一種抗體依賴增強效應減弱的登革病毒疫苗

2024-04-14 04:01:05 1

1.本發明屬於生物醫藥技術領域。更具體地，涉及一種抗體依賴增強效應減弱的登革病毒疫苗。


背景技術：

2.登革熱是登革病毒(denv)經蚊媒傳播引起的急性蚊媒傳染病。登革病毒感染後引發的一般為自限性的登革熱(df)，但如果沒有適當的治療，加之異型血清型登革病毒的繼發性登革熱感染，可能發展為嚴重併發症，如登革熱出血熱(dhf)和登革熱休克症候群(dss)，導致死亡率升高。登革病毒的廣泛傳播對人類健康造成威脅，導致全球衛生服務緊張和國家的巨大經濟損失，但迄今為止，還沒有一種抗病毒藥物獲得批准，也沒有一種疫苗被廣泛用於治療和預防登革熱。
3.登革病毒屬於黃病毒科的黃病毒屬，主要有血清型1～4四種血清型，即denv-1、denv-2、denv-3和denv-4。登革病毒的基因組為長11kb的正義單鏈rna，包括一個大的開放閱讀框(orf)、3種結構蛋白(膜蛋白(m)、包膜蛋白(e)和衣殼蛋白(c))以及7種非結構(ns)蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5)。在成熟的登革病毒粒子中，c蛋白包裹著rna基因組，並被一層脂質雙層膜包圍，其中嵌入了e蛋白和m蛋白。在登革病毒成熟過程中，prm蛋白被切割以釋放m蛋白的pr結構域，m蛋白與成熟病毒上的e蛋白相互作用，e蛋白通過與多種受體結合(dc-sign、甘露糖受體、cd207等)和內質體膜融合進入宿主細胞細胞。
4.登革病毒的e蛋白包含三個結構域(d i、d ii、d iii)，其中，d iii區域負責與宿主受體結合，是誘發高效中和抗體(nab)的主要靶點。也因此，大多數疫苗策略都是基於登革病毒e蛋白的d iii結構域，但是e蛋白的d iii結構域的免疫原性弱，且不包含全部受體結合位點，以其作為抗原所得疫苗的免疫保護效果不理想。另有不少疫苗直接基於登革病毒e蛋白，但研究表明e蛋白d ii結構域的fl區域誘發產生的抗體可能在不同血清型登革病毒感染時引發抗體依賴增強效應(ade)。
5.抗體依賴性增強效應是指當存在弱中和抗體或者抗體濃度較低時，病毒結合抗體形成的複合物在fc受體的介導下非但沒有被抗體中和，反而促進病毒進入並感染宿主細胞，這可能與疾病的進一步加重有關。ade最早的報導來自於登革熱，而提供一種減弱登革病毒抗體依賴增強效應的方法，研發一種高免疫原性且能避免感染時產生ade效應的登革疫苗具有重要意義。


技術實現要素：

6.本發明要解決的技術問題是克服現有登革病毒疫苗免疫保護效果不理想和會引發抗體依賴增強效應的缺陷和不足，提供一種減弱登革病毒抗體依賴增強效應的方法，並在此基礎上提供一種抗體依賴增強效應減弱的登革病毒疫苗。
7.本發明的第一個目的是提供一種減弱登革病毒抗體依賴增強效應的方法。
8.本發明的第二個目的是提供一種登革病毒抗原。
9.本發明的第三個目的是提供一種登革病毒納米抗原。
10.本發明的第四個目的是提供所述抗原在製備抗登革病毒的藥物中的應用。
11.本發明的第五個目的是提供一種抗體依賴增強效應減弱的登革病毒疫苗。
12.本發明上述目的通過以下技術方案實現：
13.本發明提供了一種減弱登革病毒抗體依賴增強效應的方法，所述方法為：以ggggs和s替換登革病毒的包膜蛋白中的兩個d ii結構域後所得融合蛋白作為登革病毒抗原進行免疫。
14.具體地，ggggs替換的是登革病毒包膜蛋白從n端起的第一個d ii結構域，s替換的是登革病毒表面包膜蛋白從n端起的第二個d ii結構域。
15.研究表明e蛋白d ii結構域的fl區域誘發產生的抗體可能在不同血清型登革病毒感染時引發抗體依賴增強效應，本發明嘗試通過截去e蛋白d ii結構域的fl區域期望能減弱登革病毒的抗體依賴增強效應，但由於截去了e蛋白中的部分區域，剩餘部分的構象與e蛋白的天然構象不同，其免疫原性也因此受到影響。本發明通過大量研究，發現截去登革病毒e蛋白的d ii結構域(誘發的抗體大部分中和能力低)，再通過ggggs和s將剩餘e蛋白片段進行連接，不僅有效避免了抗體依賴增強效應，通過ggggs和s連接d i區和d iii區也使所得融合蛋白e13的構象更接近e蛋白的天然構象，大大增加了誘發中和抗體的表位。
16.基於上述方法，本發明還提供了幾種登革病毒抗原：
17.一種登革病毒抗原，所述抗原為血清型1登革病毒抗原，所述血清型1登革病毒抗原(記為e113)的胺基酸序列如seq id no.1所示。
18.一種登革病毒抗原，所述抗原為血清型2登革病毒抗原，所述血清型2登革病毒抗原(記為e213)的胺基酸序列如seq id no.2所示，
19.一種登革病毒抗原，所述抗原為血清型3登革病毒抗原，所述血清型3登革病毒抗原(記為e313)的胺基酸序列如seq id no.3所示，
20.一種登革病毒抗原，所述抗原為血清型3登革病毒抗原，所述血清型4登革病毒抗原(記為e413)的胺基酸序列如seq id no.4所示。
21.本發明還提供了一種表達上述抗原(seq id no.1～4)的重組載體或轉基因細胞系。
22.本發明還提供了一種登革病毒納米抗原，所述納米抗原是以所述登革病毒抗原分別與seq id no.5所示gvtag通過linker連接後融合表達得到融合蛋白，再將所得融合蛋白與seq id no.10所示sdcatcher-hpf蛋白通過gv-sd的自發化學鍵結合得到的納米抗原。
23.具體地，本發明通過將截去登革病毒e蛋白的d ii結構域後所得融合蛋白(即所述登革病毒抗原)通過共價結合gvtagopti/sdcatcher(gv/sd)系統，基於hpf蛋白實現抗原多聚化，從而獲得登革病毒納米抗原。所述gvtagopti/sdcatcher(gv/sd)系統可參見公開號為cn113621031a的中國專利。
24.具體地，所述gvtag通過linker連接於抗原的c端。
25.通常情況下，在利用gvtagopti/sdcatcher(gv/sd)系統構建納米抗原時是將gvtag連接於抗原的n端，但對本發明所述登革病毒抗原來說，將gvtag連接於抗原的n端時融合蛋白的表達量並不理想，而通過將gvtag連接在本發明所述抗原的c端，相較於連接在n端，大大提高了融合蛋白的表達量。
26.具體地，當所述linker為ggs時，本發明所述登革病毒抗原，即seq id no.1～4所示抗原分別與gvtag連接所得融合蛋白的胺基酸序列依次分別如seq id no.6～9所示。
27.具體地，所述登革病毒抗原與gvtag所得融合蛋白的n端連接有分泌型信號肽，c端還連接有his純化標籤。
28.具體地，本發明所述登革病毒抗原(seq id no.1～4所示)分別與分泌型信號肽、gvtag和his純化標籤連接後所得融合蛋白的胺基酸序列依次分別如seq id no.11～14所示。
29.本發明還提供了所述納米抗體的製備方法，所述方法為：使用真核表達系統表達本發明所述登革病毒抗原與gvtag所得融合蛋白，使用原核表達系統表達seq id no.10所示sdcatcher-hpf蛋白，融合蛋白和sdcatcher-hpf蛋白在經表達、純化後通過gv/sd共價作用形成二十四聚體納米抗原，記為e13-hpf二十四聚體納米抗原。若所用登革病毒抗原為血清型1登革病毒抗原(e113)，則製備所得二十四聚體納米抗原記為e113-hpf。
30.本發明還申請保護所述抗原在製備抗登革病毒的藥物中的應用，所述藥物包括疫苗。
31.本發明還提供了一種抗體依賴增強效應減弱的登革病毒疫苗，所述疫苗是以本發明所述登革病毒抗原或登革病毒納米抗原製備得到。
32.具體地，當所用抗原為納米抗原時，疫苗所用佐劑為鋁佐劑。
33.本發明還提供了一種抗體依賴增強效應減弱的四價登革病毒納米顆粒疫苗，所述納米顆粒疫苗是將本發明所述四種不同血清型的登革病毒納米抗原等比例混合均勻後，與鋁佐劑混合製備得到。
34.本發明具有以下有益效果：
35.本發明提供了一種減弱登革病毒抗體依賴增強效應的方法，並在此方法的基礎上提供了一種登革病毒抗原、納米抗原和疫苗。本發明以登革病毒e蛋白的d i區融合d iii區(e13)作為抗原片段，並通過共價結合系統gvtagopti/sdcatcher(gv/sd)結合幽門螺旋桿菌鐵蛋白(hpf)實現抗原多聚化，同時加上分泌型信號肽及his純化標籤，通過質粒轉染真核細胞表達系統可表達得到e13-hpf蛋白並自組裝成球狀二十四聚體納米顆粒，再以此納米顆粒作為抗原製備得到了抗體依賴增強效應減弱的登革疫苗。
36.本發明所述疫苗克服了e蛋白d iii區域單體免疫原性不足的缺點，可以有效地引起更強的免疫反應，產生中和登革病毒入侵靶細胞的抗體，且所述疫苗能針對四種不同血清型的登革病毒產生平衡的、強大的免疫保護反應，可以避免產生ade效應，顯著提高了宿主針對登革病毒的中和抗體水平。此外，本發明所述登革病毒疫苗的製備方法簡單、易於純化、安全性高。
附圖說明
37.圖1為e13-gvtag-his融合蛋白和sdcatcher-hpf融合蛋白的結構示意圖。
38.圖2為四種血清型登革病毒納米抗原(e13-hpf蛋白)的構建過程示意圖。
39.圖3為用於表達e13-gvtag-his融合蛋白的重組表達載體pcdna3.1-intron-e13-gvtag-wpre的結構示意圖。
40.圖4為e13-gvtag-his融合蛋白(約35kd)、e13-gvtag融合蛋白和e13-hpf蛋白(約
70kd)純化後的sds-page圖。
41.圖5為多聚體蛋白e13-hpf的純化分子篩圖。
42.圖6為四價e13-hpf納米顆粒疫苗免疫小鼠的免疫策略。
43.圖7為用四價e13-hpf納米顆粒疫苗免疫小鼠10周後所採血清中四種e13蛋白特異igg滴度的檢測結果；圖中****表示差異極顯著，p＜0.0001。
44.圖8為用四價e13-hpf納米顆粒疫苗免疫小鼠10周後所採血清中所產生的抗體對登革病毒的中和活性檢測結果；圖中****表示差異極顯著，p＜0.0001。
45.圖9為用四價e13-hpf納米顆粒疫苗免疫小鼠10周後所採血清中抗體的抗體依賴增強效應檢測結果；圖中***表示差異極顯著，p＜0.001。
具體實施方式
46.以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明採用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。
47.除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
48.實施例1構建四種血清型的登革病毒納米抗原(融合蛋白e13-hpf)
49.本發明構建四種不同血清型登革病毒納米抗原所需的e13-gvtag-his融合蛋白和sdcatcher-hpf融合蛋白的結構示意圖如圖1所示。由圖1可知，在去除誘發ade的抗體結合位點，即去除d ii結構域後，登革病毒e蛋白的d i結構域變為了三段，為保持後續所得融合蛋白的蛋白構象與e蛋白的天然構象一致，本發明利用ggggs和s將截去d ii結構域的e蛋白進行了連接；其中，ggggs位於第一個缺口處，相當於ggggs替換了e蛋白從n端起的第一個d ii結構域，s位於第二個缺口處，相當於s替換了e蛋白從n端起的第二個d ii結構域。本發明將去除d ii結構域後用ggggs和s連接所得融合蛋白命名為e13(若為血清型1登革病毒的d i和d iii融合蛋白，則記為e113)，該蛋白可作抗原使用，某些情況下也稱作抗原e13。
50.所述血清型1登革病毒抗原e113的胺基酸序列如seq id no.1所示，血清型2登革病毒抗原e213的胺基酸序列如seq id no.2所示，血清型3登革病毒抗原e313的胺基酸序列如seq id no.3所示，血清型4登革病毒抗原e413的胺基酸序列如seq id no.4所示；上述登革病毒抗原與seq id no.5所示gvtag通過ggs連接後的胺基酸序列分別如seq id no.6～9所示；上述抗原與分泌型信號肽(sp)、gvtag和his純化標籤連接後的胺基酸序列分別如seq id no.11～14所示。
51.四種血清型的登革病毒納米抗原的構建過程如圖2所示，將製備得到的不同血清型的e13-gvtag融合蛋白分別與sdcatcher-hpf融合蛋白於25℃條件下孵育過夜，e13-gvtag融合蛋白與sdcatcher-hpf融合蛋白可通過共價結合gvtagopti/sdcatcher(gv/sd)系統，通過gv-sd的自發化學鍵結合，自組裝得到e13-hpf二十四聚體，即納米抗原，將四種不同血清型登革病毒納米抗體等比例混合後可用於製備四價登革病毒納米顆粒疫苗。所述gvtagopti/sdcatcher(gv/sd)系統可參見公開號為cn113621031a的中國專利。
52.具體地，本發明所述蛋白e13-gvtag-his的製備方法如下：
53.1、表達蛋白e13-gvtag-his的重組載體的構建
54.分別在編碼蛋白e13-gvtag-his的核苷酸序列的3』端加上翻譯終止密碼子後，克
隆到添加了intron及wpre增強表達的表達載體(pcdna3.1-intron-wpre)的ecor i和xba i酶切位點之間，構建得到重組表達載體pcdna3.1-intron-e13-gvtag-wpre，所述重組表達載體的結構示意圖如圖3所示。
55.將構建所得重組表達載體轉化dh5α感受態細胞，37℃過夜培養，挑取單菌落並用pcr鑑定出陽性克隆；提取去內毒素的質粒(pcdna3.1-intron-e13-gvtag-wpre)，經酶切以及測序驗證構建得到了正確的pcdna3.1-intron-e13-gvtag-wpre重組表達載體後，將其用於納米抗原蛋白的表達。
56.將經驗證的pcdna3.1-intron-e13-gvtag-wpre重組表達載體通過脂質體轉染的方案轉染hek293f細胞，轉染5天後離心收穫細胞上清，利用his純化標籤對目的蛋白e13-gvtag-his進行純化。
57.2、e13-gvtag-his抗原純化
58.將表達e13-gvtag-his的細胞上清通過0.22μm的濾膜過濾，除去細胞碎片；將過濾後的細胞上清液流穿histrap excel鎳柱進行粗提純。
59.粗提純後，先用pbs(ph＝7.4)緩衝液和低濃度咪唑緩衝液(pbs，20mm imidazole，ph＝7.4)分別進行洗滌，50ml，去除流穿的雜蛋白；其後，用含高咪唑緩衝液(pbs，50或500mm imidazole，ph＝7.4)進行目的蛋白洗脫；隨後將洗脫液濃縮至小體積1ml；將純化後的四種e13-gvtag-his蛋白分別與sdcatcher-hpf按物質的量為1:1的比例於25℃孵育過夜。
60.本發明對製備蛋白e13-gvtag-his過程中的轉染細胞上清和his純化洗脫液中的目的蛋白，以及多聚體流出液中的蛋白進行了sds-page檢測，結果如圖4所示，由圖4所示結果可知，本發明成功表達、純化、孵育獲得了蛋白e13-gvtag-his、e13-gvtag和e13-hpf。
61.收集孵育後形成的四種多聚體蛋白e13-hpf(納米抗原)，分別通過siperose6increase10/300gl柱子(ge)進行分子篩層析，對所得蛋白進行純化，分子篩層析緩衝液是：pbs，ph 7.4，e13-hpf純化分子篩圖如圖5所示，由圖5所示結果可知，所得多聚體蛋白e13-hpf的峰單一，表明本發明獲得了純度高於99％的二十四聚體e13-hpf蛋白。
62.將所得四種e13-hpf蛋白濃縮後分裝成小份(500μl)，用液氮迅速冷凍後於-80℃保存。
63.實施例2四種e13蛋白特異性igg滴度的elisa實驗
64.將實施例1中得到的四種二十四聚體e13-hpf蛋白，即四種e13-hpf(e113-hpf、e213-hpf、e313-hpf、e413-hpf)納米抗原按物質的量等比例混合後，按照表1所示用量用生理鹽水稀釋至100μg/ml，並與等體積鋁佐劑(adjuvant 2％，貨號：vac-alu-250，cas number:21645-51-2)進行分組乳化，製備得到四價登革病毒納米顆粒疫苗。對6～8周齡的balb/c小鼠進行分組免疫。免疫策略如圖6所示，即通過皮下注射的方式，每隻小鼠分別在第0天，第4周，第8周接受3次疫苗免疫，每次200μl的接種體積(10μg)；分別在第2、4、6、8和10周，對小鼠進行眼眶取血；小鼠血清在靜置一段時間待血清析出後，4℃，2800rpm離心10分鐘獲得免疫後的小鼠血清，立刻進行該血清中四種e13蛋白特異性igg滴度的elisa實驗以及針登革病毒中和檢測實驗。
65.表1
[0066][0067][0068]
四種不同血清型登革病毒e13蛋白特異性igg滴度的elisa實驗過程如下：
[0069]
1、包板
[0070]
將四種抗原e113-gvtag-his、e213-gvtag-his、e313-gvtag-his、e413-gvtag-his分別用pbs分別稀釋到5ng/μl，50μl/孔，分別加入96孔elisa板(格瑞納，655061)，用貼紙貼緊孔板，防止蒸發，4℃過夜。
[0071]
2、封閉
[0072]
先甩出並扣幹孔板中液體，配製5％pbs脫脂奶粉，倒入加樣槽，用排槍加入100μl/孔，用貼紙貼緊孔板，封閉常溫下1h。
[0073]
3、洗板
[0074]
大力甩出並扣幹孔板中液體，加入200μl 0.1％pbst溶液，重複此過程3次，徹底洗乾淨奶粉溶液。
[0075]
4、加入稀釋後血清
[0076]
擺好1.5ml ep管，加入450ml pbs，再加入50μl血清進行稀釋(10倍稀釋)；除第一排的板孔外，其餘板孔用排槍加入100μl pbs。按濃度梯度3倍稀釋，第一孔加150μl稀釋後血清，用排槍吸出50μl加入下一排，反覆吹吸混勻，重複吸出混勻操作，直至最後一排，混勻後將多餘的50ul稀釋血清棄去。將最上面的板子貼上貼紙防止蒸乾。
[0077]
5、孵育一抗
[0078]
將加入血清的板子放入37℃烘箱孵育1h。
[0079]
6、洗板
[0080]
大力甩出並扣幹孔板中液體，加入200μl 0.1％pbst溶液，重複此過程3次，徹底洗乾淨。
[0081]
7、孵育二抗
[0082]
根據樣品種屬配製酶標記的鼠二抗(invitrogen，31430)，配比1:4000，用排槍加入100μl/孔，最上面的貼紙貼緊板孔防止蒸發，孵育1h。
[0083]
8、洗板
[0084]
大力甩出並扣幹孔板中液體，加入200μl 0.1％pbst溶液，重複此過程4次。
[0085]
9、加入顯色底物和終止顯色
[0086]
全程避光操作，用排槍加入顯色底物tmb 50μl/孔，顯色10分鐘後加入50μl終止液終止顯色。
[0087]
10、酶標儀檢測
[0088]
設定檢測波長為450nm進行檢測，每個板子作3次重複檢測。保存原始數據及導出的excel表格。
[0089]
11、處理數據
[0090]
用四價e13-hpf納米顆粒疫苗免疫小鼠10周後所採血清中四種e13蛋白特異igg滴
度的檢測結果如圖7所示。將四價e13-hpf納米抗原免疫balb/c小鼠後10周後，從小鼠血清中分別檢測對四種e13蛋白特異性igg滴度，sidak多重比較檢驗顯示實驗組與對照組組間存在差異顯著性，在顯著性水平為0.05的情況下，雙尾概率水平小於0.05。結果表明，利用本發明所述四價e13-hpf納米顆粒疫苗，在距離第一次免疫後10周後能激發小鼠產生高水平的針對四種血清型denv的e13蛋白的igg滴度。
[0091]
實施例3denv中和試驗
[0092]
denv中和試驗過程如下：
[0093]
1、day 1：按照2*104/well將vero細胞加入96孔板，培養過夜12小時(或者長滿孔後)進行實驗
[0094]
2、day 2：預稀釋血清、病毒液
[0095]
每個樣品血清預稀釋如下：
[0096]
1)第一個孔稀釋20倍，接下來3倍梯度稀釋
[0097]
病毒液稀釋：每種病毒液按照100ffu/well製備總量
[0098]
混合物＝55μl稀釋血清+55μl稀釋病毒液，37℃孵育1小時
[0099]
3)將day 1的細胞板用50μl的pbs洗一遍後棄掉pbs，將孵育的混合物對應加入細胞(100μl/well)，37℃2小時，2小時後換液，每孔100μl加入2％的dmem，換液後不要移動板子
[0100]
3、day 4：換液後48小時後收板，棄掉上清，用200μl pbs洗一遍，加50μl的甲醇(-20℃儲存)固定破膜30min，用pbs洗3遍，每孔加一抗ns3抗體(genetex，gtx124252)50μl(1:2000稀釋的)4℃過夜
[0101]
4、day 5：棄掉一抗，加0.1％的pbst，洗3遍後，50μl 1:1000稀釋好的螢光二抗(ab150077-500μg，abcam)37℃1小時後(避光)，0.1％pbst洗6遍，最後兩遍放搖床洗3分鐘後，輕輕拍幹，避光晾乾3小時或者過夜後上機ctl儀器讀取螢光斑點數。
[0102]
5、結果分析
[0103]
用四價e13-hpf納米顆粒疫苗免疫小鼠10周後所採血清中所產生的抗體對登革病毒的中和活性檢測結果如圖8所示。四價e13-hpf納米抗原免疫balb/c小鼠後10周後血清檢測到對denv-2、denv-3、denv-4病毒的中和活性，sidak多重比較檢驗顯示實驗組與對照組組間存在差異顯著性；在顯著性水平為0.05的情況下，雙尾概率水平小於0.05。結果表明，本發明將e13-hpf與鋁佐劑合用製備所得疫苗，在距離第一次免疫後10周小鼠體液中具有高水平阻礙denv感染的中和抗體，與平行對照相比，本發明所述疫苗所激發的針對denv的中和抗體效價高，且差異顯著。
[0104]
實施例4ade效應檢測
[0105]
1、將實施例3中所得免疫後的小鼠血清用無血清opti培養基(gibco，opti mem)稀釋50倍，用感染過denv-3小鼠血清作為陽性對照。
[0106]
2、在96孔細胞培養板上，加入54μl預稀釋好的血清，並對應每孔加入54μl的denv-2病毒液(5*104ffu/孔)，病毒對照孔加入等量病毒液和無血清的opti培養基，37℃1小時。
[0107]
3、按8*105個/孔細胞量在上述孵育板加入10μl k562細胞(表達fc受體的細胞系，研究中常用於登革病毒ade效應檢測)，細胞預先用無血清的1640培養基(源培，l210kj)重懸，37℃3小時，之後每孔加入100μl的4％的1640培養基，37℃放置24小時。
[0108]
4、將細胞轉移至1.5ml ep管，轉速350g離心5min，棄掉上清後，每管加入400μlpbs洗一次，轉速350g離心5min，棄去上清，細胞沉澱用rna提取試劑盒(ezbioscience，bd0004d)提取樣品rna。所得樣品rna通過反轉錄試劑盒(vazyme，r211-02)得到對應樣品cdna。
[0109]
5、以上述所得cdna為模板，用denv特異性qpcr引物，通過sybr螢光定量pcr的方法，95℃3min，95℃10s、60℃30s(40cycles)，測各樣品的ct值，通過比對標準品，得到對應樣品孔細胞的病毒rna載量。
[0110]
6、結果分析
[0111]
用四價e13-hpf納米顆粒疫苗免疫小鼠10周後所採血清中抗體的抗體依賴增強效應檢測結果如圖9所示。對比病毒對照孔，四價e13-hpf納米抗原免疫balb/c小鼠10周後的血清沒有明顯增強denv-2的感染，t檢驗結果顯示實驗組與對照組組間存在差異顯著性；在顯著性水平為0.05的情況下，雙尾概率水平小於0.05。結果表明，本發明所述四價e13-hpf納米顆粒疫苗，在距離第一次免疫後10周小鼠，與平行對照相比，並未誘導明顯的ade現象，具有良好的安全性。
[0112]
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。