一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法

2023-12-09 01:46:46 2

專利名稱：一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法
技術領域：
本發明涉及分析方法應用研究領域中的毛細管電泳檢測方法，尤其涉及一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法。
背景技術：
基因突變的檢測在臨床疾病診斷中起著十分重要的作用。目前，篩查基因點突變常常採用以PCR為基礎的聚丙烯醯胺凝膠(PAGE)電泳與各種基因突變檢測技術相結合的方法，這些方法在滿足臨床快速檢測基因突變的需要時有一定的局限性。因此建立一種準確快速地用於臨床診斷的基因突變檢測方法勢在必行。毛細管電泳(CE)是一種新型電泳與色譜相結合的分離分析技術，具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、應用範圍廣等特點，廣泛應用於分子生物學、分子醫學和生命科學等方面。CE與各種基因突變檢測技術例如SSCP(單鏈構象多態性檢測)、RFLP(限制性內切酶片段長度多態性)相結合時，在突變基因檢測方面顯示了無可比擬的優越性。在 1984 2010年中國專利資料庫中記載了申請號為200510026931. X的中國專利《一種腫瘤相關基因突變的PCR檢測方法及試劑系統》、專利號為200910042599. 4的中國專利《用於惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變檢測的基因晶片及其應用》、申請號為200810005523. X的中國專利《檢測基因突變的方法》、申請號為201010134207. X的中國專利《APC基因突變的快速檢測》申請號為200910201917. 7的中國專利《一種用於檢測K-ras基因突變的引物及其應用》，上述專利僅僅公開了採用實時定量螢光PCR、測序、高解析度溶解曲線法、螢光雙環探針技術等基因突變檢測方法對組織中或血液中腫瘤基因突變進行了檢測，而採用毛細管電泳結合SSCP、RFLP用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法及應用卻未見文獻報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種操作簡單、重現性好的用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法。為解決上述問題，本發明所述的一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，包括以下步驟(1)含TBE的聚環氧乙烷篩分介質的配製將聚環氧乙烷加入IXTBE緩衝液中， 使最終溶液濃度為2. 5 3. 5%、pH值為7. 5 9. 0後，攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用0. 22um或0. 45um水系微孔濾膜過濾後，即得到聚環氧乙烷篩分介質；(2)血液樣品中基因組DNA提取在血液樣品中加入Tris緩衝液I裂解紅細胞後，棄去上清，向沉澱中加入Tris緩衝液II將細胞團懸浮並加入蛋白酶K，55 57°C水浴孵育2 他；孵育結束後加入酚-氯仿沉澱蛋白，吸取上清液並在該上清液中加入無水乙醇，得到沉澱DNA ；該沉澱DNA經室溫自然乾燥至恆重時，即得基因組DNA ；所述Tris緩衝液I與所述血液樣品的體積比為1 2 3;所述Tris緩衝液II與所述血液樣品的體積比為1 0.5 1;所述蛋白酶K與所述血液樣品的體積比為1 0.03 0.05;所述酚-氯仿與所述血液樣品的體積比為1 1 1.5;所述無水乙醇與所述血液樣品的體積比為 1 1. 5 2. 0 ；(3)需檢測基因目的片段擴增將所述基因組DNA作為擴增模板，採用pp5設計 P53基因及k-ras基因目的片段擴增引物，進行常規PCR擴增，即得p53基因PCR擴增樣品和k-ras基因PCR擴增樣品；(4)樣品處理將p53基因PCR擴增樣品和k_ras基因PCR擴增樣品經94 97°C 變性8 IOmin後，冰浴5 lOmin，得到變性DNA樣品溶液；或分別在p53基因PCR擴增樣品、在k-ras基因PCR擴增樣品中加入三蒸水、Tango緩衝液，並在p53基因PCR擴增樣品中加入Msp I內切酶、在k-ras基因PCR擴增樣品中加入BstN I內切酶，在37°C孵育4 8h,在80°C滅活15 20min後，得到酶切DNA樣品溶液；所述p53基因PCR擴增樣品、k_ras 基因PCR擴增樣品分別與三蒸水、Tango緩衝液的體積比為1 1. 5 1. 8 0. 2 0. 3 ； 所述P53基因PCR擴增樣品與所述Msp I內切酶的體積比為1 0. 1 0. 2 ；所述k_ras基因PCR擴增樣品與所述BstN I內切酶的體積比為1 0. 1 0. 2 ；(5)樣品檢測①在17 22ul變性DNA樣品溶液中分別加入10 X STOR Green I螢光染料、所述步驟(2)所得的基因組DNA，混勻後加入去離子水至體系為30 50 μ 1 ；然後，使用毛細管電泳儀壓力系統自動填充所述聚環氧乙烷篩分介質，在分離電壓為10 20kv、溫度為15 20°C的條件下採用負極-IOkv電動進樣的方式進行CE-SSCP檢測即可；②在17 22ul酶切DNA樣品溶液中分別加入10 X STOR Green I螢光染料、所述步驟(2)所得的基因組DNA，混勻後加入去離子水至體系為30 50 μ 1 ；然後，使用毛細管電泳儀壓力系統自動填充所述聚環氧乙烷篩分介質，在分離電壓為10 20kv、溫度為15 20°C的條件下採用負極-IOkv電動進樣的方式進行CE-RFLP檢測即可。所述步驟(1)中的IXTBE緩衝液是指將在800毫升去離子水中分別加入三羥甲基氨基甲烷(Tris) 10. 8克、硼酸5. 5克、乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)0. 74克經攪拌溶解後，加去離子水將溶液定容至1升所得的緩衝液。所述步驟O)中的血液樣品是指胃癌、肺癌患者及正常人外周靜脈血液樣品。所述步驟⑵中的Tris緩衝液I是指由pH值為8. O且lOmmol/L的Tris-HCl緩衝液、10mmol/L的氯化鉀、10mmol/L的氯化鎂、pH值為8. 0且2mmol/L的EDTA和25mL/L的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)混合而成的緩衝液。所述步驟(2)中的Tris緩衝液II是指由pH值為8. 0且10mmol/L的Tris-HCl緩衝液、10mmol/L的氯化鉀、10mmol/L的氯化鎂、pH值為8. 0且2mmol/L的EDTA、0. 4mol/L氯化鈉和10g/L十二烷基硫酸鈉(SDQ混合而成的緩衝液。所述步驟O)中的酚-氯仿是指將飽和酚與氯仿等體積混合所得的溶液。所述步驟(3)中的擴增條件為94°C變性30s，50 60°C退火30s，72°C延伸30s， 共行30個循環。所述步驟(4)中的Tango緩衝液是指由33mM三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽 (Tris-acetate)、IOmM 醋酸鎂(Mg-acetate)、66mM 醋酸鉀(K-acetate)、0. lmg/ml N，0_ 雙三甲矽基乙醯胺(BSA)混合後，加去離子水定容至1升所得的緩衝液；所述三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽(Tris-acetate)的pH值為7.9，溫度為37°〇。
所述步驟(5)中10 X STOR Green I螢光染料與所述基因組DNA樣品的體積比為 1 3 1 4。本發明與現有技術相比具有以下優點1、本發明採用毛細管電泳結合SSCP、RFLP突變檢測技術，與傳統平板電泳檢測基因突變相比較，具有良好的溫度控制系統，能有效控制溫度在15 20°C，從而保證了檢測結果的準確性和重現新。2、本發明以含有IXTBE緩衝液的聚環氧乙烷(PEO)作為篩分介質，具有良好分離效能，可完成對血液樣品中腫瘤突變基因的檢測(參見圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、 圖9)。同時，選用了 10XSTOR green I作為螢光染料，有效提高了檢測的靈敏度。3、本發明操作簡單、快速簡便、樣品用量少、結果直觀可靠、重現性好，可廣泛應用於臨床血液樣品中腫瘤突變基因的檢測。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細的說明。圖1為本發明實施例1的毛細管電泳圖。圖2為本發明實施例2的毛細管電泳圖。圖3為本發明實施例2的毛細管電泳圖。圖4為本發明實施例2的毛細管電泳圖。圖5為本發明實施例2的毛細管電泳圖。圖6為本發明實施例3的毛細管電泳圖。圖7為本發明實施例3的毛細管電泳圖。圖8為本發明實施例3的毛細管電泳圖。圖9為本發明實施例3的毛細管電泳圖。圖10為本發明實施例4的毛細管電泳圖。圖11為本發明實施例4的毛細管電泳圖。圖12為本發明實施例4的毛細管電泳圖。圖13為本發明實施例4的毛細管電泳圖。圖14為本發明實施例5的毛細管電泳圖。圖15為本發明實施例5的毛細管電泳圖。圖16為本發明實施例5的毛細管電泳圖。圖17為本發明實施例5的毛細管電泳圖。
具體實施例方式實施例1 一種用於檢測血液樣品中腫瘤突變基因的方法，用於pUC19 DNA/Msp I / Hpa II DNA Marker 的分離。(1)含TBE的聚環氧乙烷篩分介質的配製將聚環氧乙烷加入1 X TBE緩衝液中，使最終溶液濃度為3. 0 %、pH值為8. 3後，並用河南鞏義市予華儀器有限責任公司生產的DF-101S型磁力攪拌器以400轉/分鐘的速率攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用0. 45um水系微孔濾膜過濾後，即得到聚環氧乙烷篩分介質。其中1 XTBE緩衝液是指將在800毫升去離子水中分別加入上海生物工程公司生產的三羥甲基氨基甲烷(Tris) 10. 8克、上海生工公司生產的硼酸5. 5克、上海生工公司生產的乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)O. 74克經攪拌溶解後，加去離子水將溶液定容至1升所得的緩衝液。該方法在分離pUC19 DNA/Msp I /Hpa II DNA Marker中的應用，包括以下步驟①使用毛細管電泳儀(P/ACE 5000，美國Beckman公司)，在分離時使用壓力為 IOpsi (磅/平方英寸)的壓力系統自動填充含TBE的聚環氧乙烷篩分介質。②將10 X SYBR Green I的螢光染料(廈門百信威公司提供)與pUC19 DNA/ Msp I /Hpa II DNA Marker (BBI公司提供)按4 1的體積比混勻，以-10KV負極電動進樣 10s，然後加入去離子水至體系為30 50 μ 1。③在分離電壓為15kV、電泳溫度為15°C下進行電泳分離。其分離電泳圖參見圖1，共得到11個色譜峰。圖中1為^bp ；2為34bp ；3為67bp ； 4 為 110 和 Illbp ;5 為 147bp ；6 為 190bp ；7 為 242bp ；8 為 331bp ；9 為 404bp ；10 為 489bp ； 11 為 501bp。從圖中可以看出，該方法對不同長度DNA片段進行了良好的分離。實施例2 —種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，包括以下步驟(1)含TBE的聚環氧乙烷篩分介質的配製將聚環氧乙烷加入1 X TBE緩衝液中，使最終溶液濃度為2. 5 %、pH值為8. 0後，攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用0. 22um水系微孔濾膜過濾後，即得到聚環氧乙烷篩分介質。其中1 X TBE緩衝液同實施例1。(2)血液樣品中基因組DNA提取在血液樣品中加入Tris緩衝液I裂解紅細胞後，棄去上清，向沉澱中加入Tris緩衝液II將細胞團懸浮並加入蛋白酶K，55°C水浴孵育4h;孵育結束後加入酚-氯仿沉澱蛋白，吸取上清液並在該上清液中加入無水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp離心2min，得到沉澱DNA ； 該沉澱DNA經室溫自然乾燥至恆重時，即得基因組DNA。Tris緩衝液I與血液樣品的體積比為1 2 ；Tris緩衝液II與血液樣品的體積比為1 0.5 ；蛋白酶K與血液樣品的體積比為1 0.03 ；酚-氯仿與血液樣品的體積比為 1 1 ；無水乙醇與血液樣品的體積比為1 1.5。其中血液樣品是指胃癌患者外周靜脈血液樣品。Tris緩衝液I是指由pH值為8. 0且IOmmol/L的Tris-HCl緩衝液、10mmol/L的氯化鉀、10mmol/L的氯化鎂、pH值為8. 0且2mmol/L的EDTA和25mL/L的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)混合而成的緩衝液。Tris緩衝液II是指由pH值為8. 0且10mmol/L的Tris-HCl緩衝液、IOmmol/L的氯化鉀、10mmol/L的氯化鎂、pH值為8. 0且2mmol/L的EDTA、0. 4mol/L氯化鈉和10g/L十二烷基硫酸鈉(SDQ混合而成的緩衝液。酚-氯仿是指將飽和酚與氯仿等體積混合所得的溶液。(3)需檢測基因目的片段擴增將基因組DNA作為擴增模板，採用pp5設計p53基因及k-ras基因目的片段擴增引物，進行常規PCR擴增，即得p53基因PCR擴增樣品和k-ras 基因PCR擴增樣品。其中擴增條件為94°C變性30s，50 60°C退火30s，72°C延伸30s，共行30個循環。(4)樣品處理分別取p53基因PCR擴增樣品和k_ras基因PCR擴增樣品各22ul， 在96°C變性lOmin，立即冰浴5min，得到變性DNA樣品溶液。(5)樣品檢測在20ul變性DNA樣品溶液中分別加入10X STOR Green I螢光染料、步驟(2)所得的基因組DNA，10XSTOR Green I螢光染料與基因組DNA樣品的體積比為 1 3。混勻後加入去離子水至體系為30 50 μ 1;然後，使用毛細管電泳儀壓力系統自動填充所述聚環氧乙烷篩分介質，在分離電壓為13kv、溫度為15°C的條件下採用負極-IOkv 電動進樣的方式進行CE-SSCP檢測即可。其分離電泳圖參見圖2、圖3、圖4、圖5。圖2、圖3分別為p53基因正常對照和腫瘤樣品CE-SSCP檢測電泳圖；圖4、圖5分別為k-ras基因正常對照和腫瘤樣品CE-SSCP檢測電泳圖。圖中1為未變性完全雙鏈DNA，2，3為變性所得正常單鏈DNA，4為變性所得異常單鏈DNA。從圖中可以看出，該用於血液中腫瘤突變基因檢測方法對雙鏈DNA、單鏈DNA均能得到良好的分離。實施例3 —種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，包括以下步驟(1)含TBE的聚環氧乙烷篩分介質的配製將聚環氧乙烷加入IXTBE緩衝液中，使最終溶液濃度為2. 5%、pH值為7. 5後，攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用0. 22um水系微孔濾膜過濾後，即得到聚環氧乙烷篩分介質。其中1 X TBE緩衝液同實施例1。(2)血液樣品中基因組DNA提取在血液樣品中加入Tris緩衝液I裂解紅細胞後，棄去上清，向沉澱中加入Tris緩衝液II將細胞團懸浮並加入蛋白酶K，56°C水浴孵育孵育結束後加入酚-氯仿沉澱蛋白，吸取上清液並在該上清液中加入無水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp離心2min，得到沉澱DNA ； 該沉澱DNA經室溫自然乾燥至恆重時，即得基因組DNA。Tris緩衝液I與血液樣品的體積比為1 2. 5 ;Tris緩衝液II與血液樣品的體積比為1 0.55 ；蛋白酶K與血液樣品的體積比為1 0.04;酚-氯仿與血液樣品的體積比為1 1.2 ；無水乙醇與血液樣品的體積比為1 1.7。其中血液樣品是指胃癌患者外周靜脈血液樣品。Tris緩衝液I、Tris緩衝液II、酚-氯仿同實施例2。(3)需檢測基因目的片段擴增將基因組DNA作為擴增模板，採用pp5設計p53基因及k-ras基因目的片段擴增引物，進行常規PCR擴增，即得p53基因PCR擴增樣品和k-ras 基因PCR擴增樣品。其中擴增條件同實施例2。(4)樣品處理分別取p53基因PCR擴增樣品和k_ras基因PCR擴增樣品各22ul， 在94°C變性9min，立即冰浴7min，得到變性DNA樣品溶液。
(5)樣品檢測在17ul變性DNA樣品溶液中分別加入10X STOR Green I螢光染料、步驟(2)所得的基因組DNA，10X STOR Green I螢光染料與基因組DNA樣品的體積比為1 3.5。混勻後加入去離子水至體系為30 50 μ 1 ；然後，使用毛細管電泳儀壓力系統自動填充所述聚環氧乙烷篩分介質，在分離電壓為10kv、溫度為20°C的條件下採用負極-IOkv電動進樣的方式進行CE-SSCP檢測即可。分離電泳圖參見圖6、圖7、圖8、圖9。圖6、圖7分別為p53基因正常對照和腫瘤樣品CE-SSCP檢測電泳圖；圖8、圖9分別為k-ras基因正常對照和腫瘤樣品CE-SSCP檢測電泳圖。圖中1為未變性完全雙鏈DNA，2，3為變性所得正常單鏈DNA，4，5為變性所得異常單鏈DNA。其中圖9中k-ras基因發生缺失只檢測到一條單鏈。從圖中可以看出，該用於血液中腫瘤突變基因檢測方法對雙鏈DNA、單鏈DNA均能得到良好的分離。實施例4 一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，包括以下步驟(1)含TBE的聚環氧乙烷篩分介質的配製將聚環氧乙烷加入1 X TBE緩衝液中，使最終溶液濃度為2. 5 %、pH值為8. 5後，攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用0. 35um水系微孔濾膜過濾後，即得到聚環氧乙烷篩分介質。其中1 X TBE緩衝液同實施例1。(2)血液樣品中基因組DNA提取在血液樣品中加入Tris緩衝液I裂解紅細胞後，棄去上清，向沉澱中加入Tris緩衝液II將細胞團懸浮並加入蛋白酶K，55°C水浴孵育4h;孵育結束後加入酚-氯仿沉澱蛋白，吸取上清液並在該上清液中加入無水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp離心2min，得到沉澱DNA ； 該沉澱DNA經室溫自然乾燥至恆重時，即得基因組DNA。 Tris緩衝液I與血液樣品的體積比為1 2 ；Tris緩衝液II與血液樣品的體積比為1 0.5 ；蛋白酶K與血液樣品的體積比為1 0.03 ；酚-氯仿與血液樣品的體積比為 1 1 ；無水乙醇與血液樣品的體積比為1 1.5。其中血液樣品是指胃癌患者外周靜脈血液樣品。Tris緩衝液I、Tris緩衝液II、酚-氯仿同實施例2。(3)需檢測基因目的片段擴增將基因組DNA作為擴增模板，採用pp5設計p53基因及k-ras基因目的片段擴增引物，進行常規PCR擴增，即得p53基因PCR擴增樣品和k-ras 基因PCR擴增樣品。其中擴增條件同實施例2。(4)樣品處理分別取p53基因PCR擴增樣品和k_ras基因PCR擴增樣品各22ul， 在97°C變性8min，立即冰浴lOmin，得到變性DNA樣品溶液。(5)樣品檢測在22ul變性DNA樣品溶液中分別加入10X STOR Green I螢光染料、步驟(2)所得的基因組DNA，10XSTOR Green I螢光染料與基因組DNA樣品的體積比為 1 3。混勻後加入去離子水至體系為30 50 μ 1;然後，使用毛細管電泳儀壓力系統自動填充所述聚環氧乙烷篩分介質，在分離電壓為20kv、溫度為18°C的條件下採用負極-IOkv 電動進樣的方式進行CE-SSCP檢測即可。其分離電泳圖參見圖10、圖11、圖12、圖13。圖10、圖11分別為p53基因正常對照和腫瘤樣品CE-RFLP檢測電泳圖；圖12、圖13分別為k_ras基因正常對照和腫瘤樣品 CE-RFLP檢測電泳圖。其中圖10經酶切所得53bp和147bp兩條片段，圖11可見由於突變未能酶切開所得的200bp單一片段。其中圖12經酶切所得45bp和117bp兩條片段，圖13 可見由於突變未能酶切開所得的162bp單一片段。從圖中可以看出，該用於血液中腫瘤突變基因檢測方法對酶切腫瘤及正常對照樣品均能得到良好的分離。實施例5 —種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，包括以下步驟(1)含TBE的聚環氧乙烷篩分介質的配製將聚環氧乙烷加入IXTBE緩衝液中，使最終溶液濃度為3. 5%、pH值為9. 0後，攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用0. 45um水系微孔濾膜過濾後，即得到聚環氧乙烷篩分介質。其中1 X TBE緩衝液同實施例1。(2)血液樣品中基因組DNA提取在血液樣品中加入Tris緩衝液I裂解紅細胞後，棄去上清，向沉澱中加入Tris緩衝液II將細胞團懸浮並加入蛋白酶K，57°C水浴孵育Ml;孵育結束後加入酚-氯仿沉澱蛋白，吸取上清液並在該上清液中加入無水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp離心2min，得到沉澱DNA ； 該沉澱DNA經室溫自然乾燥至恆重時，即得基因組DNA。Tris緩衝液I與血液樣品的體積比為1 3;Tris緩衝液II與血液樣品的體積比為1 1 ；蛋白酶K與血液樣品的體積比為1 0.05;酚-氯仿與血液樣品的體積比為 1 1.5 ；無水乙醇與血液樣品的體積比為1 2.0。其中血液樣品是指肺癌患者外周靜脈血液樣品。Tris緩衝液I ,Tris緩衝液II、酚_氯仿同實施例2。(3)需檢測基因目的片段擴增將基因組DNA作為擴增模板，採用pp5設計p53基因及k-ras基因目的片段擴增引物，進行常規PCR擴增，即得p53基因PCR擴增樣品和k-ras 基因PCR擴增樣品。其中擴增條件同實施例2。(4)樣品處理分別在p53基因PCR擴增樣品、在k-ras基因PCR擴增樣品中加入三蒸水、Tango緩衝液，並在p53基因PCR擴增樣品中加入Msp I內切酶、在k_ras基因PCR 擴增樣品中加入BstN I內切酶，在37°C孵育4 他，在80°C滅活15 20min後，得到酶切 DNA樣品溶液。其中=Tango緩衝液是指由33mM三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽(Tris-acetate)、 IOmM 醋酸鎂(Mg-acetate)、66mM 醋酸鉀(K-acetate)、0· lmg/ml N, 0_ 雙三甲矽基乙醯胺(BSA)混合後，加去離子水定容至1升所得的緩衝液。三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽 (Tris-acetate)的 pH 值為 7. 9，溫度為 37 V。p53基因PCR擴增樣品、k-ras基因PCR擴增樣品分別與三蒸水、Tango緩衝液的體積比為1 1.8 0. 3 ;p53基因PCR擴增樣品與Msp I內切酶的體積比為1 0. 2 ;k-ras 基因PCR擴增樣品與BstN I內切酶的體積比為1 0.2。(5)樣品檢測在22ul酶切DNA樣品溶液中分別加入10X STOR Green I螢光染料、步驟(2)所得的基因組DNA，10XSTOR Green I螢光染料與基因組DNA樣品的體積比為1 4。混勻後加入去離子水至體系為30 50 μ 1;然後，使用毛細管電泳儀壓力系統自動填充所述聚環氧乙烷篩分介質，在分離電壓為Mkv、溫度為18°C的條件下採用負極-IOkv 電動進樣的方式進行CE-RFLP檢測即可。其分離電泳圖參見圖14、圖15、圖16、圖17。圖14、圖15分別為p53基因正常對照和腫瘤樣品CE-RFLP檢測電泳圖；圖16、圖17分別為k_ras基因正常對照和腫瘤樣品 CE-RFLP檢測電泳圖。其中圖14經酶切所得87bp和94bp兩條片段，圖15可見由於突變未能酶切開所得的ISlbp單一片段。其中圖16經酶切所得39bp和136bp兩條片段，圖17可見由於突變未能酶切開所得的175bp單一片段。從圖中可以看出，該用於血液中腫瘤突變基因檢測方法對酶切腫瘤及正常對照樣品均能得到良好的分離。實施例6 —種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，包括以下步驟(1)含TBE的聚環氧乙烷篩分介質的配製將聚環氧乙烷加入1 X TBE緩衝液中，使最終溶液濃度為3. 5 %、pH值為9. 0後，攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用0. 45um水系微孔濾膜過濾後，即得到聚環氧乙烷篩分介質。其中1 X TBE緩衝液同實施例1。(2)血液樣品中基因組DNA提取在血液樣品中加入Tris緩衝液I裂解紅細胞後，棄去上清，向沉澱中加入Tris緩衝液II將細胞團懸浮並加入蛋白酶K，57°C水浴孵育Ml;孵育結束後加入酚-氯仿沉澱蛋白，吸取上清液並在該上清液中加入無水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp離心2min，得到沉澱DNA ； 該沉澱DNA經室溫自然乾燥至恆重時，即得基因組DNA。Tris緩衝液I與血液樣品的體積比為1 3 ;Tris緩衝液II與血液樣品的體積比為1 1 ；蛋白酶K與血液樣品的體積比為1 0.05;酚-氯仿與血液樣品的體積比為 1 1.5 ；無水乙醇與血液樣品的體積比為1 2.0。其中血液樣品是指肺癌患者外周靜脈血液樣品。Tris緩衝液I ,Tris緩衝液II、酚_氯仿同實施例2。(3)需檢測基因目的片段擴增將基因組DNA作為擴增模板，採用pp5設計p53基因及k-ras基因目的片段擴增引物，進行常規PCR擴增，即得p53基因PCR擴增樣品和k-ras 基因PCR擴增樣品。其中擴增條件同實施例2。(4)樣品處理分別在p53基因PCR擴增樣品、在k-ras基因PCR擴增樣品中加入三蒸水、Tango緩衝液，並在p53基因PCR擴增樣品中加入Msp I內切酶、在k_ras基因PCR 擴增樣品中加入BstN I內切酶，在37°C孵育4 他，在80°C滅活15 20min後，得到酶切 DNA樣品溶液。其中=Tango緩衝液同實施例5。p53基因PCR擴增樣品、k-ras基因PCR擴增樣品分別與三蒸水、Tango緩衝液的體積比為1 1.5 0. 2 ;p53基因PCR擴增樣品與Msp I內切酶的體積比為1 0. 1 ;k-ras 基因PCR擴增樣品與BstN I內切酶的體積比為1 0. 1。(5)樣品檢測在17ul酶切DNA樣品溶液中分別加入10XSTOR Green I螢光染料、步驟(2)所得的基因組DNA，10XSTOR Green I螢光染料與述基因組DNA樣品的體積比為1 3。混勻後加入去離子水至體系為30 50 μ 1;然後，使用毛細管電泳儀壓力系統自動填充所述聚環氧乙烷篩分介質，在分離電壓為10kv、溫度為20°C的條件下採用負極-IOkv電動進樣的方式進行CE-RFLP檢測即可。實施例7 —種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，包括以下步驟(1)含TBE的聚環氧乙烷篩分介質的配製將聚環氧乙烷加入1 X TBE緩衝液中，使最終溶液濃度為3. 5 %、pH值為9. 0後，攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用0. 45um水系微孔濾膜過濾後，即得到聚環氧乙烷篩分介質。其中1 X TBE緩衝液同實施例1。(2)血液樣品中基因組DNA提取在血液樣品中加入Tris緩衝液I裂解紅細胞後，棄去上清，向沉澱中加入Tris緩衝液II將細胞團懸浮並加入蛋白酶K，57°C水浴孵育Mi;孵育結束後加入酚-氯仿沉澱蛋白，吸取上清液並在該上清液中加入無水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp離心2min，得到沉澱DNA ； 該沉澱DNA經室溫自然乾燥至恆重時，即得基因組DNA。Tris緩衝液I與血液樣品的體積比為1 3 ;Tris緩衝液II與血液樣品的體積比為1 1 ；蛋白酶K與血液樣品的體積比為1 0.05;酚-氯仿與血液樣品的體積比為 1 1.5 ；無水乙醇與血液樣品的體積比為1 2.0。其中血液樣品是指肺癌患者外周靜脈血液樣品。Tris緩衝液I ,Tris緩衝液II、酚_氯仿同實施例2。(3)需檢測基因目的片段擴增將基因組DNA作為擴增模板，採用pp5設計p53基因及k-ras基因目的片段擴增引物，進行常規PCR擴增，即得p53基因PCR擴增樣品和k-ras 基因PCR擴增樣品。其中擴增條件同實施例2。(4)樣品處理分別在p53基因PCR擴增樣品、在k-ras基因PCR擴增樣品中加入三蒸水、Tango緩衝液，並在p53基因PCR擴增樣品中加入Msp I內切酶、在k_ras基因PCR 擴增樣品中加入BstN I內切酶，在37°C孵育4 他，在80°C滅活15 20min後，得到酶切 DNA樣品溶液。其中=Tango緩衝液同實施例5。p53基因PCR擴增樣品、k-ras基因PCR擴增樣品分別與三蒸水、Tango緩衝液的體積比為1 1.6 0.25 ;p53基因PCR擴增樣品與Msp I內切酶的體積比為1 0.15; k-ras基因PCR擴增樣品與BstN I內切酶的體積比為1 0.15。(5)樣品檢測在20ul酶切DNA樣品溶液中分別加入10X STOR Green I螢光染料、步驟(2)所得的基因組DNA，10XSTOR Green I螢光染料與所述基因組DNA樣品的體積比為1 3.5。混勻後加入去離子水至體系為30 50 μ 1 ；然後，使用毛細管電泳儀壓力系統自動填充所述聚環氧乙烷篩分介質，在分離電壓為20kv、溫度為15°C的條件下採用負極-IOkv電動進樣的方式進行CE-RFLP檢測即可。
權利要求
1.一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，包括以下步驟(1)含TBE的聚環氧乙烷篩分介質的配製將聚環氧乙烷加入IXTBE緩衝液中，使最終溶液濃度為2. 5 3. 5 %、pH值為7. 5 9. 0後，攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用 0. 22um或0. 45um水系微孔濾膜過濾後，即得到聚環氧乙烷篩分介質；(2)血液樣品中基因組DNA提取在血液樣品中加入Tris緩衝液I裂解紅細胞後，棄去上清，向沉澱中加入Tris緩衝液II將細胞團懸浮並加入蛋白酶K，55 57°C水浴孵育 2 他；孵育結束後加入酚-氯仿沉澱蛋白，吸取上清液並在該上清液中加入無水乙醇， 得到沉澱DNA ；該沉澱DNA經室溫自然乾燥至恆重時，即得基因組DNA ；所述Tris緩衝液 I與所述血液樣品的體積比為1 2 3;所述Tris緩衝液II與所述血液樣品的體積比為1 0.5 1 ；所述蛋白酶K與所述血液樣品的體積比為1 0.03 0.05;所述酚-氯仿與所述血液樣品的體積比為1 1 1.5;所述無水乙醇與所述血液樣品的體積比為 1 1. 5 2. 0 ；(3)需檢測基因目的片段擴增將所述基因組DNA作為擴增模板，採用pp5設計p53基因及k-ras基因目的片段擴增引物，進行常規PCR擴增，即得p53基因PCR擴增樣品和k-ras 基因PCR擴增樣品；(4)樣品處理將p53基因PCR擴增樣品和k-ras基因PCR擴增樣品經94 97°C變性 8 IOmin後，冰浴5 lOmin，得到變性DNA樣品溶液；或分別在p53基因PCR擴增樣品、 在k-ras基因PCR擴增樣品中加入三蒸水、Tango緩衝液，並在p53基因PCR擴增樣品中加入Msp I內切酶、在k-ras基因PCR擴增樣品中加入BstN I內切酶，在37°C孵育4 他， 在80°C滅活15 20min後，得到酶切DNA樣品溶液；所述p53基因PCR擴增樣品、k_ras基因PCR擴增樣品分別與三蒸水、Tango緩衝液的體積比為1 1. 5 1. 8 0. 2 0. 3 ；所述p53基因PCR擴增樣品與所述Msp I內切酶的體積比為1 0. 1 0. 2 ；所述k_ras基因PCR擴增樣品與所述BstN I內切酶的體積比為1 0. 1 0. 2 ；(5)樣品檢測①在17 22ul變性DNA樣品溶液中分別加入10XSTORGreen I螢光染料、所述步驟(2)所得的基因組DNA，混勻後加入去離子水至體系為30 50 μ 1 ；然後，使用毛細管電泳儀壓力系統自動填充所述聚環氧乙烷篩分介質，在分離電壓為10 20kv、溫度為15 20°C的條件下採用負極-IOkv電動進樣的方式進行CE-SSCP檢測即可；②在17 22ul酶切DNA樣品溶液中分別加入10XSTOR Green I螢光染料、所述步驟(2)所得的基因組DNA，混勻後加入去離子水至體系為30 50 μ 1 ；然後，使用毛細管電泳儀壓力系統自動填充所述聚環氧乙烷篩分介質，在分離電壓為10 20kv、溫度為15 20°C的條件下採用負極-IOkv電動進樣的方式進行CE-RFLP檢測即可。
2.如權利要求1所述的一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，其特徵在於所述步驟(1)中的IXTBE緩衝液是指將在800毫升去離子水中分別加入三羥甲基氨基甲烷 10. 8克、硼酸5. 5克、乙二胺四乙酸二鈉鹽0. 74克經攪拌溶解後，加去離子水將溶液定容至 1升所得的緩衝液。
3.如權利要求1所述的一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，其特徵在於所述步驟O)中的血液樣品是指胃癌、肺癌患者及正常人外周靜脈血液樣品。
4.如權利要求1所述的一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，其特徵在於所述步驟(2)中的Tris緩衝液I是指由pH值為8. 0且IOmmol/L的Tris-HCl緩衝液、IOmmol/ L的氯化鉀、10mmol/L的氯化鎂、pH值為8. O且2mmol/L的EDTA和25mL/L的聚乙二醇辛基苯基醚混合而成的緩衝液。
5.如權利要求1所述的一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，其特徵在於所述步驟(2)中的Tris緩衝液II是指由pH值為8. O且IOmmol/L的Tris-HCl緩衝液、IOmmol/ L的氯化鉀、10mmol/L的氯化鎂、pH值為8. O且2mmol/L的EDTA、0. 4mol/L氯化鈉和IOg/ L十二烷基硫酸鈉混合而成的緩衝液。
6.如權利要求1所述的一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，其特徵在於所述步驟O)中的酚-氯仿是指將飽和酚與氯仿等體積混合所得的溶液。
7.如權利要求1所述的一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，其特徵在於所述步驟(3)中的擴增條件為94°C變性30s，50 60°C退火30s，72°C延伸30s，共行30個循環。
8.如權利要求1所述的一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，其特徵在於所述步驟⑷中的Tango緩衝液是指由33mM三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽、IOmM醋酸鎂、66mM 醋酸鉀、0. lmg/ml N, 0-雙三甲矽基乙醯胺混合後，加去離子水定容至1升所得的緩衝液； 所述三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽的PH值為7.9，溫度為37°C。
9.如權利要求1所述的一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，其特徵在於所述步驟(5)中10XSTOR Green I螢光染料與所述基因組DNA樣品的體積比為1 3 1 4。
全文摘要
本發明涉及一種用於檢測血液中腫瘤突變基因的方法，該方法包括以下步驟(1)配製含TBE的聚環氧乙烷篩分介質；(2)提取血液樣品中基因組DNA；(3)需檢測基因目的片段擴增將基因組DNA作為擴增模板，進行常規PCR擴增，即得p53基因PCR擴增樣品和k-ras基因PCR擴增樣品；(4)樣品處理將p53基因PCR擴增樣品和k-ras基因PCR擴增樣品經變性或酶切後分別得到變性樣品溶液、酶切樣品溶液；(5)樣品檢測分別在變性樣品溶液和酶切樣品溶液中加入10×SYBR Green I螢光染料與基因組DNA，混勻後加入去離子水至體系為30～50μl；然後，使用毛細管電泳儀壓力系統自動填充聚環氧乙烷篩分介質，分別進行CE-SSCP或CE-RFLP檢測即可。本發明操作簡單、重現性好。
文檔編號G01N27/447GK102251046SQ201110218578
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年7月29日
發明者王榮, 謝華, 謝希輝, 賈正平 申請人:王榮