萬能dna片段擴增技術及萬能dna片段擴增試劑盒的製作方法
2023-12-04 19:12:06 1
專利名稱：萬能dna片段擴增技術及萬能dna片段擴增試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種擴增大小在一定範圍內的具有3＇羥基和5＇磷酸基的任意DNA片段的技術方法和用以實現這種技術的試劑盒，國際專利分類號為C12 Q1/68.
目前已有的DNA片段擴增技術主要有以下幾種一，經典方法，該方法是利用DNA重組技術把待擴增DNA片段或其一部分轉入適當載體如質粒載體或噬菌體，病毒載體中，然後轉化或轉染宿主細胞，通過載體的複製或繁殖從而達到擴增目的DNA片段的目的。要想獲得目的DNA片段還要再通過提取，限制酶切割，純化等繁瑣的步驟。這是一個費力，費時，費錢的過程，(分子克隆實驗指南.J.薩姆布魯克)二，常規PCR方法即多聚酶鏈式反應。這是一種體外快速擴增特異性DNA片段的方法。這種方法就是將特異性引物，耐熱DNA聚合酶，四種脫氧核糖核苷三磷酸(即dNTP)，模板分子按適當的比例與PCR緩衝液(一般含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris.Cl，PH8.3，和1.5mmol/LMgCl2)混合，經過高溫(94攝氏度)熱變性，使雙鏈的DNA分子解為單鏈，低溫(60攝氏度)下使引物與兩單鏈分別退大，中溫(72攝氏度)下DNA鏈廷伸，新合成的DNA又可作為模板，之後再進行變性，退火，鏈延伸，反覆熱循環，每循環一次，從理論上講，目的DNA的量比該次循環前增加一倍，這樣，經過30--35個循環後，目的DNA將擴增千百萬倍。因此PCR的突出特點是能生成大量特異性片段供分析研究檢測。缺點是需要先知道待擴增DNA片段的序列，至少需要已知待擴增DNA片段的部分序列即它不能擴增序列完全未知的DNA片段，並且每擴增一個片斷都需要單獨設計合成合適的該片段特異的引物。並且一般情況下只能擴增模板DNA片斷內部的一部分。(Marx，J.L.，Science 2401408，1988Mihovilovic，M.，Biotechniques，71，14)三，特種PCR技術，包括錨式PCR，這種PCR適用於從mRNA出發的cDNA克隆(Loh，E.Y.，Science 243217，1989)，其中有難以控制的加同聚尾反應。並且多聚C，G尾對將來克隆後的基因的表達有不良影響；Universal Amplification(CLONTECH Fall 7，1990)，Anchor-ligated PCR(Kinzler，K.W.，Nucleic Acids Res.173645，1989)等，這類PCR利用T4DNA連接酶將人工接頭引物連接到平端雙鏈(或經修平的雙鏈)DNA上，然後再用相應引物進行PCR擴增。這類連接不可避免地導致產生接頭二聚體，進而給以後的擴增帶來麻煩，並且它還不能用來擴增單鏈DNA片段。
本發明的目的是提供一種能夠快速，方便，忠實，經濟地擴增大小在一定範圍內的任意具有3＇羥基，5＇磷酸的DNA片段的技術方法，即萬能DNA片段擴增技術和用以方便地實現該技術的試劑盒。
本發明根據PCR引物設計原理首先人工合成四個萬能PCR引物第一個萬能PCR引物是5＇HO-CTGCAGGATCCTGCAGGGAGG-OH3＇，記作引物1。用符號「5＇HO-ABCDEF-OH3′」表示。該引物合成時，用牛小腸磷酸單酯酶對該引物的5′-端進行去磷酸化修飾，去磷酸化的5＇端記作「5＇HO-」，該引物含有BamH1，Pst1，等限制性內切酶位點；第二個萬能PCR引物是5＇P-GAGCCGTCGACAAGCTTGACC-H 3＇記作引物2，用「5＇P-KLMNOPQ-H3′」表示，在人工合成該引物時，3＇端的最後一個鹼基用雙脫氧鳥嘌呤(ddGTP)合成，使該引物3＇端無羥基。這樣做的目的是防止在後面的連接反應中出現不期望的連接，該引物含有Handlll，Sall，Hincll，Accl等限制性內切酶位點；第三個萬能PCR引物是3＇HO-CTCGGCAGCTGTTCGAACTGG-OH 5＇，記作引物3，用「3＇HO-klmnopq-OH5′」表示，該引物與修飾了3′-端的引物2互補，且5＇端經過去磷酸修飾，小寫字母代表的鹼基序列與的寫字母代表的鹼基序列互補。第四個萬能引物是3＇H-ACGTCCCTCC-OH5＇，記作引物4，用「3＇H-def-OH5′」表示。該引物與引物1的3＇端互補，小寫字母代表的鹼基序列與大寫字母代表的鹼基序列互補。在人工合成該引物時，3＇端最後一個鹼基用雙脫氧鳥嘌呤核苷三磷酸(ddGTP)合成，5＇端用小牛腸磷酸單酯酶切除磷酸基，該引物較短，其長度為引物1長度的1/3到1/2。再在T4RNA連接酶的作用下將引物1和引物3與待擴增DNA單鏈(如果待擴增DNA片段為雙鏈，則先加熱變性淬冷變成單鏈)連接，使待擴增DNA片段帶上萬能PCR引物接頭，然後再用引物1和引物3進行擴增。為實現上述技術，而將各種必要試劑按一定比例組裝成萬能DNA片段擴增試劑盒，該試劑盒包含四種萬能PCR引物，T4RNA連接酶，耐熱DNA聚合酶，ATP，四種脫氧核糖核苷三磷酸，DNA連接緩衝液，PCR緩衝液等。
實施例1.待擴增DNA片段為單鏈(以5＇P————OH3＇表示)時在10ul反應體系中加入20ng單鏈DNA片段，引物1(終濃度為lumol/L)，ATP(終濃度為10mmol/L)和T4RNA連接酶5U，在連接緩衝液中37攝氏度下保溫30分鐘，使引物1與待擴增DNA片段的單鏈的5＇-端連接，然後加入過量的引物4(終濃度為10umol/L)繼續保溫1小時，以封閉引物1的3＇端；加入引物2，再於37攝氏度下保溫30分鐘，使引物2與待擴增DNA片段的單鏈的3′-端進行連接。得到擴增用模板5＇HO-ABCDEF——————JKLMNOPQ-H3＇；68攝氏度加熱20分鐘滅活連接酶後，加入引物3，引物1，四種脫氧核糖核苷三磷酸，PCR緩衝液，耐熱DNA聚合酶，進行PCR擴增，即可得到目的產物5＇HO-ABCDEF——————JKLMNOPQ-OH3＇3＇HO-abodef——————jklmnopq-OH5＇這種產物可以直接進行PCR測序。
實施例2.待擴增DNA片段為雙鏈(以A鏈3＇HO————P5＇B鏈5＇P————OH3＇表示)時在10ul反應體系中加入20ng雙鏈DNA片段，經97攝氏度下保溫10分鐘，進行熱變性，冰水中淬冷，便其解鏈變成單鏈，加入引物1(終濃度為1umol/L)，ATP(終濃度為10mmol/L)和T4RNA連接酶5U，在連接緩衝液中37攝氏度下保溫30分鐘，使引物1與待擴增DNA片段的單鏈的5′-端連接，然後加入過量的引物4(終濃度為10umol/L)繼續保溫1小時，以封閉引物1的3＇端；加入引物2，再於37攝氏度下保溫30分鐘，使引物2與待擴增DNA片段的單鏈的3＇-端進行連接從而得到擴增用模板A鏈5＇HO-ABCDEF——————JKLMNOPQ-H3＇B鏈3＇H-QPONMLKJ——————FEDCBA-OH5＇，68攝氏度加熱20分鐘滅活連接酶後，加入引物3，引物1，四種脫氧核糖核苷三磷酸，PCR緩衝液，耐熱DNA聚合酶，進行PCR擴增，即可得到目的產物5＇HO-ABCDEF——————JKLMNOPQ-OH3＇3＇HO-abcdef——————jklmnopq-OH5＇和5＇HO-qponmlkj——————fedcba-OH3＇3＇HO-QPONMLKJ——————FEDCBA-OH5＇實施例3.待擴增DNA片段為具有平端或具有5＇突出端的雙鏈DNA片段(以A鏈3＇HO——————P5＇B鏈5＇P——————OH3＇表示)時在10ul反應體系中加入20ng雙鏈DNA片段，經97攝氏度下保溫10分鐘，進行熱變性，冰水中淬冷，使其解鏈變成單鏈，加入引物1(終濃度為2umol/L)，ATP(終濃度為10mmol/L)和T4RNA連接酶5U，在連接緩衝液中37攝氏度下保溫30分鐘，使引物1與待擴增DNA片段的單鏈的5＇-端連接5＇HO-ABCDEF-OH3＇＋5＇P————OH3＇，3＇OH———— P5＇＋3＇HO-FEDCBA-OH5＇，連接後得到5＇HO-ABCDEF————OH3＇，3＇HO————FEDCBA-OH5＇68攝氏度加熱40分鐘滅活連接酶後，加入引物1，四種脫氧核糖核苷三磷酸，PCR緩衝液，耐熱DNA聚合酶，這兩種連接產物相互復性再經聚合酶補平生成擴增用模板5＇HO-ABCDEF————fedcba-OH3＇3＇HO-abcdef————FEDCBA-OH5＇再直接用原引物進行PCR擴增，得到目的產物5＇HO-ABCDEF————fedcba-OH3＇3＇HO-abcdef————FEDCBA-OH5＇為了方便廣大生物醫學科技工作者應用該技術，將上述四種萬能PCR引物，T4RNA連接酶，ATP，耐熱DNA聚合酶，四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，DNA連接緩衝液，PCR緩衝液等按一定的比例組合在一起，形成萬能DNA片段擴增試劑盒。
由於本發明合成了四個在合成時或合成後進行特別修飾的萬能PCR引物，並使這些引物與待擴增DNA片段相連接，在連接過程中，採用末端阻斷法防止出現不期望的連接，從而獲得了兩端帶有萬能PCR引物接頭的待擴增的DNA片段模板分子，從而不必合成待擴增DNA片段的特異性引物，就能夠利用萬能PCR引物進行擴增，同時，由於擴增用引物是萬能PCR引物，其擴增條件可經最優化固定下來，且引物2和引物4在退火時降低擴增用引物的有效濃度，變性時釋放擴增用引物，具有引物濃度平衡劑的作用，實現了無論待擴增的DNA片段的序列是已知的還是未知的，是單鏈還是雙鏈，具有平端還是黏端，都能夠進行快速，方便，忠實，經濟，有效地擴增。
權利要求
1.一種通過將人工合成的萬能PCR引物連接於待擴增DNA片段單鏈，使其兩端帶上萬能PCR引物接頭，從而利用PCR技術擴增長度在一定範圍內的具有5＇-磷酸和3＇羥基的任意DNA片段的方法，其特徵在於該方法包括人工合成四個在合成前或合成後進行末端修飾的萬能PCR引物，將其中的一個或兩個萬能PCR引物連接到待擴增DNA片段單鏈末端，再用相應萬能PCR引物進行擴增。
2.根據權利要求1所述的方法，其中四個萬能PCR引物，引物1，引物2，引物3，引物4；合成引物1時，用牛小腸磷酸單酯酶對該引物的5′-端進行去磷酸化修飾，合成引物2時，3＇端的最後一個鹼基用雙脫氧核糖核苷三磷酸合成，使該引物3＇端無羥基，引物3與修飾了3＇-端的引物2互補，且5＇端在合成後作去磷酸修飾，引物4與引物1的3＇端互補，在人工合成該引物時，其3＇端最後一個鹼基用雙脫氧核糖核苷三磷酸，5＇端用小牛腸磷酸單酯酶切除磷酸基，該引物較短，其長度為引物1長度的1/3到1/2。
3.根據權利要求1所述的方法，其中將雙鏈DNA熱變性，淬冷使其成為單鏈，在T4RNA連接酶的作用下便其與引物1連接。
4.根據權利要求1所述的方法，其中待擴增DNA片段單鏈與引物1連接完成後，用過量的引物4封閉引物1的3′-端，之後使待擴增DNA片段單鏈與引物2連接。
5.根據權利要求1，2，3，4所述的方法，其中以連接產物為模板，用引物1，引物3進行PCR擴增。
6.根據權利要求1，3所述的方法，其中引物1或引物3分別與平端或5＇突出端的雙鏈DNA的兩條單鏈的5′-端連接，連接有萬能PCR引物接頭的待擴增DNA片段單鏈之間退火後，經DNA聚合酶補平後用引物1或引物3進行PCR擴增。
7.根據權利要求1，2，3，4，5，6，所述的方法，藉此進行單鏈DNA的測序，單鏈或雙鏈DNA，cDNA的快速擴增和克隆。
8.一種通過將人工合成的引物連接到單鏈DNA上後，再通過原引物或原引物和原引物的互補引物的廷伸而擴增DNA片段的試劑盒，即萬能DNA片段擴增試劑盒，該試劑盒包括1)四個萬能PCR引物或其中的一個，2)T4RNA連接酶，及其緩衝液，3)腺苷三磷酸(ATP)，超純水，4)耐熱DNA多聚酶，PCR緩衝液，5)四種脫氧核糖核苷三磷酸dATP，dTTP，dCTP，dGTP。
9.權利要求8所述的試劑盒，其中四個萬能PCR引物在合成前或合成後進行了末端修飾。
10.上述任一項權利要求所述的方法，用於擴增DNA片段和組裝DNA片段擴增試劑盒。
全文摘要
本發明萬能DNA片段擴增技術及萬能DNA片段擴增試劑盒提供了一種擴增大小在一定範圍內的具有3′羥基和5′磷酸基的任意DNA片段的技術方法和用以實現這種技術的試劑盒，國際專利分類號為C12Q1/68，由於本發明合成了四個萬能PCR引物，並使這些引物與待擴增DNA片段單鏈相連接，獲得了兩端帶有萬能PCR引物接頭的待擴增的DNA片段模板分子，從而直接利用萬能PCR引物將待擴增的DNA片段高效，方便地進行擴增。
文檔編號C12Q1/25GK1133344SQ9511131
公開日1996年10月16日 申請日期1995年4月12日 優先權日1995年4月12日
發明者夏慶傑 申請人:夏慶傑