 (SEQID NO 11)。依據製造商提供的信息，在PCR中獲得的319個鹼基對DNA片段可以用QIApr印 Spin Miniprep Kit ^jiagen，Hilden，Germany) DNA 吸收柱純化。e)在gapA啟動子的控制下，克隆h印S基因、h印T基因和假定的七異戊烯基轉移酶基因到PACYC184-LH質粒載體中在用T4DNA連接酶連接反應(Roche，Mannheim)之前，可以用以下限制核酸內切酶 (Roche, Mannheim)切斷來自 a)、b)、c)和 d)的 DNA 片段(I)用SacI和ApaI切斷來自a)的片段；(II)用ApaI和BfrI切斷來自b)的片段；(III)用BfrI和BglII切斷來自c)的片段；(IV)用 BglII 禾口 PacI(New England Biolabs,Frankfurt am Main,Germany)切斷來自d)的片段。用限制核酸內切酶SacI (Roche，Mannheim)和 PacI (New EnglandBiolabs, Frankfurt am Main)切斷pACYC184_LH(DSM 10172)的克隆載體，然後在提純(參照圖1) 後的連接反應中，將切斷的片段(I)、(II)、(III)和(IV)連接在一起。通過桑格測序法可以正確確認生成的質粒。完成的甲萘醌-7的生產質粒稱為pKG82(參照圖2)。依據布達佩斯條約，於2009年11月27日將用於生產甲萘醌_7的pKG82質粒以保藏編號DSM 23159進行保藏(德國微生物菌種保藏中心)。實施例2 甲萘醌-7的生產菌株的製備通過CaCl2法可以將實施例1中的pKG82質粒用於大腸桿菌菌株W3110 (ATCC 27325)的轉化。在含有20mg/L四環素的LB瓊脂板上篩選後，將該質粒從一個轉化株上再次分離出來，同時限制核酸內切酶將其切斷並將其檢測出來。這種菌株稱為W3110/pKG82，可用以生產甲萘醌_7。實施例3:用於發酵的甲萘醌-7生產菌株的初次預培養(白天培養(day culture))將20ml含有葡萄糖的LB培養液(10g/L胰蛋白腖，5g/L酵母提取物，5g/L氯化鈉， 15g/L葡萄糖；高壓處理)與鹽酸四環素(tetracycline -HC1)在IOOml無菌錐形瓶中(最終的鹽酸四環素的濃度15mg/L ；鹽酸四環素的儲備液在無菌過濾的50%乙醇中IOmg/ ml)混合。在培養液開始出現輕微的渾濁之前，用接種環將生產菌株細胞從瓊脂板上取出。 預培養在32°C (菌株W3110和菌株W3110/pKG8》和30°C (菌株DSM 1088)分別獨立地進行，同時以150rpm旋轉他。實施例4 用於發酵的甲萘醌-7生產菌株的第二次預培養(過夜培養)第二次預培養(過夜培養)是在2L的發酵罐中藉助於來自貝朗國際生物工程公司(Braun Biotech International,Melsungen, Germany)的Biostat B DCU 裝置進行的。 將來自實施例3的20ml的LB預培養液用於接種980ml的生產培養基，該培養基含有25g/L 葡萄糖、0. 015g/L鹽酸硫胺素、0. 015g/L鹽酸四環素、3g/L(NH4)2S04、0. 25g/L NaCl,0. 9g/L 的 L-異亮氨酸、0. 6g/L 的 D/L-蛋氨酸、30g/L 玉米漿(Roquette，Lestrem，France)、0. 03g/ L 的 CaCl2 · 2Η20、0· 6g/L 的 MgSO4 · 7Η20、0· 15g/L 的 Na2MO4 · 2Η20、2· 5g/L 的 Η3Β03、0· 7g/ L 的 CoCl2 · 6Η20、0· 25g/L 的 CuSO4 · 5Η20、1· 6g/L 的 MnCl2 · 4Η20、0· 3g/L 的 ZnSO4 · 7H20、 0. 15g/L的!^SO4 -7H20Ug/L的二水檸檬酸三鈉和1. 7g/L的KH2P04。以無菌的方法先將培養基組分引入到一個2L的發酵罐中。在17h的培養過程中，溫度恆定保持在32°C (菌株 W3110和W3110/pKG82)或30°C (菌株DSM1088)，通過調節劑(25%氨)使pH值保持恆定在 7.0$$。 Struktol J673(Schill+Seilacher, Hamburg, Germany) ^ /^^ 1 6 稀釋，所得溶液作為消泡劑使用。向培養基以5V0l/V0l/min充入無菌壓縮空氣，攪拌器以 400rpm的速度攪拌。氧飽和度降到50%時，用發酵罐控制單元將轉數提高到1500rpm，以此來維持50%的氧飽和度。在400rpm轉數下用p02探針校準到100%飽和度，這決定了氧飽和度值。一旦發酵罐中的葡萄糖含量降低到大約5g/L時，開始定量供應56% (w/v)的葡萄糖溶液。以6-12ml/h的流速加入葡萄糖，使發酵罐中的葡萄糖的濃度始終保持在0. Ig/ L 至 10g/L 之間。可以用 YSI 7100MBS 分析器(YSLYellow Springs,Ohio,USA)測定葡萄糖。實施例5 甲萘醌-7的發酵生產藉助於貝朗國際生物工程公司(Braun Biotech International, Melsungen, Germany)提供的Biostat B D⑶裝置，在發酵罐中生產得到甲萘醌-7。在主發酵罐中注入100ml經過夜培養(參見實施例4)的培養液。發酵條件與實施例4中的預發酵罐中的條件一樣。發酵時間是96h。正如文獻Suvama et al. (2008, Journal of Bacteriology 180，No. 10，pages 2782-2787)描述的那樣，甲萘醌 _7 被確定。 24h.48h.72h和96小時後取樣。醌類利用Agilent (Boblingen，Germany)的 HPLC HP 1200 進行分析。所使用的分離柱是來自 Phenomenex(Aschaffenburg, Germany)公司的 5μ (IOOmmX4. 6mm)的 Luna C18 (2) RP-HPLC柱。在40°C和0. 7ml/min流速下用異丙醇/乙腈[1 3 (vol/vol)]等度洗脫該樣品。表1描述了由不同菌株得到的甲萘醌-7的產量。表 1
菌株甲萘醌-7 [mg/gBTM]24 h48 h72 h96 h枯草芽孢桿菌DSM 1088 [1]0.070.080.22_[2]大腸桿菌W3110_ P]_ P]_ P]_ P]W3110/pKG820.210.841.191.59BTM =幹的生物質[1]=由於菌株會產生很多的泡沫，培養他後，氣流必須限制到lvol/vol/min，攪拌器的轉數必須限制到400rpm。[2] = 72h後停止發酵[3]=檢測不到。
權利要求
1.一種生產甲萘醌-7的方法，其特徵在於將含有枯草芽孢桿菌DSM1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的大腸桿菌菌株的細胞在發酵培養基中發酵，同時甲萘醌-7在發酵的大腸桿菌菌株細胞中累積。
2.利用大腸桿菌進行甲萘醌-7的工業生產的甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於含有枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因。
3.根據權利要求2所述的甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於含有同源啟動子或異源啟動子。
4.根據權利要求3所述的甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於所述異源啟動子是大腸桿菌 gapA基因的啟動子或大腸桿菌tufB基因的啟動子，或者是lac、tac、trc、λ、ara或tet啟動子。
5.根據權利要求2至4所述的甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於含有操縱子的結構，在所述操縱子結構中枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM1088七異戊烯基轉移酶基因受大腸桿菌gapA啟動子的控制。
6.根據權利要求2至5所述的甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於所使用的質粒是能夠在大腸桿菌中染色體外複製並含有篩選標記的DNA分子。
7.根據權利要求6所述的甲萘醌-7生產質粒，其特徵在於所使用的質粒在大腸桿菌中具有高的細胞拷貝數或在大腸桿菌中具有平均的拷貝數或在大腸桿菌中具有低的拷貝數。
8.一種大腸桿菌菌株，包含根據權利要求2至7所述的質粒或枯草芽孢桿菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088hepT基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶基因的多個染色體的拷貝。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於發酵之後，通過發酵培養基的離心以分離出細胞並隨後從所述細胞中提取甲萘醌-7來分離甲萘醌_7，甲萘醌-7的層析提純、濃縮、 配製或複合。
全文摘要
本發明涉及一種生產甲萘醌-7的方法，其特徵在於大腸桿菌菌株的細胞含有枯草芽孢桿菌DSM 1088 hepS基因、枯草芽孢桿菌DSM 1088hepT基因和假定的枯草芽孢桿菌DSM 1088七異戊烯基轉移酶(heptaprenyl transferase)基因，這些細胞在發酵培養基中發酵，同時甲萘醌-7在發酵的大腸桿菌菌株的細胞中累積。
文檔編號C12N15/70GK102168116SQ20111003640
公開日2011年8月31日 申請日期2011年2月11日 優先權日2010年2月11日
發明者託馬斯·施勒澤爾 申請人:瓦克化學股份公司