巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)DAS啟動子變體的製作方法

2023-12-10 04:31:41 5

專利名稱：巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) DAS啟動子變體的製作方法
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastor is) DAS啟動子變體涉及序列表本申請含有計算機可讀形式的序列表，所述計算機可讀形式通過提述併入本文。 發明領域本發明涉及包含畢赤酵母DAS啟動子變體的分離的多核苷酸，包含可操作地連接 於編碼目標多肽的多核苷酸的所述啟動子變體的DNA構建體，包含所述DNA構建體的表達 載體，包含所述DNA構建體或表達載體的宿主細胞，產生目標多肽的方法，包含UAS的啟動 子和UAS用於增加轉錄的用途。
背景技術：
真核生物廣泛在產業上用作宿主細胞以供產生用於，例如，藥物和工業應用的多 肽。操縱基因轉錄和表達的能力給出了提供更高生產得率的基礎。常規地，基因在真核生物中的最大表達是通過在染色體中擴增表達盒來實現 的，所述表達盒包含可操作地連接於編碼目標多肽的基因的單一啟動子，以及擴增物 (amplifier)選擇性標誌物。經常需要受控的表達。在甲基營養型酵母中，長期以來已知某些啟動子依賴於 生長培養基中甲醇的存在以供誘導轉錄。然而，此通過甲醇誘導需要其他因子的存在，並 未闡明這些因子作用的確切機理。已知來自酵母的正因子(positive factor)的實例包 括Mxrlp，其被描述為在巴斯德畢赤酵母中利用甲醇所需的關鍵正調節子(Lin-Cereghino 等，2006，Mol Cell Biol 26(3) :883-897)。這些甲醇依賴性啟動子的實例描述於幾種屬於已知為甲基營養型酵母的酵母組 中的酵母細胞。在這些生物中調控甲醇代謝中牽涉的酶的表達的啟動子特別強，且這些啟 動子通常在酵母中用於調控蛋白質的異源表達。然而，用於培養這些宿主細胞的特定碳源 對甲醇代謝啟動子的調節具有巨大影響。甲醇和甘油被認為是對甲基營養型酵母表達系統 的充分底物，而葡萄糖被認為不充分(EP 299108) 0因此，如果能使已知由甲醇代謝啟動子 的表達對底物的依賴性減少是合意的。

發明內容
本發明提供了改進的畢赤酵母DAS啟動子的變體以供增加目標多肽的表達。在第一個方面，本發明涉及分離的多核苷酸，其包含i)由來自畢赤酵母屬的DAS 啟動子序列或其功能性部分組成的核苷酸序列，其中所述DAS啟動子包含於SEQ ID NO 1 ； 和ii)至少一個其他的UAS，其中所述UAS包含於SEQ ID NO :2。在第二個方面，本發明涉及包含本發明多核苷酸序列(修飾的DAS啟動子)的DNA 構建體，所述多核苷酸序列可操作地連接於編碼目標多肽的結構基因和終止子。在第三個方面，本發明涉及包含本發明DNA構建體的表達載體，還包含信號肽編 碼區。在第四個方面，本發明涉及包含本發明表達載體的畢赤酵母屬宿主細胞。
在第五個方面，本發明涉及產生目標多肽的方法，包括(a)在有益於產生目標多肽的條件下培養本發明的宿主細胞；和(b)回收所述多肽。在第六個方面，本發明涉及包含選自下組的UAS的啟動子i) (a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 2具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補鏈雜交；或ii) (a)包含SEQ ID NO 3或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補鏈雜交；和其中根據⑴或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多於一個拷貝存在。在第七個方面，本發明涉及UAS用於增加由啟動子的轉錄的用途，其中所述UAS選 自下組i) (a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 2具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補鏈雜交；或ii) (a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補鏈雜交；和其中根據⑴或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多於一個拷貝存在。附圖簡述

圖1顯示對SEQ ID NO 1所示的DAS啟動子的缺失分析。圖2顯示DAS啟動子變體具有的內部缺失的位置，和所採用的引物的編號。圖3顯示本發明具有多個UAS的DAS啟動子變體。如圖所示從NsiI位點開始並 包括編碼肌醇六磷酸酶N端的區域的pDAS wt2的DNA序列對應於SEQ ID NO :6。圖4顯示所述DAS啟動子在-255位左右具有內部缺失的另外的缺失變體。定義
同一性就本發明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如 EMBOSS 禾呈· 1 (EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等，2000,見上)(優選版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中執行的 Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970,見上)測定。使用的任選參數是缺 口開啟罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩 陣。將標記為「最長同一性」的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一 性並且是如下計算的(相同的脫氧核糖核苷酸χ100)/(比對的長度-比對中的缺口總數)雜交就本發明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴格條件下與標 記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應於所述序列，例如，SEQ IDNO :7;其全長互補鏈；或 其亞序列。可使用例如X射線片(X-ray film)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在 42°C，在5X SSPE、0. 3% SDS、200y g/ml已剪切並且變性的鮭精DNA中，並且對於非常低和 低嚴格性為25%的甲醯胺、對於中和中-高嚴格性為35%的甲醯胺、或對於高和非常高嚴 格性為50%的甲醯胺，根據標準的Southern印跡步驟進行預雜交和雜交最佳12至M小 時。對於長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2X SSC、0. 2% SDS優選在45°C (非 常低嚴格性)，更優選在50°C (低嚴格性)，更優選在55°C (中嚴格性)，更優選在 60°C (中-高嚴格性)，甚至更優選在65°C (高嚴格性)，並且最優選在70°C (非常高嚴格 性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴格條件定義為在比 使用*艮據 Bolton 禾P McCarthy 計算法(1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48 :1390)計算的 Tm 低大約 5°C至大約 10°C，在 0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7. 6,6mM EDTA,0. 5% NP-40, IXDenhardt 溶液，ImM 焦磷酸鈉，ImM 磷酸二氫鈉(sodium monobasic phosphate)，0. ImMATP 和 0. 2mg 每 ml 的酵母 RNA 中，根據標準的 Southern 印跡 步驟進行預雜交、雜交和雜交後洗滌最佳12至M小時。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6X SSC加0. 1% SDS中洗滌一次15分鐘，並用6X SSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗 滌兩次，每次15分鐘。亞序列術語「亞序列」在本文中定義為從SEQ ID NO :1序列5，和/或3，端具 有一個或多個(幾個)核苷酸缺失的核苷酸序列；其中所述亞序列具有啟動子活性(因此 為其功能性部分)。在一個優選方面，亞序列包含SEQ ID NO :1的至少755個核苷酸，更優 選SEQ ID NO 1的至少555個核苷酸，甚至更優選SEQ ID NO 1的至少455個核苷酸，且最 優選SEQ ID NO :1的至少355個核苷酸，分別對應於SEQ ID NO :1的301-1055、501_1055、 601-1055 和 701-1055 位。分離的多核苷酸術語「分離的多核苷酸」用於本文中指從來源分離的多核苷酸。 在一個優選的方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述多核苷酸為至少純，優選至少5% 純，更優選至少10 %純，更優選至少20 %純，更優選至少40 %純，更優選至少60 %純，甚至 更優選至少80%純，並且最優選至少90%純。
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基本上純的多核苷酸術語「基本上純的多核苷酸」用於本文指多核苷酸製備物， 其不含其它外來的或不期望的核苷酸，並且處於適合於在遺傳工程蛋白質生產體系中使 用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多 6 %，更優選至多5 %，更優選至多4%，更優選至多3 %，甚至更優選至多2 %，最優選至多 1 %，並且甚至最優選至多0. 5%的與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上 純的多核苷酸可以包括天然存在的5』和3』非翻譯區，如啟動子和終止子。優選基本上純的 多核苷酸是按重量計至少90%純，優選至少92%純，更優選至少94%純，更優選至少95% 純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，甚至更優選至少98%純，最優選至少99%，並 且甚至最優選至少99. 5%純的。本發明的多核苷酸優選為基本上純的形式，即所述多核苷 酸製備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。所述多核 苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。cDNA:術語「cDNA」在本文中定義為能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已 剪接的mRNA分子製備的DNA分子。cDNA缺少通常存在於相應基因組DNA中的內含子序列。 起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然後作為成 熟的已剪接的mRNA出現。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因而源自 mRNA的cDNA沒有任何內含子序列。核酸構建體術語「核酸構建體」用於本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分 子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在於(not otherwise exist)自 然界中的方式修飾以含有核酸的區段或所述核酸分子是合成的。當所述核酸構建體含有表 達本發明的編碼序列所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語「表達盒」同義。調控序列(control sequence)術語「調控序列」在本文定義為包括對編碼本發明 多肽的多核苷酸表達是必需的所有組分。各個調控序列對於編碼所述多肽的核苷酸序列可 以是天然的或外源的，或各個調控序列對於彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包 括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少 的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和目的為引入特異 性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核苷酸序列 編碼區的連接。可操作地連接術語「可操作地連接」在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置 於相對於多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導多肽編碼序列的表達。表達術語「表達」包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉錄後修 飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。表達載體術語「表達載體」在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含編 碼本發明多肽的多核苷酸，並且所述多核苷酸與提供用於其表達的額外核苷酸可操作地連 接。宿主細胞如本文中所使用的術語「宿主細胞」包括任何細胞類型，所述細胞類 型對於使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的 (susceptible)0外源術語「外源」在本文中意指，根據本發明的上遊激活序列(UAS)來源於不同 的來源，其中「來源」可指基因或細胞。因此，舉例而言，UAS通常見於巴斯德畢赤酵母DAS啟動子的啟動子區，然而，其可根據本發明用於不同的，天然地不含所述UAS的啟動子。因 此所述UAS可來源於來自相同細胞的不同基因，或其可來源於遺傳上不同的細胞/物種的 功能等同基因。
具體實施例方式本發明涉及多肽由甲醇誘導型啟動子的受控表達。這些啟動子的實例已經在屬於 已知為甲基營養型酵母的酵母組的幾種酵母細胞中描述。在本發明的上下文中，將甲基營 養型酵母定義為能夠利用甲醇作為唯一碳源用於它們的生長的一組酵母。在這些生物中與 甲醇代謝有關的酶的啟動子是特別強的，並且這些啟動子(甲醇代謝啟動子)通常用於調 控酵母中蛋白質的異源表達。甲基營養型酵母宿主細胞的已知成員屬於選自下組的屬畢赤酵母屬(Pichia)、 漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、球擬酵母屬(Torulopsis)。根據本發 明，在一個實施方案中，畢赤酵母屬宿主細胞可以選自下組巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵 母(Pichia methanolica)、安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)、嗜熱甲醇畢赤酵母(Pichia thermomethanolica)。漢遜酵母屬或假絲酵母屬宿主細胞可以選自下組多形漢遜酵母 (Hansenulapolymorpha)和博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)。先前已經分離並在文獻中描述了幾種啟動子，通過向生長培養基中添加甲醇，可 以控制異源多肽由所述啟動子的表達。這些啟動子包括但不限於例如AOXl啟動子(醇氧 化酶啟動子)、DHAS啟動子(或DAS啟動子)(二羥基丙酮合酶啟動子)、FDH啟動子(或 FMDH啟動子)(甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase)啟動子)、Μ0Χ啟動子(甲醇氧化酶 啟動子)、A0X2啟動子、ZZA1、PE)(5-、PEX8-、PEX14-啟動子。具體地，與本發明相關的啟動 子是二羥基丙酮合酶(DAS或DHAQ啟動子通常地，所有上述啟動子都要求存在甲醇用於它們的誘導。這種甲醇誘導要求 存在其他因子(如轉錄因子)，然而，這些因子的確切作用機制尚未闡明。在酵母中，例 如Mxrlp，已經被描述為巴斯德畢赤酵母中甲醇利用所需的關鍵正調節子(Lin-Cereghino 等，2006，Mol Cell Biol 26(3) :883-897)。本發明的發明人之前發現，由來自巴斯德畢赤酵母的Prml基因編碼的單一正因 子的受控表達，如其它地方(共同未決的申請WO 2008/090211，優先權日2007年1月沈 日)所述，可足以在生長培養基中無需甲醇而誘導由幾種甲醇誘導型啟動子的轉錄。這已 經使用Prml蛋白質作為正活化子的模式蛋白(model protein)，和使用AOXl或DAS啟動子 用於報告子多肽(importer polypeptide)的受控表達而證明。獲得的結果顯示，僅通過控 制prml基因的表達，且在生長培養基中不存在甲醇的情況下誘導AOXl或DAS啟動子是可 能的。正調節子Prml的作用機理並未闡明，但一個可能性是所述調節子結合甲醇誘導 型啟動子的啟動子區，本發明的發明人已經在包含來自巴斯德畢赤酵母的DAS啟動子的 DNA序列中鑑定了一個可能包含Prml結合區的上述區域。如其它地方(W02008/090211/PCT/EP2008/050870)所述，可在 1055bp 的片段 (SEQ ID NO 1)上獲得包含來自巴斯德畢赤酵母DAS啟動子的片段。為了測試啟動子活性以供分析經修飾的啟動子變體，所述啟動子需要可操作地連接於報導子基因。可使用其表達可方便地確定的任何基因。合適的報導子基因可為布氏 檸檬酸桿菌(CitrcAacter braakii)肌醇六磷酸酶基因，所述基因經密碼子優化以供在畢 赤酵母屬中表達，並與來自釀酒酵母的α因子信號肽在框內融合。編碼所述信號肽的核 酸序列還可有利地經密碼子優化以供畢赤酵母屬表達。上述報導子基因構建體的完整DNA 序列示於SEQ ID NO :4(關於如何構建該報導子基因構建體的細節，參見共同未決的申請 W02008/090211)。所述α因子信號肽編碼SEQ ID NO :4的1-255位。然後所述報導子基 因可與包含DAS啟動子的片段(SEQ ID NO 1)融合。一種上述構建體示於SEQ ID NO :5， 其包含所述啟動子和所述肌醇六磷酸酶基因的起始。信號肽的起始密碼子可見於SEQ ID NO :5 的 1065 位。使用插入合適表達載體(任何支持在畢赤酵母屬中表達的載體)的上述構建體進 行缺失分析。根據這些分析，如在實施例中詳細解釋的，可得出結論所述1055bp DAS啟動 子片段(SEQ ID NO 1)包含似為上遊激活序列(Upstream Activating Sequence, UAS)的 區域。該UAS序列似包含於IOObp片段(SEQ ID NO 1中的701-800位)。當該片段以1、 2或3個拷貝添加至所述1055bp片段的亞序列時，可觀察到啟動子活性的顯著增加。因此 巴斯德畢赤酵母DAS啟動子包含於1055bp片段，而UAS包含於IOObp片段。因此，在一個實施方案中，本發明涉及分離的多核苷酸，其包含i)由來自畢赤酵母屬的DAS啟動子序列組成的核苷酸序列，或其功能性亞序列， 其中所述DAS啟動子包含於SEQ ID NO 1 ；和ii)至少一個其他UAS，其中所述UAS包含於SEQ ID NO :2。根據進行的分析可見，在另一個實施方案中，DAS啟動子包含於對應SEQ ID NO=I 的201-1055位的855bp亞序列，特別是包含於對應SEQ ID NO 1的301-1055位的755bp 亞序列，更特別是包含於對應SEQ ID NO 1的401-1055位的655bp亞序列，更特別是包含 於對應SEQ ID NO :1的501-1055位的555bp亞序列，更特別是包含於對應SEQ ID N0:1的 601-1055位的455bp亞序列，更特別是包含於對應SEQ ID NO 1的701-1055位的!355bp亞 序列。通過分析所述啟動子序列，揭示了另外3個可能的TATA盒，分別在SEQID NO :1的 882、955和1002位。在一個實施方案中，啟動子至少包含在882位的TATA盒。在另一個實 施方案中，啟動子至少包含在955位的TATA盒。還在另一個實施方案中，啟動子至少包含 在1002位的TATA盒。UAS包含於對應SEQ ID NO 1的701-800位的IOObp亞序列。然而，所述UAS可 小於lOObp。在所述IOObp亞序列內，在SEQ ID NO :1中767-788位的大約20bp似對正常 功能是必需的。因此，在另一個實施方案中，所述UAS至少包含SEQ ID NO :1中767-788位的亞序 列。添加更多其他的UAS會更增加啟動子活性。添加三個其他的UAS時觀察到最高活 性。因此，在一個實施方案中，根據本發明的啟動子包含至少兩個其他的UAS,特別是至少三 個其他的UAS,更特別是至少四個其他的UAS,且甚至更特別是至少五個其他的UAS0然而，可預見這些數字不會無限增加，當其他的UAS數目變得過高時，也會增加正 活化子Prml的表達，或者可增加Mxrl正活化子的水平。
在一個實施方案中，根據本發明的經修飾的DAS啟動子包含一個其他的UAS，其位 於SEQ ID N0:1855bp亞序列的上遊。因此，一個實施方案涉及本發明的分離的多核苷酸， 其中所述啟動子選自下組a)包含SEQ ID NO 7的77_擬8位，特別是77-901位，更特別是77_948位的多核 苷酸，或由SEQ ID NO 7的77-8 位，特別是77-901位，更特別是77-948位組成的多核苷 酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 7的77-8 位，特別是77-901位，更特別是77-948位具有至少90%同一性，優選至少 95 %，更優選至少97 %，甚至更優選至少99 %同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高 嚴格條件下與SEQ ID NO 7的77-擬8位，特別是77-901位，更特別是77-948位或其全長 互補鏈雜交。在另一個實施方案中，根據本發明經修飾的DAS啟動子包含兩個其他UAS，其位於 SEQ ID N0:1的855bp亞序列的上遊。因此，一個實施方案涉及本發明的分離的多核苷酸， 其中所述啟動子選自下組a)包含SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位的多 核苷酸，或由SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位組成的多
核苷酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位具有至少90%同一性，優選至少 95 %，更優選至少97 %，甚至更優選至少99 %同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高 嚴格條件下與SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位或其全長 互補鏈雜交。在另一個實施方案中，根據本發明經修飾的DAS啟動子包含三個其他UAS，位於 SEQ ID N0:1的855bp亞序列的上遊。因此，一個實施方案涉及本發明的分離的多核苷酸， 其中所述啟動子選自下組a)包含SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位的 多核苷酸，或由SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位組成 的多核苷酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位具有至少90%同一性，優選至 少95 %，更優選至少97 %，甚至更優選至少99 %同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高 嚴格條件下與SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位或其全 長互補鏈雜交。所述經修飾的本發明DAS啟動子對在畢赤酵母屬，且例如在多形漢遜酵母和博伊 丁假絲酵母或其他甲基營養型酵母中表達任何目標多肽是有用的。因此，在另一個方面，本 發明涉及包含本發明的多核苷酸序列(經修飾的DAS啟動子)的DNA構建體，所述多核苷酸序列可操作地連接於編碼目標多肽的結構基因和終止子。所述經修飾的本發明DAS啟動子還可有利地用於任何合適的畢赤酵母屬表達質 粒。本領域技術人員會知道如何將所述啟動子克隆入上述構建體。因此在另一個實施方案 中，本發明涉及包含本發明的DNA構建體的表達載體，其進一步包含信號肽編碼區。還在另一個方面，本發明涉及畢赤酵母屬宿主細胞，其包含本發明的表達載體。具 體而言所述畢赤酵母屬宿主細胞是巴斯德畢赤酵母屬宿主細胞。在甚至另一個方面，本發明涉及產生目標多肽的方法，包括(a)在有益於產生目標多肽的條件下培養本發明的宿主細胞；和(b)回收所述多肽。在所述產生方法中，正調節子Prml會由宿主細胞產生，因為prml基因對巴斯德畢 赤酵母而言是內源的。然而，過量產生Prml可進一步增加啟動子活性，特別是當UAS以多 拷貝存在時。甚至過表達Mxrl蛋白可對經修飾的DAS啟動子活性具有作用。因此，在一個實施方案中，本發明涉及根據本發明產生目標多肽的方法，其中正調 節子Prml在宿主細胞中的表達通過調控Prml的表達或通過增加Prml編碼基因的拷貝數 而增加。在又一個實施方案中，正調節子Mxrl的表達通過調控Mxrl的表達或通過增加Mxrl 編碼基因的拷貝數而增加。在一個其他的實施方案中，調節子Prml和Mxrl兩者的表達水 平均增加。在本發明的一個實施方案中，從合適的啟動子組成型表達正調節子。優選地，啟動 子不是天然啟動子，意思是調控正調節子表達的啟動子與通常調控表達的啟動子不同。在 本發明的上下文中，將這些優選的啟動子稱為「非天然的」。啟動子可以對宿主生物仍然是 天然的，但是在所研究基因(例如prml基因)的語境中是外源的。在一個具體實施方案中， 啟動子選自下組GAP啟動子(甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子)、TEF1啟動子(翻譯延長因 子EF-I α啟動子)和PGK啟動子(磷酸甘油酸激酶啟動子)。除了由如上所述的非天然 啟動子調控的表達之外，根據本發明的宿主細胞通常從存在於染色體上的內源基因表達正 調節子。在另一個實施方案中，可將編碼正調節子的基因的內源拷貝失活，例如通過缺失失 活，或者控制基因的內源拷貝的正常啟動子可以被所選的非天然啟動子代替。在另一個的實施方案中，正調節子的表達受控於(is controlled from)並非甲醇 誘導型的誘導型啟動子。如上所述，根據本發明的正調節子還可為從其他酵母細胞分離的Prml功能性同 源物。根據本發明的一個實施方案，一個這樣的候選者可為由來自多形漢遜酵母(同種異 名安格斯畢赤酵母)的mut3基因編碼的Mut3。在本文提供的實施例中，Prml或Mxrl在巴 斯德畢赤酵母中過量產生。然而可能的是相同的作用可通過在畢赤酵母屬中過量產生Mut3 或在漢遜酵母屬中過量產生Prml或在漢遜酵母屬中過量產生Mut3來獲得。這些未經測試。因此，在本發明另一個實施方案中，所述正調節子是Mut3.存在於宿主細胞中正調節子水平的增加還可簡單地通過在宿主細胞中存在編碼 所述調節子的基因的多重拷貝來提供。本發明的另一個方面涉及包含於SEQ ID NO :2的UAS，或至少包含SEQ ID NO 3 的 UAS。因此，本發明涉及選自下組的分離的多核苷酸
(a)包含SEQ ID NO :2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 2具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補鏈雜交。在另一個實施方案中，本發明涉及選自下組的分離的多核苷酸(a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補鏈雜交。根據本發明UAS可用於像激活DAS啟動子一樣激活外源啟動子。在此情況下，根 據本發明的UAS的一個或多個拷貝與在其天然形式中不含有如本文所解釋的UAS的啟動子 組合。因此，在另一個方面，本發明涉及包含根據本發明的UAS的啟動子，其中所述UAS對 所述啟動子是外源的，或其中所述UAS以多於一個拷貝存在。在另一個實施方案中，本發明涉及UAS用於增加由啟動子的轉錄的用途。所述啟 動子可為外源啟動子，在此情況下，其尚未包含UAS的拷貝，或其可為DAS啟動子，在此情況 下，可如上所述添加其他的拷貝。因此，在另一個實施方案中本發明涉及包含選自下組的UAS的啟動子i) (a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 2具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補鏈雜交；或ii) (a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補鏈雜交；和其中根據⑴或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多於一個拷貝存在。在又一個方面，本發明涉及UAS用於增加由啟動子的轉錄的用途，其中所述UAS選 自下組i) (a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 2具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補鏈雜交；或ii) (a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補鏈雜交；和其中根據(i)或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多於一個拷貝存在。適於上述激活的啟動子可具體而言是由甲醇誘導的啟動子。在本發明的產生方法中，使用本領域公知方法將細胞在適於產生多肽的營養培養 基中培養。舉例而言，所述細胞可通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的 條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分 批、補料分批或固態發酵)來培養。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培 養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可 以根據公布的組成(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)製備。如果多肽分泌到 營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌到培養基中，其能夠 從細胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本領域已知的對於所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法 可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzyme assay) 可用於測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養 培養基中回收，所述常規方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱。本發明產生的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限 於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型 (preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或提取(參見，例 如，Protein Purification, J.-C. Janson 禾口 Lars Ryden 編，VCH Publishers, New York, 1989)。在一個具體實施方案中，由宿主細胞產生的多肽對宿主細胞是異源的。在另一個 實施方案中，所述多肽對所述宿主細胞是同源的。實施例材料和方法菌株大腸桿菌TOPl(Kinvitorgen)和 Dffialpha(TOYOBO)用於質粒構建。LB (1 % Tripton (Difco), 0. 5%酵母提取物(Difco)，0. 5% NaCl)在補充相關抗生素之後用作基礎
培養基。巴斯德畢赤酵母his4突變體，GS115用於表達測試。巴斯德畢赤酵母C01s702 (Muts)是AOXl基因破壞的畢赤酵母NRRLY-15851菌株，並描述於實施例5。供其生長所用的培養基如下所述YPD 蛋白腖(Difco)，1%酵母提取物(Difco)，2%葡萄糖)RD 瓊脂；IM 山梨醇，2 % 葡萄糖，1. 34 % 酵母氮基(Yeast nitrogen base) (Difco)，4X10_5(%生物素，0. 005%胺基酸(L-穀氨酸、L-甲硫氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和 L-異亮氨酸),2% Agar Noble (Difco)MD瓊脂；1.34%酵母氮基，4X10_5%生物素，2%葡萄糖巴斯德畢赤酵母的轉化巴斯德畢赤酵母菌株通過電穿孔來轉化。新鮮轉化態細胞通過下述方法製備。將 宿主菌株接種入IOOml的YPD，並生長至0D660為1. 2 1. 4。細胞用冰水洗滌兩次(IOOml 和50ml)，並用細1冰冷的IM山梨醇洗滌。然後將細胞懸於0. 2ml冰冷的IM山梨醇。將 線性化的(linearized)的質粒DNA(1 2 μ g)與80 μ 1新鮮感受態細胞混合，並在冰上 儲存5分鐘。將細胞轉移至冰冷的0. 2cm電穿孔小杯(cuvette)中。轉化使用BioRad GenePulser II進行。使用的參數為1500V、25 μ F和200 Ω。在脈衝之後緊接著將細胞懸 於Iml冰冷的IM山梨醇。將混合物鋪於相關的選擇平板上。篩詵His4位點整合的菌落PCR用經滅菌的牙籤將細胞挑取到0. 2ml試管中，然後在微波烤爐中烘烤。將經幹 燥的細胞懸於50 μ 1滅菌水中，並對其使用Expand High Fidelity Plus (Roche)進行 PCR0反應混合物為20μ 1，包含2mM dNTP，每種引物10 μ M，1單位Expand High Fidelity Plus(Roche)，IX Expand High Fidelity Plus 緩衝液(Roche)以及 1 μ 1 如上所述的細胞 懸液。PCR 引物為引物 139 :5，-ctgctctagccagtttgctg-3，(SEQ ID NO :10)(在基因組中 His4 標誌物上遊)和 S98 :5，-gccgcccagtcctgctcgct-3，(SEQ ID NO :11)(在表達載體中 His4標誌物和AOX終止子之間)。PCR程序如下所示
權利要求
1.一種分離的多核苷酸，其包含i)由來自畢赤酵母屬(Pichia)的DAS啟動子序列或其功能性部分組成的核苷酸序列， 其中所述DAS啟動子包含於SEQ ID NO 1 ；和ii)至少一個其他的UAS，其中所述UAS包含於SEQID NO :2。
2.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述UAS至少包含示於SEQIDNO 3的序列。
3.權利要求1或2的分離的多核苷酸，其中所述DAS啟動子包含於SEQIDNO :1中的 501-1055 位。
4.前述權利要求中任一項的分離的多核苷酸，其中所述DAS啟動子包含於SEQID NO 1 中的 601-1055 位。
5.前述權利要求中任一項的分離的多核苷酸，包含至少兩個其他UAS0
6.前述權利要求中任一項的分離的多核苷酸，包含至少三個其他UAS0
7.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述啟動子選自下組a)包含SEQID NO 7的77-828位，特別是77-901位，更特別是77-948位的多核苷酸， 或由SEQ ID NO 7的77-8 位，特別是77-901位，更特別是77-948位組成的多核苷酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 7的77-8 位，特別是77-901位，更特別是77-948位具有至少90 %同一性，優選至少95 %， 更優選至少97%，甚至更優選至少99%同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴格 條件下與SEQ ID NO 7的77-8 位，特別是77-901位，更特別是77-948位或其全長互補 鏈雜交。
8.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述啟動子選自下組a)包含SEQID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位的多核苷 酸，或由SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位組成的多核苷 酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位具有至少90%同一性，優選至少 95 %，更優選至少97 %，甚至更優選至少99 %同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴格 條件下與SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位或其全長互補 鏈雜交。
9.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述啟動子選自下組a)包含SEQID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位的多核 苷酸，或由SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位組成的多 核苷酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位具有至少90%同一性，優選至少 95 %，更優選至少97 %，甚至更優選至少99 %同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴格 條件下與SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位或其全長互補鏈雜交。
10.一種DNA構建體，其包含權利要求1-9中任一項所述的多核苷酸序列，所述多核苷 酸序列可操作地連接於編碼目標多肽的結構基因和終止子。
11.一種表達載體，其包含權利要求10的DNA構建體，進一步包含信號肽編碼區。
12.畢赤酵母屬宿主細胞，其包含權利要求10的表達載體。
13.—種產生目標多肽的方法，包括(a)在有益於產生目標多肽的條件下培養權利要求12的宿主細胞；和(b)回收所述多肽。
14.權利要求13的方法，其中通過調控Prml的表達或通過增加編碼Prml的基因的拷 貝數而增加正調節子Prml的表達。
15.權利要求13的方法，其中通過調控Mxrl的表達或通過增加編碼Mxrl的基因的拷 貝數而增加正調節子Mxrl的表達。
16.權利要求13的方法，其中通過調控Prml和Mxrl的表達或通過增加各自基因的拷 貝數而同時增加正調節子Prml和Mxrl的表達。
17.一種啟動子，其包含選自下組的UAS:i)(a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 2具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同一 性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴 格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補鏈雜交；或ii)(a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 3具有至少90 %同一性，優選至少95 %，更優選至少97 %，甚至更優選至少99 %同一 性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴 格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補鏈雜交；和其中根據(i)或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多於一個拷貝存在。
18.UAS在增加由啟動子的轉錄中的用途，其中所述UAS選自下組i)(a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 2具有至少90%同一性，優選至少95%，更優選至少97%，甚至更優選至少99%同一 性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴 格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補鏈雜交；或ii)(a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90 %同一性，優選至少95 %，更優選至少97 %，甚至更優選至少99 %同一 性；或(C)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴 格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補鏈雜交；和其中根據(i)或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多於一個拷貝存在。
19.權利要求18的用途，其中所述啟動子由甲醇誘導。
全文摘要
本發明涉及分離多核苷酸形式的啟動子變體，包括i)由來自畢赤酵母的DAS啟動子序列組成的核苷酸序列或其功能性部分，其中所述DAS啟動子包含於SEQ ID NO1；和ii)至少一種其他UAS，其中所述UAS包含於SEQID NO2。
文檔編號C12N15/81GK102105589SQ200980126957
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月10日 優先權日2008年7月11日
發明者堤紀子, 高木忍 申請人:諾維信公司