從忍冬莖中提取和純化活性成分的方法、其在抗炎和止痛藥中的應用的製作方法

2023-10-16 22:47:59 1

專利名稱：：從忍冬莖中提取和純化活性成分的方法、其在抗炎和止痛藥中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及從忍冬(忍冬)中提取和純化活性成分的方法及其應用。更具體的說，本發明涉及從忍冬莖(除去了葉的忍冬莖)中提取和純化包括當藥甙在內的活性成分的方法，通過除去單寧、難溶性類黃酮、皂草苷等來進行。由此獲得的活性成分比從忍冬花或忍冬葉中獲得的常用活性成分具有更好的抗炎和止痛作用、更為安全且更為穩定，且包括為抗炎和止痛藥的有效活性組分的當藥甙。
背景技術：
：忍冬(忍冬)是半常綠配體藤狀灌木，它天然生長在日本、中國和韓國海拔50-600米範圍的山或大堤腳下。其花蕾(金銀花)和莖(忍冬莖)用作促進排尿、解毒、止血、血液純化、治療腫瘤、治療水腫、感冒、腹瀉、嘔吐等的草藥。[韓國植物教科書中解釋，Chang-BokLee，709，1989，HangmunPublishingCo.，Seoul；《韓國藥典未包括的草藥(草藥)標準》(StandardforHerbs(HerbMedicines)NotCoveredbyKorbanPharmacopoeia)，Hyung-JoonChi，Sang-InLee，87，305，1988，KoreaMedicalIndexCo.，Seoul；《韓國植物資源》(ResourcePlantsinKorea)，Tae-KyungKim，vol.4，148-149，1996，SNUPress，Seoul]。此外，許多傳統的中藥書籍，包括SasangConstitutionalMedicine和GwangjeBigeup中教導了它可以很好地治療各種人體內外的炎性膿腫[SasangConstitutionalMedicineforChosunPeople，YenbenChosunMedicalInstitute，276，1991，YeogangPublishingCo.，Seoul；GwangjeBigeup，Kyung-HwaLee，349-351，1991，YeogangPublishingCo.，Seoul]。因其抗炎止痛活性長期用作治療諸如感冒、扁桃體炎和神經痛這類上呼吸道感染的民間藥。近來，已經通過各種實驗動物模型證實了忍冬的抗炎和止痛活性且已經在學術範圍內分離和報導了其有效的生理活性成分[「植物抗炎藥的研發忍冬提取物抗炎和止痛作用的比較」(Developmentofthevegetableanti-inflammatorymedicineComparisonofanti-inflammatoryandanalgesicactionsofthehoneysuckleextract)，Song-JinLee等，《韓國生藥學雜誌》(KoreanJournalofPharmacognosy)，363-367，25，1994；「來自忍冬地上部分的類黃酮」(FlavonoidsfromtheaerialpartsofLonicerajaponica)，Son等，《藥物研究學報》(Arch.Pharm.Res.)，365-370，15，1992；「忍冬的抗炎活性」(AntiinflammatoryactivityofLonicerajaponica)，Lee等，《植物療法研究》(Phytother.Res.)，445-447，12，1998；「來自忍冬地上部分的三萜系化合物皂草苷類」(TriterpenoidsaponinsfromtheaerialpartsofLoiiiceiajaponica)，Son等，《植物化學》(Phytochem.)，1005-1008，35，1994；「忍冬主要成分的抗炎活性」(Anti-inflammatoryactivityofthemajorconstituentsofLonicerajaponica)，Lee等，《藥物研究學報》(Arch.Pharm.Res.)，133-135，18，1995]。相關領域的描述迄今為止，諸如綠原酸、咖啡酸甲酯、綠原酸和異綠原酸這類可水解的單寧和諸如番木鱉苷、當藥甙、vogeloside和epi-vogeloside這類環烯醚萜苷類稱作忍冬莖中含有的有效活性成分。大部分常規研究集中在忍冬花和忍冬葉上。應注意忍冬莖具有不同於忍冬葉或忍冬花的成分分布。即不同於忍冬莖，忍冬葉或忍冬花的主要成分為類黃酮，諸如忍冬苷、野漆樹苷和鏈木黃酮；帶有常春配基或齊墩果酸作為非糖成分的三萜皂草苷；和各種可水解的單寧。難以將這些成分製成注射劑。如果注射劑富含聚合物單寧，那麼它們可以與其它成分結合而產生共沉澱且可以結合血液中的血清蛋白而形成難溶性沉澱，這可能是血管狹窄的原因。此外，由於忍冬中包括的類黃酮一般不溶於水，所以必不可少的是以作為溶解介體的相當大量的有機溶劑或其它試劑將它們溶解至高於有效濃度的水平。此外，富含類黃酮的活性成分極難溶於注射用生理鹽水溶液且如果在鹼性緩衝溶液中長期儲存，那麼可能會變得不穩定。最後，已知獲自忍冬的皂草苷、特別是單皂苷(monodesmosides)具有強溶血作用。因此，不能將它們不經純化而直接注入靜脈[「有關忍冬皂草苷的研究」(StudiesonthesaponinsofLonicerajaponicaThunb.)，Kawai等，《藥物化學簡報》(Chem.Pharm.Bull.)，4769-4775，36(12)，1988]。忍冬葉和忍冬花的單寧和難溶性類黃酮含量高於忍冬莖。在注射用急性毒性試驗中，它們在低含量下也會產生更多的毒性且提供的止痛和抗炎作用較差。忍冬、日本當藥、龍膽、三花龍膽、條葉龍膽、堅龍膽、點花滇龍膽用於減輕發熱或解毒已經有許多年。然而，並未清楚地理解哪些成分可提供這類作用且大部分研究集中於鑑定忍冬莖的主要藥用成分番木鱉苷的活性[《天然產物雜誌》(J.Nat.Prod.)，54(4)，1102-1104，1991《植物藥》(PlantaMed.)，60，232-234，1994《植物療法研究》(PhytotherapyRes.)，12，405-408，1998]。此外，認為當藥甙僅有效地保肝並抑制細菌活性[《民族藥物學雜誌》(Ethnopharmacol.)，42，183-191，1994《藥物化學簡報》(Chem.Pharm.Bull.)，45(11)，1823-1827，1997YakugakuZasshi，102(8)，755-759，1982]，而迄今為止尚未報導其抗炎和止痛作用。
發明內容本發明者確定除去了單寧、難溶性類黃酮、皂草苷等的忍冬莖的活性成分(除去了葉的忍冬莖)和所述活性組分中的有效活性成分當藥甙具有優良的抗炎和止痛作用。因此，本發明的一個目的是提供從忍冬莖中製備具有優良抗炎和止痛活性、安全性和穩定性的活性成分的方法。本發明的另一個目的是提供包括所述活性成分的抗炎和止痛藥。本發明的另一個目的是提供包括當藥甙的抗炎和止痛藥。附圖簡述附圖1是表示隨含量改變的活性成分藥物作用的示意圖。優選實施方案的詳細描述本發明提供了從忍冬莖中製備具有優良抗炎和止痛活性、安全性和穩定性的活性成分的方法。本發明還提供了包括所述活性成分的抗炎和止痛藥。本發明還提供了包括所述當藥甙的抗炎和止痛藥。下文給出了本發明的詳細描述。本發明涉及從忍冬中提取和純化活性成分和當藥甙的方法，通過除去單寧、難溶性類黃酮、皂草苷等來進行。由此獲得的活性成分比從忍冬花或忍冬葉中獲得的常用活性成分具有更好的抗炎和止痛作用、更為安全且更為穩定且包括為抗炎和止痛藥的有效活性組分的當藥甙。從忍冬莖中提取活性成分和當藥甙並通過下列方法純化。用約7-10個體積的蒸餾水將忍冬莖樣品回流提取2-3小時且然後過濾。收集殘餘物並用約5-7個體積的蒸餾水回流提取2-3小時。過濾由此獲得的液體並與上述濾液合併、在減壓條件下濃縮並再次過濾，使得其體積約為草藥重量的1-3倍(v/w)。在用蒸餾水提取的過程中，如果使用的蒸餾水過少，那麼攪拌就會變得困難且提取效率就會降低，因為提取物的溶解性變差。相反，如果使用過量蒸餾水，那麼需要的時間和成本就會過高。因此，加入等量水飽和的低級醇並在30-50rpm下攪拌約10-20分鐘。層分離後，過濾水飽和的低級醇層並在減壓條件下濃縮而得到初級活性成分。在本文中通過將蒸餾水加入到諸如丙醇和丁醇這類低級醇中並攪拌、隨後沉降來製備水飽和的低級醇。使層分離過程進行2-3次。在獲得低級醇溶劑級分的過程中，如果使用的低級醇過少，那麼純化效率就會降低，由此提取產率和有效成分含量降低。相反，如果使用過多的低級醇，那麼會使成本增加。因此，建議使用體積(v/w)為1-3倍草藥重量的低級醇。使用聚醯胺樹脂、聚乙烯吡咯烷酮樹脂等對初級活性成分進行柱色譜以除去不需要的物質並檢測有效組分。在1-10個體積(w/w)的水飽和的低級醇層中使用填料。洗脫2-3個體積的50％(v/v)甲醇和甲醇與填料體積且然後通過分步梯度法洗脫蒸餾水溶劑。通過用蒸餾水洗脫活性成分得到的二次活性成分含有更少的芳族有機酸、單寧和類黃酮且表現出較好的藥物作用、顯著降低的毒性、增加的溶解性和改善的血液穩定性。使用(十八烷基矽烷)樹脂對二次活性成分再進行柱色譜。從10％(v/v)甲醇開始，通過分步梯度法洗脫2-3個體積的溶劑樹脂體積，同時將甲醇含量增加10％(v/v)。使用為純化的初級活性成分重量20-50倍體積的聚醯胺或聚乙烯吡咯烷酮樹脂。通過洗脫20-30％(v/v)甲醇得到的活性成分表現出最佳抗炎和止痛活性。對這些活性成分的分析揭示出環烯醚萜類物質、諸如當藥甙和番木鱉苷為主要活性組分。當藥甙含量為15.1-72.1wt％且番木鱉苷含量為13.9-41.4wt％。通過洗脫20-30％(v/v)甲醇得到的活性成分具有最高當藥甙含量。再對這些活性成分進行柱色譜以分離由下列化學通式1表示的當藥甙對由此得到的活性成分和當藥甙進行花生四烯酸誘發的耳水腫試驗和巴豆油誘發的耳水腫試驗以測定抗炎作用。並進行乙酸誘發的扭體試驗以測定止痛作用。結果發現它們具有遠優於獲自忍冬花或忍冬葉的常用活性成分的抗炎和止痛活性。可以通過製藥領域中公知的方法將通過本發明獲得的當藥甙製備成治療藥。還可以將其單獨或與藥物上可接受的載體、成形劑、稀釋劑等一起經口服或非腸道給藥。特別可以將其製成粉劑、顆粒、片劑、膠囊、糖漿劑、皮膚軟膏或注射藥物形式。可以根據活性組分在體內的吸收性、失活率和排洩率、受試者的年齡、性別和身體狀況、所治療疾病的嚴重程度等選擇本發明活性成分或當藥甙的人體劑量。優選對成年人給予1-200mg的活性成分或當藥甙。按照指定方法給藥，如果需要，根據專家的建議來決定。可以將藥物每天在固定間隔給藥幾次，優選每天1-3次。可以通過口服或非口服的方式給予所述的藥物組合物。當經非腸道給藥時，可以將其通過靜脈、肌肉、直腸或皮膚給藥。因為忍冬莖的活性成分具有優良的抗炎和止痛作用以及理想的溶解性、急性毒性和血液穩定性，所以它們非常適合於注射藥物。下文通過下面的實施例更具體地描述了本發明。然而，下列實施例僅用於理解本發明且不應將它們看作限定本發明的範圍。實施例實施例1忍冬各部位的藥物作用於1999年7月在韓國的Yeongcheon、Gyeongsangbuk-do採集忍冬全草(帶莖和葉的忍冬)、忍冬葉和忍冬莖的樣品。將樣品陰乾並用7個體積的蒸餾水回流提取2.5小時且然後過濾。隨後收集殘餘物並用7個體積的蒸餾水回流提取2.5小時。過濾由此得到的液體並於上述濾液合併、在減壓條件下濃縮並再次過濾，使得其體積約為草藥重量的2倍(v/w)。然後加入等體積的水飽和的正丁醇並將該混合物以約30rpm攪拌15分鐘。在層分離後，過濾醇層並在減壓條件下濃縮而得到初級活性成分。隨後使用聚醯胺樹脂(CASNO.63428-83-1)進行柱色譜以得到純化級分。樹脂量為5個體積的樣品。洗脫2個體積的50％(v/v)甲醇和甲醇且然後通過分步梯度法洗脫蒸餾水溶劑而得到二次活性成分。通過將忍冬全草、忍冬莖和忍冬葉的二次活性成分給藥入已經禁食4小時的6-周齡ICR小鼠(體重20-30g，n＝6，SLC，日本)尾靜脈進行巴豆油誘發的耳水腫試驗。15分鐘後，用2.5％巴豆油誘發炎症。4小時後，使用刻度厚度計測定小鼠左耳和右耳的厚度。通過下列等式1計算炎症率且結果如表1中所示。等式1炎症率(％)＝[發炎(右)耳的厚度-正常(左)耳的厚度]/[正常耳的厚度]×100表1正如表1中所示，忍冬莖的活性成分顯示最佳抗炎和止痛活性。實施例2獲自忍冬莖的活性成分的藥物作用比較如實施例1中所述進行巴豆油誘發的耳水腫試驗。此外，通過將藥物(marobiven，忍冬莖的初級成分和忍冬莖的二次活性成分)給藥入已經禁食4小時的6-周齡ICR小鼠(體重20-30g，n＝6，SLC，日本)尾靜脈進行花生四烯酸誘發的耳水腫試驗。15分鐘後，用0.05％花生四烯酸誘發炎症。約1小時後，測定小鼠左耳和右耳的厚度並通過等式1計算抑制率且結果如表2中所示。表2正如表2中所示，獲自忍冬莖的二次活性成分不包括如芳族有機酸、單寧和類黃酮這類化合物且具有高於初級活性成分的活性成分含量。實施例3獲自忍冬莖的活性成分的藥物作用比較通過用聚乙烯吡咯烷酮樹脂(CASNO.25249-54-1)取代聚醯胺進行表3實施例4最終活性成分的製備和藥物作用試驗在減壓條件下濃縮實施例1中製備的忍冬莖的二次活性成分而得到粉末。使用ODS樹脂(YMC*GELODS-A12nm，S-150m或ODS-AM12nm，8-50m或ODS-AQ12nm，S-50m)對所述粉末再進行柱色譜。使用3個體積的樹脂並洗脫20％(v/v)甲醇而得到最終活性成分。如實施例1中所述進行巴豆油誘發的耳水腫試驗。此外，通過將藥物(marobiven，和忍冬莖的最後活性成分)給藥入已經禁食1天的ICR小鼠(體重20-30g，n＝8，SLC，日本)尾靜脈進行乙酸誘發的扭體試驗。20分鐘後，經腹膜內注射0.7％乙酸。15分鐘後，對10分鐘內扭體的次數進行計數以計算炎症抑制率。結果如表4中所示。表4實施例5活性組分含量和藥物作用試驗從對實施例1和4中製備的最終活性成分進行的高效液相色譜(HPLC)中鑑定了活性組分含量當藥甙＝15.1-72.1wt％和番木鱉苷＝13.9-41.4wt％。各樣品的當藥甙和番木鱉苷含量如表5中所示。隨產地和採集時間不同而改變的最終活性成分的藥物作用如表6中所示。表5隨產地和採集時間不同而改變的當藥甙和番木鱉苷含量Lo番木鱉苷；Sw當藥甙表6*巴豆油誘發的耳水腫試驗結果**乙酸誘發的扭體試驗結果實施例6最終活性成分的溶血試驗使用用肝素處理的注射器從家兔心臟中採集20mL血液。將血液離心約10分鐘。潷析上清液並用10個體積的注射用生理鹽水溶液稀釋殘餘物。在通過緩慢振搖混合後，將0.5mL稀釋的血液和0.5mL實施例1的各藥物(忍冬莖的最終活性成分和忍冬莖、忍冬葉和忍冬全草的初級活性成分)以及實施例4的最終活性成分放入試管(還製備了生理鹽水溶液和蒸餾水(100％溶血)對照組)。將試管在保持在37℃下的浴中保溫15分鐘且然後置於室溫下45分鐘。最終在以2500rpm離心2分鐘後，在540nm處分析上層。表7實施例7當藥甙的製備使用十八烷基矽烷樹脂對實施例4中製備的最終活性成分進行柱色譜以分離由如下化學通式1表示的當藥甙實施例8當藥甙抗炎作用的測定通過將當藥甙給藥入已經禁食4小時的6-周齡ICR小鼠(體重20-30g，n＝6，SLC，日本)尾靜脈進行巴豆油誘發的耳水腫試驗。15分鐘後，用2.5％巴豆油誘發炎症。4小時後，使用刻度厚度計測定小鼠左耳和右耳的厚度。通過等式1計算炎症率且結果如表8中所示。口服給藥的藥物作用如表9中所示。表8表9此外，通過將當藥甙給藥入已經禁食4小時的6-周齡ICR小鼠(體重20-30g，n＝6，SLC，日本)尾靜脈進行花生四烯酸誘發的耳水腫試驗。15分鐘後，用0.05％花生四烯酸誘發炎症。1小時後，測定小鼠左耳和右耳的厚度並通過等式1計算抑制率且結果如表10中所示。口服給藥的藥物作用如表9中所示。表10表11實施例9當藥甙止痛作用的測定通過將當藥甙給藥入已經禁食1天的ICR小鼠(體重20-30g，n＝8，SLC，日本)尾靜脈進行乙酸誘發的扭體試驗。20分鐘後，經腹膜內注射0.7％乙酸。15分鐘後，對10分鐘內扭體的次數進行計數以計算炎症抑制率。結果如表12中所示。口服給藥的藥物作用如表13中所示。表12表13實施例10毒性試驗分別將1.0g/kg、1.5g/kg和2.0g/kg用量的忍冬莖活性成分和當藥甙通過已經禁食4小時的SD大鼠的尾靜脈給藥(體重120-170g，每次給藥劑量有5隻雄性和雌性大鼠，SLC，日本)。首先對大鼠觀察30分鐘且然後間隔30分鐘用肉眼觀察。給藥後將死亡率、一般症狀和體重改變觀察2周。進行實體解剖以鑑定存在的任何器官異常。忍冬莖活性成分和當藥甙的口服給藥致死劑量均超過5.0g/kg(沒有觀察到死亡的大鼠)，而靜脈內注射致死劑量均超過2.0g/kg(沒有觀察到死亡的大鼠)。當靜脈內注射2.0g/kg時，大鼠表現出呼吸計數增加且活動減少，持續約10分鐘，迅速恢復。沒有觀察到其它症狀且沒有因給藥而發生體重的改變。實體解剖結果沒有顯示出異常，與對照組的情況相同。分別在50、100和150mg/kg劑量下的局部毒性試驗沒有顯示出與給予生理鹽水溶液的組的差異。沒有觀察到諸如組織壞死或炎症這類毒性。製備實施例1片劑的製備將忍冬莖活性成分或當藥甙製成具有如下組成的片劑活性組分160mg輕體無水矽酸20mg玉米澱粉87mg結晶纖維素72mg羥基乙酸(glyconate)澱粉鈉60mg硬脂酸鎂6mg總計672mg製備實施例2糖漿劑的製備將忍冬莖活性成分或當藥甙製成具有如下組成的糖漿劑活性組分4,000mg對羥基苯甲酸甲酯(5％乙醇溶液)60mg對羥基苯甲酸丙酯(5％乙醇溶液)40mg苯甲酸鈉(5％溶液)100mg香蕉粉(10％溶液)600mgD-山梨醇140,000mg蒸餾水196mL製備實施例3注射劑的製備將忍冬莖活性成分或當藥甙製成具有如下組成的注射劑注射安瓿活性組分20mg甘露糖醇60mg相應的溶劑樣品注射用生理鹽水溶液2000mg總計2080mg製備實施例4注射劑的製備將忍冬莖活性成分或當藥甙製成具有如下組成的注射劑注射安瓿活性組分50mgKH2(PO4)8.5mg注射用生理鹽水溶液3000mg總計3058.5mg製備實施例5注射劑的製備將忍冬莖活性成分或當藥甙製成具有如下組成的注射劑注射安瓿活性組分100mg甘露糖醇300mgKH2(PO4)17mg注射用生理鹽水溶液3000mg總計3417mg製備實施例6軟膏藥的製備將忍冬莖活性成分或當藥甙製成具有如下組成的軟膏藥活性組分5g液體石蠟10g硬鉛9g乙醇8g失水山梨糖醇單油酸酯2g聚山梨醇酯4g對羥基苯甲酸丙酯0.05g對羥基苯甲酸甲酯0.1g濃甘油10g純水足量如上所述，本發明獲自忍冬莖的活性成分比那些常用的活性成分具有顯著增加的溶解性和血液穩定性。此外，證實它們具有優良的止痛和抗炎作用、安全性和穩定性。此外，本發明獲自忍冬莖的當藥甙具有極為優良的藥物作用且幾乎沒有顯示出毒性，由此特別適合於抗炎和止痛藥。儘管參照優選實施方案具體描述了本發明，但是本領域技術人員會理解可以對其進行各種修改和替換而不會脫離如待批權利要求確定的本發明的實質和範圍。權利要求1.忍冬莖活性成分的製備方法，包括(a)步驟用水回流提取忍冬莖，將其過濾，通過向所述濾液中加入等量水飽和的低級醇進行層分離並將該體系在減壓條件下濃縮而得到初級活性成分；和(b)步驟用聚醯胺樹脂或聚乙烯吡咯烷酮樹脂純化所述的初級活性成分而得到二次活性成分且再用十八烷基矽烷樹脂純化而得到最終的活性成分。2.權利要求1所述的忍冬莖活性成分的製備方法，其中所述的水飽和的低級醇為飽和的丙醇或丁醇溶液。3.權利要求1所述的忍冬莖活性成分的製備方法，其中所述的活性成分包括作為有效組分的當藥甙和番木鱉苷。4.權利要求3所述的忍冬莖活性成分的製備方法，其中所述的活性成分包括15.1-72.1wt％的當藥甙和13.9-41.4wt％的番木鱉苷。5.抗炎和止痛藥，包括通過權利要求1-4中任意一項所述方法製備的所述忍冬莖的活性成分。6.權利要求5所述的抗炎和止痛藥，其中所述的活性成分包括作為有效組分的當藥甙和番木鱉苷。7.權利要求6所述的抗炎和止痛藥，其中所述的活性成分包括15.1-72.1wt％的當藥甙和13.9-41.4wt％的番木鱉苷。8.權利要求5所述的抗炎和止痛藥，將其製成片劑、粉劑、顆粒、膠囊、糖漿劑、皮膚軟膏或注射劑形式。9.抗炎和止痛藥，包括如下化學通式1表示的當藥甙全文摘要本發明公開了從忍冬(忍冬)中提取和純化活性成分的方法及其應用。更具體的說，本發明涉及從忍冬莖(除去了葉的忍冬莖)中提取和純化包括當藥甙在內的活性成分的方法，通過除去單寧、難溶性類黃酮、皂草苷等來進行。由此獲得的活性成分比從忍冬花或忍冬葉中獲得的常用活性成分具有更好的抗炎和止痛作用、更為安全且更為穩定且包括為抗炎和止痛藥的有效活性組分的當藥甙。文檔編號A61K36/00GK1684699SQ03823484公開日2005年10月19日申請日期2003年9月8日優先權日2002年9月11日發明者郭義宗,趙龍白,韓昌均,慎希縡,柳根鎬,柳憲升,李海仁申請人:Sk化學株式會社