產紫杉醇亮白麴黴菌及用其製備紫杉醇的方法

2023-10-29 19:58:27 1

專利名稱：產紫杉醇亮白麴黴菌及用其製備紫杉醇的方法
技術領域：
本發明屬於微生物生物技術、生物製藥領域，具體涉及產紫杉醇亮白
麴黴(^perg/〃w owcfe/ws)及一株產紫杉醇亮白麴黴HUST-RBB3菌株， 以及用其製備抗癌藥物紫杉醇的方法。
背景技術：
分離自紅豆杉樹皮的紫杉醇是目前國際上公認的重要抗腫瘤藥物，但 由於紅豆杉資源的短缺，導致紫杉醇藥源緊張。微生物發酵法生產紫杉醇 是解決紫杉醇藥源問題的最有效途徑之一。微生物發酵生產紫杉醇具有易 培養、易控制、生產成本低，可通過優化發酵條件等手段大幅度提高紫杉 醇產量等優點，其大規模工業化生產比較容易實現，應用前景廣闊。
自1993年Stierle等首次報導了從太平洋紅豆杉樹中分離到一種可產紫 杉醇的內生真菌以來，國內外己有30多種可產紫杉醇的真菌報導。但是，
目前發現的產紫杉醇真菌的紫杉醇產量都比較低，首次發現的安德魯紫杉 菌(roxo附j;c^ a"Aea"ae)的紫杉醇產率只有24 50 ng/L(Stierle et al.， 1993, &/ewCe， 260: 214-216)。因此，需要提供新的紫杉醇產量高的菌株。

發明內容
本發明的目的在於提供一種產紫杉醇的亮白麴黴及用其製備紫杉醇的 方法，該菌種的發明為通過微生物發酵法生產紫杉醇提供了新的菌株。
本發明提供的新的紫杉醇產生菌亮白麴黴HUST-RBB3已於2008年11月10日保藏於中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)，該菌種保藏號為CCTCC No. M208209,分類命名為 亮白麴黴"s/ ergz7/ws cam/z'c/ws)。
本發明的亮白麴黴HUST-RBB3菌株具有以下特徵在25 28。C溫度 下，在PDA (potato dextrose agar medium)平板上生長，兩星期後菌落直徑 大約1cm,在CYA (Czapek yeast autolysate agar medium)平板上在可以達 到4 5cm，而在37。C不能生長；菌落為白色，有光澤，菌落背面為淺黃 色；菌絲直徑約為5 8 Kim，分枝、有隔；分生孢子大小為2.5 3.5 ^m、 白色、表面光滑、水珠型；具有特徵性的孢子頭結構，直徑約為20 50拜， 白色，球形；分生孢子梗約600 900 nm，頂囊球形或近球形，小梗雙層， 在頂囊頭部著生。詳細的形態學特徵和生理生化特徵見圖1和表1。
上述亮白麴黴HUST-RBB3發酵產紫杉醇可在18 32°C、 pH4.0 8.0、 需氧條件下進行。該菌株產生的紫杉醇，主要儲藏於細胞中， 一部分分泌 於細胞外的培養基中。本發明提供的由發酵製造紫杉醇的方法，其特徵在 於:在培養基中培養亮白麴黴HUST-RBB3菌株以在其細胞內和培養基中聚 集紫杉醇後，從其細胞內和培養基中提取紫杉醇。
在溫度為25°C、 180 rpm振蕩培養的條件下，野生亮白麴黴HUST-RBB3 菌株在300ml 土豆葡萄糖液體培養基中發酵10天，可以得到大約120pg/L 的紫杉醇，是首次發現的產紫杉醇真菌安德魯紫杉菌(roxom^w ""Am"m) 的紫杉醇產量(24 50ng/L)的2 5倍，是目前己報導在未優化培養條件 下的紫杉醇產量較高的野生菌株。上述土豆葡萄糖液體培養基按下述配比 和條件製備馬鈴薯300 g，葡萄糖30 g，馬鈴薯去皮，切成塊後用800 ml 蒸餾水煮沸半小時，然後用紗布過濾，再加葡萄糖，溶化後補蒸餾水至1 L， 自然pH值，121 °C，滅菌15分鐘後使用。
亮白麴黴HUST-RBB3菌株所產紫杉醇已經被本發明人證實，其結構和 天然紅豆杉植物中分離、純化得到的紫杉醇標準品完全一致。


圖1為亮白麴黴HUST-RBB3的形態觀察圖，其中，(A)為CYA平板 上的菌落，(B)為分生孢子頭(光學顯微鏡鏡)，(C)為分生孢子(電鏡)。
具體實施例方式
使用本發明提供的亮白麴黴HUST- RBB3菌株進行發酵培養可以製備 紫杉醇，其發酵製備紫杉醇的優化方案為
(1)將亮白麴黴HUST-RBB3菌株接種在PDA培養基平板上，25°C 30。C靜置培養10 15天後，加入滅菌的蒸餾水，通過玻璃棉過濾器過濾收 集孢子，用無菌生理鹽水洗滌3 5次，然後用無菌生理鹽水稀釋至106 1S個孢子/ml的數目。
(2) 按每300 500 ml液體發酵培養基接種1 5 mi亮白麴黴 HUST-RBB3菌株的孢子懸液，將亮白麴黴HUST-RBB3菌株接種到液體發酵 培養基中，發酵培養是在需氧條件下、18 32°C、 pH4.0 8.0下進行的，發 酵培養10 15天後，分別收集菌絲體和發酵液；
(3) 菌絲體在45。C 50。C條件下烘乾，然後研磨粉碎，過200目篩子 收集細粉，每l.O g細粉用6 ml甲醇/氯仿抽提3 5次，合併所有抽提液，甲 醇/氯仿的體積比為l: 0 1: 1;
(4) 發酵液用氯仿振蕩抽提3 5次，發酵液與氯仿的體積比為l: l 3: 1，合併所有抽提液；
(5) 將(3)和(4)中得到的抽提液分別在45°C 50°C條件下減壓 蒸餾回收溶劑，並將蒸餾回收溶劑後的殘餘物質溶解在適量的100 %甲醇 中，即獲得紫杉醇粗提溶液。
上述發酵條件的進一步優化條件為在初始pH為6.0的300 ml液體發 酵培養基中接種1 ml濃度為1S個孢子/ml的亮白麴黴HUST-RBB3菌株的 孢子懸液，200rpm， 30.(TC條件下恆溫發酵培養13天。在該優化的發酵條件下，亮白麴黴HUST-RBB3菌株可生產497.3 pg/L的紫杉醇。
上述液體發酵培養基按下述配比和條件製備葡萄糖80 g，酵母粉10 g，蛋白腖5g， KH2P042g， MgS04-7H20 1 g，苯甲酸鈉10 mg，苯丙氨 酸25mg，絲氨酸15mg,甘氨酸20mg，水楊酸15mg，加入適量蒸餾水 溶化後，用蒸餾水定容至l L，調節pH至6.0， 121°C，滅菌15分鐘後使 用。
紫杉醇粗提溶液依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江，等。2002,林產化 學與工業，22: 45-48)進行純化後可直接用於高相液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分析。對於HPLC，色譜柱為 C18反向柱(5x300 mm， Waters)，流動相為甲醇H20 (68:32， v/v)，流 速為1.0 ml/min，紫外波長設定為227 nm。通過對比紫杉醇標準品的吸收 峰停留時間、峰面積和亮白麴黴HUST-RBB3菌株發酵後分離純化獲得的紫 杉醇的吸收峰停留時間、峰面積，可計算其紫杉醇的濃度。
通過藉助以下實施例將更加詳細說明本發明，且以下實施例僅是說明 性的，本發明並不受這些實施例的限制。 [實施例1]
採集華中科技大學校園苗圃種植的曼地亞紅豆杉樹皮組織，用無菌小 刀切成( 0.5x0.5xQ.5cm)小塊，用70% (v/v)酒精進行表面消毒3 min， 用滅菌的ddH20漂洗3次，然後用無菌小刀剝取內表皮並均勻放置在含有 50嗎/mL的氨苄青黴素的PDA培養基平板上，在25。C 28。C的培養箱中 靜置培養，根據真菌生長情況，採用菌絲頂端分離純化法將形態不同的真 菌分離到新的PDA培養基平板上。分離後的真菌在25。C 28。C培養傳代 並檢測純度，直至獲得單克隆。最後，每個真菌的單克隆再次通過菌絲頂 端分離法將真菌接種到新的PDA斜面進行保藏，並收集相應真菌的孢子制 備孢子懸液，加入終濃度為15% (v/v)的甘油在-70。C進行低溫保藏。亮 白麴黴HUST-RBB3是依據實施例1從曼地亞紅豆杉內表皮中自行分離到的一株產紫杉醇內生真菌。
上述PDA培養基按下述配比和條件製備馬鈴薯300 g，葡萄糖30 g， 瓊脂20 g，馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然後用紗布過濾，再加葡萄 糖和瓊脂，溶化後補足水至1L,自然pH值，121°C，滅菌15分鐘後使用。
用接種針將保藏於PDA斜面的亮白麴黴HUST-RBB3挑取少許，接種 到300ml土豆葡萄糖液體培養基中(1L三角燒瓶)，在25。C、 180rpm條 件下培養10天。將發酵液在4'C、 12000 rpm條件下，離心10 min，分別 收集菌絲體和發酵液依據上述優化方案中的步驟(3) (5),製備獲得2ml溶 解在100%甲醇中的紫杉醇粗提液。依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江,等. 2002,林產化學與工業，22: 45-48)進行純化後，獲得溶解在1 ml 100%甲醇 中的紫杉醇溶液。取10 ^用於HPLC分析，儀器為Agilent 1200 HPLC System,色譜柱為C18反向柱(5x300 mm， Waters)，流動相為甲醇H20 (68:32, v/v)，流速為1.0 ml/min，紫外波長設定為227 nm，柱溫為25°C。 通過HPLC法計算其紫杉醇的濃度發現，亮白麴黴HUST-RBB3菌株在該 條件下，可以生產約120 ^g/L的紫杉醇。
取實施例2中所得亮白麴黴HUST-RBB3菌株發酵後分離純化的紫杉醇 10 ^進行質譜分析(由華中科技大學分析測試中心完成)。質譜儀為 Agilent 1100 LC/MSD Trap, 採用電噴霧質譜(electrospray mass spectrometry)技術，噴射電壓(a spray voltage ) : 2.2 kV;柱型C18分 離柱(5x300 mm， Waters);進樣量10 pi;檢測波長227 nm;流動相為 甲醇H20 (68:32， v/v);流速lml/min，以標準品紫杉醇做對照。結果 表明，亮白麴黴HUST-RBB3菌株所產紫杉醇和天然紅豆杉植物中分離的紫杉醇標準品具有一樣的分子量。
取實施例2中所得亮白麴黴HUST-RBB3菌株發酵後分離純化的紫杉醇 500 ^，減壓蒸餾回收溶劑後，將蒸餾後的殘餘物質重新溶解在100%的氘 /(戈甲醇中，進《亍核磁共振i普(Nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) 分析(由華中科技大學分析測試中心完成)，儀器為Bruker 400 MHz instrument,結果表明，亮白麴黴HUST-RBB3菌株所產紫杉醇和天然紅豆杉 植物中分離純化得到的紫杉醇標準品的&、 UC-NMR譜完全一致，即二者 具有一樣立體化學結構。
在PDA培養基平板上，25'C靜置培養亮白麴黴HUST-RBB3菌株10 天后，加入滅菌的蒸餾水，通過玻璃棉過濾器過濾收集孢子，用無菌生理 鹽水洗滌3 5次，然後用無菌生理鹽水稀釋獲得濃度為10S個孢子/ml的亮 白麴黴HUST-RBB3菌株的孢子懸液。
配製以下初始發酵培養基各300ml，每升初始液體發酵培養基(I)中 各組分的質量分別為葡萄糖80 g，酵母粉10 g，蛋白腖5g， KH2P042g， MgS(V7H20 1 g， pH自然；每升初始液體發酵培養基(II)中各組分的質 量分別為葡萄糖90g，酵母粉10g，蛋白腖5 g， KH2P04 4 g， MgS04'7H20 2g， pH自然；每升初始液體發酵培養基(III)中各組分的質量分別為葡 萄糖100 g，酵母粉15 g，蛋白腖lg， KH2P045g， MgS04'7H20 3 g， pH 自然；每升初始液體發酵培養基(IV)中各組分的質量分別為葡萄糖100 g，酵母粉10 g，蛋白腖3g, KH2P043g， MgSCV7H20 3 g， pH自然。各 接入lml亮白麴黴HUST-RBB3菌株的孢子懸液，在25。C、 180rpm條件 下恆溫發酵培養10天。將發酵液在4。C、 12000 rpm條件下，離心10min， 分別收集菌絲體和發酵液，依據上述優化方案中的步驟(3) (5)，製備獲得 紫杉醇，並最終定容在2ml的100%甲醇中，依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江，等.2002，林產化學與工業，22: 45-48)進行純化後，獲得溶解在1 ml 100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10 ^用於HPLC分析(條件同[實施例2])， 測定其紫杉醇的含量，實施例結果表明，用初始發酵培養基(1)、 (11)、 (m)、 (IV)進行亮白麴黴HUST-RBB3菌株的發酵，都有紫杉醇的合成， 其中，初始發酵培養基(I)的紫杉醇產量最高，為135.1 pg/L。
依據實施例4的發酵培養基(I)組成配製發酵培養基，並分別將初始 pH調至4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0，然後各接入1 ml亮 白麴黴HUST-RBB3的孢子懸液，在25"C、 180rpm條件下恆溫培養10天。 4°C、 12000 rpm離心10 min收集菌絲體和發酵液，依據上述優化方案中的 步驟(3) (5)製備獲得紫杉醇，並最終定容在2 ml的100%甲醇中，依據常 規紫杉醇純化方法(餘龍江,等.2002,林產化學與工業,22: 45-48)進行純化 後，獲得溶解在1 1111100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10pl用於HPLC分 析(條件同[實施例2])，測定其紫杉醇的含量，實施例結果表明，用液體 發酵培養基(I)進行亮白麴黴HUST-RBB3菌株發酵，初始pH為4.0 8.0 時，都有紫杉醇的合成，其中pH6.0是亮白麴黴HUST-RBB3菌株發酵產紫 杉醇的最適初始pH值，該條件下紫杉醇的產量為150.5 pg/L。
在實施例5的基礎上，亮白麴黴HUST-RBB3菌株分別在16.0°C、 18.0°C、 20.0°C、 22.0。C、 24.0°C、 26.0°C、 28,0°C、 30,0°C、 32.0°C、 34.0°C 條件下，180rpm發酵培養IO天后，4°C、 12000 rpm離心10 min收集菌絲 體和發酵液，依據上述優化方案中的步驟(3) (5)製備獲得紫杉醇，並最終 定容在2ml的100%甲醇中，依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江，等.2002，林 產化學與工業，22: 45-48)進行純化後，獲得溶解在1 ml 100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取IO ^用於HPLC分析(條件同[實施例2])，測定其紫杉 醇的含量，實施例結果表明，用初始pH6.0的液體發酵培養基(I)進行亮 白麴黴HUST-RBB3菌株發酵，培養溫度在18°〇 32°(:都有紫杉醇的合成， 其中，30.(TC是亮白麴黴HUST-RBB3菌株發酵產紫杉醇的最適培養溫度， 該條件下紫杉醇產量為171.6 pg/L。
在初始pH為6.0的300 ml優化的液體發酵培養基中接種1 ml濃度為 1S個孢子/ml的亮白麴黴HUST-RBB3菌株的孢子懸液，在初步優化後的 發酵條件下，即200 rpm， 30.(TC條件下恆溫發酵培養13天，亮白麴黴 HUST-RBB3菌株可生產497.3 pg/L的紫杉醇。每升優化的液體發酵培養基 中各組分的質量分別為葡萄糖80 g，酵母粉10 g，蛋白腖5g, KH2P04 2g， MgS04.7H20 1 g，苯甲酸鈉10mg，苯丙氨酸25 mg,絲氨酸15mg， 甘氨酸20mg，水楊酸15mg。
以上所述為本發明的較佳實施例而已，但本發明不應該局限於上述實 施例所公開的內容。所以，凡是不脫離本發明所公開的精神下完成的等效 或修改，都落入本發明保護的範圍。表1:亮白麴黴HUST-RBB3菌株的形態特徵和生理特徵
檢測項目結果檢測項目結果
形態特徵碳源利用
菌苔顏色白色D-半乳糖+
基質顏色無色D-半乳糖醛酸-
氣生菌絲豐茂龍膽二糖+
分 枝+D-葡萄糖酸-
次生分枝+D-葡萄糖胺-
菌絲隔膜+a-D-葡萄糖
分生孢子串珠狀葡萄醛醯胺-
枝 孢球形D-葡萄醛酸-
孢子顏色白色甘油+
糖原+
碳源利用m-肌醇+/-
D-阿拉伯糖+a-D-乳糖-
L-阿拉伯糖+乳果糖+/-
D-阿拉伯醇+/-麥芽糖醇-
熊果苷+麥芽糖+
D-纖維二糖+麥芽三糖+/-
(3-環狀糊精-D-甘露醇+
i-赤藻糖醇-D-甘露糖+
D-果糖+D-松三糖+/-
L-海藻糖+D-蜜二糖+
蔗糖+P-甲基-D-半乳糖苷-
松二糖+木糖醇-
(注+- positive; negative)
權利要求
1、產紫杉醇亮白麴黴(Aspergillus candidus)具有產紫杉醇的能力，用於發酵生產紫杉醇，一株保藏號為CCTCC No.M208209的亮白麴黴HUST-RBB3菌株具有較強的產紫杉醇的能力。
2、 一種由發酵製造紫杉醇的方法，其特徵在於在培養基中培養亮白 麴黴HUST-RBB3菌株以在其細胞內和培養基中聚集紫杉醇後，從其細胞內 和培養基中提取紫杉醇。
3、 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，該方法具體包括下述步(1) 將亮白麴黴HUST-RBB3菌株接種在PDA培養基平板上，25°C 28"C靜置培養10 15天後，加入滅菌的蒸餾水，通過玻璃棉過濾器過濾收 集孢子，用無菌生理鹽水洗滌3 5次，然後用無菌生理鹽水稀釋至106 18個孢子/ml的數目；(2) 按每300 500 ml液體發酵培養基接種1 5 ml亮白麴黴 HUST-RBB3菌株的孢子懸液，將亮白麴黴HUST-RBB3菌株接種到液體發酵 培養基中，在18 32-C、 pH4.0 8.0、需氧條件下發酵培養10 15天後，分 別收集菌絲體和發酵液；(3) 菌絲體在45i: 5(rC條件下烘乾，然後研磨粉碎，過200目篩子 收集細粉，每l.O g細粉用6 ml甲醇/氯仿抽提3 5次，合併所有抽提液， 甲醇/氯仿的體積比為l: 0 1: 1;(4) 發酵液用氯仿振蕩抽提3 5次，發酵液與氯仿的體積比為l: l 3: 1，合併所有抽提液；(5) 將步驟(3)和(4)中得到的抽提液分別在45r 50。C條件下減 壓蒸餾回收溶劑，並將蒸餾回收溶劑後的殘餘物質溶解在適量的100 %甲醇中，即獲得紫杉醇粗提溶液。
4、 根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於，每升優化後的液體 發酵培養基中各組分的質量分別為葡萄糖80 g,酵母粉10 g,蛋白腖5 g， KH2P042g, MgS04'7H20 1 g，苯甲酸鈉10mg，苯丙氨酸25 mg,絲 氨酸15mg，甘氨酸20mg,水楊酸15mg。
5、 根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於，發酵的優化條件為 在初始pH為6.0的300 ml液體發酵培養基中，接種1 ml濃度為108個孢子 /ml的亮白麴黴HUST-RBB3菌株的孢子懸液，200rpm, 30.(TC條件下恆溫 發酵培養13天。
全文摘要
本發明涉及到從曼地亞紅豆杉(Taxus x media)中分離到的一種產紫杉醇的內生真菌亮白麴黴(Aspergillus candidus)。在溫度為25℃、180rpm振蕩培養的條件下，野生菌株亮白麴黴HUST-RBB3在300mL土豆葡萄糖液體培養基中發酵10天，可以得到大約120μg/L的紫杉醇，是目前已報導在未優化培養條件下的較高紫杉醇產量的野生菌株。在初步優化的發酵條件下，亮白麴黴HUST-RBB3發酵可生產約497.3μg/L紫杉醇。通過該菌株發酵生產紫杉醇，具有生產周期短、菌種選育和保藏容易等優點。該發明為利用微生物發酵生產紫杉醇提供了新的菌種及相應的發酵生產工藝。
文檔編號C12R1/66GK101586082SQ200810236809
公開日2009年11月25日 申請日期2008年12月10日 優先權日2008年12月10日
發明者餘龍江, 周蓬蓬, 鵬 張 申請人:華中科技大學