人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體及其應用的製作方法

2023-12-03 14:00:31 5

專利名稱：：人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體，同時涉及所述單克隆抗體的製備方法以及產生所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株，還涉及含有所述單克隆抗體的試劑盒、所述單克隆抗體在檢測Latexin基因及其編碼蛋白的水平中的應用、以及所述單克隆抗體在製備具有檢測或輔助診斷腫瘤作用的組合物中的應用。
背景技術：
：癌基因和抑癌基因的研究使人們逐步認識癌變的分子過程，推動了細胞生物學基礎理論知識的積累，同時為腫瘤防治提供分子靶點。羧肽酶A具有蛋白水解和蛋白保護雙重功能，可提高彈性蛋白結合蛋白(EBP)的穩定性，而EBP是成纖維細胞、平滑肌細胞、白細胞以及多種腫瘤細胞(包括黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等)膜表面受體的構成成分，介導了細胞與細胞基質間的相互作用，在組織血管形成、白細胞浸潤以及腫瘤細胞遠處轉移等細胞生物學過程中發揮重要作用(1、PshezhetskyAV,AshmarinaM.Lysosomalmultienzymecomplex:biochemistry,genetics,andmolecularpathophysiology./Vog.7Vwc/e/cj"'dMo/,所o/.2001;69:81-114.)。己有研究顯示人惡性黑色素瘤遠處轉移瘤組織內的羧肽酶A活性明顯高於原發灶瘤組織內的酶活性，提示羧肽酶A與惡性黑色素瘤的細胞惡性轉化和瘤細胞的遠處轉移密切相關(2、KozlowskiL,WojtukiewiczMZ,OstrowskaH.CathepsinAactivityinprimaryandmetastatichumanmelanocytictumors,yirc//.Dermato/.2000Feb-Mar;292(2-3):68-71.)，早期動物實驗的結果也提示羧肽酶A的蛋白水解活性與胰腺癌的腫瘤發生相關(3、RabanalR,FondevilaD，VargasA,RamisA,BadiolaJ,FerrerL.Immunocytochemicaldetectionofamylase,carboxypeptidaseA,carcinoembryonicantigenandalpha1-antitrypsinincarcinomasoftheexocrinepancreasofthedog.K".5W.1992Mar;52(2):217-223.)。Latexin基因及其編碼的Latexin蛋白是羧肽酶A抑制因子。Latexin蛋白最早是由ArimatsuY.等應用單克隆抗體PC3.1從大鼠腦組織中分離到的蛋白分子，隨後的研究顯示Latexin蛋白在中樞神經系統大腦皮層V和皮層VI的特異神經元細胞群中表達，在外周神經系統中的表達則僅限於小直徑的初級感覺神經元細胞(4、ArimatsuY,MiyamotoM,NihonmatsuI,HirataK，UrataniY,HatanakaY,Takiguchi陽HayashiK.Earlyregionalspecificationforamolecularneuronalphenotypeintheratneocortex.屍roc.jVaZ/.爿cat/.5W.SA1992Octl;89(19):8879-8883.;5、ArimatsuY.Latexin:amolecularmarkerforregionalspecificationintheneocortex.jVewmsr/.ie義1994Aug;20(2》131-135.;6、ArimatsuY,IshidaM,Takiguchi-HayashiK，UrataniY.Cerebralcorticalspecificationbyearlypotentialrestrictionofprogenitorcellsandlaterphenotypecontrolofpostmitoticneurons.Dev—1999Feb;126(4):629-638.;7、MiyasakaN，HatanakaY,JinM，ArimatsuY.Genomicorganizationandregulatoryelementsoftheratlatexingene,whichisexpressedinacelltype-specificmannerinbothcentralandperipheralnervoussystems.5ra/"她/.Sra!、1999May21;69(1):62-72.)。已有的少數關於Latexin基因的功能研究主要是在大鼠中進行，大鼠Latexin蛋白是羧肽酶A的抑制劑，可在體外抑制羧肽酶Al、A2的蛋白水解活性(8、No畫ntE,MartresMP,SchwartzJC，GrosC.Purification,cDNAcloning,functionalexpression,andcharacterizationofa26-kDaendogenousmammaliancarboxypeptidaseinhibitor.Prac.Ato/.^cad5W.USA1995Dec19;92(26):12225-12229.)，大鼠Latexin蛋白可能通過控制蛋白酶的活性參與調節神經元細胞的功能(9、BaiWZ，IshidaM，ArimatsuY.ChemicallydefinedfeedbackconnectionsfrominfragranularlayersofsensoryassociationcorticesintheratjVew簡dewce.2004;123(l》257-267.)。近來有研究顯示大鼠Latexin蛋白與類固醇/甲狀腺激素受體超家族成員Nuirl核受體在大腦皮層V、Via以及新皮層側區的白質中共表達(10、ArimatsuY，IshidaM,KanekoT,IchinoseS，OmoriA.Organizationanddevelopmentofcorticocorticalassociativeneuronsexpressingtheorphannuclearrec印torNurrl.J.Cow;.Wewra/.2003Nov10;466(2):180-196.)，也有研究發現在大鼠造骨細胞的高分化階段檢測到Latexin基因的高表達(11、BalintE,LapointeD，DrissiH,vanderMeijdenC,YoungDW,vanWijnenAJ，SteinJL,SteinGS，LianJB.Phenotypediscoverybygeneexpressionprofiling:mappingofbiologicalprocesseslinkedtoBMP-2-mediatedosteoblastdifferentiation.O;〃說oc/zew.2003May15;89(2):401-426.)，但都沒有關於Latexin蛋白的進一步功能提示，關於Latexin蛋白與腫瘤相關性的研究更未見報導。人羧肽酶A抑制因子一一Latexin基因是在人胃黏膜上皮細胞多步癌變過程中克隆到的基因。Latexin基因來源於GES-1與MC細胞系(GES-1細胞系是人胎兒胃黏膜上皮細胞經SV40轉化而成的永生化細胞系，GES-1細胞再經化學致癌劑MNNG處理轉4化成為具有惡性表型的MC細胞系)的差異顯示分析，在GES-1細胞中高表達(12、柯楊，寧濤，王冰，路桂榮，馮莉雅，李吉友，呂有勇，鄂徵.人胃黏膜上皮細胞系GES-1的建立及其生物學特性.中舉,蘑染志1994;16(1):7-10.;13、蘇秀蘭，柯楊，王冰，寧乾馮莉雅，路桂榮，舍英.MNNG誘導人胃黏膜上皮細胞系GES-1及正常胃黏膜標本原癌基因的激活.^舉##染盧1995;17:42-43.;14、柯楊，徐國威，KoichiHagiwara,張建明，寧濤，王冰，蘇秀蘭，馮莉雅，路桂榮，呂有勇，CurtisC.Harris.化學致癌作用靶基因的分離與測序.^房W學.1996;26(1):85-91.)。Latexin基因(登錄號NM—020169)的cDNA全長1144bp，其序列如SEQIDNo.1所示，具有669bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼222個胺基酸(編碼的胺基酸序列如SEQIDNo.2所示，本發明中稱為Latexin蛋白)，與大鼠Latexin基因編碼的胺基酸序列存在84%的同源性，而且兩者均具有相同的11個胺基酸殘基(，LWHPQYGTKVK刑)的羧肽酶A作用結構域(15、HiraiwaM.CathepsinA/protectiveprotein:anunusuallysosomalmultifunctionalprotein.Ce//iWo/.Zz/e5W.1999;56(ll-12):894-907.)，提示Latexin蛋白也可能通過抑制羧肽酶A的活性參與腫瘤細胞多種生物學過程的調控。臨床上研究表明，腫瘤相關的分子標誌對腫瘤的診斷和治療起著重要的作用。但是，由於腫瘤細胞的異質性和發生機制的複雜性，目前已知的分子標誌只能解決部分患者的早期診斷和治療指標的問題，因此尋找新的腫瘤標誌分子，將為臨床早發現早診斷和早治療提供更多更可靠的靶分子，是腫瘤研究的重要內容。目前臨床上迫切需要高度的抗原結合特異性的單克隆抗體，以有助於Latexin的功能檢測，從而適於腫瘤的臨床診斷、預後判斷，並指導臨床治療。
發明內容本發明的一個目的在於提供人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體，該單克隆抗體對SEQIDNo.2所示蛋白有特異性。本發明的另一個目的在於提供產生所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發明的另一個目的在於提供製備所述單克隆抗體的方法。本發明的另一個目的在於提供所述單克隆抗體在檢測Latexin基因及其編碼蛋白的水平中的應用，優選所述水平為在細胞內的分布水平。本發明的另一個目的在於提供一種檢測試劑盒，該試劑盒含有所述的單克隆抗體、和用於與單克隆抗體結合的標記物。5本發明的另一個目的在於提供所述單克隆抗體在製備具有檢測和/或輔助診斷腫瘤作用的組合物中的應用。本案發明人已利用差異顯示法在人胃黏膜上皮細胞多步癌變過程中克隆到人羧肽酶A抑制因子——Latexin基因，人Latexin的序列如SEQIDNo.1所示。為了進一步研究Latexin，本發明應用雜交瘤技術製備了人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體。首先，本發明的一個方面是提供了一種對SEQIDNo.2所示蛋白有特異性的單克隆抗體。本發明中所述的"抗體的特異性"是指單克隆抗體對相應抗原或近似抗原物質的識別能力。特異性高，抗原的識別能力就強。本發明中SEQIDNo.2所示蛋白可以是由SEQIDNo.1第216至884位核苷酸編碼產生。在本發明的一個具體實施方案中，本發明的單克隆抗體對GST(穀胱苷肽轉移酶)-Latexin融合蛋白有特異性，對穀胱苷肽轉移酶沒有特異性。在本發明的一個優選的具體實施方案中，所述的單克隆抗體是由保藏號為CGMCCNo.2336的細胞株分泌產生。抗體類型屬於IgGl。本發明的另一個方面提供了產生所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株。按照《國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約》的規定，一種產生本發明單克隆抗體的雜交瘤細胞株已保藏在國際保藏單位之一一一中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC，地址中國北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101)，保藏日期2008年1月10日，保藏編號CGMCCNo.2336，分類命名小鼠雜交瘤細胞(Mowse/3^〃'(i蘭(3)。本發明的另一個方面提供了一種製備所述單克隆抗體的方法。在本發明的實施方案中，是將本發明如SEQIDNo.2所示蛋白與已知的標籤形成重組蛋白作為抗原，以製備獲得本發明的單克隆抗體。所述的標籤選自，但不限於，組氨酸標籤(His標籤)、穀胱苷肽-S-轉移酶標籤(GST標籤)、HA標籤、HSV標籤、Myc標籤和VSV-G-標籤。在本發明的一個具體實施方案中，採用GST與如SIQIDNo.2所示蛋白形成的重組蛋白。製備本發明的單克隆抗體所用的抗原可以按本領域技術人員已知的常規固相合成方法合成。例如本發明如SEQIDNo.2所示蛋白可以按StewardandYoung(Steward,J.M.禾口Young,J.D.,SolidPhasePeptideSynthesis,2ndEd.，PierceChemicalCompany，Rockford,111.,(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成儀或Pioneer肽合成儀按固相化學技術合成。優選本發明的抗原通過基因工程的方法獲得，利用在原核生物中表達含有編碼本發明的抗原的多核苷酸序列。本領域普通技術人員熟知適用於表達本發明的抗原的載體。可根據所選用的適當啟動子和待表達的結構基因序列來選擇適當的載體。可使用任何適當的宿主細胞表達本發明的抗原。可提到的適當宿主的例子包括原核細胞如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈黴菌等。轉導、轉化或轉染的方法是本領域已知的，包括，但不限於，病毒感染、氯化鈣轉染法、脂質體轉染法、電穿孔法或微粒轟擊法等。為了活化啟動子、選擇轉化體或擴增所需的基因，可以在適當修飾的常規營養培養基中培養被轉導、轉染或轉化的宿主細胞。培養中所使用的溫度、pH值等培養條件一般都是由所選用的表達特定蛋白質的宿主細胞決定的，並且這些條件都是本領域技術人員熟知的。為了大量獲得重組蛋白，可以採用誘導型啟動子，並利用誘導物誘導基因的表達。實質上，"誘導物"可以是任何能誘導宿主中基因表達的物質，可以化學物質或環境刺激，如，暴露於特定波長的光下。在本發明的一個優選實施方案中，採用的誘導物為IPTG(異丙基-e-D-硫代半乳糖苷)。在本發明的一具體實施例中，應用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒(amplificationkit)，經過逆轉錄及特異引物進行PCR擴增以及質粒水平上的核苷酸序列重組得到了Latexin基因讀碼框的全長序列；並通過BamHI和SalI酶切、連接等步驟將包含Latexin基因全部開放讀碼框的669bp核苷酸序列克隆到原核表達載體pGEX-4T-3(購自Promega)中，構建成pGEX-4T-3-Latexin的原核表達載體，轉化大腸桿菌，在IPTG的誘導下，分子量約50kD的pGEX-Latexin融合蛋白以包涵體形式存在。在本發明的一個優選的具體實施方案中，以GST-Latexin融合蛋白作為抗原免疫小鼠，取小鼠的脾細胞作為能夠產生抗體的漿細胞(免疫細胞)，與同系動物的骨髓瘤細胞進行融合。篩選能夠產生目的抗體的雜交瘤細胞，進行克隆化培養，並建立雜交細胞株。上述方法僅是示例性的，例如可以用同樣的方法免疫其他哺乳動物，將其脾細胞作為免疫細胞。還可以選擇適宜的骨髓瘤細胞用於融合，例如用來自大鼠、小鼠或倉鼠的骨髓瘤細胞。免疫細胞與骨髓瘤細胞的融合可以按照常規方法進行(Milsteinetal.,MechodsEnzymol.,1981,73,3-46)。更具體地說，免疫細胞和骨髓瘤細胞可以按照1:51:10的比例混合在培養基中充分混合，在融合促進劑的作用下進行細胞融合，例如將預熱至37。C的PEG(平均分子量1,000-6,000)溶液以30%60%(W/V)的比例加入培養基。7可以作為融合促進劑的物質還有仙臺病毒(HVJ)，此外，還可以根據需要適當加入佐劑(如二甲基亞碸)以增強融合效果。用於融合的培養基包括RPMI-1640培養基、DMEM培養基以及其他可用於此類培養的培養基，還可以根據需要補加新生小牛血清等物質。可以用普通的選擇培養基篩選雜交瘤細胞，例如用含有次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的HAT培養基。在HAT培養基中持續培養足夠的時間，以使雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡，一般為幾天至幾周。然後篩選產生目的抗體的雜交瘤細胞並進行單克隆化。得到的產生本發明單克隆抗體的雜交瘤細胞，可以在普通培養基中傳代培養或者在液氮長時間保存。從雜交瘤細胞收集本發明的單克隆抗體時，可以從雜交瘤細胞體外培養上清液中獲得抗體，或者將雜交瘤細胞注入適宜的哺乳動物並從動物腹水中獲取抗體。前一種方法適於獲得高純度的抗體，後一種方法適於大量獲取抗體。通過上述方法獲得的抗體，可以用常規方法純化，例如鹽析、凝膠過濾、親合色譜等方法。在本發明的一具體實施方案中，所述製備單克隆抗體的方法包括用GST-Latexin融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選出能夠分泌對SEQIDNo.2所示蛋白有反應性、對穀胱苷肽轉移酶沒有反應性的單克隆抗體的雜交瘤細胞，從雜交瘤細胞上清液中或從注射雜交瘤細胞後的動物腹水中獲取單克隆抗體。在該方案中，具體是用純化的GST-Latexin融合蛋白常規免疫Balb/c小鼠，血清效價達10—5時，將免疫小鼠脾細胞與SP20骨髓瘤細胞融合。HAT選擇培養第10天，雜交瘤細胞融合率約為60%。融合後第13天進行第一次ELISA雙篩、亞克隆，此後重複進行ELISA雙篩及亞克隆34次，直至每個單克隆孔均為GST-Latexin強陽性而GST陰性為止。該方案中篩選出了四株雜交瘤細胞株，其中命名為1G11的雜交瘤細胞株即為前述保藏編號為CGMCCNo.2336的雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株能穩定分泌抗Latexin的單克隆抗體，體外連續培養2個月以上及液氮凍存4個月後，仍能穩定分泌單克隆抗體。將該株雜交瘤細胞擴大培養，能誘導Balb/c小鼠產生抗人Latexin的腹水，腹水產量在310ml之間，其效價達10—6。雜交瘤細胞株1G11所分泌產生的單克隆抗體(本發明中命名為單克隆抗體1G11)，具有高度的抗原結合特異性。在本發明的一具體實施方案(實施例三)中，為分析Latexin單克隆抗體的特異性，本發明用純化的GST及GST-Latexin融合蛋白包被96孔板，ELISA實驗結果表明，包被純化的GST-Latexin融合蛋白的孔1G11為強陽性反應，包被GST蛋白的孔均為陰性。8本發明還提供了本發明的單克隆抗體的用途。在本發明的一個實施方案中，本發明提供了所述單克隆抗體在檢測Latexin基因及其編碼蛋白的水平中的應用，優選所述水平為在細胞內的分布水平。本發明的單克隆抗體特異性強、純度高、效價高，並可同時應用於ELISA方法，WesternBlot雜交，免疫組織化學和細胞免疫化學方法檢測Latexin基因編碼蛋白的細胞核漿表達水平。本發明的另一個方面還提供了所述單克隆抗體在製備檢測試劑盒中的應用。本發明提供了一種檢測試劑盒，該試劑盒含有本發明的單克隆抗體、和用於與單克隆抗體結合的標記物。本發明的單克隆抗體可以用任何已知的方法與作為檢測信號的標記物結合，標記物可以是放射性同位素、螢光化合物、生物素和酶等物質。本發明的檢測試劑盒還可進一步包含用於檢測的試劑和/或緩衝液。本發明應用所述的單克隆抗體，就人Latexin基因在人類細胞及組織中的亞細胞定位及功能，特別是與腫瘤發生發展的關係進行了研究，研究實驗主要包括本發明利用所述的單克隆抗體，應用免疫組織化學及WesternBlot技術，將Latexin蛋白定位於胞漿區(參見實施例四)。本發明還應用免疫組織化學及WesternBlot技術檢測了Latexin蛋白在多種腫瘤細胞系及組織中的表達水平，發現Latexin基因在永生化細胞系GES-l中表達水平較高，而在十幾種腫瘤細胞系中表達水平較低或不表達；人Latexin蛋白在胃癌和食管癌組織的檢出率均顯著低於其對應的遠端正常組織；賁門癌各個病理分期的檢測結果顯示從高分化至低分化的組織中Latexin蛋白表達量遞減(參見實施例五)。本發明的實驗研究結果有力提示Latexin基因的表達水平與胃癌、食管癌等腫瘤的發生、發展呈負相關，是一個新的候選抑癌基因。由於本發明的單克隆抗體具有高度的抗原結合特異性，利用本發明的單克隆抗體檢測Latexin蛋白在多種腫瘤細胞系及組織中的表達水平發現Latexin基因在永生化細胞系GES-l中表達水平較高，而在十幾種腫瘤細胞系中表達水平較低或不表達。因此，本發明的另一個方面還提供了本發明的單克隆抗體在製備具有檢測和/或輔助診斷腫瘤作用的組合物中的應用。本發明中已檢測的腫瘤具體包括胃癌、食管癌和賁門癌。本發明通過大量的實驗研究證實本發明的單克隆抗體，尤其是1G11，具有以下兩個顯著的特點(一)高度的抗原結合特異性，主要的實驗證據包括1.免疫裸鼠應用GST-Latexin融合蛋白，而獲得的單克隆抗體1G11經ELISA法檢測(參見實施例三)證實，1G11為強陽性反應，而包被GST蛋白的孔均為陰性；2.應用WesternBlot方法對永生化和腫瘤細胞系以及11種4月齡胎兒組織中Latexin蛋白表達水平進行檢測(參見實施例四)，結果顯示Latexin主要分布在細胞漿，雜交帶行單一，對應分子量大小與Latexin蛋白的分子大小一致；應用免疫細胞化學技術檢測四種細胞系(參見實施例四)的結果顯示，Latexin蛋白主要分布在細胞漿中；3.應用免疫組織化學方法檢測胃癌、食管癌及其遠端的正常組織以及賁門癌中Latexin蛋白的表達(參見實施例五)，結果顯示Latexin蛋白主要在腺體細胞的胞漿中表達。(二)由於本發明的單克隆抗體與Latexin高度特異性結合，而針對抗原Latexin蛋白發揮抑癌作用，因此，本發明的單克隆抗體可廣泛應用於酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫分析、WesternBlot、免疫組化等技術。主要的實驗證據包括1.應用單克隆抗體1G11進行的消化道腫瘤(包括胃癌、食管癌和賁門癌及遠端的正常對照組織)的免疫組織化學檢測結果顯示，Latexin蛋白在腫瘤組織中的表達水平明顯低於其正常對照組織(參見實施例五)；2.應用逆轉錄病毒載體pLXSN構建Latexin基因的反義cDNA序列的重組體(pLXSN-LatexinAntisense)，轉染Latexin蛋白基礎表達水平較高的人胃黏膜腺癌細胞系BGC823並篩選穩定轉染細胞系。進一步的克隆形成率實驗分析顯示轉染反義Latexin基因的BGC823細胞生長速度加快，克隆形成能力明顯增強(參見實施例六)；3.BGC823細胞裸鼠致瘤性實驗結果顯示，穩定轉染pLXSN-LatexinAntisense的BGC823細胞裸鼠致瘤能力顯著降低，高度支持Latexin基因具有抑制腫瘤生長的功能(參見實施例六)。所以，本發明所製備的Latexin單克隆抗體IGII為進一步深入研究Latexin基因的功能及其與腫瘤發生發展相關性的分子機制奠定了基礎，有利於深入探討Latexin基因的功能及其抑制腫瘤細胞生長的分子機制，並有利於開展Latexin基因與腫瘤細胞侵襲、轉移等細胞生物學行為的相關性研究。圖1顯示應用內切酶EcoRI鑑定pcDNA3-Latexin重組質粒；其中，M:DNAladdermix。圖2為pcDNA3-Latexin重組質粒測序圖。圖3為pGEX-4T-3-Latexin表達載體的構建示意圖。圖4顯示GST-Latexin融合蛋白的表達與純化結果；其中，M:低分子量蛋白marker;1:IPTG誘導前轉化pGEX-4T-3-Latexin質粒的BL21細菌總蛋白；2:IPTG誘導1小時後轉化pGEX-4T-3-Latexin質粒的BL21細菌總蛋白；3:IPTG誘導4小時後轉化pGEX-4T-3-Latexin質粒的BL21細菌總蛋白；4:應用GlutathioneSepharose4B純化的GST-Latexin融合蛋白。圖5顯示ELISA法檢測單克隆抗體的特異性結果；其中，系列1:GST-Latexin;系歹'J2:GST。圖6A顯示WesternBlot方法檢測抗Latexin蛋白的單克隆抗體1G11的特異性。圖6B顯示WesternBlot方法檢測Latexin蛋白在細胞系中的核漿表達情況；其中，GES-1:人胃黏膜永生化細胞；MC、N87禾I3MGC803均為人胃癌細胞系；C:細胞漿蛋白；N:細胞核蛋白。所用一抗為1G11單克隆抗體，以1:500稀釋。圖6C顯示11種人4月齡胎兒組織中Latexin蛋白在的表達情況；其中，1:BGC823做陽性對照；2:腦；3:心；4:肺；5:胃；6:肝；7:睥；8:小腸；9:結腸；10:腎；11:骨骼肌；12:皮膚；所用一抗為1G11單克隆抗體，以1:500稀釋。圖7顯示免疫細胞化學方法檢測Latexin蛋白在細胞系核漿分布情況；其中，A:胃癌細胞系BGC823;B:胃黏膜永生化細胞系GES-1;C:胃癌細胞系MC;D:胃癌細胞系N87。所用一抗為1G11單克隆抗體，以1:100稀釋，DAB顯色後再經10%蘇木素復染(200X)。圖8為免疫組織化學方法顯示Latexin蛋白在腫瘤組織及其遠端正常組織中的表達情況；其中，A:胃癌；B:正常胃組織；C:食管癌；D:正常食管組織；E:賁門癌；F:正常賁門組織。所用一抗為1G11單克隆抗體，以1:100稀釋(200X)。圖9A和圖9B顯示轉染反義Latexin基因對胃癌細胞系BGC823克隆形成能力的影響；圖9A中，1:BGC823;2:BGC823-pLXSN;3:BGC823-Anti-Latexin;圖9B中，pLXSN:胃癌細胞系BGC823轉染逆轉錄病毒載體pLXSN;Anti-Latexin:BGC823細胞轉染pLXSN-反義LatexincDNA序列。圖10A和圖10B顯示Latexin基因表達水平對BGC823細胞裸鼠致瘤性的影響；圖10B中，1和2組織蛋白取自轉染pLXSN空載的BGC823細胞接種裸鼠組，3和4組織蛋白取自轉染pLXSN-Latexin反義的BGC823細胞接種裸鼠組。用於專利程序的微生物保存保藏日期2008年1月10日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC);保藏編號CGMCCNo.2336;分類命名小鼠雜交瘤細胞(Afoz^/7y6rWowa)。具體實施例方式為了更清楚地理解本發明的實質，下面通過具體實施例並配合附圖進一步詳細說明本發明，但本發明並不因此而受到任何限制。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件；實施例中所用到的各種常用化學試劑，除標註外，均購自北京化學試劑公司。實施例一.Latexin基因全長讀碼區序列的獲得及鑑定一.RACE法擴增Latexin5'末端1.細胞總RNA的製備使用Invitrogene公司的產品TrizolLSReagent(Cat.No.10296-010)，按產品說明書操作。2.用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒(購自Clontech公司)獲得Latexin5'末端片段2.1cDNA第一條鏈的合成lOmMPolyOligo*(dT)lpl細胞總RNA3W(1昭)SMARTIIAOligo**(10mM)lpl丄70°C5min，冰浴2min丄5x第一條鏈合成液2plDTT(20mM)1^1dNTPC10mM)lplPowerScript逆轉錄酶lpl丄42°C1.5小時丄終止反應時向反應管內加入100mlTricine-EDTA緩衝液，72°C，加熱7min。2.2PCR擴增LatexincDNA片段根據Latexin3'端片段設計特異3'PCR引物，其中具有Latexin片段單一的Sspl切點，位置在5'端447bp處。12PCR反應體系(50nl)10xAdvantage2PCR緩衝液(Buffer)5|al50xdNTPmixl^il5'PCR引物IIA***(10pM)l^il3'Latexin特異引物""(10pM)lpl50xAdvantage2聚合酶混合(PolymeraseMix)1^1cDNA產物lpl去離子水4(^1PCR反應程序95。C預變性3min，95'C變性15秒，55'C復性30秒，72。C延長2min，共30個循環。(注*5，_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，(SEQIDNo.3);**5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'(SEQIDNo.4);5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(SEQIDNo.5);****5，-CTGGAATATTTTGTGCTTCTAGC-3，(SEQIDNo.6);上述引物除試劑盒提供外，其餘均為北京奧科生物技術有限責任公司合成)二.pcDNA3-Latexin基因讀碼區全長序列重組質粒的獲得1.將PCR擴增片段連接到TA載體(購自Promega)中，獲得TA/Latexin重組質粒，測序鑑定。2.用內切酶EcoRI(本發明具體實施例中所用內切酶均購自NEBENGLANDBioLabs公司)禾卩SspI從TA-Latexin中獲得Latexin5'末端470bp片段。3.內切酶SspI和Xbal從pcDNA3-Latexin3'中獲得Latexin3'末端528bp片段。4.用EcoRI和XbaI對pcDNA3進行雙酶切獲得pcDNA3線形載體。5.將Latexin5'EcoRI-SstI片段、Latexin3'SspI-XbaI片段和用SstI-EcoRI將pcDNA3線性化載體(購自Invitrogen公司)用T4連接酶(購自Promega)4'C連接過夜，構建成可用EcoRI單一酶切即可釋放包括Latexin基因全部開放閱讀框架(ORF)的669bp核苷酸序列在內的pcDNA3-Latexin重組質粒。6.測序鑑定。三.結果應用內切酶EcoRI鑑定pcDNA3-Latexin重組質粒的結果見圖1;陽性克隆進一步測序鑑定，測序準確結果見圖2。可以確定，本實施例中應用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒，經過逆轉錄及特異引物進行PCR擴增得到了Latexin基因讀碼框的全長序13列。將Latexin基因讀碼框的全長序列進一步構建入pGEX-4T-3載體中，重組質粒結構示意圖見圖3。實施例二.Latexin原核表達載體pGEX/Latexin的構建、原核表達及抗原的純化一.Latexin原核表達載體pGEX/Latexin的構建將pcDNA3-Latexin經EcoRI酶切，回收並純化切出756bp的片段(LatexincDNA194887(SEQIDNo.1所示第194至887位)，此外包含一小段來自pcDNA3載體的序列)，將其克隆入pGEX-4T-3(購自Promega)中，構建成pGEX-4T-3-Latexin的原核表達載體，將其轉化BL21表達菌，鋪LBAmP+盤，挑克隆，小提質粒，酶切鑑定，全自動測序，鑑別插入片段和閱讀框架，構建原核表達質粒pGEX-Latexin融合蛋白。二.GST-Latexin重組蛋白的誘導、表達及純化1.無菌吸取經上述鑑定後的pGEX-4T-3-Latexin陽性菌5ml，接種於400mlLBAmp+培養液中，37。C200300g震蕩培養23h，至0D6(X)=1左右；2.細菌加IPTG(Promega)至終濃度為lmM，繼續培養，在4h後收集細菌；3.臺式離心機離心(400ml分裝成100ml、4管)4000g/min離心5min，棄上清，沉澱重懸於20ml用冰預冷過的lxPBS，混勻，此步後兩管並作一管，即每管有200ml細菌；4.於4°C4000g離心5min，棄上清；5.沉澱加細菌裂解液10ml(50pl/ml)，冰浴20min;6.超聲18Hz，約15秒x3次，每次中間間歇10秒，至細胞清亮，菌液不粘，並避免氣泡；7.加TritonX-100(Promega)至終濃度1%，冰浴1030min;(此步驟有助於融合蛋白溶解)8.15000g離心20min，收集上清；9.細菌的裂解上清中加200^1的經PBS漂洗過的50%slurryofGlutathioneSepharose4B(穀胱苷肽瓊脂糖凝膠4B)，室溫下混合15min;10.於4°C500g離心10min，棄上清；11.收集吸附後的珠子，用lml的lmMPMSF(購自SIGMA)/PBS或PBS洗珠子並轉移至1.5ml的離心管，於4'C500g離心10min，棄上清；12.重複第11步3次，每次混勻5min;13.力P100nl穀胱苷肽洗脫緩衝液(GlutathionElutionBuffer)，室溫下孵育10min;14.於室溫下500g離心5min，吸上清；15.重複13、14步2次；16.上清可用來定量lOD28。=0.5mg/ml，依次取1^1上清+9pl去離子水+10jal2xSDS-PAGE上樣緩衝液(buffer)，5^1去離子水+10pl2><SDS-PAGE上樣緩衝液，10pl上清+10nl2xSDS-PAGE上樣緩衝液，混勻，在沸水中煮35min;17.行10。/。SDS-PAGE膠電泳，考馬斯亮蘭染液染l10h，脫色液脫色30min10h，觀察重組蛋白的表達情況。三，結果將pGEX-4T-3-Latexin的原核表達載體轉化BL21細菌，在IPTG誘導下，能穩定表達GST-Latexin融合蛋白，表達的融合蛋白的分子量約50kD，與推算值相符。該融合蛋白以包涵體形式存在。經鹼變性法提取包涵體，又經SDS-PAGE、GlutathioneSepharose4B柱子純化，獲得了電泳純的GST-Latexin融合蛋白(請參見圖4，其中，M:低分子量蛋白marker;1:IPTG誘導前轉化pGEX-4T-3-Latexin質粒的BL21細菌總蛋白；2:IPTG誘導1小時後轉化pGEX-4T-3-Latexin質粒的BL21細菌總蛋白；3:IPTG誘導4小時後轉化pGEX-4T-3-Latexin質粒的BL21細菌總蛋白；4:應用GlutathioneSepharose4B純化的GST-Latexin融合蛋白；圖中箭頭所示即為GST-Latexin融合蛋白)。實施例三.人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體的製備、純化、鑑定1.動物雌性，68W齡Balb/c小鼠4隻(購自中國醫學科學院實驗動物研究所)，1820g/只。2.抗原GST-Latexin融合蛋白由原核表達，SDS-PAGE膠純化，純度達電泳級，50嗎/只/次。3.免疫程序及途徑初次免疫Latexin抗原與等體積完全弗氏佐劑充分混勻，形成油包水，於鼠背部皮內多點注射。四周後第一次加強免疫，Latexin抗原與不完全弗氏佐劑等體積混勻，背部皮內多點注射。之後每隔一個月加強免疫一次並於加強後第10天取尾血2^1，用ELISA法測抗體效價。待抗體效價達10—5或10—6時，尾靜脈加強免疫(不加佐劑)，於三天後取脾，進行細胞融合。4.細胞融合4.1飼養細胞的製備取兩隻正常昆明小鼠，常規無菌取腹腔飼養細胞，加入含HAT選擇培養基中。4.2脾細胞的製備取免疫的Balb/c小鼠，無菌取脾，置於盛有無血清1640培養基的平皿中，過鋼絲網(200目)，收集過網後的脾細胞於試管中，靜置數min;吸出上層細胞放入50ml無菌試管中。4.3骨髓瘤SP2/0細胞的準備取三瓶SP20細胞，棄培養液，加無血清1640培養基吹起，與上述分離的脾細胞混勻，1000g離心5min，棄上清，用無菌濾紙條吸淨培養基，輕輕彈起細胞。4.4融合於37'C水浴中，將50%PEG慢慢加入細胞中，邊加邊輕輕攪拌，lml50%PEG於lmin內加完，繼續攪拌30秒，靜置30秒，於兩分鐘內輕輕加入4.5ml無血清1640培養基，1000g離心5min，棄上清，輕輕打散沉澱細胞，少量HAT培養基懸浮後加到已配好的含腹腔飼養細胞的HAT培養基中，用尖吸管滴加在96孔板中(3滴/孔)，37°C，5%0)2培養箱中培養。5.陽性克隆篩選及亞克隆融合後10天進行全換液，再過3天後進行第一次ELISA雙篩，篩選到僅GST-Latexin包板陽性而GST包板陰性的孔進行亞克隆，710天進行ELISA雙篩，對Latexin陽性、GST陰性孔進行第二次亞克隆，如此亞克隆35次，直至檢測所有孔均為Latexin陽性而GST陰性為止。選出四株單抗，分別為命名為1G11、1G7、1F9、1D6。擴大培養、建株、凍存並製備腹水。其中，在選出的四株單抗中，命名為1G11的單抗能穩定分泌抗Latexin的雜交瘤細胞株，體外連續培養2個月以上及液氮凍存4個月後，仍能穩定分泌單克隆抗體，抗體類型屬於IgGl。將1G11雜交瘤細胞擴大培養能誘導Balb/c小鼠產生抗人Latexin的腹水，腹水產量在310ml之間，其效價達10—6。6.單克隆抗體的純化6.1小鼠雜交瘤腹水的製備及收集選取2022gBalb/c雌性小鼠，腹腔注射降殖烷(2,6,10,14-Tetramethylpen陽tradecaneJANSSENCHIMICA)，0.5ml/只。一周後，腹腔注射雜交瘤細胞2xl0"只小鼠，710天後待小鼠腹部明顯膨脹後，收集腹水。將收集的腹水12000g離心30秒，去除底部沉澱和上層油脂，收集中段液體，-2(TC儲存待用。6.2雜交瘤上清的濃縮取待測雜交瘤上清至少15ml，加等量飽和硫酸胺(50%)，充分混勻，4"C放置過夜，次日10000g離心10min，沉澱用500^1去離子水溶解，4'C存放待用。6.3單克隆抗體的純化(高鹽-Pro.ASepharose4B柱純化)將收集的腹水以33%硫酸銨沉澱過夜，次日10000g離心4min，沉澱溶於去離子水中，對PBS透析。6.4高鹽結合緩衝液平衡柱子以高鹽結合緩衝液l:l稀釋待純化樣品，然後上樣(必要時可重複上樣)。用23個柱床體積的BandingBuffer流洗柱子直至流出液體OD值O.01。用pH2.6、0.1M的檸檬酸鈉緩衝液洗脫，用Eppendorf管收集洗脫液，1.5ml/管，紫外分光光度計測每管的OD280值，將峰值所在管的液體合併，再測OD280值，並推算所純化的單克隆抗體含量。用5MTris(pH8.8)調pH至7，PBS透析過夜。行SDS-PAGE電泳鑑定其純度，分裝、-7(TC儲存備用。7.單克隆抗體的儲存7.1純化的單克隆抗體透析至PBS中，以110mg/ml-70匸儲存；低濃度時，加1%BSA及0.02%疊氮鈉，-70°〇儲存。7.2雜交瘤上清力n1/20體積的lMTris(pH8.0)，並加0.02%疊氮鈉，-20。C保存，可保存數年；4'C可穩定存放6個月。8.單克隆抗體的鑑定8.1酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測抗體特異性8.1.1ELISA包被液稀釋純化的GST-Latexin抗原至濃度為5嗎/ml，包被96孔板50pl/孔，4。C過夜；8.1.2用0.05%Tween20-PBS洗2遍，3%脫脂奶粉(PBS配製)封閉200^1/孔，室溫12小時或4'C過夜；8.1.30.05。/。Tween20-PBS洗2遍，加入不同稀釋度的抗血清(l(T3、l(T4、10-5、l(T6，用上述純化的GST-Latexin融合蛋白常規免疫昆明小鼠，經三次加強免疫後，效價達10—5，取血得抗GST-Latexin融合蛋白的抗血清)和正常鼠血清(10—3)，50^1/孔，室溫1小時；8.1.40.05%Tween20-PBS洗5遍，加羊抗鼠HRP(1:1000,購自中杉金橋公司)50pl/L,室溫1小時；8.1.5PBS洗5遍，力POPD顯色液lOOpl/孔，避光顯色，顯色後加終止液50^1/孔，觀察結果並用ELISAReader測OD492。ELISA實驗方法同上，檢測的一抗分別為命名為1G11、1G7、1F9、1D6的四種單克隆抗體。ELISA檢測抗體特異性的實驗結果請參見圖5所示，圖中系列1表示GST-Latexin，系列2表示GST，可以看出，在4株單克隆抗體中包被純化的GST-Latexin融合蛋白的孔1D6呈弱陽性反應，1F9和1D7呈陽性、1G11為強陽性反應，包被GST蛋白的孔均為陰性。表明本發明的命名為"1G11"的抗體具有高度的抗原結合特異性。因此除特別註明外，後續實施例的實驗中所用的單克隆抗體均採用命名為"1G11"的抗體。8.2WesternBlot檢測單克隆抗體的特異性吸去BGC823及Hela細胞培養基，加lmlPBS至培養瓶中，用細胞刮將細胞刮至一1.5mlEP管中，離心棄上清，重懸沉澱於RIPA(購自上海博彩生物科技有限公司)，冰上放置10min，4°C14000g離心30min，移上清至新EP管中(-70。C保存)。用Bradford比色法對蛋白定量。取BGC823、Hela細胞總蛋白、GST蛋白、GST-Latexin融合蛋白及BSA各30嗎行12%SDS-PAGE電泳，電轉移至PVDF膜(美國AmershamBiosciences公司)。5%脫脂奶粉封閉4匸過夜或37°C1小時，加Latexin單克隆抗體4。C過夜。0.5%Tween20-PBS充分洗滌後在加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體。按ECL(Westernblottingdetectionreagents,購自美國AmershamBiosciences公司)說明書方法進行化學發光、X光片曝光、洗片。WesternBlot檢測單克隆抗體的特異性的結果顯示製備的單克隆抗體1G11在4種細胞系總蛋白的約30kD處及GST-Latexin融合蛋白在約48kD處出現了一條特異的帶(Latexin蛋白預計大小為29kD左右)，而在GST蛋白處卻沒有任何條帶出現。說明1G11為Latexin特異性結合抗體(參見圖6A、圖6B)。實施例四.應用WesternBlot方法和免疫細胞化學技術檢測Latexin蛋白在永生化和腫瘤細胞系中的表達本實施例中，應用WestemBlot方法，採用本發明的命名為"1G11"的單克隆抗體，對永生化和腫瘤細胞系以及11種4月齡胎兒組織中Latexin表達進行檢測。本實施例中還應用免疫細胞化學技術檢測細胞系中Latexin蛋白在細胞系核漿分布情況。具體方法可參照以下操作(其中，應用SP-9000/9001/9002HistostainTM-PlusKits免疫組化染色試劑盒，購自中杉金橋公司代理的美國ZYMED公司)石蠟切片常規脫蠟至水(二甲苯I60min—二甲苯II60min—二甲苯III60min—100%乙醇I3min—100。/。乙醇n3min—95%乙醇3min—75%乙醇3min—蒸餾水衝洗，lxPBS再洗一次)；1%H202阻斷內源性過氧化物酶室溫10min;抗原微波修復切片放入修復液中92'C98'C至少維持lOmin後室溫冷卻2030min;lxPBS洗3次每次5min，10%正常18羊血清37。C封閉4'C過夜；吸去羊血清(勿洗)，加入一抗(1:100)4。C過夜；^PBS洗3次，每次5min，加入生物素標記的羊抗鼠二抗，37'C作用30min至1小時；lxPBS洗3次，每次5min，加入辣根過氧化物酶標記的三抗鏈黴卵白素(HRP-Strepavidin)，37°C作用30min至1小時；lxPBS洗3次，每次5min，DAB避光顯色510min，鏡下觀察有信號時可用自來水衝洗終止反應，10%蘇木精復染(自來水衝洗)，1%鹽酸-酒精分色(可滴片並直接泡在lxPBS裡然後用水衝)；逐級酒精脫水、二甲苯透明(75%乙醇3min—95%乙醇3min—100%乙醇I3min—100%乙醇II3min—二甲苯I3min—二甲苯113min;中性樹膠加蓋玻片封片。結果判定標準以細胞胞漿內出現棕黃色顆粒狀著染判斷為陽性，細胞胞漿內無棕黃色顆粒著染為陰性。應用WesternBlot方法檢測Latexin蛋白在永生化和腫瘤細胞系中的表達結果請參見圖6B、圖6C所示。其中，圖6B顯示的為WesternBlot方法檢測Latexin蛋白在細胞系中的核漿表達情況，圖中GES-1為人胃黏膜永生化細胞，MC、N87和MGC803均為人胃癌細胞系，C為細胞漿蛋白，N為細胞核蛋白；所用一抗為1G11單克隆抗體(以l:500稀釋)。圖6C顯示ll種人4月齡胎兒組織中Latexin蛋白在的表達情況，其中，用BGC823做陽性對照，所用一抗為1G11單克隆抗體(以1:500稀釋)。檢測結果顯示Latexin主要分布在細胞漿，雜交帶行單一，對應分子量大小與Latexin蛋白的分子大小一致。免疫細胞化學方法檢測Latexin蛋白在細胞系核漿分布情況的結果請參見圖7;其中，圖片A為胃癌細胞系BGC823，圖片B為胃黏膜永生化細胞系GES-1，圖片C為胃癌細胞系MC，圖片D為胃癌細胞系N87。所用一抗為1G11單克隆抗體(以1:100稀釋)，DAB顯色後再經10%蘇木素復染(200X)。檢測結果表明Latexin在細胞內主要分布在細胞漿。實施例五.免疫組織化學方法檢測Latexin蛋白在腫瘤組織中的表達本實施例應用本發明的單克隆抗體採用免疫組織化學方法檢測了胃癌、食管癌及其遠端的正常組織以及賁門癌中Latexin蛋白的表達，檢測結果請參見圖8和表1。圖8中，圖片A為胃癌，圖片B為正常胃組織，圖片C為食管癌，圖片D為正常食管組織，圖片E為賁門癌，圖片F為正常賁門組織；所用一抗為1G11單克隆抗體，以1:100稀釋(200X)。從圖8中可以看出Latexin蛋白在腫瘤組織中的表達水平明顯低於其正常對照組織。19表1.免疫組織化學技術檢測Latexin在各種腫瘤組織及遠端正常組織中的表達tableseeoriginaldocumentpage20從表1中的數據可以看出胃癌陽性率為14.63%(6/41)，而遠端的正常組織為72.09%(31/43)，比較胃癌組織與正常組織的Latexin蛋白的表達量，發現遠端正常組織的表達顯著高於胃癌組織；食管癌陽性率為14.81%(8/54);而賁門癌的不同分化程度腺癌的Latexin蛋白表達情況為高-中分化腺癌陽性率為66.67%(6/9)、中分化腺癌為50%(7/14)、中低分化腺癌為42.86%(6/14)、低分化腺癌為37.50%(12/32)。對以上數據進行分析表明，隨著分化程度的降低Latexin的表達量呈遞減的趨勢。實施例六，應用逆轉錄病毒載體pLXSN建立Latexin基因的反義RNA體系，研究Latexin蛋白表達水平對腫瘤細胞惡性程度的影響(一)應用逆轉錄病毒載體pLXSN構建Latexin基因的反義cDNA序列的重組體，轉染Latexin蛋白基礎表達水平較高的人胃黏膜腺癌細胞系BGC823並篩選穩定轉染細胞系；進一步的克隆形成率實驗分析顯示轉染反義Latexin基因的BGC823細胞生長速度加快，克隆形成能力明顯增強(結果見圖9A和圖9B，圖9A中，1:BGC823;2:BGC823-pLXSN;3:BGC823-Anti-Latexin;圖9B中，pLXSN:胃癌細胞系BGC823轉染逆轉錄病毒載體pLXSN;Anti-Latexin:BGC823細胞轉染pLXSN-反義LatexincDNA序列)。(二)檢測Latexin基因表達水平對BGC823細胞裸鼠致瘤性的影響分別應用穩定轉染pLXSN空載和pLXSN-Latexin反義(Antisense)的BGC823細胞接種B/C裸鼠各IO只(接種細胞數100萬/只)致瘤，4周後將瘤體剝離稱重(稱重量結果參見圖10A和表2，表2中的裸鼠編號與圖10A中瘤體從左至右的位置相對應)，並進行WesternBlot檢測Latexin蛋白的表達水平，結果見圖IOB(圖10B中，1和2組織蛋白取自轉染pLXSN空載的BGC823細胞接種裸鼠組，3和4組織蛋白取自轉染pLXSN-Latexin反義(Antisense)的BGC823細胞接種裸鼠組)。表2tableseeoriginaldocumentpage21T檢驗結果P0.05，兩組數據有統計學差異。本實施例的實驗結果顯示Latexin蛋白的表達水平降低，腫瘤生長速度顯著增加，高度支持Latexin基因具有抑制腫瘤生長的功能。序列表北京市腫瘤防治研究所人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體及其應用〈130〉GAI08C翻88C6Patentlnversion3.3<210〉11144薩<213〉人類(Homosapiens)CDS(216)..(884)1agaagcagtcagcccagggctctcggatgcagggagcctgggcccaaacagcagcttccg60gagtcggaaggagctgaggaagaagacagactgaaggagcttgcgacttttccgcctcgg120caaccggacccagcagcaagcaggacgggcggcgctctgctactggtcccgttaagccag180agtagcccaagccctgaagtcactgctcatccggaatggaaateccgccgacc233MetGlulieProProThr15aactacccagcctecagggcggccttggtggcacagaactacateaac281AsnTyrProAlaSerArgAlaAlaLeuValAlaGinAsnTyrlieAsn101520taccagcaggggaccccgcacagggtgtttgaggtgcagaaggtcaaa329TyrGinGinGlyThrProHisArgValPheGluValGinLysValLys253035caagccageatggaggatattccaggaagaggacata_agtatcgcctt377GinAlaSerMetGluAsplieProGlyArgGlyHisLysTyrArgLeu404550aaatttgetgttgaagaaattatacaaaaacaagttaaggtgaactgc425LysPheAlaValGluGlulielieGinLysGinValLysValAsnCys55606570acagetgaagtactttaccctteaacgggacaagaaactgcaccagaa473ThrAlaGluValLeuTyrProSerThrGlyGinGluThrAlaProGlu758085gtcaacttcacatttgaaggagaaactgg已aagaatccagatgaagaa521ValAsnPheThrPheGluGlyGluThrGlyLysAsnProAspGluGlu9095100gacaacacattttotcaaagacttaagtecatgaaggaaccgetagaa569AspAsnThrPheTyrGinArgLeuLysSerMetLysGluProLeuGlu105110115gcacaaaatattccagacaattttgga犯tgtatctccsgaastgacg617AlaGinAsnlieProAspAsnPheGlyAsnValSerProGluMetThr120125130etcgttetacatttagcctgggttgcctgtggttatataatatggcaa665LeuValLeuHisLeuAlaTrpValAlaCysGlyTyrlielieTrpGin135140145150aattctactgaagacacatggtataaaatggtaaaaattcaaactgtc713AsnSerThrGluAspThrTrpTyrLysMetValLyslieGinThrVal155160165aagcaagtgcaaagaaatgatgactttattgaattagactacaccatt761LysGinValGinArgAsnAspAspPhelieGluLeuAspTyrThrlie170175180etacttcataatatagcatctcaggagattattccctggcaaatgcaa809LeuLeuHisAsnlieAlaSerGinGlulielieProTrpGinMetGin185190195gttetctggcatccacaatacggcactaaagtaaaacataatagecgt857ValLeuTrpHisProGinTyrGlyThrLysValLysHisAsnSerArg200205210ctgccagaagtactggaataaacaaaaaccctsacactgga904LeuProLysGluValGinLeuGlu215220tgtctattgatgtgtatgccaatttcactggcatctagct964aataatcccaaagtgtcactgtcttgattacagtatagaactttatagag1024aaagtatcactacataaaaatgtctttaaatggtatgtat1084atccaaaataaaaagcttca1144〈210〉2222〈212〉PRT〈213〉人類(Homosapiens)〈400〉2MetGlulieProProThrAsnTyrProAlaSerArgAlaAlaLeuVal15101523AlaGinGluValGlyHis50GinVal65GinGluLysAsnMetLysValSer130GlyTyr145ValLysAsnTyrlie20GinLysVal35LysTyrArgLysValAsnThrAlaPro85ProAspGlu100GluProLeu115ProGluMetlielieTrplieGinThr165GluLeuAspTyrThr180lieProTrpGinMet195ValLysHisAsnSerArgLeu210215AsnTyrGinGinGlyThrProHisArgValPhe2530LysGinAlaSerMetGluAsplieProGlyArg4045LeuLysPheAlaValGluGlulielieGinLys5560CysThrAlaGluValLeuTyrProSerThrGly707580GluValAsnPheThrPheGluGlyGluThrGly9095GluAspAsnThrPheTyrGinArgLeuLysSer105110GluAlaGinAsnlieProAspAsnPheGlyAsn120125ThrLeuValLeuHisLeuAlaTrpValAlaCys135140GinAsnSerThrGluAspThrTrpTyrLysMet150155160ValLysGinValGinArgAsnAspAspPhelie170175lieLeuLeuHisAsnlieAlaSerGinGlulie185190GinValLeuTrpHisProGinTyrGlyThrLys200205ProLysGluValGinLeuGlu220320DNA〈213>人工序列(Artificial)〈220>〈223>引物<400〉3tttttttuttututttt4302024〈212〉賺人工序列(Artificial)〈223〉引物〈400>4aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg30〈210〉5〈211>23DNA〈213〉人工序列(Artificial)〈220〉〈223>引物〈400〉5aagcagtggtatcaacgcagagt23〈210>623廳〈213〉人工序列(Artificial)<220〉引物〈400〉6ctggaatattttgtgcttctage232權利要求1.一種對SEQIDNo.2所示蛋白有特異性的單克隆抗體。2.根據權利要求1所述的單克隆抗體，該抗體對GST-Latexin融合蛋白有特異性，對穀胱苷肽轉移酶沒有特異性。3.根據權利要求1所述的單克隆抗體，該抗體由保藏號為CGMCCNo.2336的細胞株分泌產生。4.產生權利要求1所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。5.根據權利要求4所述的雜交瘤細胞株，該細胞株的保藏號為CGMCCNo.2336。6.—種製備權利要求1所述的單克隆抗體的方法，該方法包括用GST-Latexin融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選出能夠分泌對SEQIDNo.2所示蛋白有反應性、對穀胱苷肽轉移酶沒有反應性的單克隆抗體的雜交瘤細胞，從雜交瘤細胞上清液中或從注射雜交瘤細胞後的動物腹水中獲取單克隆抗體。7.權利要求1所述的單克隆抗體在檢測Latexin基因及其編碼蛋白的水平中的應用，優選所述水平為在細胞內的分布水平。8.—種檢測試劑盒，該試劑盒含有權利要求1所述的單克隆抗體、和用於與單克隆抗體結合的標記物。9.權利要求1所述的單克隆抗體在製備具有檢測和/或輔助診斷腫瘤作用的組合物中的應用。10.根據權利要求9所述的應用，其中所述腫瘤為胃癌、食管癌、或賁門癌。全文摘要本發明涉及一種人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體，同時涉及該單克隆抗體的製備方法以及產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發明還涉及含有所述單克隆抗體的試劑盒、所述單克隆抗體在檢測Latexin基因及其編碼蛋白的水平中的應用、以及所述單克隆抗體在製備具有檢測和/或輔助診斷腫瘤作用的組合物中的應用。文檔編號C07K16/18GK101497664SQ20081005702公開日2009年8月5日申請日期2008年1月29日優先權日2008年1月29日發明者丁慧榮,濤寧,巴桑卓瑪,勇李,楊柯,陸哲明,魏浩然申請人:北京市腫瘤防治研究所