製備重組人源神經生長因子蛋白質的方法及復性液的製作方法

2023-10-12 00:07:39

專利名稱：製備重組人源神經生長因子蛋白質的方法及復性液的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥領域中的重組蛋白質藥物，涉及製備重組人源神經生長因子蛋白質的方法及復性液。
背景技術：
神經生長因子(Nerve growth factor,NGF)是神經系統最重要的生物活性分子之一。NGF對正常神經細胞具有營養作用，對損傷神經修復機能具有調節作用，可以維持交感神經和感覺神經的生存，促進神經細胞的分化，決定軸突的伸展方向，對促進大腦的發育、神經系統的生長、損傷神經的再生和功能恢復等具有決定性作用。人源神經生長因子(hNGF)可應用於神經系統疾病,如糖尿病性周圍神經病變、老年痴呆症、帕金森症、面神經炎以及包括脊髓損傷、高位截癱、斷肢再植、腦損傷、周圍神經損傷等中樞及外圍神經系統的損傷的神經損傷，hNGF是目前唯一可應用於臨床的神經系統蛋白質因子。hNGF在人體中含量甚微，天然來源幾乎不可能。因此，用基因工程的方法生產重組人源神經生長因子(rhNGF)成為唯一的選擇。利用基因工程技術、以微生物或酵母為載體生產外源蛋白質具有廣闊的應用前景。到目前為止，已經發展了多種蛋白質表達系統。CN100357441C公開了一種新的表達人源神經生長因子的酵母表達系統將合成的hNGF基因插入由商購的PPIC9K質粒改造的pPIC9KL質粒，構建表達hNGF的重組表達載體；用該重組表達載體轉化酵母宿主，構建表達hNGF的酵母表達系統；最後培養該酵母表達系統，獲得hNGF。但該專利中GSl 15酵母菌株生產NGF的發酵周期為160 180小時，而使用大腸桿菌生產NGF的發酵周期一般為30 35小時，遠遠短於酵母發酵的周期，生產成本低；同時，酵母的培養要求相比大腸桿菌要高很多，培養成本高。大腸桿菌表達系統是研究的最清楚的一套原核表達系統，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高、表達產物分離純化相對簡單以及適於工業化生產的優點，其應用非常廣泛。CN1219795C公開了一種用二硫鍵異構酶(TOI)促進變性的重組人源神經生長因子正確摺疊並提高其復性率的方法。但是PDI價格昂貴，大大增加了生產成本。常規的復性製備rhNGF蛋白質的方法使用緩慢加入復性液的復性方法，復性率較低、製備過程複雜、耗時長、操作複雜，因而生產成本較高。

發明內容
本發明針對rhNGF蛋白質在工程大腸桿菌表達系統中包涵體復性率較低、製備過程複雜、耗時長、操作複雜，生產成本較高的問題，提出了能夠顯著提高復性率、設備要求非常簡單、耗時短、操作簡單的復性方法。同時提供了一種復性液，該復性液提高了 rhNGF蛋白質的復性率，同時降低了生產成本。
本發明的技術方案通過改變復性液的加入速度提高了 rhNGF蛋白質的復性率。本發明涉及製備rhNGF蛋白質的方法，該方法包括步驟①通過工程大腸桿菌表達rhNGF蛋白質，②破碎表達rhNGF蛋白質的工程大腸桿菌菌體，③離心收集rhNGF蛋白質的包涵體，④利用變性體系變性溶解所述入到所述包涵體溶解後溶液rhNGF包涵體以形成包涵體溶解後溶液，⑤復性液以大於1080ml/min的流速加入進行復性，⑥純化rhNGF蛋白質。復性液瞬間稀釋復性大大提高了復性率，稀釋後可以搖勻或玻璃棒攪勻，降低了對設備的要求，操作簡單。所述方法步驟①中使用的工程大腸桿菌包括各類大腸桿菌表達菌株，優選BL21(DE3)。 所述方法步驟②中可使用各種菌體破碎方法，優選超聲破碎。所述方法步驟④中的變性體系包括尿素變性溶解液和鹽酸胍變性溶解液等，優選尿素變性溶解液。步驟④中，復性液以大於1080ml/min的流速加入到所述包涵體溶解後溶液中，搖勻或玻璃棒攪勻，然後靜置，優選4°C靜置4小時。步驟⑤中，使用的復性液包含45 55mM Tris_HCl,0 ΙΟπιΜβ -巰基乙醇,0 ImM 二價銅鹽，O. 95 I. 05mM EDTA, pH8. 5 10. O。該復性液採用廉價的組分，降低了生
產成本。同時使用該復性液可提高復性率。根據本發明的一個實施方式，所述復性液的pH值為9. O 10. O。優選pH值為9. O ο根據本發明的一個實施方式，所述復性液中β -巰基乙醇的濃度為2. 5 5mM，優選 5mM。上述復性液中，可使用各種二價銅鹽，如CuSO4和CuCl2等。根據本發明的一個實施方式，使用CuS04。根據本發明的一個實施方式，所述二價銅鹽濃度為10 20 μ M，優選10 μ Μ。根據本發明的一個實施方式，步驟⑤中，使用的復性液包含45 55mMTris-HCl，
I.95 2. 05mM GSSG，4. 5 5. 5mM GSH，0. 95 I. 05mM EDTA, ρΗ8· 6。根據本發明的一個實施方式，在步驟⑤中用上述復性液對所述包涵體溶解後溶液進行5 20倍稀釋復性。優選5倍稀釋。根據本發明的一個實施方式，所述復性液包含50mM Tris-HCl，5πιΜβ -巰基乙醇，10 μ M CuSO4, ImM EDTA, ρΗ9. O。根據本發明的另一個實施方式，步驟①中6組氨酸標籤和rhNGF蛋白質融合表達。6組氨酸標籤的使用可簡化rhNGF蛋白質的純化步驟，使其經一步鎳瓊脂糖凝膠層析柱純化即可達到純度90%以上。rhNGF融合蛋白質切除6組氨酸標籤後的胺基酸序列與天然蛋白質一致，避免了額外免疫源的幹擾。本發明還涉及一種rhNGF蛋白質的復性液，該復性液包含45 55mMTris_HCl，O IOmMβ -巰基乙醇，O ImM 二價銅鹽，O. 95 I. 05mM EDTA，pH8. 5 10. O。該復性液採用廉價的組分，降低了生產成本。同時該復性液提高了復性率。根據本發明的另一個實施方式，上述復性液的pH值為9. O 10. O。優選9. O。在上述PH值範圍內時，可大大提高復性率。根據本發明的一個實施方式，上述復性液中β -巰基乙醇的濃度為2. 5 5mM，優選 5mM。
根據本發明的一個實施方式，上述復性液的二價銅鹽濃度為10 20μΜ。優選10 μ Μ。根據本發明的一個實施方式，上述復性液包含50mM Tris-HCl，5πιΜβ -巰基乙醇，10 μ M CuSO4, ImM EDTA, ρΗ9. O。根據本發明的另一個實施方式，上述復性液包含45 55mM Tris-HCl，I. 95
2.05mMGSSG，4. 5 5. 5mM GSH，0. 95 I. 05mM EDTA, ρΗ8· 6。上述各種復性液中各個組分的濃度是基於復性液總體積的濃度。上述復性液適用於蛋白質的復性，特別適用於rhNGF蛋白質的復性。


圖I為pET-28a_hNGF重組質粒的酶切檢測結果；圖2為BL21 (DE3) /pET-28a_hNGF誘導表達檢測結果；圖3為rhNGF蛋白質表達位置檢測結果；圖4為尿素變性溶解液溶解rhNGF包涵體的檢測結果；圖5為鹽酸胍變性溶解液溶解rhNGF包涵體的檢測結果；圖6為復性液I緩慢稀釋復性檢測結果；圖7為復性液I瞬間稀釋復性檢測結果；圖8為使用復性液I和復性液2的rhNGF蛋白質包涵體的復性檢測結果；圖9為使用復性液3的rhNGF蛋白質包涵體的復性檢測結果；圖10為復性液不同稀釋倍數的瞬間稀釋復性檢測結果；圖11為使用不同pH值復性液的瞬間稀釋復性的檢測結果I ;圖12為使用不同pH值復性液的瞬間稀釋復性的檢測結果2 ；圖13為使用不同濃度β -巰基乙醇的復性液的瞬間稀釋復性的檢測結果I ;圖14為使用不同濃度β -巰基乙醇的復性液的瞬間稀釋復性的檢測結果2 ；圖15為使用不同二價銅離子濃度的復性液的瞬間稀釋復性的檢測結果I ;圖16為使用不同二價銅離子濃度的復性液的瞬間稀釋復性的檢測結果2 ；圖17為rhNGF蛋白質包涵體的鎳瓊脂糖凝膠層析柱純化的檢測結果；圖18為rhNGF融合蛋白質切除6組氨酸標籤的檢測結果；圖19為Ong/ml rhNGF蛋白質處理SY5Y/pEGFP_N3細胞72小時的細胞突觸生長情況；圖20為5ng/ml rhNGF蛋白質處理SY5Y/pEGFP_N3細胞72小時的細胞突觸生長情況；圖21為10ng/ml rhNGF蛋白質處理SY5Y/pEGFP_N3細胞72小時的細胞突觸生長情況；圖22為20ng/ml rhNGF蛋白質處理SY5Y/pEGFP_N3細胞72小時的細胞突觸生長情況；圖23為40ng/ml rhNGF蛋白質處理SY5Y/pEGFP_N3細胞72小時的細胞突觸生長情況；圖24為20ng/ml rhNGF蛋白質處理SY5Y/pEGFP_N3細胞6天的細胞突觸生長情、況I;圖25為20ng/ml rhNGF蛋白質處理SY5Y/pEGFP_N3細胞6天的細胞突觸生長情況2。
具體實施例方式本發明提供了一種制 備重組人源神經生長因子蛋白質的方法，該方法包括步驟①通過工程大腸桿菌表達重組人源神經生長因子蛋白質，②破碎表達rhNGF蛋白質的工程大腸桿菌菌體，③離心收集rhNGF蛋白質的包涵體，④利用變性體系變性溶解所述rhNGF蛋白質的包涵體以形成包涵體溶解後溶液，⑤將復性液以大於1080ml/min的流速加入到所述包涵體溶解後溶液中進行復性,⑥純化所述rhNGF蛋白質。一種重組人源神經生長因子蛋白質的復性液，所述復性液包含45 55mMTris-HCl，0 IOmMβ -巰基乙醇，O ImM 二價銅鹽，O. 95 I. 05mMEDTA，ρΗ8· 5 10.0。本申請中所用的實驗材料如無特別說明均為市售購買產品，具體見表I。各種試劑和培養基的成分和配置方法可以參見常規實驗手冊中的描述。各種試劑中各個組分的濃度是基於各試劑總體積的濃度。表I實驗材料的生產廠商和貨號
試劑等名稱[TlΓ^Ι
Tris-HClAmresco6976-37-0
GSSG上海生工GB0228-5g
GSH上海生工70-18-8
EDTA阿拉丁6381-92-6
~β - 巰基乙醇SigmaM6250-500ML
CuSO4阿拉丁7758-98-7
EDTA阿拉丁6381-92-6
NdeITAKARAD1161A
HindIIITAKARAD1060A
DNA Ligation Kit SolutionTAKARAD6022A
卡那黴素阿拉丁25389-94-0
BL21(DE3)NEBC2527I
權利要求
1.一種製備重組人源神經生長因子蛋白質的方法，該方法包括步驟①通過工程大腸桿菌表達重組人源神經生長因子蛋白質，②破碎表達所述重組人源神經生長因子蛋白質的エ程大腸桿菌菌體，③離心收集所述重組人源神經生長因子蛋白質的包涵體，④利用變性體系變性溶解所述包涵體以形成包涵體溶解後溶液，⑤將復性液加入到所述包涵體溶解後溶液中進行復性，⑥純化所述重組人源神經生長因子蛋白質， 其中所述復性液以大於1080ml/min的流速加入到所述包涵體溶解後溶液中。
2.如權利要求I所述的製備重組人源神經生長因子蛋白質的方法，其特徵在於所述復性液包含45 55mM Tris_HCl，0 IOmMP -巰基こ醇，O ImM ニ價銅鹽，0. 95 I. 05mMEDTA，pH8. 5 10. O。
3.如權利要求2所述的製備重組人源神經生長因子蛋白質的方法，其特徵在於所述復性液的pH值為9.0 10. O。
4.如權利要求I所述的製備重組人源神經生長因子蛋白質的方法，其特徵在於所述復性液包含45 55mM Tris-HCl，I. 95 2. 05mM GSSG，4. 5 5. 5mMGSH, 0. 95 I. 05mMEDTA，pH 8. 6。
5.如權利要求I 4中任一項所述的製備重組人源神經生長因子蛋白質的方法，其特徵在於步驟⑤中用所述復性液對所述包涵體溶解後溶液進行5 20倍稀釋。
6.如權利要求I所述的製備重組人源神經生長因子蛋白質的方法，其特徵在於步驟①中所述重組人源神經生長因子蛋白質和6組氨酸標籤融合表達。
7.如權利要求2所述的製備重組人源神經生長因子蛋白質的方法，其特徵在於復性液包含50mM Tris-HCl, 5mM P -巰基こ醇，IOy M CuSO4, ImMEDTA，pH9. O。
8.—種重組人源神經生長因子蛋白質的復性液，其特徵在於所述復性液包含45 55mM Tris-HCl，0 IOmMP -巰基こ醇，0 ImM ニ價銅鹽，0. 95 I. 05mMEDTA, pH8. 5 10.O。
9.如權利要求8所述的重組人源神經生長因子蛋白質的復性液，其特徵在於所述復性液的pH值為9.0 10.0。
10.如權利要求8所述的重組人源神經生長因子蛋白質的復性液，其特徵在於所述復性液包含50mM Tris-HCl, 5mM ^ -巰基こ醇，IOuM CuSO4, ImMEDTA，pH9. O。
全文摘要
本發明涉及製備重組人源神經生長因子(rhNGF)蛋白質的方法及復性液，所述方法包括通過工程大腸桿菌表達rhNGF蛋白質，破碎表達rhNGF蛋白質的工程大腸桿菌菌體，離心收集rhNGF蛋白質包涵體，利用變性體系變性溶解包涵體以形成包涵體溶解後溶液，復性液以大於1080ml/min的流速加入到包涵體溶解後溶液中進行復性，純化rhNGF蛋白質。所述復性液包含45～55mMTris-HCl，0～10mMβ-巰基乙醇，0～1mM二價銅鹽，0.95～1.05mM EDTA，pH8.5～10.0。本發明的方法通過復性液瞬間加入稀釋復性提高了復性率，降低了生產成本，且操作簡單。
文檔編號C07K14/48GK102628058SQ201210080228
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者錢永常 申請人:杭州紐龍生物科技有限公司