適用於臍帶組織衍生幹細胞的臍帶組織冷凍保存的製作方法

2023-12-05 20:09:41 2

專利名稱：適用於臍帶組織衍生幹細胞的臍帶組織冷凍保存的製作方法
技術領域：
本發明是關於幹細胞，特別是關於臍帶組織衍生幹細胞。本申請主張2011年9月I日提出申請的臺灣專利申請第100131519號的優先權，該申請的整體內容在此以引用的方式併入本申請。
背景技術：
前人已提出保存嬰兒臍帶血的潛在好處，現在，科學家則要進一步保存實際的臍帶組織。此想法是要保存出生時的一段臍帶與其內的所有細胞，並將臍帶組織冷凍在低溫儲槽內以利長期保存。未來如果需要嬰兒的細胞做為治療之用，即可以當時最先進的技術處理臍帶組織，進而擷取出細胞。
臍帶(臍帶組織)內的華通氏膠富含多能間質幹細胞(MSC)，其於再生醫學上具有巨大潛力。MSC可分化為骨骼、軟骨、神經、脂肪、心臟、平滑肌、肝臟與皮膚細胞。然而，無論就保存或後續的細胞培養而言，以上所述均屬相當新穎的技術領域，尚須建立一套有效率的作業流程。

發明內容
在一個實施方式中，本發明是關於一種保存臍帶的方法。該方法包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊，其中各臍帶組織塊的尺寸不大於2毫米(mm);將臍帶組織塊與冷凍組合物混合以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護劑與蛋白質；搖晃該混合物，且搖晃的時間不少於28分鐘但亦不超過32分鐘；然後冷凍保存該混合物。在另一個實施方式中，本發明是關於一種保存臍帶的方法，其包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護劑與蛋白質；搖晃該混合物，且搖晃的時間不少於20分鐘但亦不超過40分鐘；然後冷凍保存該混合物。在另一個實施方式中，本發明是關於一種從一段臍帶中獲取臍帶組織衍生幹細胞的方法，其包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護劑與蛋白質；搖晃該混合物，且搖晃的時間不少於20分鐘但亦不超過40分鐘；冷凍保存該混合物；將該混合物解凍，並去除冷凍組合物；然後在培養介質中培養臍帶組織塊，以獲得臍帶衍生幹細胞。在另一個實施方式中，本發明是關於一種冷凍組合物，其包括a)血清白蛋白或人類血清；與13)冷凍保護劑，其中組合物不含非人類動物衍生組分。在另一個實施方式中，本發明是關於一種冷凍組合物，其包括30%至50%的人類臍帶血血清或2. 5%至25%的血清白蛋白；5. 5%至55%的二甲基亞碸(DMSO);與0. 5%至5%的葡聚糖。在參閱以下較佳實施例的說明及附圖後，即可清楚了解上述與其它實施方式。本領域的技術人員可提出變化例與修正例而不脫離本案新穎概念的實質與範圍。
附圖顯示本發明一個以上的實施例，圖式的作用是與書面說明共同解釋本發明的原理。在可能情況下，所有圖式均以相同的參考標號表示同一實施例中相同或類似的組件。


圖IA至IE為顯微照片，分別顯示僅以酶處理而未經冷凍保存、冷凍保存前先以酶處理、未以酶處理也未經冷凍保存、冷凍保存後以酶處理，以及僅冷凍保存而未以酶處理的切碎臍帶組織塊衍生細胞。圖2A至 2C顯不突光激活細胞分選法(Fluorescence Activated Cell Sortingorf I ow cy tome try, FACS)或流動式細胞測量法的分析結果,其分析對象分別為冷凍保存前先以酶處理、冷凍保存後以酶處理，以及僅冷凍保存而未以酶處理的切碎臍帶組織塊衍生細胞。圖3顯示衍生自切碎臍帶組織塊的細胞數量，其中切碎臍帶組織塊分別為未接受酶處理，及在冷凍保存之前或之後接受酶處理。
圖4顯示切碎臍帶組織塊衍生細胞未經過冷凍保存及經過冷凍保存之後的倍增時間。圖5為顯微照片，分別顯示切碎臍帶組織塊(左圖)與濾液(右圖)的細胞培養物。圖6A與6B分別顯示衍生自切碎臍帶組織塊與非切碎臍帶組織塊的群落數量與細胞數量。圖7顯示幹細胞標記基因的RT-PCR分析結果。圖8A為顯微照片，顯示切碎臍帶衍生幹細胞與造血幹細胞共同培養物中的鵝卵石構造。圖SB顯示RT-PCR的分析結果，其分析對象為臍帶組織衍生幹細胞上與細胞增殖相關的信號途徑。圖9A至9C為顯微照片，分別顯示從切碎臍帶組織衍生幹細胞分化而成的脂肪細胞、軟骨細胞與血管內皮細胞。圖IOA至IOF顯示細胞在接受血管生成誘導前(圖IOA至10C)、後(圖IOD至10F)的螢光激活細胞分選法(FACS)或流動式細胞測量法的分析結果。圖11顯示幹細胞群落形成單位的數量與臍帶組織以冷凍保護劑溶液培養的時間長短的關係。
具體實施例方式定義本申請說明書所使用的術語在本發明範圍內及各術語的特定上下文中大致具有其相關領域中的通常涵義。本說明書中用以描述本發明的特定用語將在下文中或在本說明書的他處加以說明，以利業界人士了解本發明的相關敘述。為便於閱讀，某些術語可能會以斜體及/或引號等格式加以凸顯，但使用這些凸顯格式並不影響術語的範圍與意義。同一術語在相同上下文中的範圍與意義皆相同，此與是否採用凸顯格式無關。此外，同一件事的表示方法不止一種。因此，本文所討論的術語均可以替代用語及同義詞取代，且一術語是否在本文中經詳細說明或討論，並無任何特別意義。本文提供某些術語的同義詞，但使用某一或多個同義詞並不表示排除其它同義詞。本說明書所提供的範例，包括此處所討論的術語範例，僅供說明之用，而非用於局限本發明或任何例示術語的範圍與意義。同樣的，本發明並不限於本說明書所列舉的各種實施例。除非另有定義，否則本文中所有技術與科學術語的含義均與本領域技術人員所普遍了解者相同。若有相互衝突之處，則以本說明書及其所提供的定義為解釋依據。在本文中，「左右」、「約」或「大約」均指已知數值或範圍的20%以內，較佳者為10%以內，更佳者則為5%以內。本文所列的數量為約略值，亦即縱使未明白寫出「左右」、「約」或「大約」等詞，仍帶有該等用詞的含義。在本文中，「臍帶組織塊」與「切碎的臍帶組織」兩詞可以互換。切碎的臍帶組織塊是指一塊尺寸小於O. 5釐米(cm)的臍帶組織。在本文中，臍帶組織塊的尺寸不超過O. 4釐米，或不超過O. 3釐米，或不超過O. 2釐米。臍帶組織塊的尺寸不超過O. 2釐米是指該臍·帶組織塊可通過篩孔大小為2毫米(mm)的細胞過濾器。在本文中，「一段臍帶組織」是指臍帶的一部分，其長度為O. 5釐米或超過O. 5釐米。一段臍帶組織可為O. 5、1、2或3釐米，甚至超過3釐米。「冷凍保存法」或「冷凍保存」均指同一方法，其中是將細胞或整個組織冷卻至零度以下的低溫，通常為77K或零下196°C (液態氮的沸點)，藉以達到保存細胞或整個組織的目的。在此等低溫下，任何生物活性，包括會導致細胞死亡的生化反應，皆能得到有效遏制。然而，若不使用冷凍保護劑溶液，則被保存的細胞往往會在接近低溫或回暖至室溫的過程中因冷凍而受損。「冷凍」與「冷凍保存」兩詞可以互換。「冷凍組合物」、「冷凍溶液」、「冷凍保存組合物」與「抗凍溶液」等詞可以互換。除非另有規定，否則「臍帶組織衍生細胞」、「臍帶組織塊衍生細胞」、「臍帶組織衍生幹細胞」與「臍帶組織衍生MSC」等詞可以互換。「倍增時間」是指尺寸或數值增加一倍所需的時間。在一個實施方式中，本發明是關於一種保存臍帶的方法。該方法包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊，其中各臍帶組織塊的尺寸不大於2毫米；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護劑與蛋白質；搖晃該混合物，且搖晃的時間不少於28分鐘但亦不超過32分鐘；然後冷凍保存該混合物。在另一個實施方式中，本發明是關於一種保存臍帶的方法，其包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護劑與蛋白質；搖晃該混合物，且搖晃的時間不少於20分鐘但亦不超過40分鐘；然後冷凍保存該混合物。在另一個實施方式中，本發明是關於一種從一段臍帶中獲取臍帶組織衍生幹細胞的方法，其包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護劑與蛋白質；搖晃該混合物，且搖晃的時間不少於20分鐘但亦不超過40分鐘；冷凍保存該混合物；將該混合物解凍，並去除冷凍組合物；然後在培養介質中培養該臍帶組織塊，以獲得臍帶衍生幹細胞。在本發明的一個實施例中，培養介質包括人類臍帶血血清，或者，培養介質是由DMEM與人類臍帶血血清組成。在本發明的另一個實施例中，各臍帶組織塊的尺寸為2毫米或小於2毫米(亦即不超過2毫米)。在本發明的另一個實施例中，上述方法包括持續搖晃所述混合物25至30分鐘。在本發明的另一個實施例中，搖晃步驟持續28至32分鐘。所述搖晃步驟可持續30分鐘。在本發明的另一個實施例中，所述搖晃步驟是於低於15°C、或0°C與10°C之間，或不高於4°C的溫度下進行。在本發明的另一個實施例中，所述臍帶組織塊未經酶消化處理。 在本發明的另一個實施例中，所述臍帶組織塊在混合步驟前或在解凍步驟後接受酶消化處理。上述方法可進一步包括利用酶抑制劑抑制酶消化作用。在另一個實施方式中，本發明是關於一種冷凍組合物，其包括a)血清白蛋白或人類血清；與13)冷凍保護劑，其中該組合物不含非人類動物衍生組分。在本發明的一個實施例中，冷凍保護劑是從二甲基亞碸(DMSO)、甘油、乙二醇與丙二醇中選出，且至少為其中之一。在本發明的另一個實施例中，冷凍保存溶液包括DMEM或磷酸鹽緩衝溶液，以及DMSO或甘油。在本發明的另一個實施例中，冷凍保存溶液包括DMEM或磷酸鹽緩衝溶液，以及DMSO或甘油，以及人類臍帶血血清或胎牛血清。在本發明的另一個實施例中，冷凍保存溶液包括DMEM或磷酸鹽緩衝溶液，以及DMSO或甘油，以及血清白蛋白或血漿蛋白部分(PPF)。或者，冷凍保存溶液是由DMEM、DMS0、葡聚糖，以及人類臍帶血血清或血清白蛋白組成。在本發明的另一個實施例中，蛋白質組分是從血清白蛋白、人類血清與血漿蛋白部分(PPF)中選出，且至少為其中之一。在本發明的又一個實施例中，冷凍組合物不含非人類動物衍生組分與單糖。而在另一個實施方式中，本發明是關於一種冷凍組合物，其包括30%至50%的人類臍帶血血清或2. 5%至25%的血清白蛋白；5. 5%至55%的DMSO ;與O. 5%至5%的葡聚糖。在本發明的一個實施例中，冷凍組合物包括40 %的人類臍帶血血清或2. 5 %至25%的血清白蛋白；5. 5%至55%的DMSO ;與O. 5%至5%的葡聚糖。實施例以下僅為本發明實施例中的示範用設備、器材、方法及其相關結果，不應視為本發明的限制。請注意，各範例的標題或子標題僅為方便閱讀之用，同樣不應視為本發明的限制。此外，本文雖提出並披露若干理論，但只要本發明是依據其本身實施，而非依據特定理論或實行方案，則該等理論無論正確與否，均不應視為本發明的限制。材料與方法細胞培養介質適合培養臍帶衍生幹細胞的市售介質包括但不限於RPMI、MDM、DMEM, α -MEM,F12K、McCoy』 s 5a與X-VIVO 10。本發明的一個實施例是以DMEM (90%至70% )與人類血清(10%至30% )培養臍帶衍生細胞。
在某些實施例中，先以市售介質培養諸如HUVEC、MS-5或人類基質細胞系等細胞，以便取得含有該等細胞所分泌的因子的培養介質。收集此含有該等細胞所分泌的因子的介質，並於稀釋後或以未稀釋的狀態使用，藉以取代市售介質做為細胞培養之用。在另一些實施例中，市售介質含有諸如FBS、FCS等細胞培養添加劑；人類外周血血清；人類臍帶血血清；富含血小板的血漿(PRP);諸如IL-3、IL-6、TP0、FltL-3、SCF、EGF、TGF-β、bFGF等細胞生長因子；丙酮酸鈉；葡萄糖；麩胺醯胺與/或HEPES。或者，用以培養臍帶衍生幹細胞的市售介質同時含有細胞培養添加劑與上述由細胞所分泌的因子。臍帶處理以酒精(70%至75% )與磷酸鹽緩衝溶液清潔臍帶。將臍帶切成適當小段，然後以機械工具將臍帶小段切碎成更小的臍帶組織塊。所有工具均經過消毒。酶處理為評估酶消化作用對臍帶組織衍生細胞生長狀況的影響，發明人進行以下試驗。部分臍帶組織塊未經酶處理，部分臍帶組織塊則在冷凍保存之前或之後以酶處理30分鐘。試驗時是以胰蛋白酶或以胰蛋白酶與膠原酶的混合物進行酶消化。其它可用的酶包括但不限於蛋白酶、gelatase、透明質酸酶與其任意組合。消化作用在人類血清(臍帶血血清或非臍帶血血清)或胎牛血清等酶抑制劑的作用下停止。可用以取代血清的其它酶抑制劑包括但不限於胰蛋白酶抑制劑、含血清(人類或非人類動物血清)介質，或含有EDTA的緩衝溶液。細胞以緩衝溶液或培養介質進一步清洗數次，藉以將酶去除，然後在培養介質中培養7天，每隔3至7天更換一次介質。冷凍保存經過酶消化處理或未經酶消化處理的臍帶組織塊先以磷酸鹽緩衝溶液清洗，再與冷凍組合物混合，接著以旋轉器(搖動器)在諸如4°C的低溫下連續搖晃30分鐘，然後以BIOARCHIVE 搭配機器人式液態氮冷凍保存與儲存系統，將其儲存在零下196°C左右的溫度至少一星期，以確保其長期生存力。冷凍溶液含有緩衝溶液或細胞培養介質，以及冷凍保護劑。冷凍保存溶液可視需要含有來自人類的血清(如人類臍帶血血清或人類血清)與來自人類的蛋白質，蛋白質可為但不限於血清白蛋白或血漿蛋白部分(PPF)。緩衝溶液可為磷酸鹽緩衝溶液。細胞培養介質可為DMEM。冷凍保護劑可為二甲基亞碸(DMSO)、甘油、乙二醇或丙二醇。冷凍保存溶液可進一步包括蔗糖、海藻糖或葡聚糖。為評估冷凍儲存對於來自臍帶組織的臍帶衍生細胞的培養與生長有何種影響，上述臍帶組織塊解凍後便放置在含有介質的培養皿中，並在37°C與5%二氧化碳的培養器內進行培養。細胞計數臍帶組織塊在培養介質中培養7天，更換新介質後再培養8至14天。收集細胞後，計算細胞數量。細胞群體倍增時間是按照下列公式計算倍增時間=培養小時數/Log2(細胞擴增倍數)。臍帶組織衍生細胞與造血幹細胞(HSC)的共同培養
造血幹細胞可來自人類臍帶血或外周血。使用FICOLL_PAQUE PLUS(GE醫療集團)從人類臍帶血中分離出單核細胞後，以磁場激活細胞分選法(MACS)進行CD34+造血幹細胞的純化與分離。另一方面，將臍帶組織塊衍生幹細胞(即MSC)接種到6孔板，然後在培養器內以37°C與95%的溼度培養數天。以含有生長因子的新介質取代介質後，將臍帶組織塊衍生幹細胞與⑶34+造血幹細胞(HSC)共同培養一星期。每隔2至3天更換一次介質或添加更多生長因子。生長因子包括但不限於幹細胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)與Flt3-配位基(Flt3-Ligand)。最後以臺盼藍(Trypan blue, Invitrogen公司)與血球細胞計數器進行細胞計數。反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)RT-PCR技術是用於檢查幹細胞早期標記基因的表達，並偵測細胞增殖相關信號通路內的基因的表達。試驗時是使用RNAeasy迷你套組(Qiagen公司)，並依製造商手冊所規定的方式從臍帶組織衍生細胞中提取出總RNA。 脂肪細胞分化切碎臍帶組織衍生細胞在DMEM/血清介質中生長至100%融合後，在不含血清的培養介質中培養48小時，然後在脂肪細胞誘導介質中再培養4周。脂肪細胞誘導介質含有DMEM、血清、抗生素(鏈黴素與青黴素)、異丁基甲基黃嘌呤、地塞米松(dexamethasone)、胰島素與吲哚美辛。為判別脂肪細胞誘導的效果，分化後的細胞以油紅0(0il red O)染色。正脂肪細胞在光學顯微鏡下染成紅色。軟骨分化收集以上述方式在DMEM/血清介質中生長的切碎臍帶組織衍生細胞，然後在軟骨細胞分化介質中培養2至3周，每隔3天更換一次新的誘導分化介質。軟骨細胞分化介質包含DMEM/血清、抗生素(鏈黴素與青黴素)、地塞米松、丙酮酸鈉、轉化生長因子-β 3 (TGF- β 3)。在為期14天的軟骨細胞誘導過程中，細胞分泌出一種細胞外基質，基質內含第二型膠原蛋白、蛋白聚糖與陰離子蛋白多糖。分化後的軟骨組織經冷凍、切片，並以醋酸溶液衝洗，然後以阿爾辛藍(Alcian blue)染色。樣本切片再以核固紅(Nuclear fastred)進行對比染色。幹細胞分化成軟骨細胞的特徵在於出現阿爾辛染色區。強酸性硫酸鹽黏液物質是染成藍色，原子核是染成粉紅色至紅色，細胞質則染成淡粉紅色。血管生成分化將細胞接種在塗有基質膠或膠原蛋白的板上，然後在內皮生長介質-2(EGM_2)中培養，以便分化為血管內皮細胞。臍帶組織塊培養於冷凍溶液的時間長度為找出最佳的冷凍溶液培養時間長度，臍帶組織塊與冷凍溶液混合後便在細胞培養器內以旋轉器輕輕搖晃，但搖晃時間各不相同。簡言之，試驗時共採集3位捐贈者的臍帶，每條臍帶各取14釐米。臍帶組織均勻切碎成小塊(<2毫米)後，分為7個均等的樣本。在60分鐘內，每隔10分鐘從各樣本中取樣一次，陸續加入15毫升的離心管內與冷凍溶液混合，並以旋轉器搖晃。60分鐘結束時，以標準冷凍保存法同時冷凍保存所有7個樣本。7個樣本在冷凍保存3天後同時解凍，並去除冷凍溶液，接著將臍帶組織塊培養10天。培養10天後，計算來自各樣本的群落形成單位數與臍帶組織衍生幹細胞數。結果
臍帶組織塊衍生細胞為間質幹細胞(MSC)。圖IA至ID分別顯示臍帶組織塊於培養第7天時在細胞培養物上的臍帶組織衍生細胞。該等細胞為紡錘狀，且增殖快速。在進行細胞培養以獲得臍帶組織衍生細胞前，各臍帶組織塊或僅接受酶消化處理(圖1A)，或既接受酶消化處理也接受冷凍保存處理(圖1B)，或為未接受酶處理也未接受冷凍保存處理的新臍帶組織塊(圖1C)，或先接受冷凍保存處理再接受酶消化處理(圖1D)，或僅接受冷凍保存處理(圖1E)。結果顯示，冷凍保存與/或酶處理並不影響臍帶組織塊衍生細胞的形狀。臍帶組織衍生細胞的細胞類型是以FACS (螢光激活細胞分選法)或流動式細胞測量法加以評估。為分析細胞表面抗原，先收集臍帶組織塊衍生細胞，再以磷酸鹽緩衝溶液衝洗，接著使細胞分別與抗體⑶ 13、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、HLA-DR、7AAD或SSEA-4反應後，再與異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)或藻紅蛋白菁染料5(PE-Cy5) (BD生物科學公司)偶聯。圖2A至2C為細胞散點圖。在進行臍帶組織塊 植體培養前，細胞分別衍生自冷凍保存前(圖2A)或後(圖2B)接受酶消化處理、或僅接受冷凍保存處理而未經酶處理(圖2C)的臍帶組織塊植體。每一點代表單一細胞，其位置則表示其前向散射(forwardscatter,FSC)強度值(細胞大小)與側向散射(side scatter,SSC)強度值(細胞粒度)。前向散射與細胞直徑大致成比例，而側向散射則與細胞粒度成比例。結果顯示，根據本發明的方法，以酶與冷凍保存法進行臍帶組織塊之前處理並不會對臍帶組織塊衍生細胞的純度與屬性造成影響。為分析細胞表面抗原，先收集臍帶組織塊衍生細胞，再以磷酸鹽緩衝溶液衝洗，接著使細胞分別與抗體⑶13、⑶29、⑶31、⑶34、⑶44、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC, HLA_DR、7AAD 或 SSEA-4 反應後，再與異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)或藻紅蛋白菁染料5(PE-Cy5) (BD生物科學公司)偶聯。結果顯示，無論細胞系衍生自冷凍保存前或後以酶處理的臍帶組織塊、或在冷凍保存前或後均未以酶處理的臍帶組織塊，細胞表面上所能辨別的抗原類型皆相同(相關數據恕未顯示)。發明人也評估臍帶組織塊冷凍保存前或後的酶處理對臍帶組織衍生細胞數量的影響，試驗數據是以相對細胞數)表示，其中100%是定義為先接受酶消化處理再冷凍保存的臍帶組織塊於解凍後所衍生出的細胞數量(如圖3的「冷凍前酶處理」柱)。結果顯示，無論臍帶組織塊是否接受酶處理(如圖3的「未經酶處理」柱)，或者臍帶組織塊是否在冷凍保存前或後以酶處理(如圖3的「冷凍前酶處理」柱及「冷凍後酶處理」柱)，細胞數量均無顯著差異。此外，以胰蛋白酶抑制劑取代血清做為停止酶消化作用的酶抑制劑也不致顯著影響所收集的細胞數量(相關數據恕未顯示)。在對照研究中，每一組實驗僅使用一塊臍帶組織。發明人亦評估冷凍保存對細胞倍增時間的影響，評估方法是比對臍帶組織塊在冷凍保存前(亦即在未接受冷凍保存處理的情況下)所衍生的細胞的倍增時間與臍帶組織塊冷凍保存一周後所衍生的細胞的倍增時間。結果顯示，根據本發明，臍帶組織塊的冷凍保存對細胞倍增時間並無顯著影響(圖4)。因此，本發明的冷凍與儲存過程並未對臍帶組織塊衍生MSC的產量造成不利影響。發明人亦分析以血清白蛋白取代冷凍溶液中的血清是否會對臍帶組織塊衍生細胞的產量有所影響。結果顯示，以血清白蛋白取代冷凍組合物中的血清時，細胞數量並無顯著差異。此項發現的意義在於提供一種不含血清且可行的冷凍組合物。
圖5的試驗結果顯示，組織培養板中所生長與增殖的細胞是從臍帶組織塊衍生而來，而非從臍帶組織樣本中的游離細胞衍生而來。臍帶組織塊與緩衝溶液混合後，是以網目大小為100微米的細胞濾器(Cell Strainer,BDFALC0N )過濾。通過網目的臍帶組織塊與緩衝溶液(即濾液或通過流體)分別在適用於臍帶組織衍生細胞的培養介質中培養。結果顯示，只有包含臍帶組織塊的培養出現細胞生長與遷移的現象，而僅含有濾液的培養皿則無。換言之，根據本發明，衍生自臍帶組織塊的細胞(亦即間質幹細胞)並非來自四處遊走的游離細胞，而是來自臍帶組織內的幹細胞。換言之，幹細胞是由臍帶組織塊產生，並於培養條件下從組織植體向 外遷移。為評估切碎的動作是否對臍帶組織衍生幹細胞的生長有所影響，發明人將一段具有適當長度(約2釐米)且未切碎的臍帶直接與冷凍溶液混合，然後以零下160°C冷凍保存5至7天，並於解凍後加以培養，期能長出臍帶組織衍生細胞。為進行比對，另將一段同源臍帶切碎，與冷凍溶液混合後再以相同條件冷凍保存，接著解凍與培養。兩組試驗均以顯微鏡觀察細胞生長狀況。結果顯示，不論是否切碎臍帶組織，兩組試驗皆生出細胞。於培養第10天時計算細胞培養物上的細胞群落數量。如圖6A所示，從切碎的臍帶組織塊所衍生的細胞群落數量是從未切碎的臍帶組織部分所衍生的細胞群落數量的20. 5倍。計算細胞群落數量時是以出現幹細胞外移現象的臍帶組織塊數量為依據。換言之，出現幹細胞外移現象的臍帶組織塊數量即為細胞群落的數量。如圖6B所示，從切碎的臍帶組織塊所衍生的細胞的相對細胞數量是從未切碎的臍帶組織部分所衍生的細胞的相對細胞數量的11. 17倍。結果顯示，將臍帶組織切碎成小塊會影響臍帶組織所產出的幹細胞數量。因此，結果顯示，臍帶組織依本發明的方式切碎並冷凍保存後所能產出的臍帶組織衍生幹細胞遠多於未切碎的臍帶組織於冷凍保存後所能產出的臍帶組織衍生幹細胞。此項發現具有重要臨床意義，因為必須在短時間內提供足量的幹細胞才能將細胞治療的風險降到最低。上述臍帶組織衍生細胞均表達出BMP4、0ct4、REXl、S0X2與Nanog等多能幹細胞標記。如圖7所示的瓊脂凝膠帶為RT-PCR的DNA產物，顯示該等幹細胞標記在從切碎的臍帶組織所衍生的細胞內的基因表達。結果顯示，依本發明的方式從切碎的臍帶組織所衍生的幹細胞為多能的初期幹細胞。根據本發明，從切碎的臍帶組織所衍生的幹細胞可做為飼養細胞，以支持造血幹細胞(HSC)的成長與增殖。臍帶組織衍生細胞與HSC的共同培養物可形成一鵝卵石結構(圖8A)，其中每一鵝卵石皆為一HSC細胞團，其在相位差顯微鏡中呈現灰暗的鵝卵石狀。形成鵝卵石結構的原理如下鬆散浮動在飼養細胞上的HSC為球形，因而具有折射性，而位於飼養細胞下方的HSC則為扁平狀，故不具有折射性。結果顯示，將造血幹細胞與臍帶組織塊衍生幹細胞一同培養可促進造血幹細胞的增長。發明人也在依本發明而取得的臍帶組織衍生幹細胞中偵測與細胞增殖相關的信號途徑。偵測得到的信號如圖8B所示，包括IGF-2信號途徑，如IGF-2與IGFBP5 ;FGF信號途徑，如FGF-I與FGF-2 ;間隙連接信號途徑，如Panx-I、Panx_2 ；EMT途徑，如a -SMA、骨橋蛋白、CK18、Twist、BMP-4、TGF-β I ;早期基因，如0ct4、Rexl、S0X2 ;其它基因，如血管生成素類-2(Angptl-2)、dlk ;Wnt信號途徑，如Wnt5a、SFRP1、Dkk3 ;表面標記，如CD13 ;以及黏著分子，如N型|丐黏素(N-cadherin)、β -連鎖蛋白(β -catenin)。
衍生自切碎臍帶組織的細胞為多能幹細胞，其具有形成脂肪、軟骨以及血管生成與血管新生的能力。圖9A顯示在脂肪介質中經過4周培養後、由臍帶組織衍生幹細胞分化而成且經油紅染色的脂肪細胞。在軟骨介質中培養2至3周可誘導臍帶組織衍生幹細胞分化成軟骨細胞，其以阿爾辛藍染色後呈現陽性(圖9B)。內皮生長介質-2(EGM-2)則可誘導臍帶組織衍生幹細胞分化成血管內皮細胞(圖9C)，其中分化後的細胞變為長形且相互連結，最後形成毛細管狀網絡。在此利用流動式細胞測量法偵測細胞的尺寸(直徑)、粒度與表面抗原在血管生成誘導前、後的變化。圖IOA與IOD顯示細胞尺寸與粒度皆產生變化。此外，誘導分化細胞以抗VEGF-Rl與抗VE-Cad抗體染色後呈現陽性(圖10B、10C、IOE與10F)，顯示分化細胞具有血管內皮細胞的特徵。冷凍保存的臍帶組織塊，其產生臍帶衍生幹細胞的能力乃受到臍帶組織於冷凍溶液中培養的時間長短的影響。圖11顯示群落形成單位(CFU)的數量與冷凍溶液培養時間 的關係。各樣本以冷凍溶液分別培養不同時間後，將各樣本的CFU與培養30分鐘的樣本比較。實驗中共使用3個捐贈者樣本(η = 3)。P值< O. 05者以星號標示。長條顯示平均值土SEM。結果顯示，以冷凍溶液持續培養的適當時間為20至40分鐘，最佳培養時間則為30分鐘。僅以冷凍溶液培養O至20分鐘的臍帶組織塊並未充分貼附於培養皿的底面。臍帶組織塊若能貼附於培養皿底面，將使MSC更容易貼附在培養皿的底面以利增長。以冷凍溶液培養40至60分鐘的臍帶組織塊，其臍帶組織塊衍生MSC的產量並不穩定，原因在於多次反覆實驗中的細胞數量差異頗大(相關數據恕未顯示)。以上為本發明的實施範例，其作用僅在於說明，而非窮盡本發明的所有可能型態，且本發明的實施方式並不限於上述型態。依據以上教導，當可實現本發明的多種修改及變化。以上實施例與範例的選擇與描述，是為解釋本發明的原理及其實際應用，使本領技術人員得以利用本發明及各種實施例，或依實際需要而以不同方式修改。本領技術人員可在不偏離本案實質與範圍的情況下，容易想到多種替代實施例。因此，本發明的範圍取決於後附申請權利要求範圍，而非由以上敘述及其中所描述的實施範例加以定義。在本發明的上述說明中曾引用若干參考文獻，包括專利、專利申請案及多種出版物。之所以引用及/或討論該些參考文獻乃為闡明本發明的內容，而非承認該些參考文獻為本發明的「背景技術」。本專利說明書所引用與討論的所有參考文獻，在此以引用的方式將其全文併入本文，且其併入的程度一如各參考文獻是分別以引用的方式併入本文。
權利要求
1.一種保存臍帶的方法，包括下列步驟 獲取一段臍帶； 將臍帶切碎成臍帶組織塊，其中各臍帶組織塊的尺寸皆不大於2毫米； 將該臍帶組織塊與冷凍組合物混合，以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護劑與蛋白質； 搖晃該混合物，且搖晃的時間不少於28分鐘但亦不超過32分鐘；以及 冷凍保存該混合物。
2.一種保存臍帶的方法，包括下列步驟 獲取一段臍帶； 將臍帶切碎成臍帶組織塊； 將該臍帶組織塊與冷凍組合物混合，以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護劑與蛋白質； 搖晃該混合物，且搖晃的時間不少於20分鐘但亦不超過40分鐘；以及 冷凍保存該混合物。
3.如權利要求2所述的方法，其中各臍帶組織塊的尺寸為2毫米或小於2毫米。
4.如權利要求2或3所述的方法，包括搖晃所述混合物25至35分鐘。
5.如權利要求2或3所述的方法，其中搖晃步驟是在低於15°C的溫度下實施。
6.如權利要求5或3所述的方法，其中搖晃步驟是在介於0°C與10°C之間的溫度下實施。
7.如權利要求6或3所述的方法，其中搖晃步驟是在不超過4°C的溫度下實施。
8.如權利要求2或3所述的方法，其中搖晃步驟實施28至32分鐘。
9.如權利要求2或3所述的方法，其中臍帶組織塊未經酶消化處理。
10.一種從一段臍帶中獲取臍帶組織衍生幹細胞的方法，其包括下列步驟 獲取一段臍帶； 將臍帶切碎成臍帶組織塊； 將該臍帶組織塊與冷凍組合物混合，以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護劑與蛋白質； 搖晃該混合物，且搖晃的時間不少於20分鐘但亦不超過40分鐘； 冷凍保存該混合物； 使該混合物解凍，並去除冷凍組合物；以及 在培養介質中培養該臍帶組織塊，以獲得臍帶組織衍生幹細胞。
11.如權利要求10所述的方法，其中各臍帶組織塊的尺寸為2毫米或小於2毫米。
12.如權利要求10或11所述的方法，包括搖晃該混合物25至35分鐘。
13.如權利要求10或11所述的方法，其中所述臍帶組織塊未經酶消化處理。
14.如權利要求10或11所述的方法，其中所述臍帶組織塊是在混合步驟前或在解凍步驟後接受酶消化處理。
15.如權利要求2或3所述的方法，其中冷凍組合物包括 (a)30%至50%的人類臍帶血血清或2. 5%至25%的血清白蛋白； (b)5.5%至55%的二甲基亞碸；以及·0.5%至5%的葡聚糖。
全文摘要
在此披露一種保存臍帶的方法，該方法包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護劑與蛋白質；搖晃該混合物，搖晃時間不少於20分鐘但亦不超過40分鐘；然後冷凍保存該混合物。
文檔編號A01N1/02GK102960334SQ20111042772
公開日2013年3月13日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年9月1日
發明者章修綱, 羅瑋瑜 申請人:生寶生物科技股份有限公司