表達兔病毒性出血症病毒vp60蛋白疫苗的製作方法

2023-12-09 03:37:06

表達兔病毒性出血症病毒vp60蛋白疫苗的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種以豬痘病毒為表達載體表達兔瘟病毒VP60基因的重組疫苗，該重組疫苗包含豬痘病毒載體和兔病毒性出血症病毒（RHDV）VP60基因。本發明所述的重組疫苗是以豬痘病毒作為表達載體，將兔病毒性出血症病毒VP60基因為外源基因克隆入載體pSWE11，得到轉移載體pSWE11/P28V。將豬痘病毒和轉移載體pSWE11/P28V感染、轉染PK15細胞，通過同源重組獲得重組豬痘病毒。本發明重組疫苗能高效、穩定表達兔病毒性出血症病毒VP60蛋白，免疫後能誘導免疫動物產生高效價的抗體，並具有良好的免疫保護作用。
【專利說明】表達兔病毒性出血症病毒VP60蛋白疫苗

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物製品領域，涉及一種重組豬痘病毒載體疫苗，具體為：一種表達兔 病毒性出血症病毒VP60蛋白的重組豬痘病毒（rSWEll/P28V)載體疫苗，該重組疫苗能提供 針對兔病毒性出血症病毒的免疫保護作用，降低養兔業的經濟損失。

【背景技術】
[0002] 兔病毒性出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD)是由兔病毒性出血症病毒 (Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV)引起的一種高度接觸傳染性致死性傳染病。 以呼吸系統和實質器官水腫、淤血及出血性變化為特徵，易感兔的病死率可達100%，是兔的 一種毀滅性傳染病。該病於1984年在我國江蘇省首次爆發，這是全球首次報導該病，並迅 速流行蔓延，隨後波及到亞、歐、非及美洲等地區，呈全球性分布，給養兔業造成了巨大的經 濟損失。
[0003] VP60蛋白是RHDV的主要結構蛋白，分子量大小約為60 ku，180個VP60單體共 同組成病毒粒子的核衣殼。是病毒免疫保護性抗原，在誘導宿主免疫反應中起重要作用。 Torrecuadradan等研究發現VP60蛋白N端的第31位至第250位胺基酸殘基是RHDV的主 要抗原區域，並且C端的第477位至第579位胺基酸殘基也是RHDV的抗原區域。Viaplana E等將VP60片段分成5個相互重疊的片段，分別在大腸埃希菌中表達，結果顯示，與RHDV 抗血清的反應性中，位於N端的VP60蛋白最強，而位於C端相對較弱。在體外沒有其他 成分的情況下，RHDV VP60蛋白可以自發聚合成擁有立體構象的病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs)，能夠模擬完整病毒粒子誘導宿主的免疫系統。Mehdaoui等將位於N端 的VP60蛋白與人乳頭狀瘤病毒（HPV)Ll蛋白相融合，結果顯示，在昆蟲細胞中，重組的VP60 蛋白可以表達，大小與自然RHDV的VLPs相似。Farnos等將RHDV AST/89株的VP60基因轉 入畢赤酵母系統中進行表達，免疫VP60蛋白的兔子能夠產生強烈的特異性反應，並能夠抵 御攻毒計量為100 LD5tl的同型病毒。
[0004] 兔病毒性出血症病毒的體外培養是世界性難題，目前組織滅活苗是國內廣泛使用 的兔瘟疫苗。組織滅活苗是用甲醛滅活勻漿後的感染RHDV兔肝臟組織。接種方式一般為 皮下或肌肉注射。組織滅活苗接種後，HI抗體一般在6-8天產生，HI滴度在16-18天可達 2 11以上，隨後緩慢下降；鋁膠苗和油佐劑疫苗的免疫期分別可達8-10個月和1年以上。目 前組織滅活苗的生產成本日益增加，同時也存在因病毒滅活不徹底，導致疫苗散毒的現象。
[0005] 痘病毒載體作為基因工程中的重要工具，其應用及其廣泛，已成功地表達了來源 於植物、動物，乃至人類的很多基因。作為病毒疫苗載體，痘病毒具有許多優點。首先，痘病 毒痘病毒在感染細胞的細胞的細胞質內複製，因細胞酶不能轉錄病毒基因組，不能產生病 毒蛋白，因此痘病毒的DNA不具感染性；其次，痘病毒的基因組大，容易組裝，以及外源DNA 的插入（至少25 kb)，還有很多可以作為外源基因插入位點的複製非必須區；再次，痘病毒 載體的外源基因表達產物能誘導抗外來抗原的抗體和細胞毒性T細胞反應，接種一次就能 獲得長期的免疫效果；此外，痘病毒具有嚴格的宿主特異性，病毒本身不會對免疫接種的動 物和人造成疾病，或不會由人接種而傳播到動物。因此，痘病毒是一種安全有效的疫苗載 體。
[0006] 由於豬痘病毒對免疫動物兔本身無致病作用，且豬痘病毒在兔體內只能產生非復 制性感染（non-productive infection),即病毒能在宿主細胞體內完成複製循環，但不產 生具有感染性的子代病毒。因此，以豬痘病毒為載體表達兔瘟病毒VP60蛋白的重組豬痘病 毒載體疫苗兼具弱毒疫苗的複製特性和滅活疫苗的安全性，具有良好的應用前景。目前關 於以豬痘病毒作為表達載體構建重組疫苗的報導主要有豬瘟病毒E2蛋白、豬偽狂犬病毒 gp55蛋白和豬圓環病毒2型Cap蛋白等。目如尚未有關於利用重組豬痕病毒載體表達兔病 毒性出血症病毒VP60蛋白的報導。
[0007] 本發明人經過大量實驗成功構建了以豬痘病毒SPV017?SPV020和SPV063 (TK 基因)為缺失位點表達兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的重組豬痘病毒載體疫苗。在實驗過 程中發現，兩者均能在免疫動物體內進行有效的增殖，由於SPV017?SPV020缺失不影響病 毒增殖,產生的重組病毒滴度比SPV063插入位點顯著要高，免疫後產生的抗體效價也明顯 高於SPV063插入位點；兩者的免疫效果均優於兔瘟滅活疫苗。因而以其作為載體構建的疫 苗取得了更好的免疫效果。


【發明內容】

[0008] 本發明的目的是提供一種能夠有效預防兔病毒性出血症的重組疫苗。
[0009] 一方面，本發明提供了一種重組豬痘病毒（rSWEll/P28V)，該重組豬痘病毒是在豬 痘病毒載體中插入本發明所述的VP60基因重組製備而成。
[0010] 在本發明的技術方案中，本發明所述的VP60基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所 /Jn 〇
[0011] 本發明通過動物免疫試驗發現：本發明提供的重組豬痘病毒能夠在免疫動物體內 增殖並表達目的蛋白，能夠誘導動物體內產生針對目的蛋白的高效價抗體，並對免疫動物 產生良好的保護作用。
[0012] 另一方面，本發明提供了一種疫苗組合物，一個表達兔病毒性出血症病毒VP60蛋 白的重組疫苗，該重組疫苗包含豬痘病毒載體和本發明提供的VP60基因。
[0013] 在一個優選實施方案中，所述的豬痘病毒載體為VR-363。
[0014] 本發明涉及所述的重組疫苗在製備預防和/或治療兔病毒性出血症病毒引發的 疾病藥物的用途，優選用於製備預防和/或治療兔病毒性出血症病毒引發的疾病藥物的用 途。所述的兔病毒性出血症病毒引發疾病以呼吸系統和實質器官水腫、淤血及出血性變化 為特徵。
[0015] 本發明所述免疫的接種途徑包括但不限於肌肉注射等。
[0016] 本發明提供了一種製備重組豬痘病毒的技術方案，該方案是這樣實現： (1) 利用基因工程方法構建轉移載體PSWEll ; (2) 利用特異性引物對擴增兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的編碼基因； (3) 將VP60基因克隆入轉移載體pSWEl 1中，通過PCR和雙酶切鑑定，獲得含有VP60基 因的轉移載體pSWEl 1/P28V ; (4) 讓含有VP60基因的轉移載體pSWEll/P28V與豬痘病毒親本病毒同源重組，獲得重 組豬痘病毒rSWEll/P28V ; (5)純化重組豬痘病毒rSWEll/P28V。
[0017] 所述的特異性引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3所示。
[0018] 在本發明的一個優選實施方案中，所述讓含有VP60基因的轉移載體pSWEll與豬 痘病毒同源重組的具體操作為：用豬痘病毒親本病毒（SWPV)感染PK15單層細胞，吸附2小 時後用脂質體轉染法加入轉移載體PSWE11/P28V，二者發生同源重組。PK15細胞在常規條 件下培養4天後，反覆凍融3次，獲得最初的重組豬痘病毒rSWEll/P28V。
[0019] 在本發明的一個優選實施方案中，所述純化重組豬痘病毒rSWEll/P28V的具體操 作為：將所述重組豬痘病毒rSWEl 1/P28V進行10倍梯度稀釋，接種PK15單層細胞後繼續培 養4天，在螢光顯微鏡下標記單個帶綠色螢光蝕斑，無菌操作挑取單個的病毒蝕斑，反覆凍 融後適當稀釋後再次接種PK15單層細胞，重複8次，直至最後獲得能夠穩定遺傳的重組豬 痘病毒。
[0020] 另一方面，本發明提供了一種將上述重組豬痘病毒製成疫苗的方法，該方法包 括： (1)將純化的重組豬痘病毒rSWEl 1/P28V在PK15細胞上連續傳代30次，檢測其VP60 基因的表達情況，至VP60基因穩定表達，且重組豬痘病毒的毒價穩定在108_ 5PFU/mL。
[0021] 擴大培養時，以重組豬痘病毒rSWEll/P28V按5M0I接種單層PK15細胞，培養3? 4天，當細胞病變達到80 %左右時收毒，反覆凍融3次，即可獲得表達VP60基因的重組豬痘 病毒載體疫苗。
[0022] 本發明有益效果 1、本發明成功構建了表達兔病毒性出血症病毒VP60基因的重組疫苗，該重組豬痘病 毒可在兔體內進行非感染性複製，在兔體內表達兔病毒性出血症病毒VP60蛋白，不斷刺激 機體產生中和抗體，提供持續的保護力。因此，相對於目前使用的兔病毒性出血症病毒滅活 疫苗具有更強、更持久的保護效果。
[0023] 2、本發明構建的表達兔病毒性出血症病毒VP60基因的重組疫苗是以豬痘病毒 SPV017?SPV020和SPV063 (TK基因）作為插入位點插入VP60基因，試驗證明，本實驗構 建的重組豬痘病毒均能對外源蛋白高效、穩定表達；其中SPV017?SPV020缺失位點的種 毒滴度最高，不影響病毒增殖，種毒的病毒滴度穩定在1〇 8_5PFU/mL，相對SPV063 (TK基因） (IO7 2PFUAiL)為缺失位點的種毒滴度要高。動物免疫試驗證明，本發明所述重組豬痘病毒 載體疫苗均能夠產生針對兔瘟VP60蛋白的高效價中和抗體，但SPV017?SPV020缺失位 點產生的抗體效價要高於SPV063位點；且兩者均比兔瘟滅活疫苗產生的抗體效價要高，因 此，具有很好的免疫保護作用。
[0024] 3、本發明構建的重組豬痘病毒載體疫苗相對於目前使用的滅活疫苗具有穩定性 好、製備簡單、成本低、免疫效果好等優點，適用於大規模生產。
[0025] 4、由於豬痘病毒嚴格的宿主特異性，只能在兔體內產生不具感染性的病毒粒子， 且對免疫動物本身不具致病性。因此本發明構建的重組豬痘病毒載體疫苗兼具弱毒疫苗的 複製特性和滅活疫苗的安全性，對人、豬等動物沒有致病性，是一種理想的生物工程疫苗。
[0026] 四、【專利附圖】

【附圖說明】 圖1為以SPV017-SPV020為插入位點轉移載體PSWE11/P28V結構示意圖。其中LF和 RF分別為豬痘病毒SPV017-SPV020的左、右同源交換臂；Pll和P28為痘病毒啟動子，EGFP 為標記基因；VP60為目的蛋白基因； 圖2為以SPV063 (TK基因）為缺失位點構建的重組轉移載體； 圖3為豬痘病毒SPV017-SPV020的左、右同源臂和Pll-EGFP的PCR擴增結果； 圖4為兔病毒性出血症病毒VP60基因PCR擴增結果； 圖5為轉移載體pSWEll/P28V酶切產物電泳檢測結果； 圖6為western blot檢測VP60蛋白在重組豬痘病毒rSWEll/P28V中的表達情況，其 中泳道M :預染蛋白Marker，泳道1 :感染rSWEll/P28V的PK15細胞，泳道2 :豬痘病毒親本 病毒感染PK15細胞，泳道3 :正常無病毒感染PK15細胞； 圖7圖示的是螢光條件下檢測重組豬痘病毒rSWEl 1/P28V在PK15細胞中的表達情況， 其中（A)為轉移載體PSWE11-28V與豬痘病毒親本病毒轉染PK15細胞，能夠看到明顯的散在 綠色螢光斑；圖（B)為單個綠色螢光斑；圖（C)為純化3輪後的重組豬痘病毒rSWEll/P28V， 可見成片綠色螢光； 圖8圖示的是免疫小鼠血清抗體效價測定結果。

【具體實施方式】
[0027] 下列實施例的給出是為了更好的理解和闡述本發明，而決不應理解為對本發明的 任何限制。
[0028] 實施例1通用轉移載體pSWEll的構建 根據NCBI唯一收錄的豬痘病毒（GenBank :AF410153. 1)基因序列設計兩對特異性引 物，分別擴增SPV017-SPV020左右同源臂： SPV017-020-L11 (基因組中的位置：11134bp-11158bp) 5 z -CGAGCTC (Sac I ) ACTTCTGTTTAGATTCACAGCATTT-3 ^ SPV017-020-L12 (基因組中的位置：12280bp-12300bp) 5 , -CGGGATCC (.BamH I ) ACGATAGCAGCGTTGGTGTT-3 SPV017-020-R11 (基因組中的位置：13365bp-13384bp) 5 ^ -GCTCTAGA (.Xba I ) CTCGAG iXho I ) GTCGAC (.Sal I ) GTGGGTGGTGTAGACTGTGT-3 z SPV017-020-R12 (基因組中的位置：14416bp-14436bp) 5 z -CCMGCTT (^i/?i/III) TTCGATTTTTCACAGGTGGCT-3 ^ 用病毒核酸提取試劑盒（QIAGEN)提取豬痘病毒（ATCC :VR-363?)的基因組作為模 板，用上述引物通過PCR方法分別擴增得到轉移載體的左右同源臂SPV017-020-L和 SPV017-020-R (擴增結果見圖3)。PCR擴增產物經膠回收純化後，SPV017-020-R片段插入 到PUC19質粒的歷和油a I酶切位點，同時將SPV017-020-L片段插入到pUC19質粒 的及麗7 I和fee I酶切位點，構建出pSW-R-L。
[0029] 通用穿梭質粒pSWEll的構建。以質粒EGFP-Nl為模板，用引物： PlI-EGFPl: 5 z _ GCTCTAGA (.Xba I ) TAGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATG GTGAGCAAGGGCGAG - 3 , P11-EGFP2: 5 ' - CGGGATCC (.BamH I ) TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG - 3 ^ 其中上遊引物（P11-EGFPI)中帶有P11啟動子序列，擴增出綠色螢光蛋白EGFP的基因， 通過酶切、連接等步驟，將其克隆到載體PSW-R-L中的油a I和及_7 I位點，形成轉移載體 pSWEll。
[0030] 實施例2兔病毒性出血症病毒VP60基因的擴增、克隆、鑑定和測序分析 2. I PCR引物設計及合成 根據GenBank收錄的VP60基因序列（GenBank :DQ205345. 1)設計了一對擴增VP60基 因的特異性引物，在上遊引物的5'端加上P28啟動子序列，同時含有限制性內切酶通〇 I 和5?/ I的酶切位點。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0031] P28-VP11 ： 5' - CCCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATGGAGGGCAAAGCCCGCAC- 3' (.XhoO P28-VP12 ： 5' - gc GTCGAC (.Sal I ) TCACTATCAGACATAAGAAAAGCCG- 3' 2. 2 PCR擴增 (I)RNA提取 以感染RHDV的兔肝臟組織提取RNA為模板。
[0032] (2) RT-PCR 取 RNA 模板 10 μ L，下遊引物 P28-VP12 2 μ L，5 X RT Buffer 4 μ L，RNAsin 0.5 μ L， AMV 0.5yL，dNTPs 3yL，輕輕混勻後，42 °C I h，然後 94 °C 滅活 5 min，得到的 cDNA -20 °C保存備用。
[0033] (3) PCR 擴增 取 ddH20 37. 5 μ L，IOXTrans Taq Buffer 5 μ L、dNTPs (2. 5 mmol /1,)4 μ L, cDNA 2 yL，上遊引物 P28-VP11 0.5 yL、下遊引物 P28-VP12 0.5 yL，Trans Taq 酶（5 U/yL) 0.5 yL，共 50 yL。PCR 程序為：95 °C 5 min，95 °C 30 s，54 °C 30 s，72 °C 延伸 90 s，共35個循環，最後72 °C延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳。
[0034] 2. 3 PCR產物回收與純化 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳後，在紫外燈下切下完整、單一的目的條帶，用DNA膠回收 純化試劑盒回收目的片段。具體操作步驟按天根生化科技(北京)有限公司膠回收試劑盒說 明書進行。圖4為兔病毒性出血症病毒VP60基因 PCR擴增結果。
[0035] 2. 4 PCR產物酶切與純化 酶切反應總體積為 50μ L :PCR 回收片段 30yL，IOXbuffer Tango 5μ L，5^ I 2yL， ZAo I 2 μ L，補足滅菌去離子水至50 μ L。37°C水浴2h，然後進行瓊脂糖凝膠電泳並用瓊脂 糖凝膠回收試劑盒對酶切後的產物進行回收，方法同上。
[0036] 2. 5目的片段VP60與轉移載體pSWEl 1的連接 VP60 酶切回收產物6 μ L，載體pSWEll酶切回收產物2 μ L，IOX ligation bufferl μ L，T4 DNA連接酶1 μ L，混勻後4°C連接過夜。連接產物pSWEll/P28V轉化大腸 桿菌T0P10。pSWEll/P28V具體結構見圖1。圖5為轉移載體pSWEll/P28V酶切產物電泳檢 測結果。
[0037] 2. 6大腸桿菌T0P10感受態細胞的製備和轉化 感受態細胞的製備及連接產物的轉化步驟詳見《分子克隆實驗指南》。
[0038] 2. 7重組質粒的提取和鑑定 用質粒提取試劑盒提取重組質粒PSWE11/P28V (具體操作步驟按天根生化科技有限公 司質粒提取試劑盒說明書進行)，PCR和雙酶切鑑定中都可以看到目的條帶。
[0039] 2. 8目的基因 VP60序列分析 測序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司協助完成。測序結果如SEQ ID NO :1所示， 克隆的目的基因 VP60為1740bp，符合載體閱讀框要求。
[0040] 實施例3含有VP60基因的重組豬痘病毒的製備及測定 3. I PK15細胞準備 PK-15細胞每隔20h左右傳代一次，保持細胞對數生長期，轉染前天取一瓶細胞，按一 瓶細胞接六孔板六孔比例，每孔含2mL培養液，37°C，5%C02培養20h左右。
[0041] 3. 2重組豬痘病毒rSWE 11/P28V的獲取 取豬痘病毒株VR-363?病毒液，用5%DMEM稀釋，按0. 05M0I的豬痘病毒感染PK15單層 細胞，吸附2h，期間每隔20min搖晃一次。病毒吸附最後半小時前開始稀釋質粒及脂質體。 轉染按Lipofectamine 2000試劑盒（Invitrogen公司)操作說明書操作。37°C培養箱孵育 6h後(靜止不動)棄掉上清，換上10%DMEM 2mL繼續培養。細胞培養4d後有病變時收毒，反 復凍融3次，收集重組病毒rSWEll/P28V原始液。
[0042] 3. 3重組豬痘病毒的純化 將原始重組病毒液按50、500、5000倍稀釋，每孔接毒90〇μ?，病毒吸附時間3-4h，期間 輕晃搖勻3次。病毒吸附完成後，棄掉感染液，加含10%小牛血清DMEM 0. 5%低熔點瓊脂糖 3mL，室溫放置30min左右後37°C 5% CO2繼續培養4d後，在螢光顯微鏡下，標記發螢光的 單個蝕斑。用高壓滅菌的20〇μ?去尖槍頭挑取單個的斑溶於20〇μ?維持液中，反覆凍融2 次作為下一輪純化和增值。由PCR鑑定是否純化到，一般需要純化7?8輪。得本發明重 組豬痘病毒。
[0043] 3. 4重組豬痘病毒滴度的測定 按病毒學操作手冊方法，分別用含雙抗(青黴素和鏈黴素）的DHanks緩衝液將病毒作 10倍梯度稀釋。
[0044] 然後分別接種於長滿單層ΡΚ15細胞的96孔細胞培養板，每個稀釋度接種8孔，每 孔接種100 μ L。同時設定陰、陽性對照。37 °C 5% C02溫箱培養2. 5h後，換5% DMEM繼 續培養。每天觀察細胞病變，並按Reed-Muench法計算病毒滴度。本重組病毒滴度為IO8 5 PFU/mL，而SPV063 (TK基因）缺失的重組病毒滴度為IO7 2 PFU/mL。
[0045] 3. 5重組豬痘病毒的PCR檢測 取分別接種重組豬痘病毒rSWEll/P28V和親本豬痘病毒的PK15細胞各一瓶，用病毒 核酸提取試劑盒（QIAGEN)提取病毒DNA後分別用引物對P28-VP11/ P28-VP12進行PCR擴 增。擴增產物電泳檢測結果表明重組豬痘病毒中含有VP60基因片段，而對照組的親本豬痘 病毒中擴增不出VP60基因。
[0046] 3.6綠色螢光蛋白檢測 在螢光顯微鏡下可以發現：接種重組豬痘病毒rSWEl 1/P28V的PK15細胞在螢光顯微鏡 下呈現綠色螢光斑，而接種親本豬痘病毒的PK15細胞和正常PK15細胞則未見螢光斑。圖7 為螢光條件下檢測重組豬痘病毒rSWEll/P28V在PK15細胞中的表達情況，其中（A)為轉移 載體PSWE11-28C與豬痘病毒親本病毒轉染PK15細胞，能夠看到明顯的單個綠色螢光斑；圖 (B)單個的重組豬痘病毒rSWEll/P28V感染PK15細胞；圖（C)純化的重組豬痘病毒rSWEll/ P28V感染PK15細胞，可見綠色熒片。
[0047] 3. 7 Western bloting 檢測目的蛋白（VP60)的表達 取重組豬痘病毒rSWEll/P28V純化後第4代病毒液，感染PK15細胞，培養72h待細胞 出現病變後，收集上清液，用細胞刮刀將細胞刮下並收集細胞。用不完全DMEM 3500r/min 離心IOmin洗滌細胞3次後，最後加入30〇μ?不完全DMEM懸浮細胞，反覆凍融2次。加入 4X上樣緩衝液75μ?，沸水煮沸IOmin後用於SDS-PAGE電泳，同時設豬痘病毒親本病毒和 ΡΚ15正常細胞空白對照；SDS-PAGE電泳結束後，取出蛋白電泳膠，將PVDF膜蓋於膠上，60V 電轉2h ;轉完後將膜置於脫色搖床上用PBST洗滌2次；將PVDF膜移置另一平皿中，加入5% 脫脂奶室溫下置脫色搖床上封閉2h ;將用His-VP60免疫後小鼠血清用PBST稀釋至500倍， 將封閉後的PVDF膜置於一抗中孵育2h後，在脫色搖床洗滌3次，每次IOmin ;同上方法準 備羊抗鼠二抗，按1 : 3000倍稀釋後與膜接觸，室溫下孵育I. 5h，在脫色搖床中用PBST洗 滌3次，每次IOmin ;最後將洗滌後的PVDF膜浸入配置好的DAB顯色液中避光顯色，直至出 現明顯的條帶，用CldH2O終止反應，拍照。結果（圖6)表明目的蛋白在重組豬痘病毒中均有 表達，但在豬痘病毒親本病毒和正常PK15細胞中則沒有目的蛋白出現。
[0048] 實施例4重組疫苗的免疫保護實驗 4. 1重組疫苗（rSWEll/P28V)免疫小鼠試驗 取40隻4周齡的SPF級ICR小鼠隨機分成5組，每組8隻小鼠；第一組用2*107_ 5PFU的 本發明構建的重組豬痘病毒rSWEll/P28V肌肉注射免疫；第二組用2*107 5PFU的以SPV063 (TK基因)為缺失位點表達VP60蛋白的重組豬痘病毒肌肉注射免疫；第三組用2*10 7_ 5PFU的 豬痘病毒親本病毒肌肉注射免疫；第四組用兔病毒性出血症滅活疫苗肌肉注射免疫；第五 組用滅菌生理鹽水肌肉注射免疫作為空白對照組；每組小鼠免疫三次，初次免疫後的第14 天和第35天按相同方法分別進行二免和三免；每天觀察並記錄免疫小鼠反應；在初次免疫 當天及免疫後第7、14、21、28、35、42和49天通過尾靜脈採血，分離血清，用間接ELISA法檢 測抗體效價。
[0049] 結果表明（圖8):用本發明構建的重組豬痘病毒免疫小鼠血清抗體效價明顯高於 其他組和對照組。
[0050] 4. 2重組豬痘病毒rSWEll/P28V免疫兔及攻毒保護試驗 取40隻試驗兔，免疫及分組同4. 1。免疫後第42天用RHDV通過口服途徑感染兔子，每 只兔子口服接種〇. 5mL過濾的感染兔肝勻漿液。
[0051] 攻毒後觀察14天，記錄接種後兔子臨床發病症狀或死亡情況。死亡兔子立刻進行 剖檢，存活到Hd試驗結束的兔子則將其安樂死後進行剖檢，觀察組織病理變化。以肺臟 出血作為評價標準。如果超過1/4的肺葉出現了出血的情況，記3分；如果兔子肺臟出血 面積大於〇. 5cm2而小於肺葉1/4面積，則記2分；如果兔子肺臟上出現了出血，但面積小於 0. 5cm2,記1分，若肺臟表面無出血則記0分。
[0052] 結果(表1):記錄了攻讀後各組兔子的死亡情況及肺臟眼觀病理評價指數。
[0053] 表 1

【權利要求】
1. 一種用於預防兔病毒性出血症病毒所致疾病的重組疫苗，包括重組豬痘病毒；該重 組豬痘病毒包含豬痘病毒載體和編碼兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的基因。
2. 權利要求1中所述的重組疫苗，該重組疫苗包含豬痘病毒載體和編碼兔病毒性出血 症病毒VP60蛋白的基因。
3. 權利要求1或2所述的重組疫苗組合物，其中所述的兔病毒性出血症病毒VP60蛋白 編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID :1所示。
4. 權利要求2所述的重組疫苗在製備用於預防和/或治療兔病毒性出血症病毒引發疾 病的藥物中的用途。
5. 根據要求4所述的用途，其中所述的兔病毒性出血症病毒引發疾病為兔病毒性出血 症。
6. -種製備重組豬痘病毒的方法，該方法包括： 利用特異性的引物對擴增兔病毒性出血症病毒VP60蛋白的編碼基因； 將VP60基因克隆入轉移載體pSWEll中，然後通過PCR和雙酶切鑑定，獲得含VP60基 因的轉移載體PSWE11/P28V ; 讓含有VP60基因的轉移載體pSWEll/P28V與豬痘病毒在感染細胞內進行同源重組，獲 得重組豬痘病毒rSWEll/P28V ; 純化重組豬痘病毒rSWEll/P28V。
7. 權利要求6所述的方法，其中所述的特異性引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3 所示。
8. 權利要求6所述的方法，其中所述的讓含有VP60基因的轉移載體pSWEll/P28V與 豬痘病毒同源重組的具體操作為：用豬痘病毒（SWPV)感染PK15單層細胞，吸附2小時後用 脂質體轉染法加入轉移載體PSWE11/P28V，二者發生同源重組； PK15細胞在常規條件下培養4天後，反覆凍融3次，獲得原始重組豬痘病毒rSWEll/ P28V ;純化重組豬痘病毒rSWEll/P28V的具體操作為：將所述重組豬痘病毒rSWEll/P28V 進行10倍梯度稀釋，接種PK15單層細胞後繼續培養4天，在螢光顯微鏡下標記單個帶綠色 螢光蝕斑，挑取單獨的病毒蝕斑，反覆凍融後適當稀釋後再次接種PK15單層細胞，重複8次 純化，直至獲得能夠穩定遺傳的重組豬痘病毒。
【文檔編號】A61K39/275GK104436187SQ201410626467
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月10日 優先權日:2014年11月10日
【發明者】張文波, 蔣新華, 鄧舜洲, 陳松昌, 萬文忠, 王建敏, 戴益民 申請人:張文波, 蔣新華, 鄧舜洲, 陳松昌, 萬文忠, 王建敏, 戴益民, 南昌金牧動物保健服務有限公司