生產l－抗壞血酸和d－異抗壞血酸的酶方法

2023-11-03 07:37:27

專利名稱：生產l－抗壞血酸和d－異抗壞血酸的酶方法
技術領域：
本發明涉及一種通過使用α-澱粉酶或具有α-澱粉酶活性的酶分別由2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸來生產L-抗壞血酸或D-異抗壞血酸的新方法。
L-抗壞血酸，也被稱為維生素C，不僅被廣泛用作藥物，而且還被用廣泛用於食品工業、化妝品工業等領域，是一種十分有用的化合物。D-異抗壞血酸主要作為抗氧劑用於食品添加劑。
迄今為止，一直是用眾所周知的Reichstein法來工業製備L-抗壞血酸，在該方法中，L-抗壞血酸是由D-葡萄糖經由D-山梨醇、L-山梨糖、乙醯丙酮-L-山梨糖、乙醯丙酮-2-酮基-L-古洛糖酸、2-酮基-L-古洛糖酸和2-酮基-L-古洛糖酸甲酯來進行生產的。在這種過程中，D-山梨醇向L-山梨糖的轉化是唯一的微生物步驟，其它步驟都是化學步驟。乙醯丙酮-2-酮基-L-古洛糖酸向L-抗壞血酸的轉化是通過兩種不同的操作來完成的(i)去保護得到2-酮基-L-古洛糖酸，然後用甲醇進行酯化並進行鹼催化的環化；和(ii)通過酸催化的環化直接由被保護形式或去保護形式的2-酮基-L-古洛糖酸獲得L-抗壞血酸。這些轉化過程必需通過無水或低水的反應系統來進行。從環境和經濟學角度考慮，優選不使用有機溶劑的反應。
另一方面，D-異抗壞血酸一直是由D-葡萄糖經由2-酮基-D-葡糖酸來進行製造的，其本身可通過用屬於假單胞菌屬的菌株進行的發酵，並經由2-酮基-D-葡糖酸甲酯來進行製備。
人們投入了大量的時間和努力去發現通過微生物來製造L-抗壞血酸的其它方法。大多數用微生物生產L-抗壞血酸的研究都著重於生產L-抗壞血酸所用的中間體——2-酮基-L-古洛糖酸的生產，該中間體可以用單一的、混和的或重組的培養物從L-山梨糖(例如EP 213,591；US 4,960,695；EP221,707)、D-山梨醇(例如EP 213,591；US 5,312,741；WO 95/23220；WO98/17819)、或經由2，5-二酮基葡糖酸從D-葡萄糖生產。然後，可以通過上述的化學方法將2-酮基-L-古洛糖酸轉化成L-抗壞血酸。
如上所述，2-酮基-L-古洛糖酸經由2-酮基-L-古洛糖酸γ-內酯轉化成L-抗壞血酸是一種伴有除去水分子的酸催化反應。該反應的主要原理是形成一種羧基酯鍵從而在2-酮基-L-古洛糖酸分子中產生γ-內酯環。因此，尤其是在水相中，該平衡反應中的最終狀態是由物理-化學條件決定的。通過化學轉化由2-酮基-L-古洛糖酸進行的L-抗壞血酸的生產即使在水相中也十分可觀，但不足以用於工業應用。對於成本效果和環境需要而言，十分需要在水相或在具有低有機溶劑含量的水相中進行的生產過程。於是，對於在水相中的生產而言，一定會需要對該化學轉化進行一些生物學增強。高溫度和高酸度的(低)pH對於該反應而言顯然都是有利的。
WO 97/43433描述了一種通過將2-酮基-L-古洛糖酸或其酯與水解酶催化劑進行接觸來製備L-抗壞血酸的方法，所說的水解酶催化劑選自蛋白酶(酶分類為EC 3.4.x.x)、酯酶(酶分類為EC 3.1.x.x)、脂肪酶(酶分類為EC 3.1.x.x)和醯胺酶(酶分類為EC 3.5.x.x)。US 6,022,719舉例說明了用水解酶如蛋白酶、酯酶、脂肪酶或醯胺酶，由2-酮基-L-古洛糖酸的酯如2-酮基-L-古洛糖酸丁酯來形成L-抗壞血酸，但是從2-酮基-L-古洛糖酸本身不能明顯地形成L-抗壞血酸。其並沒有公開α-澱粉酶或具有α-澱粉酶活性的酶可作為水解酶催化劑用於由2-酮基-L-古洛糖酸來形成L-抗壞血酸。
α-澱粉酶是一種可催化澱粉α-1，4-糖苷鍵水解並釋放出各種長度的多糖和低聚糖的內切型水解酶。α-澱粉酶來源廣泛，可得自微生物、植物以及動物。已知一些α-澱粉酶具有良好的熱穩定性。此外，熱嗜酸性細菌酸熱脂環酸桿菌產生一種α-澱粉酶，其在酸性條件下具有很好的熱穩定性。
本發明提供了一種由2-酮基-L-古洛糖酸來製備L-抗壞血酸的酶方法，其包括將2-酮基-L-古洛糖酸在溶液中與α-澱粉酶進行接觸。此外，本發明還提供了一種由2-酮基-D-葡糖酸來製備D-異抗壞血酸的方法，其包括將2-酮基-D-葡糖酸在溶液中與α-澱粉酶相接觸。
這裡所用的術語「α-澱粉酶」包括α-澱粉酶本身和具有α-澱粉酶活性的酶。
微生物「解澱粉芽孢桿菌」、「地衣芽孢桿菌」和「酸熱脂環酸桿菌」還包括如原核生物命名法的國際代碼所定義的具有相同物理-化學性質的該類種屬的同義詞和基本異名。
在本發明的方法中用作催化劑的α-澱粉酶是那些得自生物體的澱粉酶，所說的生物體包括動物、植物以及微生物如真菌、酵母菌和細菌。本發明優選的α-澱粉酶是那些解澱粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酸熱脂環酸桿菌以及豬胰腺的α-澱粉酶。更優選的是酸熱脂環酸桿菌、尤其是酸熱脂環酸桿菌ATCC 27009的具有α-澱粉酶活性的酶。
用於本發明方法的α-澱粉酶可以購自供應商如Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，USA)或可以通過常規的蛋白純化方法如硫酸銨沉澱法、色譜法和結晶法從任何適宜的生物體，包括動物、植物和微生物中被分離出來。在本發明的方法中，可以使用任何形式的α-澱粉酶，特別是酶溶液或被固定的酶。
在本發明的方法中，2-酮基-L-古洛糖酸和2-酮基-D-葡糖酸優選的化學形式是游離酸或其金屬鹽如鈉鹽和鈣鹽。
該反應混合物可以包含適宜的α-澱粉酶穩定劑如Ca離子，並且可以進一步包含抗氧化劑如2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇或半胱氨酸以防止所產生的L-抗壞血酸或D-異抗壞血酸降解。
本發明方法的反應溫度在0℃至120℃的範圍內。優選的溫度為20℃至100℃，並且最優選地為37℃至90℃。
本發明方法適宜的pH為1.5至12。優選的pH為1.5至8，並且最優選的為2至7。可以用適宜的緩衝液對該反應混合物的pH進行調整或可以通過加入酸例如HCl或鹼例如NaOH來對其直接進行調整。
反應周期適宜地在1至7天的範圍內，優選地在1至3天的範圍內。
本發明的方法可以在溶劑如水、含水醇、有機溶劑或其混合物中進行。醇的實例包括C1-C6醇，如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇或叔丁醇。有機溶劑的實例包括脂族烴(例如，庚烷和異辛烷)、脂環族烴(例如，環己烷)和芳族烴(例如，苯和甲苯)。優選的溶劑是水或含水溶劑。
在上述條件下所產生的L-抗壞血酸或D-異抗壞血酸可以用現有技術中公知的方法容易地進行回收。例如，可以通過結晶、電滲析或使用離子交換樹脂的柱色譜來進行L-抗壞血酸或D-異抗壞血酸的分離。
用下面的實施例對本發明進行了更詳細的說明；但是，應當清楚的是本發明並不限於這些特定的實施例。
實施例1用解澱粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和豬胰腺的α-澱粉酶將2-酮基-L-古洛糖酸轉化成L-抗壞血酸進行了解澱粉芽孢桿菌(Sigma-Aldrich，產品號碼10068)、地衣芽孢桿菌(Sigma-Aldrich，產品號碼A4551)和豬胰腺(Sigma-Aldrich，產品號碼A4268)的α-澱粉酶將2-酮基-L-古洛糖酸轉化成L-抗壞血酸的試驗。將酶粉末溶解於緩衝液1[20mM Na-MES緩衝液(pH7.0)和2mM CaCl2]中並將其用於轉化試驗。該反應混合物在50μl 100mM的緩衝液中包含12％2-酮基-L-古洛糖酸鈉單水合物、2mM CaCl2和α-澱粉酶。α-澱粉酶和緩衝液在各反應混合物中的濃度如表1所示。將該反應在70℃下在厭氧條件下進行20小時。
用使用YMC-Pack PolyamineII柱(內徑4.6×150mm；YMC Co.，日本)的HPLC在264nm下對L-抗壞血酸進行分析，使用包含70％(v/v)乙腈和15mM磷酸二氫銨的流動相溶劑，流速為1.5ml/分鐘。通過由含和不含α-澱粉酶的反應液所獲得的結果之間的差異來測定生物學產生的L-抗壞血酸的量。將所產生的L-抗壞血酸的量概括地列與表1中。
表1
*產品號碼實施例2得自酸熱脂環酸桿菌的具有α-澱粉酶活性的酶的純化使酸熱脂環酸桿菌ATCC 27009在24.6升包含9.8mM(NH4)2SO4、0.47mM CaCl2、2.7mM KH2PO4、1.0mM MgSO4、10μM FeSO4、9.1μMMnCl2、11.7μM Na2B4O7、0.57μM ZnSO4、0.2μM CuCl2、0.12μM VOSO4、0.16μM NaMoO4、30nM CoSO4和10mM麥芽糖(pH3.5)的基質中在55℃下有氧生長15小時。通過離心回收培養液。
在酶純化過程中，所有柱色譜的運行都是在4℃下進行的。通過用對-硝基苯基α-D-麥芽戊糖苷(Sigma-Aldrich)作為底物，用分光光度分析對α-澱粉酶活性進行測定。該試驗混合物在40μl 50mM的醋酸鈉緩衝液(pH4.0)中包含1mM對-硝基苯基α-D-麥芽戊糖苷和酶樣品。將其在55℃下培養20分鐘後，向該反應混合物中加入100μl 1M Tris-HCl緩衝液(pH7.5)。在405nm下以吸光度的方式測定所釋放的對-硝基苯酚。
將回收的培養液用DEAE Sepharose Fast Flow (AmershamPharmacia Biotech UK Ltd.Buckinghamshire，UK)柱色譜進行處理。在20mM下將0.5M Na-MES緩衝液(pH6.0)加入該培養液中並用NaOH將pH調節至6.0。將由1.65升培養物所製得的液體樣品加載到用緩衝液2[20mM Na-MES緩衝液(pH6.0)、0.5mM CaCl2和1.0mM MgSO4]進行了平衡的DEAE Sepharose Fast Flow柱(100ml內徑4.4×6.6cm)上。在用緩衝液2洗滌後，用NaCl的線性梯度(0-0.45M，在緩衝液2中)對酶進行洗脫。將該步驟重複四次以對6.6升培養物進行處理。將四次色譜運行的活性級分合併並用緩衝液3[20mM醋酸鈉緩衝液(pH3.0)、0.5mM CaCl2和1.0mM MgSO4]對其進行透析。將進行了透析的樣品加載到用緩衝液3平衡的SP Sepharose Fast Flow柱(80ml內徑4.4×5.3cm，AmershamPharmacia Biotech UK)上。在用緩衝液3進行洗滌後，用NaCl的線性梯度(0-0.6M，在緩衝液3中)對酶進行洗脫。收集活性成分。在用緩衝液2進行透析後，將該酶樣品加載到用緩衝液2平衡的Q Sepharose Fast Flow柱(30ml內徑2.5×6.2cm，Amersham Pharmacia Biotech UK)上。在用緩衝液2洗滌後，用NaCl的線性梯度(0-0.8M，在緩衝液2中)對酶進行洗脫。收集活性級分並用Centriplus YM-30(Millipore Co.，USA)將其濃縮至3.5ml。用緩衝液4[20mM Na-MES緩衝液(pH6.0)、0.5mM CaCl2、1.0mMMgSO4和0.15M NaCl]使濃縮了的樣品通過HiPrep Sephacryl S-300 HRl6/60(Amersham Pharmacia Biotech UK)。得到9ml包含具有α-澱粉酶活性的酶的級分。用緩衝液5[20mM Na-MES緩衝液(pH6.0)、0.5mM CaCl2、1.0mM MgSO4和50mM NaCl]對該酶樣品進行透析並通過濃縮器用Centricon YM-30(Millipore Co.，USA)反覆進行濃縮/稀釋將其濃縮至0.1lml。在SDS-PAGE上，純化了的酶主要表現出約160kDa的分子量。最後，獲得0.47mg純度為約80％的具有α-澱粉酶活性的酶。
實施例3酸熱脂環酸桿菌的具有α-澱粉酶活性的酶進行的2-酮基-L-古洛糖酸向L-抗壞血酸的轉化對實施例2中由酸熱脂環酸桿菌純化得到的具有α-澱粉酶活性的酶進行的2-酮基-L-古洛糖酸向L-抗壞血酸的轉化進行了試驗。該反應混合物在20μl中包含10％2-酮基-L-古洛糖酸鈉單水合物(用HCl將pH調至2.5)和酶(100或200μg/ml)。將該反應在厭氧條件下在80℃下進行24小時。用實施例1中所描述的方法對L-抗壞血酸進行分析。通過由含和不含酶的反應液所獲得的結果之間的差異來測定生物學產生的L-抗壞血酸的量。100μg/ml酶產生3.90g/l L-抗壞血酸，200μg/ml酶產生4.22g/l L-抗壞血酸。
實施例4由解澱粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌以及豬胰腺的α-澱粉酶進行的2-酮基-D-葡糖酸向D-異抗壞血酸的轉化對實施例1所述的解澱粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌以及豬胰腺的α-澱粉酶進行的2-酮基-D-葡糖酸向D-異抗壞血酸的轉化進行了試驗。用溶解於緩衝液1中的α-澱粉酶來進行該轉化反應。該反應混合物在50μl100mM緩衝液中包含5％2-酮基-D-葡糖酸半鈣鹽(Sigma-Aldrich)、4mMCaCl2和400μg/ml的α-澱粉酶。各反應混合物中的緩衝液如表2所示。將該反應在厭氧條件下在70℃下進行20小時。用與分析L-抗壞血酸所用的方法(如實施例1所述)相同的方法來對D-異抗壞血酸進行分析。通過由含和不含α-澱粉酶的反應液所獲得的結果之間的差異來測定生物學產生的D-異抗壞血酸的量。將所產生的D-異抗壞血酸的量概括地列於表2中。
表2
*產品號碼實施例5由酸熱脂環酸桿菌的具有α-澱粉酶活性的酶進行的2-酮基-D-葡糖酸向D-異抗壞血酸的轉化對實施例2中由酸熱脂環酸桿菌純化得到的酶進行的2-酮基-D-葡糖酸向D-異抗壞血酸的轉化進行了試驗。該反應混合物在20μl中包含5％2-酮基-D-葡糖酸半鈣鹽(用HCl將pH調至2.5)和酶(0或200μg/ml)。將該反應在厭氧條件下在70℃下進行21小時。用實施例4所述的方法對D-異抗壞血酸進行分析。通過由含和不含酶的反應液所獲得的結果之間的差異來測定生物學產生的D-異抗壞血酸的量。含酶的反應液產生了76.0mg/l的D-異抗壞血酸。
權利要求
1.一種由2-酮基-L-古洛糖酸製備L-抗壞血酸或由2-酮基-D-葡糖酸製備D-異抗壞血酸的方法，其包括分別將含有2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸的溶液與α-澱粉酶或具有α-澱粉酶活性的酶進行接觸。
2.如權利要求1所述的方法，其中的溶劑是一種選自水、醇以及其混合物的水性溶劑。
3.如權利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在0℃至120℃的溫度範圍內與酶進行接觸的。
4.如權利要求3所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在20℃至100℃的溫度範圍內與酶進行接觸的。
5.如權利要求4所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在37℃至90℃的溫度範圍內與酶進行接觸的。
6.如權利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在1.5至12的pH範圍內與酶進行接觸的。
7.如權利要求6所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在1.5至8的pH範圍內與酶進行接觸的。
8.如權利要求6所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在2至7的pH範圍內與酶進行接觸的。
9.如權利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸選自游離酸和金屬鹽。
10.如權利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在37℃至90℃的溫度範圍內和在2至7的pH範圍內與具有α-澱粉酶活性的酶進行接觸的。
全文摘要
一種通過分別將2－酮基－L－古洛糖酸或2－酮基－D－葡糖酸與具有α－澱粉酶活性的酶在溶液中進行接觸來由2－酮基－L－古洛糖酸生產L－抗壞血酸或由2－酮基－D－葡糖酸生產D－異抗壞血酸的方法。用於這種反應的溶劑可以是水、含水醇、有機溶劑或其混合物。在各種情況中，起始材料可以是游離酸、鈉鹽或鈣鹽的形式。
文檔編號C12P17/04GK1585824SQ02822259
公開日2005年2月23日 申請日期2002年10月31日 優先權日2001年11月9日
發明者星野立夫, 達也喜安, 真城正子 申請人:Dsm Ip 資產有限公司