一種Ⅱ型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒的製作方法

2023-12-09 08:57:41 3

專利名稱：一種Ⅱ型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及遺傳學，分子生物學，臨床醫學及預防醫學技術領域，具體地說，本發明涉及一種II型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是聯合檢測多個核酸(DNA 和 RNA)分子標記，包括:APM1 (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661), KCNQl (rs2237892)、VDR (Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上基因多態性位點，在經過風險評估模型的計算分析，可以評估和篩選受檢者的II糖尿病易感性(susceptibility)。
背景技術：
在2000年全球有糖尿病患者1.51億，而目前全球有糖尿病患者2.85億，按目前的增長速率，估計到2030年全世界糖尿病人口將增長到5億，其中發達國家將由5100萬增長到7200萬，增長率為42 %，而發展中國家將由8400萬增長到2億3000萬，增長率達到了170%。近年我國糖尿病發病率持續升高，由1980年的I %上升至2008年9.7%。目前糖尿病患者突破9800萬人，其中90%以上是II型糖尿病，所以也是最常見的糖尿病。其特點是胰島素抵抗，即體內組織對胰島素的作用不敏感，正常量的胰島素起不到正常的降血糖作用，或胰島素分泌不足。包括中國人在內的亞洲人種的II型糖尿病患者往往並不伴有肥胖等特徵。研究表明，在未來20年裡，中國糖尿病人群以高於2倍的速度增長，亞洲將會成為最嚴重的發病區域。糖尿病及其慢性併發症嚴重威脅人類健康和生命。大量研究表明，II型糖尿病(T2DM)是一種多基因遺傳病，是由遺傳和環境因素相互作用而導致的，以胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙為特點的疾病。遺傳因素增加了機體發生II型糖尿病的危險性。其中主效基因起主要作用，次效基因起較小作用，不同基因之間還可能存在交互作用。脂聯素(A diponectin)是由脂肪細胞特異性分泌一種膠原樣細胞因子，存在於血循環中的一種激素蛋白。脂聯素由244個胺基酸組成，脂聯素在血漿中含量豐富。有研究表明，血漿脂聯素具有抗動脈粥樣硬化、改善胰島素抵抗、降血糖、抗炎等生物學作用。低脂聯素濃度可增加代謝症候群及II型糖尿病的風險。人脂聯素基因(Adiponectin gene或者APM1)是單拷貝基因，定位於染色體3q27，大小為17kb，由3個外顯子和2個內含子組成。全基因組掃描顯示該區域存在II型糖尿病(T2DM)和代謝症候群的易感位點。Q)K5 (細胞周期素依賴激酶5, cyclin-dependent kinase 5)在高糖毒性的作用下可導致β細胞變性。Q3KAL1 (Q)K5調節亞單位相關蛋白I類似物I, cyclin-dependentkinase 5 regulatory subunit associated protein 1-like I)基因編碼的蛋白質能夠抑制CDK5的活化。若CDKALl基因發生變異，則對CDK5失去抑制作用，會導致β細胞功能受損，胰島素分泌減少。可見，⑶KALl基因位點發生變異，與人群中胰島素分泌缺乏有關。rs57754840位於⑶KALl基因的第五個內含子，是與II型糖尿病遺傳易感性密切相關的SNP。⑶KALl基因rs7754840有G、C兩種等位基因。G為主效基因，C為次要基因，出現G-C變異，則CDKALl對CDK5的抑制作用減弱，會導致β細胞功能受損，因此C為導致糖尿病出現的高風險等位基因。正常人群中c%的發生頻率在40%左右。TCF7L2(轉錄因子 7 類似物 2，transcription factor 7 like2)基因可能是 T2DM的主要致病基因之一。TCF7L2基因位於染色體10q25，全長217，226bp。由14個外顯子和13個內含子組成。共編碼619個胺基酸。其表達產物是一組具有高度變異性的轉錄因子，這些轉錄因子在維持血漿葡萄糖的穩態中起重要作用。2006年Florez等通過3年的前瞻性研究發現rsl2255372和rs7903146兩個位點與糖尿病病情的進展有關，它們可以增加那些糖耐量減低患者患糖尿病的風險。Sale等發現位點rs7903146和rs7901695與居住在美國的非洲人的糖尿病腎病有關。我們的研究發現，rs7903146的基因變異型是與II型糖尿病發病風險相關性最強的基因。TCF7L2是目前為止發現的與II型糖尿病的發病關係最密切的易感基因之一，並且在不同種族的人群中有很好的重複性。TCF7L2基因變異增加II型糖尿病的發病風險，可能是通過其在糖尿病患者的胰島β細胞中的過表達，fct信號通路異常以及胰島β細胞對前胰島素加工障礙等途徑最終導致了胰島素分泌障礙和胰島素作用下降。CDKN2A和CDKN2B定位於第9號染色體9Ρ21上，CDKN2A/CDKN2B分別編碼抑癌因子pl5INK4a和pl6INK4b。後者能抑制⑶K4活性。而⑶K4 (細胞周期素依賴激酶4)能有效調節胰腺β細胞增殖。若CDKN2A /2B基因附近的rsl0811661發生變異，使得CDKN2A/2B基因產物過度表達，將會顯著抑制CDK4活性，進一步會影響β細胞的分泌功能，使胰島素分泌減少，導致II型糖尿病的發生風險升高。有臨床研究表明，⑶ΚΝ2Α/2Β基因rsl0811661有T/T、T/C、C/C三種基因型，II型糖尿病組危險等位基因T/T純合子頻率為37.5%，危險等位基因T%為59.5%，均顯著高於正常對照組。T等位基因攜帶者患糖尿病的風險為C等位基因攜帶者1.38倍。KCNQl基因定位於第11號染色體11ρ5，編碼676個胺基酸組成的蛋白，其生理作用是電壓依賴性鉀離子通道家族的成員之一。以Yasuda等為首的日本國際醫療中心研究小組比較II型糖尿病患者和普通人，發現位於KCNQl基因內區的rs2237892的變異，使II型糖尿病的發病風險將增加1.3-1.4倍。黎懷星和林旭等人以3210名漢族居民作為研究人群，系統地分析了 KCNQl 基因上的 rs2074196, rs2237892, rs52237895 和 rs522375973多態性位點與II型糖尿病及其相關表現型的關聯關係。發現:rs2237892、rs52237895和rs2237s973位點均與II型糖尿病的患病風險存在著顯著的關聯關係,其增加患病風險分別高達32.5%，18.8%和35.8%。這些位點均與β細胞功能受損相關聯。由這些多態性位點的危險等位基因所組成的單倍體型也與II型糖尿病患病風險和β細胞功能指數之間存在著很強的關聯關係。研究結果提示，KCNQl基因是中國漢族人群的一個主要的II型糖尿病基因。張留偉等研究共納入7篇論文，得到7764例II型糖尿病患者和8937例對照，經Meta分析結果顯示，KCNQl基因rs2237892位點C等位基因能夠增加T2DM的發病風險(OR =1.300,95% Cl:1.234 1.366)，CC/TC基因型是II型糖尿病的危險基因型(0R =1.453,95% Cl:1.279 1.651)。人VDR基因全長約4605個鹼基對，包括一段115bp非編碼的前導序列，一段1281bp的編碼序列以及一段3209bp的3端非編碼序列。VDR基因位於染色體第12ql3，由9個外顯子和8個內含子組成。維生素D通過與VDR結合發揮其生物活性作用，例如胰島β細胞表達維生素D受體和維生素D依賴性鈣結合蛋白(calbindinD28k，CB)，這提示維生素D可影響胰島素分泌及控制β細胞生長與分化。研究顯示，VDR基因多態性位點(FokI)與口服葡萄糖耐量後胰島素分泌增加或減少有關。VDR基因位點單核苷酸多態性可影響VDR轉錄活性的變化。因此，VDR(Fok I)基因已經作為II型糖尿病的候選基因。SLC30A8 (solute carrier family 30, member 8,鋒轉運蛋白 _8)基因核苷酸序列全長41617bp，含8個外顯子，在染色體上定位在8q24.11。SLC30A8基因編碼369個胺基酸的蛋白質。研究表明SLC30A8編碼的是一種在胰島細胞大量表達的鋅離子轉運蛋白，是一種多次跨膜蛋白，並且蛋白經過了多種形式的修飾。其主要功能是將胞漿內的鋅離子轉運到胰島素分泌囊泡中，參與胰島素合成、儲存和分泌的重要功能。多項GWAS研究發現，SLC30A8基因rsl3266634多態性位點的C等位基因是中國人II型糖尿病的風險等位基因。

發明內容
基於循證醫學的基本原則，採用病例-對照研究和隊列研究相結合的方法，並將回顧性研究與前瞻性研究相結合，通過文獻檢索、證據評價、信息提取、H-W遺傳平衡檢驗、同質性檢驗、大樣本Meta分析等一系列嚴格的篩選和實驗驗證過程，綜合考慮和分析各個基因位點與II糖尿病的關聯度(0R值)、人群中基因型發生頻率、發病機理、信號通路等，最後確定七個II糖尿病相關的易感性基因多態性位點。本發明提供一種II糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒，通過聯合檢測多個核酸(DNA 和 RNA)分子標記，包括:APM1 (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661) ,KCNQl (rs2237892)、VDR(Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上基因多態性位點，來評估和篩選II糖尿病的遺傳易感性。該試劑盒的特徵是上述基因位點的特異性擴增引物對及DNA測序引物對包括:用於檢測APMI基因上+45基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用於檢測⑶KALl基因上rsl0946398基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用於檢測TCF7L2基因上rs7903146多基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用於檢測⑶KN2A/2B基因上rsl0811661基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用於檢測KCNQl基因上rs2237892基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序弓I物對；用於檢測VDR基因上Fok I基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用於檢測SLC30A8基因上rsl3266634基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；PCR反應試液(包括:緩衝液，MgCl2溶液，UdNTPs, dNTPs，特異性引物對，Taq DNA聚合酶，UNG酶，模板DNA，純水等)；PCR產物酶解液(包括:SAP酶，ExoL酶MIX，純水等);DNA測序反應液組份(包括:EDTA，無水乙醇，70%預冷乙醇，去離子甲醯胺(H1-DiFormamide)，PCR酶解產物，BigDye Mix, DNA測序引物，純水等)。

本試劑盒所述的特徵是APMl (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B(rsl0811661) ,KCNQl (rs2237892) ,VDR(Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上七個基因多態性位點同時進行聯合檢測。本試劑盒所述的特徵是七個特異性擴增引物對分別針對APMl (+45)、CDKALl (rsl0946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661)、KCNQl (rs2237892)、VDR(Fok I)、SLC30A8(rsl3266634)上基因多態性位點，能特異性擴增出DNA片段。本發明的七個特異性引物可用常規的合成方法進行合成，這些引物本領域的技術人員可以輕易地進行設計、合成和使用等。本試劑盒所述的特徵是七個DNA測序引物對分別針對APMl (+45)、CDKALl (rsl0946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661)、KCNQl (rs2237892)、VDR (Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上基因多態性位點，能特異性進行DNA片段的序列檢測。本發明的七個DNA測序引物對可用常規的合成方法進行合成，這些引物本領域的技術人員可以輕易地進行設計、合成和使用等。本試劑盒所述的特徵是所述試劑盒的組成與含量包括:(I)PCR反應試液:單個PCR反應體系包括:10XPCR緩衝液2.5μ l，25mM MgCl2溶液 2.5μ1，25πιΜ UdNTPs 0.2 μ l,25mM dNTPs 0.2 μ 1，20 μ M 特異性引物對中的一對引物
0.5 μ I, 5U/μ I混合酶(Taq DNA聚合酶與UNG酶)I μ I，模板DNA 3 μ I (50ng)，加純水至25 μ I。其中，使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防汙染體系，經加熱可以選擇性地降解U-DNA，以防止PCR擴增產物的汙染。 (2) PCR 產物酶解液:2 μ I SAP 酶 +ExoL 酶 MIX。(3) DNA測序反應液:有兩部分組成:測序反應體系和測序產物純化。單個DNA測序反應體系包括:3 μ I PCR酶解產物，I μ I測序試劑(25% BigDye Mix)，I μ I DNA測序引物對(只使用其中一個引物)，I μ I純水。測序產物純化包括:100mM EDTA 2 μ 1，16 μ I無水乙醇，70%預冷乙醇70μ 1X2,10μ I去離子甲醯胺(H1-Di Formamide)等。上述三個組份的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡述本發明，實施例僅用於說明目的，而不用於限制本發明範圍。下列實施例中未做詳細說明和具體描述的實驗條件和實驗方法，應為常規實驗條件和方法，或按廠家提供的操作步驟和方法進行。實施例本試劑盒的使用1、樣本基因組DNA的獲取:用清水漱口一到二次，去除口腔中的食物殘渣，並注意咽盡口腔中剩餘的清水。用棉籤刮取口腔黏膜脫落細胞並將其放入Eppendorf管的細胞固定液中，擰緊瓶蓋備用。2、DNA抽提及純化:用細胞裂解法提取中的DNA，懸浮於Iml生理鹽水中，2000 Xg離心IOmin ;棄上清，每管加Iml生理鹽水重複洗滌一次，再2000 X g離心IOmin ;棄上清，每管加 400 μ I 細胞裂解緩衝液(10mmol/L Tris-HCl, PH 8.0 ；0.1mol EDTA, PH 8.0 ；0.5%SDS)，放在50°C水浴中溫育30分鐘；然後冷卻至室溫，加等體積的酚一氯仿一異戊醇(體積比25: 24:1),混勻，5000Xg離心IOmin ;轉移上層水相到另一 Eppendorf管中，重複抽提一次；再轉移上層水相到另一 Eppendorf管中，加1/10體積的3M NaAc (pH5.2)，混勻;加入2.5倍體積的95%冷乙醇，混勻，-20°C沉澱DNA 30分鐘；10000Xg離心15分鐘，棄上清；加Iml 70%冷乙醇清洗沉澱，10000 Xg離心分鐘，棄上清；37°C溫箱30分鐘烘乾；將DNA沉澱溶於20 μ I TE緩衝液中，加20 μ g/ml胰RNA酶I μ I，37°C溫浴30分鐘，置於-20°C保存。3、採用PCR方法擴增目標DNA片段:(I)本試劑盒的特點是使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防汙染體系，經加熱可以選擇性地降解U-DNA，以防止PCR擴增產物的汙染。(2)本試劑盒的PCR反應試劑組份由PCR反應液體積21 μ 1、5U/ μ I混合酶(TaqDNA聚合酶與UNG酶)I μ I，模板DNA 3 μ I (約50ng)組成。PCR反應液包括:10 X PCR緩衝液 2.5 μ I，25mMMgCl2 溶液 2.5 μ I，25mM UdNTPs 0.2 μ I，25mM dNTPs 0.2 μ I。(3)PCR反應試劑組份準備:試劑開管前請完全解凍後充分混勻並短暫離心。建議在DNA提取結束後配製混合反應液，並立即加樣。如特殊情況，可將下述分裝好的混合反應液短期存於4°C,並在3小時內使用。(4)PCR反應試劑組份配製:按每個PCR反應液體積21 μ1、混合酶I μ 1，模板DNA3μ 1，乘以所需的反應管數，計算試劑的量，加於一個無菌離心管中，振蕩混勻。再用微量加樣器在每一 PCR反應管內加入25 μ I上述混勻的混合反應液。(5) PCR反應試劑組份加樣:在上述分裝好的裝有混合反應液的PCR反應管中分別加入模板DNA和陰性對照各3 μ I。S卩:單個PCR反應體系組分，見表1:
表I單個PCR反應試劑組份
權利要求
1.本發明提供了一種II型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是包括以下步驟: 獲得受檢者的體液，毛髮，血液或細胞組織等樣本； 提取樣本中的核酸(DNA和RNA)； 通過聯合檢測多個核酸(DNA和RNA)分子標記的方法獲得受檢者的遺傳信息； 對相關的生物信息進行數據處理與統計分析，從而評估該健康受檢者的II糖尿病易感性，並對已經患有II型糖尿病人群的個性化治療和個性化保健也有指導意義。
2.根據權利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是聯合檢測多個核酸(DNA和RNA)分子標記，包括=APMl (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B(rsl0811661)、KCNQl(rs2237892)、VDR (Fok I)、SLC30A8(rsl3266634)。
3.根據權利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述核酸(DNA和RNA)分子標記的檢測方法包括: 各種DNA測序的方法； 各種螢光定量PCR方法； 各種生物晶片檢測方法； 通過各種突光標記與雜交技術檢測核酸(DNA和RNA)分子標記的方法。
4.根據權利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述核酸(DNA和RNA)分子標記包括: 單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)； 拷貝數多態性(copy number polymorphism, CNP)；微衛星 DNA (short tandem repeat, STR)； 限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)； 隨機擴增多態性 DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)； 特定序列位點(sequence-tagged site, STS)； 擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)。
5.根據權利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述七個核酸(DNA和RNA)分子標記的特異性擴增引物對及DNA測序引物對。
6.根據權利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述試劑盒的組成與含量包括:(I)PCR反應試劑組份；(2) PCR產物酶解試劑組份；(3) DNA測序反應試劑組份。
7.根據權利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述試劑盒的可應用於健康受檢者個體肥胖的遺傳風險評估，有利於專家和受檢者根據基因分型的結果，進行個性化的健康管理及幹預指導。
8.根據權利要求1所述的一種II型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述試劑盒的可應用於已經患 有II型糖尿病人群的檢測，有利於專家和受檢者根據基因分型的結果實現個性化治療和個性化保健。
全文摘要
本發明提供了一種II型糖尿病基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是聯合檢測七個核酸(DNA和RNA)分子標記，包括APM1(+45)、CDKAL1(rs10946398)、TCF7L2(rs7903146)、CDKN2A/2B(rs10811661)、KCNQ1(rs2237892)、VDR(FokI)、SLC30A8(rs13266634)。該試劑盒包括上述基因多態性位點的特異性擴增引物對及DNA測序引物對，以及PCR反應液、PCR產物酶解液、DNA測序反應液。通過本試劑盒的檢測，並對基因信息進行處理與分析，評估健康受檢者的II型糖尿病易感性，並對已患病人群的個性化治療和保健具有指導意義。
文檔編號C12Q1/68GK103074414SQ20121012833
公開日2013年5月1日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者崔春黎, 肖自力, 紀燕燕 申請人:上海金防生物科技有限公司