鑑定irs蛋白激酶抑制劑或激動劑的方法
2023-11-10 03:33:02 1
專利名稱：鑑定irs蛋白激酶抑制劑或激動劑的方法
技術領域：
本發明涉及鑑定IRS蛋白激酶抑制劑或激動劑的方法以及選擇包含PKC-ζ和其他IRS絲氨酸激酶磷酸化位點的IRS肽的方法和這些肽在鑑定治療2型糖尿病的藥物組合物中的用途。
背景技術：
非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)主要在成人中出現並且特徵在於能從血液中清除葡萄糖的組織的敏感性降低。與胰島素依賴性糖尿病(IDDM，I型糖尿病)不同的是II型糖尿病的特徵不是胰腺β細胞胰島素分泌的受損。
儘管大學中以及製藥工業中的研究人員進行了大量努力，還是不清楚導致胰島素敏感性降低或者甚至抗胰島素抗性的分子機制。最近研究闡明在II型糖尿病中連接活化的胰島素受體與GLUT4運輸和葡萄糖轉運的第二信使通路受到幹擾。具體而言，胰島素受體底物(IRS)蛋白質上多個酪氨酸殘基被活化的胰島素受體(胰島素樣生長因子受體和JAK1/2)磷酸化並在下遊胰島素信號(1，2，3)過程中起關鍵性作用。磷酸酪氨酸基序，特別是IRS-1和IRS-2中的磷酸酪氨酸基序作為一系列銜接蛋白質的停靠位點，所述銜接蛋白具有Src同源性2(SH2)結構域(包括Grb2)、胞內PTPaseSHP-2、Nck、Crk和磷脂醯肌醇-3激酶(PI-3激酶)(4-6)。PI-3激酶由催化性的110-kDa亞基(p110)和調節性的85-kDa亞基(p85)組成並誘導PI-3激酶的活化(7)，85-kDa亞基含有與IRS蛋白質中酪氨酸磷酸化的pYMXM和pYXXM基序結合的兩個SH2結構域。PI-3激酶的活化導致依賴磷酸肌醇的激酶1刺激其他下遊激酶，包括絲氨酸/蘇氨酸激酶PKB/Akt(8，9)和非典型蛋白激酶C同種型ζ和λ(PKC-ζ/λ)(10，11)。已顯示PKB和PKC-ζ/λ的活化以及其下遊信號在介導胰島素的代謝活動(如GLUT4運輸和葡萄糖轉運(10，11)、GSK3絲氨酸磷酸化和糖原合成(12)、PDE絲氨酸磷酸化和抗脂解作用(13，14)以及mTOR活化和蛋白質合成(15，16))中起關鍵性作用。
胰島素信號系統失調為多因素過程，其導致胰島素抗性和2型糖尿病，其中IRS蛋白質可能代表主要靶點(17)。由此推測IRS蛋白質的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化在胰島素信號的反饋抑制和細胞胰島素抗性的產生中發揮關鍵作用(綜述見17-19)。已顯示IRS-1上絲氨酸/蘇氨酸的共價修飾損害其胰島素誘導的酪氨酸磷酸化、PI3-激酶的活化和葡萄糖轉運的刺激(20)。在未刺激狀態IRS-1的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化在細胞中組成型的存在(21)並且其進一步受抑制信號轉導的細胞因子和代謝物(如腫瘤壞死因子(TNF)α(22)、游離脂肪酸、葡萄糖或神經醯胺(23))促進。此外，在胰島素抗性和2型糖尿病中普遍發現IRS-1上絲氨酸/蘇氨酸殘基的超磷酸化(24)。
儘管是產生胰島素抗性的關鍵環節，IRS-1的絲氨酸磷酸化還未完全了解，主要因為IRS-1含有超過100個潛在的絲氨酸磷酸化位點並且因為已顯示其是許多蛋白激酶的底物，這此蛋白激酶包括c-Jun N端激酶(JNK)(25)、IkappaB激酶β(26)、MAP激酶(27)、酪蛋白激酶(28)、糖原合成酶激酶(29)、磷酸肌醇-3激酶(30)、蛋白激酶A(31)、蛋白激酶C(32)、蛋白激酶B(PKB)(33)和AMP活化的蛋白激酶(AMPK)(34)。有意思的是，發現PKB和AMPK作為IRS-1功能的正調節物，這支持了IRS-1的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化具有雙重作用(增強或終止胰島素信號)的觀點(35)。鑑定IRS-1不同結構域中應答不同刺激而絲氨酸磷酸化的殘基促進了我們對胰島素作用中這個高度複雜的調節步驟的理解。由此，鑑定了位於磷酸酪氨酸結合(PTB)結構域附近的Ser307為應激活化的激酶(包括JNK)的靶點(25)並且也可能作為胰島素作用的負反饋調節物發揮作用(36)。Ser789被AMPK作用並且正調節胰島素作用(34)，然而也發現未知激酶對Ser789的磷酸化減弱胰島素信號(37)。Ser612、Ser632、Ser662和Ser731位於PI3激酶相互作用結構域中或附近，然而還不清楚這些位點的功能含意(38-40)。
與上面提到的蛋白激酶不同，絲氨酸/蘇氨酸激酶的PKC家族非典型成員蛋白激酶C(PKC)-ζ似乎參與胰島素信號的下遊轉導和IRS-1功能的負反饋控制(11，41-44)。這樣發現PKC-ζ與GLUT4共定位並且為骨骼肌(41)和脂肪細胞(11)中胰島素調節的GLUT4運輸和葡萄糖轉運所必需。此外，PKC-ζ的有缺陷活化可造成肥胖依賴性的骨骼肌胰島素抗性的產生(42)。Quon和合作者(43)的最近數據顯示IRS-1代表了PKC-ζ的新底物，Zick和合作者(44)的類似研究中發現此過程抑制PI3激酶活化，這表明PKC-ζ代表了胰島素作用負反饋控制中的關鍵因素。
總之，雖然本領域已知IRS與PKC-ζ相互作用，尤其是IRS-1與PKC-ζ相互作用，但是還不知道這種相互作用的本質。因此，本領域還不知道影響IRS-PKC-ζ相互作用的物質。然而急需此類物質因為很可能IRS和PKC-ζ相互作用的抑制會造成IRS和更下遊的PI3激酶抑制的下調，其依次造成GLUT4運輸和葡萄糖轉運的提高。
因此本發明的目的是提供鑑定IRS蛋白激酶抑制劑或激動劑的方法。
根據本發明，此目的通過鑑定IRS蛋白激酶抑制劑的方法實現，所述方法包括下列步驟a)在存在至少一種推定抑制劑的條件下使PKC-ζ與至少一種IRS肽接觸，其中所述的IRS肽包含至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點，b)測量PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點的磷酸化。
本發明基於在IRS的序列中令人吃驚地鑑定了PKC-ζ特異識別的特定絲氨酸磷酸化位點。因此在本發明中，鑑定了提供IRS-PKC-ζ相互作用的分子機理。此外可能其他蛋白激酶(如c-Jun N端激酶(JNK)、IkappaB激酶β、MAP激酶、酪蛋白激酶、糖原合成酶激酶、磷酸肌醇-3激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、蛋白激酶B 8PKB和AMP活化的蛋白激酶(AMPK))能識別這些磷酸化位點。因此確定蛋白激酶磷酸化的絲氨酸位點(尤其是PKC-ζ磷酸化的絲氨酸位點)使我們能鑑定以拮抗或對抗方式幹擾此相互作用的分子。
在本發明中，術語「IRS蛋白激酶抑制劑」涉及幹擾IRS和蛋白激酶間(例如PKC-ζ)相互作用的物質。
在本發明的背景中，術語「IRS肽」涉及包含IRS的至少5個，優選7個，優選地至少10個胺基酸的序列的肽。術語「IRS肽」包括除了來自IRS的一段胺基酸外還可包含非IRS來源的其他胺基酸的IRS肽。
本發明的所有方法優選地在體外實施。
PKC-ζ可商業購買，例如從CalBiochem(San Diego，CA，USA)購買。此外，在本應用引用的文獻中描述了分離PKC-ζ的方法。
IRS的序列(尤其是不同物種的IRS-1和IRS-2的序列)為本領域已知。大鼠IRS-1序列在此以SEQ ID NO16提供。
產生蛋白質和由此產生IRS的方法為本領域已知並包括例如從cDNA開始在適當細胞中表達蛋白質或通過在起始胺基酸中依次加入胺基酸產生(見《Current Protocols》，John Wiley和Sons，Inc.，New York)。
此外，產生蛋白質片段的方法為本領域已知(見上文)並包括用適當蛋白酶切割蛋白質或者產生編碼蛋白質片段的核酸片段隨後在適當細胞中表達片段。
產生突變蛋白質的方法(交換一個或多個胺基酸和缺失一段胺基酸序列)為本領域已知(見上文)。這些方法包括IRS基因的定點誘變和在適當細胞中表達經修飾的基因。
根據優選的實施方案，與不存在至少一種推定抑制劑相比PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點降低的磷酸化作用為推定抑制劑抑制性質的標誌。
優選地，PKC-ζ為哺乳動物來源，優選地為齧齒動物和人來源，更優選地為大鼠或人來源。
根據本發明的優選實施方案，IRS肽來源於哺乳動物的IRS(優選IRS-1)，優選地來源於人或齧齒動物的IRS，更優選地為大鼠來源。
優選IRS-1為大鼠來源並且至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點選自絲氨酸458、469、481、498、522、526、530、536、538、539、542、560、570、577、599、600、612、620、632、635、662和664，其中序列號與SEQ ID NO16中描述的大鼠IRS-1對應。此外，IRS-1可為人來源並且至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點選自與上面大鼠IRS-1的絲氨酸殘基對應的絲氨酸殘基。
優選地，本發明中的PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點可選自Ser498、Ser570和Ser612，更優選地選自Ser570。
根據本發明極優選的實施方案，肽為rIRS449-664(SEQ ID NO17)。
優選地，抑制劑選自結合肽、抗體和低分子量化合物(LMWs)。
術語「結合蛋白質」或「結合肽」指結合和抑制IRS的一類蛋白質或肽，這不限制地包括抗IRS的多克隆或單克隆抗體、抗體片段和蛋白質支架，例如抗IRS的anticalins。
根據技術人員熟知的方法完成製備抗體或抗體片段的過程，例如在適當地存在例如Freund’s佐劑和/或氫氧化鋁凝膠的情況下用IRS免疫哺乳動物例如(兔)(見例如Diamond，B.A.等人(1981)The New EnglandJournal of Medicine1344-1349)。隨後用熟知的方法從血液中分離動物中由於免疫反應而形成的多克隆抗體並且例如通過柱層析純化。可根據已知的Winter和Milstein(Winter，G.和Milstein，C.(1991)Nature，349，293-299)的方法製備單克隆抗體。
根據本發明術語抗體或抗體片段也理解為指通過重組製備並且適當的話經修飾的抗體或其抗原結合部，如嵌合抗體、人源化抗體、多功能抗體、雙特異性抗體或寡特異性抗體、單鏈抗體和F(ab)或F(ab)2片段(見例如EP-B1-0368684、US 4,816,567、US 4,816,397、WO 88/01649、WO 93/06213或WO 98/24884)。
作為經典抗體的備選，也可能使用例如抗IRS的蛋白質支架(例如基於脂質運載蛋白的anticalins)(Beste等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，1898-1903)。可例如通過「組合的蛋白質設計」方法以脂質運載蛋白結合於所選半抗原(在此為IRS)的方式改變脂質運載蛋白(例如視黃醇結合蛋白或後膽色素結合蛋白)的天然配體結合位點(Skerra，2000，Biochim.Biophys.Acta，1482，337-50)。其他已知的蛋白質支架已知作為分子識別的抗體備選物(Skerra(2000)J.Mol.Recognit.，13，167-187)。
LMWs為非蛋白質、肽抗體或核酸的分子，其表現低於5000Da，優選地低於2000Da，更優選地低於2000Da，最優選地低於500Da的分子量。可在起始於文庫的高通量方法中鑑定此類LMWs。
抑制劑可為天然產物提取物(粗製品或經純化的形式)形式。可根據標準方法生產提取物，如水和/或醇和/或有機溶劑萃取和/或柱層析和/或從動物、植物或微生物源(如蛇毒、葉片或微生物發酵液體培養基)中沉澱。
在本發明中，IRS和PKC-ζ在例如測定系統中提供並直接或間接與測試化合物(例如化合物文庫形式)接觸，尤其是與生物化學或化學測試化合物接觸。然後測量或檢測測試化合物對IRS磷酸化的影響。之後可分析和/或分離適當的抑制劑。對於篩選化合物文庫，優選使用高通量測定法，其為技術人員已知並可商業購買。
根據本發明，術語「化合物文庫」指從多種來源組裝的多種化合物(包括化學合成的分子和天然產物)或者通過組合的化學技術產生的化合物。
總之，通過測定IRS肽磷酸化程度測量或檢測測試化合物對相互作用的影響。這可通過使用磷光體特異性抗體完成。此類抗體為本領域已知並可從例如Clonetech，Santa Cruz和Cellsignal獲得。
另外，在測定中可使用放射性標記的ATP測量磷酸化程度。ATP可用32-P或33-P標記並可通過本領域已知的方法測量摻入IRS中的放射性磷酸鹽數量(見實施例2，9)。例如，通過放射自顯影測量的信號強度可為磷酸化程度的指示。
本發明的方法有利地在自動系統中進行，例如包括自動鋪板和自動液體轉移系統，例如使用微觀流體(即通道結構)的系統。
在本發明的另一個實施方案中，本方法以高通量篩選系統形式進行。在這樣的系統中，篩選方法有利地自動化和小型化，尤其它使用小型孔和機器人控制的微觀流體技術。
本發明還涉及鑑定IRS激動劑的方法，其包括以下步驟a)在存在至少一種推定激動劑(包含至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點)的條件下使PKC-ζ與至少一種IRS肽(包含至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點)接觸，b)測量推定激動劑的PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點的磷酸化作用。
對為本發明的方法，就PKC-ζ和IRS而言應用上述公開方法的相同實施方案。在優選的實施方案中，激動劑為肽。可用於本發明的肽文庫為本領域已知。
根據本發明該方法的優選實施方案，與IRS肽的PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點磷酸化相比，激動劑的PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點增加的磷酸化為推定激動劑對抗性質的標誌。
本發明還涉及測定PKC-ζ活性的方法，其包括以下步驟a)在存在至少一種推定抑制劑的條件下使PKC-ζ與至少一種IRS肽(包含至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點)接觸，b)測量PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點的磷酸化。
因此，本發明提供測量PKC-ζ活性的方法。當需要測量不同患者的PKC-ζ活性以獲得更多關於患者(尤其是糖尿病患者)信號轉導系統的信息時這樣的方法尤其有用。
在本發明的方法中，PKC-ζ優選為哺乳動物的，更優選地為人源的。
就本發明的方法和所用的IRS而言，上面公開了本發明其他方法相同的應用。
本發明還涉及IRS-1肽，其包含Ser570、優選地包含SEQ ID NO17中展示的IRS-1449-664，或者涉及其人同系物。
在本發明中，揭示出本發明的這種肽對鑑定IRS類似物或抑制劑尤其有用。
本發明還提供了試劑盒，其包含a)至少一種IRS肽，b)PKC-ζ製品和c)至少一種推定的IRS蛋白激酶抑制劑或激動劑。
如上已經討論的，這樣的試劑盒對鑑定IRS蛋白激酶抑制劑非常有用。上面已經討論了其個別組分。
另一方面，本發明提供了IRS-1肽，其中Ser570和/或Ser612被突變，優選突變成丙氨酸。這樣的肽可用於在體外或體內封閉PKC-ζ活性。
本發明還涉及如上定義的IRS肽在產生抗體中的用途，優選抗PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點的抗體，優選產生抗Ser498、Ser570和Ser612的抗體，更優選產生抗Ser570的抗體。因此藉助於本發明定義的IRS肽可能產生IRS特異性抗體，尤其是抗PKC-ζ磷酸化位點的抗體。此類抗體可用於體外診斷以及藥物組合物中。
在另一方面，本發明涉及如上定義的IRS或者如上定義的帶有經突變絲氨酸位點的IRS-1肽製備治療2型糖尿病的藥物組合物的用途。此類肽可抑制IRS和PKC-ζ的相互作用並且可因此用作IRS磷酸化的拮抗劑。
為生產藥物組合物，通常依賴於施用方式用一種或多種可藥用添加劑或輔助物質(如生理緩衝溶液(例如氯化鈉溶液、脫礦質水)、穩定劑(如蛋白酶或核酸酶抑制劑，優選地為抑酶肽、ε-氨基己酸或抑胃酶肽A)或者螯合劑(如EDTA)、凝膠製劑(如白凡士林、低粘性石蠟和/或蜂蠟等等)製備本發明鑑定的IRS蛋白激酶抑制劑或激動劑或者本發明的肽。
其他適當添加劑為例如去汙劑(例如Triton X-100或脫氧膽酸鈉)，也可以有多元醇(例如聚乙二醇或丙三醇)、糖(例如蔗糖或葡萄糖)、兩性離子化合物(例如胺基酸，如甘氨酸)或者尤其為牛磺酸或甜菜鹼和/或蛋白質(例如牛或人血清白蛋白)。優選的為去汙劑、多元醇和/或兩性離子化合物。
生理緩衝溶液優選地具有大約6.0-8.0的pH值，特別是大約6.8-7.8的pH值，尤其是大約7.4的pH值和/或大約200-400毫滲摩爾/升(優選大約290-310毫滲摩爾/升)的重量摩爾滲透壓濃度。通常使用適當的有機或無機緩衝液(例如優選使用磷酸鹽緩衝液、tris緩衝液(三(羥甲基)氨基甲烷)、HEPES緩衝液([4-(2-羥乙基)哌嗪]乙烷磺酸)或MOPS緩衝液(3-嗎啉代-1-丙烷磺酸))調節藥物組合物的pH值。通常依賴於所需緩衝液的摩爾濃度選擇各個緩衝液。磷酸緩衝液適於例如注射和輸注溶液。
可以常規方式施用藥物組合物，例如通過口服劑型(例如片劑、膠囊)施用、通過黏膜(例如鼻腔或口腔)施用、以埋植於皮下的沉積物形式施用、通過含有根據本發明的藥物組合物的注射劑、浸劑或凝膠施用。還可能局部施用藥物組合物，如果合適的話以脂質體複合物的形式施用。此外，可通過透皮治療系統(TTS)進行治療，其使實時控制藥物組合物的釋放成為可能。TTS可從例如EP 0 944 398 A1、EP 0 916 336 A1、EP 0 889 723 A1或EP 0 852 493 A1中獲知。
如果只需給身體施用相對小量的溶液或懸浮液(例如約1-20ml)通常使用注射劑。如果施用較大數量的溶液或懸浮液(例如1升或多升)通常使用輸液劑。因此，不同於輸液劑，在注射劑的情況下只施用幾毫升，注射中pH值和血液或組織液滲透壓的微小差異使其自身不能察覺或僅使其自身在痛覺方面有無關緊要程度的察覺。通常不需要使用前稀釋本發明製劑。然而在施用相對大量的情況下，應該在施用前簡單地將本發明的製劑稀釋到至少獲得大約等滲溶液的程度。等滲溶液的實例為0.9％濃度的氯化鈉溶液。在輸注的情況下，可例如使用無菌水進行稀釋而可例如通過所謂的旁路進行施用。
本發明還涉及製備藥物組合物的方法，其包括下列步驟a)鑑定如上定義的IRS蛋白激酶抑制劑或激動劑，b)提供足量的IRS蛋白激酶抑制劑，和c)將IRS蛋白激酶抑制劑配製成藥物組合物，任選地組合可藥用載體。
本發明還通過下列實施例和
，其無意於限制本發明的範圍。
實施例實施例1A)材料寡核苷酸引物從MWG-Biotech(Ebersberg，Germany)獲得。BL21Codon Plus和QuikChangeTM定點誘變試劑盒從Stratagene(La Jolla，CA，USA)購買。One Shot TOP 10感受態細胞購自Invitrogen(Karlsruhe，Germany)。質粒小量製備試劑盒從Qiagen(Hilden，Germany)獲得。多克隆抗IRS-1抗血清由J.A.Maassen博士(Leiden，The Netherlands)惠贈。偶聯辣根過氧化物酶的抗磷酸酪氨酸抗體(RC20)和抗p85α抗體從Transduction Laboratories，Inc.(Lexington，KY，USA)獲得。單克隆抗IRβ抗體由Oncogene(Cambridge，MA，USA)提供。抗IRS-1pS616抗體購自Biosource(Camarillo，CA，USA)。作為增強化學發光(ECL)檢測的二級抗體的HRP綴合的抗兔和抗小鼠IgG抗體購自Promega Corp.(Mannheim，Germany)。蛋白激酶C來自大鼠腦(PKC-rb)，重組人蛋白激酶C-ζ、二吲哚馬來醯亞胺I(BIM)和PKC-ζ假底物抑制劑從Calbiochem(San Diego，CA，USA)獲得。α凝血酶購自Upstate Biotechnology Inc.(Lake Placid，NY，USA)。分子生物學所用的酶、完全蛋白酶抑制劑混合物和經修飾的測序級胰蛋白酶從Roche(Mannheim，Germany)獲得。岡田酸、磷脂醯絲氨酸和麥胚凝集素(小麥(Triticum vulgaris))購自SIGMA(München，Germany)。IRS-1肽由Hoffmann博士(BMFZ，University of Düsseldorf，Düsseldorf，Germany)合成。用於SDS-PAGE的化學試劑、GST基因融合載體pGEX-5X-3、穀胱甘肽Sepharose4B和[γ-32P]ATP由AmershamBiosciences(Freiburg，Germany)提供。GelCode Blue Stain試劑、RestoreTM蛋白質印跡剝離緩衝液和SuperSignal底物從Pierce(Rockford，USA)獲得。Biacore X和傳感器晶片CM5為Biacore(Freiburg，Germany)的產品。所有其他化學試劑為可商業購買的最高級別。
實施例2
方法1.)融合蛋白的構建和表達克隆到表達載體pGEX-2T中的牛PI3激酶的調節性p85α亞基由P.Shepherd博士(London，UK)惠贈。基於Smith和Johnson所述的方法(40)用pGEX-5X-3載體製備含有大鼠IRS-1 449-664胺基酸(rIRS-1449-664，分子量51.2kDa)的穀胱甘肽轉移酶(GST)融合蛋白。相應的大鼠cDNA由從大鼠心臟分離的RNA用鳥類成髓細胞白血病病毒逆轉錄酶通過逆轉錄產生並且隨後用Pwo DNA聚合酶通過聚合酶鏈式反應擴增，其使用下列寡核苷酸引物5′-引物，ATATTGTCGACCAC-ACCCCACCAGCCAGG，3′-引物，ATGTACTACTACAGAGGGTC-ACGCCGGCGTAAGAATA(SEQ ID NO1和2)。分離PCR產物，用適當的限制性內切酶消化並亞克隆到pGEX-5X-3中。通過限制性內切核酸酶分析和核苷酸測序證實大鼠IRS-1克隆的同一性。此載體和p85α-pGEX-2T構建體用於轉化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21。經轉化的細胞在添加0.1毫克/毫升氨苄青黴素的2x YTA培養基(16克/升的胰蛋白腖、10g/l克/升酵母提取物，NaCl 5克/升)中生長到A600nm為0.6-0.8並用0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導兩小時。通過親和層析在穀胱甘肽sepharose柱上純化融合蛋白並通過含10mM穀胱甘肽的50mM Tris-HCl(pH 8.0)洗脫。用PBS中的牛凝血酶蛋白水解去除p85αGST融合蛋白的GST部分。在結合於穀胱甘肽瓊脂糖柱的融合蛋白中加入蛋白酶並室溫孵育2小時，然後收集洗出液。用經修改的Bio-Rad蛋白質測定法測定蛋白質。當通過十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)分析時所有GST融合蛋白具有預期分子量。
2.)胰島素受體激酶的製備迅速摘取大鼠肝臟，在液氮中速凍並如所述處理(41)。簡言之，加入3.5體積/重量的冰冷緩衝液(由50mM Hepes(pH 7.4)、1％Triton X-100和2×完全蛋白酶抑制劑組成)並用Ultraturrax和Potter-Elvehjem勻漿器勻漿肝臟，然後於4℃10,000g離心10分鐘。得到的上清液於室溫緩慢攪拌60分鐘，然後於4℃100,000g再次離心90分鐘。然後將上清液加入結合瓊脂糖的麥胚凝集素(WGA)柱。柱子用50mM Hepes(pH 7.4)、0.1％Triton X-100清洗，用含0.3M N-乙醯葡糖胺的此緩衝液從WGA柱洗脫結合的糖蛋白。
3.)體外磷酸化測定為通過胰島素受體磷酸化rIRS-1449-664，5μg的WGA純化的糖蛋白級分於30℃與100nM胰島素在磷酸化緩衝液(含有20mM Hepes(pH 7.4)、1mM DTT、10mM MgCl2、100μg/ml牛血清白蛋白、0.2mM Na3VO4、1.7mM CaCl2、0.6mg/ml磷脂醯絲氨酸和0.5μg/ml岡田酸)中預孵育30分鐘。加入50μM濃度的ATP引發自磷酸化作用並於30℃持續10分鐘。加入等體積的rIRS-1449-669(1μg)引發底物磷酸化作用並允許在50μl終體積中繼續進行10分鐘，其中所述的rIRS-1449-669通過或不通過PKC同種型於30℃在含50μM ATP的相同緩衝液中預處理(30分鐘)。加入6×樣品緩衝液(0.35M Tris-HCl(pH 6.8)、10.28％(w/v)SDS、36％(v/v)甘油、0.6M DTT、0.012％(w/v)溴酚藍)終止反應並煮沸5分鐘。通過SDS-PAGE分離蛋白質並在轉移到硝酸纖維素上後用抗磷酸酪氨酸抗體通過免疫檢測分析。通過於30℃在含50μM ATP加上2μCi[γ-32P]ATP和終體積為20μl的磷酸化緩衝液中對1μg rIRS-1449-664與0.5μg PKC-rb或PKC-ζ孵育30分鐘評估不同PKC同種型對rIRS-1449-664的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化作用。通過SDS-PAGE解析蛋白質並染色然後幹膠用於放射自顯影。通過切割片段的Cerenkov計數確定磷酸摻入的程度。
4.)GST Pull Down測定體外磷酸化的rIRS-1449-664與穀胱甘肽瓊脂糖珠於4℃在旋轉器上孵育1小時。用結合緩衝液(50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、1％(v/v)Nonidet P-40、1mM EDTA、1mM NaF、1mM Na3VO4)洗滌沉澱3次。然後加入0.5μg重組p85α並繼續於4℃孵育2小時。洗滌三次之後，用20μl 2×樣品緩衝液洗脫結合的蛋白質並通過SDS-PAGE分離。
5.)免疫印跡用8-18％梯度凝膠通過SDS-PAGE分離蛋白質然後在半乾印跡裝置中轉移到硝酸纖維素上。膜在含0.05％Tween 20和1％BSA或5％脫脂奶粉的Tris緩衝鹽水中封閉60分鐘並用適當抗體(抗IRS-1抗體、抗pTyr抗體、抗p85α抗體)檢測。仔細洗滌之後，膜與綴合辣根過氧化物酶的二級抗體孵育，再次洗滌後在LumiImager工作站(Boehringer，Mannheim，Germany)上通過增強化學發光(ECL)方法觀察蛋白質條帶。用LumiImager軟體定量所有印跡。用無效假說和不成對數據的t統計評估所報告差異的顯著性。低於0.05的p值認為是統計學上顯著的。6.)通過高效液相層析(HPLC)和電噴離子化質譜(ESI-MS)進行磷酸肽作圖使用50U(40μg)的PKC-ζ，在上述條件下用50μM ATP加上0.25mCi/ml[γ-32P]ATP對5nmol的rIRS-1449-664蛋白質磷酸化60分鐘。通過SDS-PAGE分離蛋白質並且在切出的凝膠塊中於30℃用100μg胰蛋白酶過夜消化磷酸化的rIRS-1449-664。用50mM NH4HCO3、50％乙腈洗脫肽並用Beckman金溶劑遞送系統在陰離子交換柱(Nucleogel SAX 1000-8/46，50×4.6mm，Macherey Nagel，Düren，Germany)上分離。HPLC流速為0.5ml/min。注入樣品之後，從100％緩衝液A(20mM NH4CH3COOH，p7.0)和0％緩衝液B(1M KH2PO4，pH 4.0)開始洗脫肽。40分鐘內緩衝液B的數量增加到10％並且在接下來的75分鐘內為10-50％。收集0.5ml級分，通過Cerenkov計數法測量放射性。放射性級分用於反相HPLC。在C18反相柱(Nucleosil 300-5C18，250mm×2mm，顆粒大小5μm，孔徑300A，Macherey Nagel，Düren，Germany)上分離肽。調節HPLC流速到0.33毫升/分鐘。上完樣品後，從100％溶液A(0.1％TFA)和0％溶液B(乙腈/TFA(84/0.1；v/v))開始洗脫。在120分鐘內溶液B的含量提高到100％。再次測量所收集級分的放射性。含放射性肽的級分用於ESI-TOF質譜。用納噴射源(Protana，Odense，Denmark)在電噴射四極飛行時間質譜儀(QSTAR Pulsar I，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)上記錄質譜。以串聯質譜方式分析所選肽並通過手工判讀恢復序列和翻譯後修飾。
7.)定點誘變根據製造商的說明書使用QuikChangeTM定點誘變試劑盒通過定點誘變產生rIRS-1449-664的絲氨酸570到丙氨酸和絲氨酸612到丙氨酸的突變體，其中使用pGEX-5X-3/rIRS-1449-664作為模板。使用下列引物S570A，5′-CCCGGCTACCGGCATGCCGCCTTCGTGCCCACC(SEQ ID NO3)和3′-GGGCCGATGGCCGTACGGCGGAAGCACGGGTGG(SEQ IDNO4)；S612A，5′-GGCTACATGCCCATGGCTCCCGGAGTGGCTCC(SEQ ID NO5)和3′-CCGATGTACGGGTACCGAGGGCCTCACCGAGG(SEQ ID NO6)。
通過由Qiagen Sequencing Services(Hilden，Germany)測序重組分子確認所需突變的存在。
8.)通過表面等離振子共振技術研究相互作用BIAcoreTM生物傳感器(Biacore，Freiburg，Germany)的操作原理已在前描述(42)。為避免融合蛋白GST部分二聚化的幹擾，其在純化過程中用凝血酶切割。因為已知SH2結構域與磷酸肽的結合速率非常快，所以通過競爭測定法評估相對親和力(43)。因此，恆定濃度的p85α(100nM)在電泳緩衝液(0.01M Hepes pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性劑P20(HBS-EP))中與不同濃度(50nM-10μM)的競爭物肽孵育，這與結合到CM5傳感器晶片表面上的相同。室溫預孵育1小時後，在HBS-EP緩衝液中於25℃以5μl/min的流速依次注入各種混合物。所用肽DDGYMPMSPGV(SEQ ID NO7)、DDGpYMPMSPGV、DDGYMPMpSPGV和DDGpYMPMpSPGV(代表大鼠IRS-1的胺基酸605-615)在Applied Biosystems 433型肽合成儀上合成。所有的肽以5mg/ml的濃度在100mM H3BO4(NaOH pH 8.5)中以1μl/min通過製造商所述的標準胺偶聯方法固定。每一結合實驗後通過注入6M鹽酸胍進行2分鐘再生。用BIAevaluation 3.1軟體(Biacore，Freiburg，Germany)和GraphPad Prism 3.0(San Diego，CA，USA)進行p85α與pY608和pY606-pS612相互作用的動力學分析。
9.)測量PKC對rIRS-1449-664的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化通過吸取適當體積的1μg rIRS-1449-664和0.1-1.0μg PKC-ζ或PKC-大鼠腦到μl 2×磷酸化緩衝液(20mM Hepes(pH 7.4)、1mM DTT、10mMMgCl2、100μg/ml牛血清白蛋白、0.2mM Na3NO4、1.7mM CaCl2、0.6mg/ml磷脂醯絲氨酸和0.5μg/ml岡田酸，50μM ATP+2μCi[γ-32P]ATP)中評估不同PKC同種型對rIRS-1449-664的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化作用。用水調節混合物的體積到終體積為20μl減去必需的ATP體積。加入ATP貯存液到終濃度50μM ATP加上2μCi[γ-32P]ATP啟動磷酸化反應並於30℃孵育30分鐘。加入4μl 6×樣品緩衝液(0.35M Tris-HCl(pH 6.8)、10.28％(w/v)SDS、36％(v/v)甘油、0.6M DTT、0.012％(w/v)溴酚藍)停止反應並煮沸5分鐘。通過SDS-PAGE解析蛋白質，染色並幹膠後經放射自顯影分析。
實施例3IRS-1結構域受胰島素受體磷酸化並與PI3激酶相互作用為測定絲氨酸/蘇氨酸磷酸化對IRS-1與胰島素受體和PI3激酶相互作用的影響，我們用重組p85α和GST拆除法建立了體外磷酸化及PI3激酶相互作用測定法。克隆大鼠IRS-1蛋白質的所選部分，以GST融合蛋白形式表達並從大腸桿菌中純化。此GST融合蛋白(rIRS-1449-664)涵蓋大鼠IRS-1蛋白質的216個胺基酸(449-664)的結構域，其在YMXM或YXXM共有基序中含有可能的酪氨酸磷酸化位點，這包括主要的PI3激酶結合位點Tyr608和Tyr628(39)(見圖1)。基於所編碼的融合蛋白的結構計算出51.2kDa的分子量，通過SDS-PAGE確定表觀分子量為55kDa。圖2A中提供了體外磷酸化和p85α相互作用測定法的實驗流程。
將融合蛋白暴露於WGA純化的胰島素受體以誘導顯著的胰島素刺激的rIRS-1449-664酪氨酸磷酸化(圖2B，上面部分)。定量顯示了比基底高8.8±1.1倍的刺激(n＝10，圖2C)。GST拆除測定法表明PI3激酶的p85α調節亞基與酪氨酸磷酸化的rIRS-1449-664顯著增強的相互作用(圖2B，中間部分)。
實施例4不同PKC同種型抑制胰島素刺激的rIRS-1449-664酪氨酸磷酸化和隨後與p85α的聯繫為評估蛋白激酶C是否能在體外磷酸化rIRS-1449-664，我們首先在存在[32P]ATP條件下孵育融合蛋白與大鼠腦PKC和PKC-ζ。然後通過SDS-PAGE和放射自顯影分析rIRS-1449-664(圖3A)並且可檢測到PKC對rIRS-1449-664明顯的磷酸化。rIRS-1449-664在存在PKC抑制劑條件下與相同數量的PKC孵育不表現顯著的磷酸摻入(圖3A)。然後測定增加數量的PKC的劑量反應曲線以建立最大磷酸化的條件，其在0.5μg大鼠腦PKC或PKC-ζ下觀察到(數據未顯示)。然後我們使用此條件研究了rIRS-1449-664絲氨酸磷酸化對隨後由自磷酸化IR的活化的影響。因此，rURS-1449-664在用或不用PKC處理後與WGA純化的IR孵育。如圖2描述，隨後通過rIRS-1449-664的GST部分將其偶聯於穀胱甘肽瓊脂珠並與0.5μg p85α孵育確定p85α結合。樣品通過SDS-PAGE和用抗磷酸酪氨酸(pTyr)、p85α和IRS-1的抗體免疫印跡分析。如圖3B所示，用大鼠腦PKC預處理rIRS-1449-664造成胰島素刺激的酪氨酸磷酸化和與p85α相互作用的降低。rIRS-1449-664的酪氨酸磷酸化降低27±4％(n＝9)，p85α結合的抑制更顯著(49±8％)(圖3C)。rIRS-1449-664磷酸化之後加入二吲哚馬來醯亞胺(BIM)抑制PKC-rb未改變此結果(圖3C)。
為進一步排除IR水平上PKC的影響，檢測了β亞基的自磷酸化。與對照相比，在存在PKC-rb或PKC-ζ條件下當自體活化受體在30℃孵育30分鐘時沒有可檢測的IR自磷酸化的顯著變化(圖4)。
然後對PKC-ζ重複圖3B所述的實驗方法。當與PKC-rb比較時觀察到rIRS-1449-664酪氨酸磷酸化和與p85α相互作用甚至更顯著的降低(圖5A)。數據定量顯示酪氨酸磷酸化抑制了46±5％(n＝3)並且p85α與IRS-1的結合隨之抑制了81±1％(圖5B)。
實施例5PKC作用的IRS-1絲氨酸磷酸化位點的鑑定和功能分析前面的研究表明蛋白激酶C對胰島素信號的負調節包括有絲分裂原活化蛋白激酶和IRS-1中絲氨酸612的磷酸化(26)。絲氨酸612在Y608與主要的YMXM基序直接相鄰，該基序據描述為PI3激酶主要相互作用位點之一(39)。
我們用特異性IRS-1磷酸絲氨酸612抗體(αpS612)評估了PKC對這個位點的修飾。在30℃與大鼠腦PKC和PKC-ζ孵育30分鐘後，rIRS-1449-664與αpS612強烈的免疫印跡(圖6A)；用BIM抑制PKC明顯地阻止了這個絲氨酸的磷酸化。
使用了表面等離振子共振(SPR)技術描述IRS-1的磷酸絲氨酸612對與PI3激酶相互作用的影響。為此目的合成了具有DDGYMPMSPGV(SEQID NO7)序列(代表大鼠IRS-1的605-615胺基酸)的肽並通過標準的胺偶聯固定到晶片表面。已報導SH2結構域與GST的融合可能影響其與磷酸肽的結合，導致親和力的過高評估(44)。因此切割了重組p85α融合蛋白的GST部分。通過將多種濃度的經純化p85α用於偶聯了不同磷酸化形式肽的生物傳感器晶片，研究了p85α與肽的結合。這些實驗表明p85α僅與肽的酪氨酸磷酸化形式結合(圖6B和C)，這與文獻一致(45)。
然後我們通過在存在競爭性可溶肽的條件下監測100nM p85α與肽pY608(DDGpYMPMSPGV)和pY608-pS612(DDGpYMPMpSPGV)的結合測定了此反應的相對親和力(圖6D、E、F)。通過在平衡時注入的440s之後SPR反應對log肽濃度作圖獲得半最大抑制濃度(IC50)。兩種肽都表現可測量的結合活性(圖6D對6E)。溶解的肽在微摩爾濃度抑制p85α與固定肽的結合。在～10μM的肽濃度下實現完全抑制。將測定的讀數套用於兩點競爭的公式得到pY608的IC50為0.26μmol/l和16.56μmol/l(r2＝0.9983)，pY608-pS612的IC50為0.15μmol/l、2.88μmol/l(r2＝0.9989)。該數據清楚表明肽pY608-pS612以較好的效率抑制p85α的結合，表明在磷酸酪氨酸+4位置存在磷酸絲氨酸殘基甚至增加了p85αSH2結構域對IRS-1磷酸肽的親和力。
為鑑定rIRS-1449-664上其他可能在體外系統中促進胰島素促進抑制酪氨酸磷酸化的PKC-ζ磷酸化位點，將rIRS-1449-664與PKC-ζ孵育並通過SDS-PAGE分離。用胰蛋白酶消化磷酸化的rIRS-1449-664並從凝膠中提取。通過雙向HPLC解析消化產生的肽並通過Cerenkov計數法監測級分中的放射性含量。用陰離交換柱第一次分離的HPLC譜顯示了6個可重現的主峰(圖7A)。根據洗脫分布圖合併每一個峰的放射性級分以分離共遷移肽，並進行反相(RP)-HPLC(圖7B)。這產生10個不同的放射性標記的RP-HPLC級分，其隨後進行電噴離子化質譜(ESI-MS)。MS分析獲得的結果概括於表1中。可鑑定8種肽，涵蓋rIRS-1449-664序列的37％。發現兩個磷酸絲氨酸，陰離子交換HPLC第四個峰中的絲氨酸358(全長IRS-1中的絲氨酸570)(LPGYRHpSAFVPTHSYPEEGLEMHHLER(SEQ ID NO8))和第五個和第六個峰中的絲氨酸286(絲氨酸498)(YIPGATMGTpSPALTGDEAAGAADLDNR(SEQ ID NO9))。帶有絲氨酸358/570的磷酸肽與摻入放射性的大約19％對應。帶有絲氨酸286/498的肽提供全部測量放射性的11％。
磷酸絲氨酸358由ESI-MS/MS鑑定。與母離子具有97.9Da質量差異的碎片離子表明了磷酸肽的存在(圖8A)。質量差異97.9Da與磷酸的丟失相關。通過磷酸基(HPO3)和磷酸(H3PO4)從碎片離子b9和b10的丟失鑑定磷酸化位點。此碎片離子的去磷酸化表明磷酸化只能在Y355或S358處發生。因為未從b4離子中檢測到脫磷酸化，所以S358為磷酸胺基酸，這表明了在Y355處的磷酸化(數據未顯示)。
儘管通過磷酸位點特異性抗體檢測到(圖6A)，磷酸絲氨酸612不能通過質譜檢測，但是在第二個峰中檢測發現了包括此位點的肽以及三種其他的肽。第一個峰和第三個峰只含有分別涵蓋13％和21％的放射性的一種肽(THSAGTSPTISHQK和TPSQSSVVSIEEY-TEMMPAAYPPGGGSGGR)。(SEQ ID NO10和11)為進一步確認所發現的磷酸化位點為絲氨酸570和612，產生了另外兩個帶有絲氨酸到丙氨酸突變的GST融合蛋白。這些GST融合蛋白暴露於PKC-ζ並在與野生型相當的水平被酶磷酸化(數據未顯示)。另一方面，將絲氨酸358/570轉變成丙氨酸大大的降低了陰離子交換HPLC中的第四個峰(圖9B)，證明IRS-1的絲氨酸570為PKC-ζ作用的新磷酸化位點。絲氨酸400/612到丙氨酸的突變導致第二個峰的降低(圖9C)，證實了用磷酸特異性抗血清獲得的數據。
實施例6rIRS-1449-664中絲氨酸殘基570和612的功能相關性為確定所鑑定的磷酸位點的功能相關性，在體外磷酸化和p85α相互作用測定法中檢測rIRS-1449-664絲氨酸358/570到丙氨酸和絲氨酸400/612突變體(圖10A)。比較PKC-ζ預處理之後IR的酪氨酸磷酸化的結果表明野生型rIRS-1449-664和兩個突變體表現相當的降低(30-40％)(圖10B，左部分)。然而，當比較兩個突變體與p85α相互作用時顯著的差異變得很明顯。由此，通過PKC-ζ處理p85α與S570A的結合降低到對照的43±4％(n＝3)，rIRS-1449-664的S612A突變體降低到28±3％(圖10B，右部分)。
所用的縮寫為GST，穀胱甘肽S轉移酶；HPLC，高效液相層析；IR，胰島素受體；IRS，胰島素受體底物；ESI-MS，電噴離子化質譜；p85，磷脂醯肌醇(PI)-3激酶的調節亞基；PAGE，聚丙烯醯胺凝膠電泳；PI3激酶，磷脂醯肌醇-3激酶；RP，反相；PKC，蛋白激酶C；PKB，蛋白激酶B；RTKs，受體酪氨酸激酶；SH2，src同源性結構域2；WGA，麥胚凝集素；SDS，十二烷基硫酸鈉；ECL，增強的化學發光。
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圖例簡述圖1IRS-1與已知相互作用配偶體和已知絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點的圖示概括。
上面部分指出了血小板-白細胞C激酶底物同系(PH)結構域和磷酸酪氨酸結合(PTB)結構域的相對位置然後是含有大量酪氨酸磷酸化位點的C端尾部。也顯示了可能的結合配偶體，這包括PI3激酶、Grb2和SHP-2。中間部分突出了已知的(S307、612、632、789)和可能的絲氨酸磷酸化位點。下面部分含大鼠IRS-1的449-664胺基酸(包括主要的PI3激酶結合位點)的GST融合蛋白的構建。
圖2rIRS-1449-664的酪氨酸磷酸化和與PI3激酶的p85α亞基的相互作用。
(A)實驗流程示意圖。與100nM胰島素預孵育30分鐘後，5μgIR於30℃在磷酸化緩衝液中自磷酸化10分鐘。隨後在1μg rIRS-1449-664等分試樣中加入自磷酸化的IR引發底物磷酸化。反應進行10分鐘然後加入穀胱甘肽瓊脂糖珠，樣品於4℃在旋轉器上孵育1小時。用結合緩衝液洗滌沉澱三次，加入0.5μg重組p85α並繼續孵育2小時。洗滌之後，加入2×樣品緩衝液洗脫結合的蛋白質然後煮沸5分鐘。(B)如方法部分詳細敘述的，洗脫的蛋白質通過SDS-PAGE解析並通過用抗磷酸酪氨酸、p85α和IRS-1抗體的免疫印跡分析。顯示了6次單獨實驗中代表性的印跡。(C)用Lumi Imager軟體定量rIRS-1449-664酪氨酸磷酸化。數據為平均值±SEM(n＝10)。
圖3大鼠腦PKC對rIRS-1449-664的酪氨酸磷酸化和與p85α相互作用的影響。
(A)如方法中詳述，在存在2μCi(32P)-ATP(終濃度50μM)的條件下孵育1μg rIRS-1449-664與0.5μg大鼠腦PKC(PKC-rb)或0.5μgPKC-ζ。PKC-rb或PKC-ζ的反應分別由二吲哚馬來醯亞胺I(BIM)或假底物肽抑制。蛋白質通過SDS-PAGE解析並進行放射自顯影。(B)如圖2所述測定IR對rIRS-1449-664的酪氨酸磷酸化和與p85α的相互作用。rIRS-1449-664與0.5μgPKC-rb預孵育30分鐘。顯示了代表性的印跡。(C)PKC-rb對胰島素刺激的酪氨酸磷酸化和p85α相互作用的抑制作用的定量，把胰島素刺激值定為100％。當BIM存在的時候，在IR開始底物磷酸化前10分鐘加入BIM(見圖2)。數據為平均值±SEM(n＝6-9)。
圖4PKC同種型對IR自磷酸化的影響。
(A)如圖2所述進行IR的自磷酸化。自磷酸化10分鐘後加入PKC-rb或PKC-ζ並繼續孵育10分鐘。然後通過免疫印跡分析IRβ亞基的酪氨酸磷酸化。(B)用Lumi Imager軟體進行印跡的定量。數據為平均值±SEM(n＝4-6)。
圖5PKC-ζ對rIRS-1449-664的酪氨酸磷酸化和與p85α相互作用的影響。
(A)rIRS-1449-664與PKC-ζ(0.5μg)預孵育30分鐘。如圖2中詳述的，通過免疫印跡確定通過IR的酪氨酸磷酸化和與p85α的相互作用。(B)如圖3所述進行PKC-ζ抑制作用的定量。數據為平均值±SEM(n＝3)。
圖6用表面等離振子共振鑑定IRS-1絲氨酸612為PKC和與p85α相互作用分析的靶點。
(A)0.5μg rIRS-1449-664與0.5μg不同的PKCs在30℃孵育30分鐘並用抗磷酸絲氨酸612的抗體免疫印跡。顯示了代表性的實驗。(B)用表面等離振子共振使p85α與對應於帶有磷酸酪氨酸608或(C)不帶有磷酸酪氨酸的IRS-1胺基酸605-615的固定化肽(pY608-DDGpYMPMSPGV和Y608-DDGYMPMSPGV)結合。所用的p85α蛋白質濃度為(從下至上)1、5、10、25、50、100、250、500nM。(D)與可溶肽pY608-DDGpYMPMSPGV或(E)pY608-pS612-DDGpYMPMpSPGV競爭引起的p85α結合的抑制。可溶肽也固定到晶片上。(F)通過用平衡時的SPR反應(注入後440s)對log肽濃度作圖獲得半最大抑制濃度(IC50)。pY608的IC500.26μmol/l、16.56μmol/l、pY608-pS612的IC500.15μmol/l、2.88μmol/l。
圖7HPLC分析來自PKC-ζ磷酸化的rIRS-1449-664的胰蛋白酶消化磷酸肽段。
用0.5nmol PKC-ζ磷酸化5納摩爾rIRS-1449-66460分鐘。通過SDS-PAGE分離蛋白質並且用胰蛋白酶消化切下的rIRS-1449-664。通過離子交換(A)和C18反相HPLC(B)分離回收的32P標記肽混合物。通過Cerenkov計數法測定所收集級分的放射性。反相HPLC之後通過質譜分析放射性級分。
圖8磷酸肽352-378的ESI-MS/MS譜。
(A)母離子[M+4H]4+＝818.11上正磷酸的丟失，表明了磷酸化作用。(B)碎片離子b9和b10的去磷酸化，表明了磷酸化位點。
圖9rIRS-1449-664和突變體S570A和S612A的胰蛋白酶消化磷酸肽段的HPLC分析。
顯示了從用重組PKC-ζ磷酸化的野生型rIRS-1449-664(A，)、rIRS-1449-664S570A(B)和rIRS-1449-664S612A(C)產生的胰蛋白酶消化肽段的HPLC分析。提供了代表性的HPLC譜。
圖10絲氨酸570和絲氨酸612的功能分析。
(A)如圖5所述，rIRS-1449-664和所指示的突變體與PKC-ζ預孵育並進行IR對酪氨酸的磷酸化和與p85α的相互作用。顯示了代表性的蛋白質印跡。
(B)用Lumi Imager軟體定量印跡，數據以相對於設定為100％的胰島素刺激的對照值定為100％表示。結果為平均值±SEM(n＝3)。
表1rIRS1449-664磷酸肽的序列分析結果
a陰離子交換HPLC和反相HPLC之後通過質譜分析rIRS-1449-664的胰蛋白酶消化肽段。磷酸化的絲氨酸殘基以下劃線標出。b根據穀胱甘肽轉移酶加上IRS-1胺基酸449-664的組成序列的編號。c陰離子交換HPLC的峰(數字)(見圖7A)。d摻入鑑定的磷酸肽的放射性總量定為100％並且給出的百分率代表綜合的峰面積。
序列表110塞諾菲-安萬特德國有限公司120鑑定IRS蛋白激酶抑制劑或拮抗劑的方法130DEAV 2003/006116017170PatentIn版本3.1210121129212DNA213人工序列220
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Thr Gln Arg Pro Gly Glu Pro Glu Glu Gly Ala Arg His Gln His Leu770 775 780Arg Leu Ser Ser Ser Ser Gly Arg Leu Arg Tyr Thr Ala Thr Ala Glu785 790 795 800Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Asp Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Cys805 810 815Gly Ala Arg Pro Glu Ser Ser Val Thr His Pro His His His Ala Leu820 825 830Gln Pro His Leu Pro Arg Lys Val Asp Thr Ala Ala Gln Thr Asn Ser835 840 845Arg Leu Ala Arg Pro Thr Arg Leu Ser Leu Gly Asp Pro Lys Ala Ser850 855 860Thr Leu Pro Arg Val Arg Glu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln865 870 875 880Gln Ser Ser Leu His Pro Pro Glu Pro Lys Ser Pro Gly Glu Tyr Val885 890 895Asn Ile Glu Phe Gly Ser Gly Gln Pro Gly Tyr Leu Ala Gly Pro Ala900 905 910Thr Ser Arg Ser Ser Pro Ser Val Arg Cys Leu Pro Gln Leu His Pro915 920 925
Ala Pro Arg Glu Glu Thr Gly Ser Glu Glu Tyr Met Asn Met Asp Leu930 935 940Gly Pro Gly Arg Arg Ala Thr Trp Gln Glu Ser Gly Gly Val Glu Leu945 950 955 960Gly Arg Val Gly Pro Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ser Ile Cys Arg Pro965 970 975Thr Arg Ser Val Pro Asn Ser Arg Gly Asp Tyr Met Thr Met Gln Ile980 985 990Gly Cys Pro Arg Gln Ser Tyr Val Asp Thr Ser Pro Val Ala Pro Val995 10001005Ser Tyr Ala Asp Met Arg Thr Gly Ile Ala Ala Glu Lys Val Ser101010151020Leu Pro Arg Thr Thr Gly Ala Ala Pro Pro Pro Ser Ser Thr Ala102510301035Ser Ala Ser Ala Ser Val Thr Pro Gln Gly Ala Ala Glu Gln Ala104010451050Ala His Ser Ser Leu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Met105510601065Ser Ala Phe Thr Arg Val Asn Leu Ser Pro Asn His Asn Gln Ser107010751080Ala Lys Val Ile Arg Ala Asp Thr Gln Gly Cys Arg Arg Arg His108510901095Ser Ser Glu Thr Phe Ser Ala Pro Thr Arg Ala Ala Asn Thr Val110011051110
Ser Phe Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser111511201125Glu Asp Val Lys Arg His Ser Ser Ala Ser Phe Glu Asn Val Trp113011351140Leu Arg Pro Gly Asp Leu Gly Gly Ala Ser Lys Glu Ser Ala Pro114511501155Gly Cys Gly Ala Ala Gly Gly Leu Glu Lys Ser Leu Asn Tyr Ile116011651170Asp Leu Asp Leu Val Lys Asp Val Lys Gln His Pro Gln Asp Cys117511801185Pro Ser Gln Gln Gln Ser Leu Pro Pro Pro Pro Pro His Gln Pro119011951200Leu Gly Ser Asn Glu Gly Ser Ser Pro Arg Arg Ser Ser Glu Asp120512101215Leu Ser Thr Tyr Ala Ser Ile Asn Phe Gln Lys Gln Pro Glu Asp122012251230Arg Gln123521017211216212PRT
213人工序列220
223肽40017Pro Pro Ala Arg Gly Glu Glu Glu Leu Ser Asn Tyr Ile Cys Met Gly1 5 10 15Gly Lys Gly Ala Ser Thr Leu Thr Ala Pro Asn Gly His Tyr Ile Leu20 25 30Ser Arg Gly Gly Asn Gly His Arg Tyr Ile Pro Gly Ala Thr Met Gly35 40 45Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ala Ala Gly Ala Ala Asp Leu50 55 60Asp Asn Arg Phe Arg Lys Arg Thr His Ser Ala Gly Thr Ser Pro Thr65 70 75 80Ile Ser His Gln Lys Thr Pro Ser Gln Ser Ser Val Val Ser Ile Glu85 90 95Glu Tyr Thr Glu Met Met Pro Ala Ala Tyr Pro Pro Gly Gly Gly Ser100 105 110Gly Gly Arg Leu Pro Gly Tyr Arg His Ser Ala Phe Val Pro Thr His115 120 125
Ser Tyr Pro Glu Glu Gly Leu Glu Met His His Leu Glu Arg Arg Gly130 135 140Gly His His Arg Pro Asp Ser Ser Asn Leu His Thr Asp Asp Gly Tyr145 150 155 160Met Pro Met Ser Pro Gly Val Ala Pro Val Pro Ser Asn Arg Lys Gly165 170 175Asn Gly Asp Tyr Met Pro Met Ser Pro Lys Ser Val Ser Ala Pro Gln180 185 190Gln Ile Ile Asn Pro Ile Arg Arg His Pro Gln Arg Val Asp Pro Asn195 200 205Gly Tyr Met Met Met Ser Pro Ser
權利要求
1.鑑定IRS蛋白激酶抑制劑的方法，其包括以下步驟a)在存在至少一種推定抑制劑的條件下使PKC-ζ與包含至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點的至少一種IRS肽接觸，b)測量PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點的磷酸化。
2.權利要求1的方法，其中與不存在至少一種推定抑制劑條件下的磷酸化相比PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點降低的磷酸化為推定抑制劑抑制性質的標誌。
3.權利要求1或2的方法，其中PKC-ζ為哺乳動物來源，優選為人或齧齒動物來源，更優選為大鼠或人來源。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中IRS肽來自哺乳動物的IRS，優選IRS-1，優選來自人或齧齒動物的IRS，更優選來自大鼠的IRS。
5.權利要求4的方法，其中IRS-1為大鼠來源並且其中至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點選自絲氨酸458、469、481、498、522、526、530、536、538、539、542、560、570、577、599、600、612、620、632、635、662和664，其中序列編號與SEQ ID NO16中描述的大鼠IRS-1對應。
6.權利要求5的方法，其中PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點選自Ser498、Ser570和Ser612，優選Ser570。
7.權利要求6的方法，其中肽為rIRS-1449-664(SEQ ID NO17)。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中抑制劑選自抗體、結合肽、低分子量化合物(LMWs)。
9.鑑定IRS激動劑的方法，其包括以下步驟a)在存在至少一種包含至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點的推定激動劑條件下使PKC-ζ與至少一種包含至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點的IRS肽接觸，b)測量推定激動劑PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點的磷酸化。
10.權利要求9的方法，其中激動劑的PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點與IRS肽的PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點磷酸化相比增加的磷酸化為推定激動劑對抗性質的標誌。
11.權利要求9或10的方法，其中PKC-ζ為哺乳動物來源，優選為人或齧齒動物來源，更優選為大鼠來源。
12.權利要求9-11中任一項的方法，其中IRS肽來自哺乳動物的IRS，優選IRS-1，優選地來自人或齧齒動物的IRS，更優選為大鼠來源。
13.權利要求12的方法，其中IRS為大鼠來源並且其中至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點選自絲氨酸458、469、481、498、522、526、530、536、538、539、542、560、570、577、599、600、612、620、632、635、662和664，其中序列編號與SEQ ID NO16中所述的大鼠IRS對應。
14.權利要求13的方法，其中PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點選自Ser498、Ser570和Ser612，優選Ser570。
15.權利要求14的方法，其中肽為rIRS-1449-664(SEQ ID NO17)。
16.測定PKC-ζ活性的方法，其包括下列步驟a)在存在至少一種推定抑制劑的條件下使PKC-ζ與至少一種包含至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點的IRS肽接觸，並且b)測量PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點的磷酸化。
17.權利要求16的方法，其中PKC-ζ為哺乳動物來源，優選為人或齧齒動物來源，更優選為大鼠來源。
18.權利要求16或17的方法，其中IRS肽來自哺乳動物的IRS，優選IRS-1，優選為人或齧齒動物來源，更優選為大鼠來源。
19.權利要求18的方法，其中IRS為大鼠來源並且其中至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點選自絲氨酸458、469、481、498、522、526、530、536、538、539、542、560、570、577、599、600、612、620、632、635、662和664，其中序列編號與SEQ ID NO16中所述的大鼠IRS對應。
20.權利要求19的方法，其中PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點選自Ser498、Ser570和Ser612，優選Ser570。
21.權利要求20的方法，其中肽為rIRS-1449-664(SEQ ID NO17)。
22.包含Ser570的IRS-1肽，優選為IRS-1449-664。
23.試劑盒，其包含a)至少一種IRS肽，b)PKC-ζ製品，和c)任選地包含至少一種推定的IRS蛋白激酶抑制劑或激動劑。
24.權利要求23的試劑盒，其中PKC-ζ為哺乳動物來源，優選為人或齧齒動物來源，更優選為大鼠來源。
25.權利要求23或24的試劑盒，其中IRS肽來自哺乳動物的IRS，優選IRS-1，優選為人或齧齒動物來源，更優選為大鼠來源。
26.權利要求25的試劑盒，其中IRS為大鼠來源並且其中至少一個PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點選自絲氨酸458、469、481、498、522、526、530、536、538、539、542、560、570、577、599、600、612、620、632、635、662和664，其中序列編號與SEQ ID NO16中所述的大鼠IRS對應。
27.權利要求26的試劑盒，其中PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點選自Ser498，Ser570和Ser612，優選Ser570。
28.權利要求27的試劑盒，其中肽為rIRS-1449-664(SEQ ID NO17)。
29.IRS-1肽，其中Ser570和/或Ser612被突變，優選突變成丙氨酸。
30.權利要求3-7定義的IRS肽的用途，用於產生抗體，優選產生抗PKC-ζ絲氨酸磷酸化位點抗體，優選產生抗Ser498、Ser570和Ser612的抗體，更優選產生抗Ser570的抗體。
31.權利要求3-7定義的IRS肽或權利要求29的IRS-1肽用於製備治療II型糖尿病的藥物組合物的用途。
32.製備藥物組合物的方法，其包括下列步驟d)根據權利要求1-15鑑定IRS蛋白激酶抑制劑或激動劑，e)提供足量的IRS蛋白激酶抑制劑，並且f)將IRS蛋白激酶抑制劑製備到藥物組合物中，任選地與可藥用載體組合。
全文摘要
本發明涉及鑑定IRS蛋白激酶抑制劑的方法，其包括下列步驟a)在存在至少一種推定抑制劑的條件下使PKC－ζ與至少一種包含至少一個PKC－ζ絲氨酸磷酸化位點的IRS肽接觸和b)測量PKC－ζ絲氨酸磷酸化位點的磷酸化。
文檔編號G01N33/573GK1836164SQ200480023533
公開日2006年9月20日 申請日期2004年7月16日 優先權日2003年8月16日
發明者N·特納格爾斯, J·埃克爾, S·梅茨格, M·佐默費爾德 申請人:塞諾菲-安萬特德國有限公司