短小芽孢桿菌在對蝦養殖中的應用的製作方法
2023-10-05 10:08:39
短小芽孢桿菌在對蝦養殖中的應用的製作方法
【專利摘要】短小芽孢桿菌在對蝦養殖中的應用，涉及水產養殖。所述短小芽孢桿菌為Bacillus?pumilus1A05490和Bacillus?pumilus1A08151，分離自中國黃海表層沉積物和印度洋深海沉積物，可在製備短小芽孢桿菌製劑等中應用，所述短小芽孢桿菌製劑包括致病性弧菌抑菌製劑、對蝦生長促進劑、對蝦飼料添加劑、對蝦養殖水質改良劑等中的一種。所製得的短小芽孢桿菌製劑包含的活菌數不低於1×109CFU/mL，最高可達到1×1010CFU/mL以上。所述短小芽孢桿菌製劑按對蝦飼料重量的0.5%～5%添加，所述短小芽孢桿菌製劑在養殖水體中的接種濃度可為103～104cfu/mL。
【專利說明】短小芽孢桿菌在對蝦養殖中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及水產養殖，尤其是涉及一種短小芽孢桿菌在對蝦養殖中的應用。
【背景技術】 [0002]集約化、高密度水產養殖的迅猛發展,使養殖生態環境遭到嚴重破壞,水產養殖病害越來越複雜，發病率越來越高，危害越來越嚴重，抗生素飼料添加劑的使用量日益增加。2010年，全國水產養殖面積764萬公頃，其中有24萬公頃遭受病害，產量損失近30萬噸。在95%養殖面積中，為了防止疾病發生，生產中盲目、大規模地投放各類抗生素，如氯黴素、土黴素、呋喃唑酮等。氯黴素直接加入水中，土黴素拌飼料投餵或直接潑灑養殖水體。2000年抗生素用量約為16200噸，約70%用於畜牧業和水產養殖業。由於藥物濫用、藥物殘留和細菌耐藥性等問題日趨嚴重，引發了人們對食品和環境安全的關注。尋找一種新型、安全、綠色的抗生素替代品成為當前水產研究的熱點之一，其中益生菌因其具有抑菌、促生長、提高免疫等作用日益受到重視。微生態製劑是通過「以菌治菌」達到防治水產養殖動物病害的目地。一方面，通過有益微生物產生代謝產物和生理活性物質來抑制或者殺滅病原菌，同時在養殖水體和養殖動物腸道中與病原菌競爭營養，佔據生態位，形成優勢菌群，達到防治病害的目的。另一方面，有益微生物通過產生多種消化酶，幫助蛋白質、碳水化合物、脂肪的代謝，提高飼料的利用率和轉化率，達到減少資源消耗和增產的目的。
[0003]中國專利CN101773672A公開一種防治對蝦白斑病的口服生物製劑，該製劑的組分和重量含量為:1%~10%表達VP28的重組枯草芽孢桿菌和5%~50%殼聚糖，其餘為作為載體的玉米澱粉。該製劑使用安全，且能有效防治對蝦白斑綜合症。中國專利CN102309527A公開一種防治南美白對蝦死底症的藥物，按重量％由以下成分混合製備而成:枯草芽孢桿菌粉20%~30%，反硝化菌粉10~20%，納豆芽孢桿菌粉10%~20%，乳酸菌粉1%~5%，沸石粉10%~20%，澱粉5%~49%。製備步驟如下:按重量％稱取下述各成分:枯草芽孢桿菌粉20%~30%，反硝化菌粉10%~20%，納豆芽孢桿菌粉10%~20%，乳酸菌粉1%~5%，沸石粉10%~20%，澱粉5%~49% ;然後進行混合，攪拌均勻，過20~80目篩，分裝，500g/袋。中國專利CN102586144A公開一種短小芽孢桿菌、益生菌製劑及其製備方法和應用。該短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149於2011年11月23日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號:CCTCC NO:M2011411o該發明的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149具有強的胞外蛋白酶、脂肪酶、澱粉酶活性，對弧菌具有廣泛的抑制性，且不具有溶血活性。以此菌作為發酵菌株，經固態發酵、乾燥粉碎製得以短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149作為活性成分的短小芽孢桿菌益生菌製劑，將其添加到對蝦飼料中，飼餵對蝦。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種短小芽孢桿菌。
[0005]本發明的另一目的在於提供一種短小芽孢桿菌在對蝦養殖中的應用。[0006]所述短小芽抱桿菌為Bacillus pumiluslA05490 和 Bacillus pumiluslA08151,保藏單位:中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址:中國，武漢，武漢大學；保藏日期:2013 年 06 月 25 日；保藏編號分別為:CCTCC NO:M2013288 和 CCTCC NO:M2013291。
[0007]短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) 1A05490CCTCC NO:M2013288，是從中國黃海表層沉積物分離獲得；短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) 1A08151CCTCC NO:M2013291，是從印度洋深海沉積物分離獲得。
[0008]短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) 1A05490CCTCC NO:M2013288 和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) 1A08151CCTCC NO:M2013291 具有下述特徵:
[0009]1、形態特徵:短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) 1A05490CCTCC NO:M2013288 和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) 1A08151CCTCC NO:M2013291 為杆狀，大小為(1.5 ~
1.7) UmX (2.5~3.0) iim，革蘭氏陽性，能運動，有側生鞭毛，產芽孢。在2216E固體培養基上28°C培養48h，菌落呈灰白色、表面乾燥、扁平、邊緣規則、不凸起、不透明，菌落直徑大小約為2~3mm。
[0010]2、生理生化特徵:菌株生長鹽度範圍為0~15%，18%以上不生長，最適範圍為0~9% ;生長pH範圍為5~12，最適範圍為6~8。氧化酶( + )，接觸酶( + )，硝酸鹽還原(_)，吲哚試驗(-)，不能發酵D-葡萄糖產酸，明膠液化( + )，尿素酶(-)，(6-葡萄糖苷酶( + )，(6-半乳糖苷酶( + )，能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-甘露醇、N-乙醯-葡萄糖胺、蘋果酸、檸檬酸，不能利用麥芽糖、癸酸、己二酸、苯乙酸。
[0011]API ZYM結果顯示，菌株1A05490和1A08151具有鹼性磷酸酶、酯酶、類脂酯酶、a-胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、3 -葡(萄)糖苷酶，不具有脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、纈氨酸氨肽酶、胰蛋白酶、a -半乳糖苷酶、0 -半乳糖苷酶、P -葡(萄)糖苷酸酶、a -葡(萄)糖苷酶、N-乙醯-葡萄糖胺酶、`a-甘露糖苷酶、a-巖藻糖苷酶等酶活性。
[0012]3、多基因序列分析:按照常規方法抽提短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) 1A05490 和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) 1A08151 的基因組 DNA，並對 16SrRNA、gyrB、aroE和pyrE基因序列進行測定,其中短小芽抱桿菌1A05490的16S rDNA和pyrE基因序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示；短小芽孢桿菌1A08151的16S rDNA和pyrE基因序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0013]經BLAST比對分析，短小芽孢桿菌1A05490和短小芽孢桿菌1A08151與Bacillus pumilus ATCC7061(T)的 16S rDNA 序列同源性分別為 99.67% 和 100%，與 B.altitudini41KF2b(T)的 16S rDNA 序列同源性分別為 99.93% 和 99.6%，與B.safensisF0-036b (T)的 16S rDNA 序列同源性分別為 99.54%和 99.87%。16S rDNA,gyrB,aroE 和 pyrE 四個基因的 MLSA (multilocus sequence analysis)分析結果表明，1A05490與 B.pumilus ATCC7061 (T)、B.altitudini41KF2b (T)和 B.safensisF0-036b (T)三株模式種的同源性分別為97.44%,93.06%和94.37% ；1A08151與上述三株模式種的同源性分別為97.55%、92.93% 和 94.53%。
[0014]綜合菌株的形態特徵、生理生化特性以及16S rDNA、gyrB、aroE和pyrE基因的MLSA序列分析結果，本發明的菌株1A05490和1A08151鑑定為短小芽孢桿菌，具體為短小芽孢桿菌 1A05490 (CCTCC NO:M2013288)和短小芽孢桿菌 1A08151 (CCTCC NO:M2013291 )。
[0015]所述短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus) 1A05490和短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus) 1A08151能產生酯酶、蛋白酶和纖維素酶等，且具有較強的活性，對致病性弧菌有顯著的抑菌效果，對對蝦生長有明顯的促進作用，因此短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) 1A05490和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) 1A08151可在製備短小芽孢桿菌製劑等中應用，短小芽孢桿菌製劑包括致病性弧菌抑菌製劑、對蝦生長促進劑、對蝦飼料添加劑、對蝦養殖水質改良劑等中的一種。
[0016]所述短小芽孢桿菌製劑的製備方法的具體步驟為:將短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)lA05490和短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus) 1A08151按斜面、液體種子、液體發酵的順序培養，斜面和種子培養基為常規的營養瓊脂培養基或肉湯培養基；發酵培養基配方(W/V):豆餅粉 3%，澱粉 1.5%，玉米漿 1%，葡萄糖 0.5%，(NH4) 2S041%, NH4Cl0.1%, KH2PO40.05%, NaH2PO40.5%, MgSO40.05%, MnSO40.05%。
[0017]所製得的短小芽孢桿菌製劑包含的活菌數不低於lX109CFU/mL，最高可達到I X 1010CFU/mL以上。所述短小芽孢桿菌製劑按對蝦飼料重量的0.5%~5%添加，所述短小芽孢桿菌製劑在養殖水體中的接種濃度可為IO3~104cfu/mL。 [0018]本發明的短小芽孢桿菌1A05490和1A08151對哈維氏弧菌SF1、坎貝氏弧菌VH1、鰻弧菌Wl、副溶血弧菌1937、歐文氏弧菌VH2、需鈉弧菌FS-1等對蝦致病性弧菌具有廣泛的抑制性。1A05490和1A08151發酵上清液用乙酸乙酯萃取，蒸發濃縮後，對粗提物進行薄層層析(TLC)檢測，產物經茚三酮顯色劑顯色後呈紫紅色，初步判定菌株產生的是脂肽類活性物質，該活性物質對致病性弧菌具有強的抑制性。
[0019]以短小芽孢桿菌1A05490或1A08151發酵液作為活菌製劑，潑灑到養殖水體/添加到飼料中飼餵對蝦，可以起到抑制養殖水體中病原弧菌的繁殖，提高對蝦消化道酶活，促進對蝦生長，提高對蝦抗病力，減少對蝦病害發生，特別是對於對蝦弧菌病害的防治和對蝦產量的增加具有很好的效果。
[0020]本發明的短小芽孢桿菌1A05490和短小芽孢桿菌1A08151在提高對蝦抗病力、促進對蝦生長方面有顯著效果。在用致病性坎貝氏弧菌VHl浸浴感染對蝦的實驗中發現，添加短小芽孢桿菌1A05490和1A08151的實驗組對蝦存活率顯著高於對照組，分別提高了35%和30%。將短小芽孢桿菌1A05490和1A08151進行液體發酵，以107cfu/g (每克飼料的活菌含量)的濃度添加至飼料中投餵南美白對蝦，同時以IO5CfuAiL (每毫升海水的活菌含量)的濃度潑灑至養殖水體中，結果發現，經過30天的飼養，投餵添加了短小芽孢桿菌益生菌1A05490和1A08151的飼料的實驗組與不添加益生菌的對照組相比，對蝦平均體重增長率分別提高了 33.3%和25.4%，益生菌1A05490和1A08151實驗組的對蝦腸道胰蛋白酶和澱粉酶均顯著高於對照組(P〈0.05)。弧菌含量動態監測結果表明，1A05490和1A08151實驗組的養殖海水中弧菌含量低於對照組；菌株1A05490和1A08151均能在養殖海水和對蝦腸道中存活，養殖海水中檢測到的活菌含量在IO4CfuAiL以上，對蝦腸道中芽孢桿菌含量在104cfu/g以上。現場實驗結果表明，短小芽孢桿菌1A05490和1A08151能將養殖水體亞硝酸鹽和弧菌含量控制在較低水平。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為短小芽孢桿菌1A05490的酶活性檢測圖。1、蛋白酶；2、酯酶；3、纖維素酶。
[0022]圖2為短小芽孢桿菌1A05490和1A08151抑菌活性檢測圖。1、菌株1A05490 ;2、菌株1A08151 (指示菌為坎貝氏弧菌VHl )。
[0023]圖3為短小芽孢桿菌1A05490和1A08151的16S rDNA、gyrB、aroE和pyrE基因的MLSA分析。
[0024]圖4為短小芽孢桿菌1A05490和1A08151發酵上清液對坎貝氏弧菌VHl生長的抑制。在圖4中，標記?為對照:VH1，為處理:VH1+1A08151，▲為處理:VH1+1A05490。
[0025]圖5為短小芽孢桿菌1A05490和1A08151抑菌活性物質TLC初步分析。
[0026]圖6為實驗室條件下養殖水體中弧菌含量的動態監測。在圖6中，標記?實驗組:1A05490, 為實驗組:1A08151，▲為對照組。
[0027]圖7:現場實驗中水體亞硝酸鹽含量的動態監測。在圖7中，標記? 1A05490，為1A08151，▲為對照組。
[0028]圖8:現場實驗中水體弧菌含量的動態監測。在圖8中，標記? 1A05490，為1A08151，▲為對照組。
【具體實施方式】
[0029]下面結合附圖對本發明作進一步的說明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下述的實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
[0030]實施例1短小芽孢桿菌的篩選和鑑定
[0031]1、酶活篩選:從中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)選取299株芽孢桿菌，進行蛋白酶活性、澱粉酶活性、脂肪酶活性和纖維素酶活性檢測。結果發現，具有蛋白酶、澱粉酶、油脂酶活性和纖維素酶活性的菌株分別有147株、130株、38株和58株。
[0032]2、抑菌活性篩選:採用瓊脂平板擴散法對上述獲得的具有較高產酶活性的芽孢桿菌進行抑菌活性篩選。所用培養基為海水216L培養基，指示菌為致病性哈維氏弧菌SFl和坎貝氏弧菌VHl。指示菌和受試菌分別在216L培養基中過夜培養，取適量指示菌用無菌生理鹽水稀釋至107cfu/ml，吸取IOOii L塗布216L平板，在平板上打孔，在孔中加入受試菌發酵液50ul，30°C培養24小時，觀察結果，對抑菌圈進行測量。結果表明，299株細菌中有47株對哈維氏弧菌SFl有一定的抑制作用，有26株能抑制坎貝氏弧菌VHl。其中，5株芽孢桿菌對兩株弧菌均有較強的抑制作用。進一步對這5株芽孢桿菌的抑菌譜進行測定，結果發現5株菌對不同病原菌均有不同程度的抑制作用。產酶和抑菌結果分別如表1和表2所示。
[0033]表15株短小芽孢桿菌的產酶活性
[0034]
【權利要求】
1.短小芽抱桿菌，其特徵在於為BacilluspumiluslA05490和BacilluspumiluslA08151，保藏單位:中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏日期:2013年06月25日；保藏編號分別為:CCTCC NO:M2013288 和 CCTCC NO:M2013291。
2.如權利要求1所述短小芽孢桿菌在製備短小芽孢桿菌製劑中應用，所述短小芽孢桿菌為 Bacillus pumiluslA05490 和 Bacillus pumiluslA08151。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述短小芽孢桿菌製劑包括致病性弧菌抑菌製劑、對蝦生長促進劑、對蝦飼料添加劑、對蝦養殖水質改良劑中的一種。
【文檔編號】C12R1/07GK103602608SQ201310333935
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年8月2日 優先權日:2013年8月2日
【發明者】邵宗澤, 王麗萍, 單大鵬, 黃兆斌 申請人:國家海洋局第三海洋研究所