從天然植物細胞中提取核酸的生產工藝的製作方法
2023-12-10 10:09:37
專利名稱：從天然植物細胞中提取核酸的生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於一種生物化學的提取技術。
八十年代最新研究成果是從分子水平和細胞水平研究人類營養學，形成「高核酸食物療法」，該法有利於從細胞水平維護人體的健康，保持青春、預防疾病、延緩衰老。從各種生物體如病毒、細菌、真菌、植物細胞及動物細胞中分離提取核酸，是生物學中研究的常用經典方法，它們有鹼提取法、酚提取法、煮沸提取法、甘油提取法、密度梯度離心提純法及電泳提取法等。儘管這些方法可製得高純度的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，但成本昂貴、工藝繁雜、僅限於實驗室小量提取，不適於大規模地工業性生產。目前，從動物胎盤中提取核酸的少量生產雖已有報導，但胎盤的來源受到很大限制，價格也相當昂貴。
本發明的目的是以充足、便宜的脫脂大豆粕等植物細胞為原料，創立經濟、簡便的工業性提取核酸的工藝技術，進而為製備系列高核酸營養口服液、食品及化妝品提供豐富的核酸原料，從而為實施高核酸食物療法創造有利的條件，抑制因盲目攝入高核酸食品帶來營養過剩弊端。
從脫脂大豆粕中提取核酸的工業性生產技術包括豆粕勻漿的製備、細胞裂解、溶劑抽提、透析處理、濃度與純度的測定、核酸提取液分裝及核酸純化幹品製作等工藝過程。下面對主要生產工藝作一描述1、溶脹、勻漿、裂解此三步在一個反應釜中進行。稱取定量60目以上的脫脂大豆粕粉，以重量比1∶5～10加入去離子(或蒸餾水)，加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，使其終濃度達到0.5～1.0％，用氫氧化鈉調pH為7.5～1.0，常溫下，高速勻漿40～60分鐘。
2、溶劑抽提在裂解液中加入等體積的三羥甲基氨基甲烷——乙二胺四乙酸二鈉(TE)飽和酚，低速攪拌10～20分鐘，轉速為6,000～8,000rpm，離心10～20分鐘，取上層水相，即為核酸粗提取物。溶劑還可用醇類抽提。
下層酚相沉澱物，經離心、洗滌，提取可溶性鐵和微量元素。
3、透析處理將粗提取物置入透析袋內，以去離子水(或蒸餾水)進行透析，每6～8小時更換一次透析液，約48～72小時，至提取物吸光度A270≤0.05。
4、濃度及純度測定取袋內提取物，按一定比例稀釋，作如下測定(1)濃度測定①紫外吸收法(A260)測核酸總量，濃度為0.410mg/ml。
②地衣酚法測RNA濃度，佔99.5％。
③二苯胺法測DNA濃度，佔0.07％。
(2)純度測定①測A260/A280，其比值為1.88。
②測殘留酚定性濃溴水反應(一)定性APP-鐵氰化鉀酚含量≈0(3)酸鹼度測定pH＝6.7(4)細菌檢測常規培養，致病菌(一)5、核酸提取液分裝取核酸提取液，分瓶，常規滅菌，包裝。
6、核酸純化幹品製作①取透析後核酸提取物，加入適量無水乙醇，混合；在15,000--2,000rpm離心15分鐘，取沉澱物進行第二次洗滌，沉澱。
②取沉澱物置-20～-80℃低溫冰箱冷凍乾燥或真空乾燥。
③取粉末，常規滅菌，分裝。
本發明的優點和效果在於1、取材新穎大豆粕來源豐富，價格低廉，核酸含量高，每百克含核酸約524mg，國內外利用脫脂大豆糖提取核酸尚屬首次。
2、工藝創新細胞、細胞核裂解一步完成，一併獲得DNA、RNA混合提取物，此工藝減少了RNA的降解，提高了RNA的回收率。混合提取物足以滿足製造系列高核酸食品的需要；另外，酚提後殘留物，經離心、洗滌，可進一步提取可溶性鐵及微量元素，達到綜合利用目的；再就是核酸粗提物經透析、純化成各種核酸食品製劑的原料，相比乙醇沉澱純化法，大大降低了生產成本。
3、工藝應用廣泛。
此生產工藝不僅適用於脫脂大豆粕的核酸提取，而且適用於毛核酸含量高的幼、植物細胞核酸製品的提取製備，如用此工藝從芝麻、綠豆、赤小豆、大米、蘑菇等中提取製備核酸已獲成功。
4、應用面廣。
核酸是保證人體細胞再生與健康的核心物質，成年人每天需要核酸約1500mg，而日常膳食很難完全滿足要求。因此，補充核酸，實施高核酸食物療法，可達到時間短、見效快，使人保持青春，延緩衰老的效果。用核酸可做成系列營養口服液、食品和飲料添加劑以及護膚、護髮等美容製品，起到美容、保健、抗衰老的顯著作用。另外，核酸還可作若干藥用口服液中的添加劑，對各類癌腫、心腦血管疾病、內分泌疾病、皮膚病、外傷、燒傷、骨折等，出有顯著的輔助治療作用。
脫脂大豆粕粉提取核酸生產工藝流程見說明書附圖
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實施例稱取5克脫脂大豆粕，加入STE緩衝液200毫升，溶脹三天，加入SDS，使其最終濃度達0.7％，攪拌，用濃氫氧化鈉調pH至10，攪拌，加入等體積的冷TE飽和酚，混勻，用8000rpm離心5分鐘，取水相，裝入透析袋內作透析處理(去離子水)100mM NaCl (10mM Tris，HCl pH＝8.0(10mM EDTA 10mM NaCl緩衝液 1mM EDTA)檢測透析液A270值為0.045，將透析袋內容物放出，即為純核酸提取物。
該提取物之核酸濃度及純度為濃度0.276mg/ml，其中RNA佔99.5％，DNA佔0.05％純度A260/A280，比值為1.89殘留酚定性(一)，定量≈0酸鹼度pH＝6.5細菌檢測LB平板培養，致病菌(一)酚抽提後酚相中沉澱，用等體積去離子水洗滌，在8000rpm離心10分鐘，重複3-4次，洗滌後沉澱物用於提取鐵及其它微量元素。
權利要求
1.一種通常採用生物學分離、提取核酸的方法，其特徵在於它是從植物細胞中以脫脂大豆粕粉為原料，經過豆粕粉溶脹、勻漿製備、細胞裂解、溶劑抽提、透析處理、濃度和純度測定、滅菌分裝、乾燥等生產工藝，分別製得核酸提取液和核酸純化幹品。
2.根據權利要求1所述的核酸生產工藝，其特徵在於原料除用脫脂大豆粕外，還可以用核酸含量高的綠豆、赤小豆、花生、芝麻、大米、玉米、蘑菇幼植物細胞為原料，採用該工藝製備核酸。
3.根據權利要求1所述的核酸生產工藝，其特徵在於採用60目以上的脫脂大豆粕粉，加入1∶5-10重量比的去離子水(或蒸餾水)，在一個反應釜中進行溶脹、勻漿、裂解，勻漿中加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，用氫氧化鈉調pH值為7.5～10.0，使其最終濃度為0.5～1.0％，常溫下，高速勻漿40～60分鐘。
4.根據權利要求1所述的核酸生產工藝，其特徵在於溶劑抽提可用苯酚或乙醇；酚抽提是在裂解液中，加入等體積的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二鈉(TE)飽和酚，轉速為6,000～8,000rpm，攪拌10～20分鐘，離心10～20分鐘，取上層水相得核酸粗提取物；下層酚相沉澱物，經離心、洗滌、提取得可溶性鐵和微量元素。
5.根據權利要求1所述的核酸生產工藝，其特徵在於將核酸粗提取物放入透析袋內，以去離子水(或蒸餾水)透析，每6～8小時更換一次透析液，約48～72小時，直至提取物的吸光度A270≤0.05，純核酸提取物濃度為0.41mg/ml，RNA佔99.5％，DNA佔0.07％，純度A260/A280比值為1.88，pH值6.7，無殘留酚和致病菌。
6.根據權利要求1、5所述的核酸生產工藝，其特徵在於將透析後的核酸提取物，加入無水乙醇，經混合、離心、洗滌沉澱物，再將它在-20～-80℃進行冷凍乾燥或真空乾燥，製得核酸純化幹品。
全文摘要
從天然植物細胞中提取核酸生產工藝是綜合利用植物類廉價的脫脂大豆粕為原料，採用生物化學提取技術製備核酸。該提取技術是經過豆粕勻漿製備、細胞裂解、試劑抽提、透析處理、濃度與純度測定，滅菌分裝，分別製得了核酸提取液和核酸純化幹品。所得核酸可進一步製備系列高核酸營養、藥用口服液和食品、飲料以及美容、保健、化妝品。
文檔編號C07H21/00GK1117972SQ9411543
公開日1996年3月6日 申請日期1994年8月29日 優先權日1994年8月29日
發明者吳文國 申請人:唐迎濱