產薯蕷皂甙元的枯草芽孢桿菌swb8的製作方法
2023-10-17 23:35:39 3
專利名稱：產薯蕷皂甙元的枯草芽孢桿菌swb8的製作方法
技術領域：
本發明涉及應用微生物技術領域，具體涉及一株能合成分泌薯蕷皂甙元的內生 型的枯草芽孢桿菌 SWB8 {Bacillus subtil is SWB8)。
背景技術：
薯蕷皂甙元(Diosgenin，又名皂素)是薯蕷皂甙的水解產物，主要用作合成甾體 類藥物的原材料，已廣泛應用於化妝、保健、避孕鎮痛、麻醉、降低膽固醇和治療糖尿病等類 藥物。目前，薯蕷皂甙元主要來源於薯蕷屬O^xscorea)、葫蘆巴屬(Jrigonella)和閉鞘姜 屬(Cb1Sto1S)植物。盾葉薯蕷(々ioscorea zingiberensis C. H. Wright)，又名黃姜，系多 年生草質藤本植物，其地下莖含有45 50%澱粉、40 50%纖維素及2 3%薯蕷皂甙元。 在中國黃姜是提取薯蕷皂甙元的主要來源，高峰時種植面積達180萬畝，年產皂素近1000 噸，主要用於出口。國內主要應用強酸水解法等技術從黃姜植物中提取薯蕷皂甙元，但工藝 落後，統計數據顯示，傳統強酸水解法加工鮮黃姜140噸，可生產皂素1噸，產生廢水400 500噸，COD 30000mg/L,B0D 8000mg/L，氨氮300 mg/L和10噸的廢渣(沈康榮等，黃姜開發 與種植技術，湖北科學技術出版社)，對環境造成嚴重的汙染。1993 年，Strobel 等(Science, 1993，260 (5105) 2142216)首次從短葉紅豆 杉植物中分離出一株能合成抗癌物質紫杉醇的內生真菌，證明內生菌具有合成與宿主植 物相同或相似的活性成分的功能。這一發現為解決某些藥用植物生長緩慢、資源緊缺等引 起的藥源匱乏和生態破壞問題提供了新的思路。
發明內容
鑑於薯蕷皂甙元的藥用價值及通過植物提取對環境的汙染影響，本發明申請人開 展了尋求新資源來源的研究，首次成功地從黃姜植物中分離出能產薯蕷皂甙元的微生物。本發明的目的在於提供一株能合成分泌薯蕷皂甙元的枯草芽孢桿菌SWB8 {Bacillus subtil is SWB8)。本發明從黃姜植物地下莖的內部組織中，分離出一株產薯蕷皂甙元的枯草芽孢杆 菌SWBSMaci/^As subtil is SWB8)。該菌株已於2010年10月21日保藏在中國典型培養 物保藏中心，其簡稱CCTCC，保藏編號為CCTCC M 2010271。菌株接種於普通牛肉膏蛋白腖固體培養基，32 °C培養Mh，培養基上出現直徑3 4mm、邊緣粗糙、表面呈網格狀突起的乳白色菌落。顯微鏡觀察，菌體杆狀，單個或成串排列， 大小為1 1.5X3 5丨Uil，革蘭 氏陽性，形成內生孢子。培養48h，菌落扁平、邊緣不規則、黃褐色，呈快速擴散蔓延生長；見 子實體，內充滿卵圓形孢子，大小為0. 5 0. 8X 1 2 I Uii。液體培養形成菌膜、沉澱，泡沫
豐富。菌株需氧或兼性需氧生長，能夠利用硝酸鹽或亞硝酸鹽，生長溫度區間10 50°C，生 長適溫30 ;35°C，pH6. 0 9. 0，可耐受9. 0%NaCl。菌株產薯蕷皂甙元、α -澱粉酶、α -葡萄糖苷酶、α -半乳糖苷酶、β -1，3-1，4-葡聚糖酶和脂肪酶等；可利用D-甘露醇、D-麥芽 糖、D-葡萄糖和支鏈澱粉等，菌株可生長於察氏培養基或高氏1號培養基。16S rDNA核心 序列1542bp (GenBank登錄號HM210636)。根據形態學、生物化學特徵和16S rDNA核心序 列比對結果，SWB8被鑑定為屬於枯草芽孢桿菌類的菌株。本發明獲得的枯草芽孢桿菌SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 的分離、純化和保種方法選取新鮮兩年生黃姜植物地下莖的內部組織，切成薄片貼在含有 黃姜組織乾粉的分離培養基上培養，挑取培養物在純化培養基上純化培養，純化菌株轉接 到不含黃姜乾粉的保種培養基上適應性培養，並進行斜面保種。枯草芽孢桿菌SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 的液體發酵產 物的提取將適量經過活化培養的菌株接種入液體發酵培養基進行發酵，發酵結束後離心 取發酵液的上清液，加入氯仿進行提取，收集有機相部分，減壓濃縮揮發氯仿，再加入少許 氯仿提取殘餘物一次，烘乾得發酵提取物。薄層層析、紅外光譜和質譜等方法檢測枯草芽孢桿菌SWB8(CCTCC M 2010271)、巨 大芽孢桿菌SWB15(由本發明申請人同時分離於黃姜的內生菌)和枯草芽孢桿菌(ATCC6633) 標準菌株的發酵提取物枯草芽孢桿菌SWB8的發酵液氯仿提取物為薯蕷皂甙元，分子式 C27H42O3,分子量414. 1 ；巨大芽孢桿菌SWB15和枯草芽孢桿菌標準菌株不產薯蕷皂甙元。生物活性檢測結果顯示枯草芽孢桿菌SWB8發酵所得薯蕷皂甙元抑制數種臨床 致病菌株(金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏 菌、志賀氏痢疾桿菌)的生長；同時在適當濃度範圍內能夠誘導人肺腺癌細胞(AM9)凋亡， 而對人骨髓間質幹細胞(MSCs)基本上沒有毒性。本發明的優點是，菌株經多次傳代，產薯蕷皂甙元能力穩定，無減弱。本發明與目 前從黃姜植物提取皂素工藝的最大不同在於，避免了強酸和黃姜副產物造成的環境汙染， 不需要黃姜植物作為提取薯蕷皂甙元的來源，釋放了土地，保護了有限的土地資源。本發明 提供的微生物可生產薯蕷皂甙元，具有潛在的工業化應用前景。
圖 1:枯草芽孢桿菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 形態特 徵
(a)32°C，培養24h的SWB8菌株在含有黃姜組織乾粉的純化培養基上的菌落；(b)包裹 成單鏈狀子實體的內生孢子，子實體分散存在；(c)子實體以溶解或斷裂方式釋放內生孢 子；(d)互相粘連的內生孢子(光學顯微鏡拍攝)；(e)成熟的菌體；(f)互相粘連的內生孢 子(掃描電子顯微鏡拍攝)。刻度尺代表(a) Icm ； (b), (c)、(d)、(e)10|Lim和(f) 1 jLUll。圖 2:枯草芽孢桿菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 的系統 進化分析樹
選取17株來自土壤、植物根際和植物內部組織的芽孢桿菌的16S rDNA核心序列進行 比對；依據鄰接法構建進化樹；括弧內為菌株16S rDNA核心序列的序列號。圖 3:枯草芽孢桿菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 所產的 薯蕷皂甙元的薄層層析分析
顯色劑15%磷鉬酸。SWB8 枯草芽孢桿菌SWB8 (CCTCC M 2010271)。ATCC6633 枯草芽孢桿菌標準菌株。Diosgenin 標準薯蕷皂甙元。SWB15 巨大芽孢桿菌SWB15 (由本研究 室同時分離於黃姜的內生菌)。圖 4:枯草芽孢桿菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 所產的 薯蕷皂甙元的質譜(MS)分析
離子源類型ESI。陽離子模式鈉離子。圖 5 枯草芽孢桿菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8)CCTCC M 2010271 所產的薯 蕷皂甙元對A549和MSCs細胞生存能力的影響
A549和MSCs細胞和不同濃度的菌株發酵所得薯蕷皂甙元(2. 54,7. 62,12. 7,17. 78、
22. 86和25. 4 IilI )共同孵育Mh，用MTT法計算細胞的抑制率。圖 6:枯草芽孢桿菌 SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 所產的 薯蕷皂甙元誘導A549和MSCs細胞凋亡和死亡的能力
(a)正常A549細胞；(e)正常MSCs細胞；(b)、(c)和(d)為分別經2. M、7.62和
12.7 JlS Hli薯蕷皂甙元誘導的A549細胞；(f)、(g)和(h)為分別經2. 54、7. 62和 12. 7 μ2 Illl薯蕷皂甙元誘導的MSCs細胞。應用Annexin V -FITC/PI試劑盒檢測。坐標 圖右上區代表死亡細胞數，右下區代表凋亡細胞數。
具體實施例方式實施例一.枯草芽孢桿菌SWB8 (.Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 的 分離和鑑定
1.菌株的分離與純化
(1)分離。培養基0. 3%牛肉膏；1%蛋白腖；0. 5%NaCl ；2%瓊脂；1%黃姜乾粉(黃姜去褐 色皮後乾燥粉碎成粉末狀)；蒸餾水；PH7.0。選取新鮮兩年生黃姜植物的地下莖，洗淨，95% 酒精燒灼，無菌條件下削去褐色皮，70%酒精浸泡lOmin，無菌蒸餾水洗淨，再削去2 3mm 厚的外層組織，內部組織被切成2 3mm厚的薄片貼在培養基上，32°C，恆溫培養。(2 )純化。牛肉膏蛋白腖培養基0. 3%牛肉膏；1%蛋白腖；0. 5%NaCl ； 2%瓊脂；1% 黃姜乾粉；蒸餾水；PH7. 0。察氏(Czapek)改良培養基0. 2%NaN03或NaNO2 ；0. 1%K2HP04 ； 0. 05%KC1 ；0. 05%MgS04 ；0. 001%FeS04 ；2%蔗糖；洲瓊脂；1%黃姜乾粉；蒸餾水；pH7. 0。高氏 (Gause) 1 號改良培養基0. 1%KN03 ；0. 05%K2HP04 ；0. 05%NaCl ；0. 05%MgS04 ；0. 001%FeS04 ； 洲可溶性澱粉；洲瓊脂；1%黃姜乾粉；蒸餾水；PH7. 0。挑取培養物，用生理鹽水稀釋，在上 述三種培養基上劃線接種菌株，320C，恆溫培養。(3)保種。培養基0. 3%牛肉膏；1%蛋白腖；0. 5%NaCI ；2%瓊脂；蒸餾水；pH7. 0。2.菌株的形態學和生物化學特徵
(1)將菌株接種於純化培養基培養，連續7 記錄菌落、菌體形態和結構特徵。菌 株形態結構特徵見圖1所示培養24h後，培養基上出現直徑3 4 mm、邊緣粗糙、表面呈 網格狀突起的乳白色菌落；顯微鏡觀察，菌體杆狀，單個或成串排列，大小為1 1. 5X3
5 μιη,革蘭氏陽性，形成內生孢子；培養4 後，菌落扁平、邊緣不規則、黃褐色，呈快速擴 散蔓延生長，見單鏈狀充滿卵圓形孢子的子實體，內生孢子大小為0. 5 0. 8X 1 2 MiIi。液體培養易形成菌膜、沉澱，菌液淡黃色，泡沫豐富。菌株需氧或兼性需氧生長，能夠利用 硝酸鹽或亞硝酸鹽，生長溫度區間10 50°C，生長適溫30 35°C，pH6. 0 9. 0，可耐受 9.0%NaCI。菌株可生長於察氏培養基或高氏1號培養基。 (2)應用法國生物梅裡埃公司的VITEK 2 GP卡檢測菌株的生物化學特性(見表1)
表 1.枯草芽孢桿菌 SWB8 {Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271 的生化反應
結果
權利要求
1.一株可產薯蕷皂甙元的枯草芽孢桿菌SWB8 {Bacillus subtil is SWB8)，其特徵在 於，保藏號CCTCC M 2010271,2010年10月21日在中國典型培養物保藏中心保藏。
2.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌SWB8{Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271，其特徵在於，分離自一種藥用植物盾葉薯蕷OVo1Scorea zingiberensis C. H. Wright，又名黃姜)的地下莖內部組織。
3.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌SWB8{Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271， 其特徵在於菌體1 1.5X3 5Jim,呈杆狀，形成單鏈狀充滿卵圓形孢子的子實體，破潰或斷裂方式釋放相互粘連的內生孢子，菌落粗糙、網格狀突起，液體發酵形成菌膜、沉澱、泡沫豐富，需氧或兼性需氧生長，能 夠利用硝酸鹽或亞硝酸鹽和支鏈澱粉等，生長溫度區間10 50°C，生長適溫30 35°C， pH6. 0 9. 0，可耐受 9. 0%NaCl，16S rDNA 1542bp, Genbank 序列號 HM210636。
4.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌SWB8{Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271發酵液中薯蕷皂甙元的提取方法是菌株發酵培養48 60h後，發酵液4 200C，4000 6000 r/min,離心4 5min，吸取上清液，在上清液中加入體積的氯仿進 行提取。
5.搖動5 lOmin，靜置20 40min，移出有機相部分，同樣方法再用氯仿提取水相部 分一次。
6.合併有機相，在旋轉蒸發儀中40 45°C揮發乾氯仿。
7.在40 45°C乾燥箱中烘乾殘餘物，再加入少許氯仿提取一次，烘乾即獲得薯蕷皂甙兀。
8.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌SWB8{Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271產的薯蕷皂甙元在抑制病原菌中的應用。
9.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌SWB8{Bacillus subtil is SWB8) CCTCC M 2010271產的薯蕷皂甙元在抗腫瘤細胞中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株可產薯蕷皂甙元的枯草芽孢桿菌SWB8(Bacillus subtilis SWB8)，屬於應用微生物技術領域。該菌株分離於藥用植物盾葉薯蕷地下莖的內部組織，能合成分泌宿主植物的代謝產物薯蕷皂甙元，保藏號CCTCC NO:M2010271，菌體杆狀，大小為1～1.5×3～5μm，形成單鏈狀的子實體，內生孢子，菌落粗糙、網格狀突起，液體發酵形成菌膜，泡沫豐富，可利用支鏈澱粉，生長適溫30～35℃，pH6.0～9.0，可耐受9.0%NaCl，16SrDNA核心序列1542bp，序列號HM210636。該菌株液體普通培養基發酵48～60h後，發酵液的氯仿提取物即為薯蕷皂甙元，具有抑制病原菌和抗腫瘤細胞的活性。本發明提供的菌株可產薯蕷皂甙元，與目前從黃姜植物中提取工藝相比，避免了強酸和黃姜副產物對環境的汙染，具有潛在的工業化應用前景。
文檔編號A61K31/58GK102061280SQ201010564169
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月29日 優先權日2010年11月29日
發明者萬永繼, 馮偉, 周圍, 張冉, 汪靜傑, 王曉強, 金志雄, 高紅 申請人:西南大學