利用鬆散型胚性愈傷組織誘變獲得耐鹽苜蓿新品種的方法與流程
2023-10-06 21:51:59 2
本發明屬於組培技術領域，涉及一種利用苜蓿鬆散型胚性愈傷組織在化學誘變劑作用下進行耐鹽突變體的一種育種方法。
背景技術：
苜蓿(Medicago)是世界上最重要、種植面積最廣泛的豆科牧草之一,由於其適應性廣、產草量高,且富含蛋白質、維生素和礦物質等營養物質,被譽為「牧草之王」。全世界的苜蓿種植面積約3.22×107hm2,美國、俄羅斯和阿根廷約佔70％。中國雖是苜蓿種植大國,但從未列入農業生產主體。在美國苜蓿被視為第四大作物之一,僅次於玉米、大豆和小麥,種植面積約為8.5×106hm2。我國苜蓿種植面積約3.77×106hm2,居各類人工草地之首。近年來苜蓿的育種主要採用常規雜交育種法和人工選育的方法進行，隨著苜蓿種植面積的擴大，市場需求苜蓿具備越來越優良性狀，而以上制種技術已經不能解決現實問題，因此一些育種人員將目光轉移到一些現代育種新技術上來。近幾年通過基因轉化的方法，已經培育出一些具備某種獨特形狀的苜蓿新品種，但由於環境釋放極為嚴格，短時間不能進入市場，因此還只停留在實驗室階段。而採用誘變育種技術也可以獲得一些特殊性狀，但因其效率低、遺傳穩定性差，使得這一技術一直被擱置。最近幾年，有關採用體細胞誘變育種的報導越來越多，在苜蓿的育種研究中也得到了應用。
國內外有關植物耐鹽性的研究進展非常迅速，利用誘變技術與離體培養相結合進行農作物耐鹽突變體篩選的工作做得較多，目前已在紅薯、番茄等農作物上取得成功，而在苜蓿的耐鹽育種中很少見到報導。隨著土地資源的減少，一些鹽鹼地區也需要種植苜蓿，因此苜蓿的耐鹽育種也逐漸收到了重視。採用誘變技術與體細胞離體再生技術相結合進行定向育種研究中，多採用愈傷組織作為誘變對象，而愈傷組織的形態及生理狀態各不相同，採用鬆散型胚性愈傷組織進行體細胞育種是效率最高的，其中原因主要表現為：一是誘變效率高。因為鬆散型胚性愈傷組織細胞間空隙較大，細胞之間影響較小，誘變劑的作用比較均勻，愈傷組織中每個細胞都受到相同的影響，不會因為內外位置效應而使得一些細胞作用力較大，一些影響力較小；二是鬆散型愈傷組織再生多為單細胞再生，因為細胞間聯繫較小，胚性多發生於單個細胞，因此誘變產生的突變體一般都為純合體，可以直接用於育種研究，而避免嵌合體的遺傳不穩定性；三是鬆散型胚性愈傷組織進行篩選時，由於細胞間聯繫較少，每個細胞都受到相同篩選壓力的作用，從而可以精準確定篩選壓力，從而提高誘變效率；四是鬆散型胚性愈傷組織分割容易，可以很容易控制愈傷組織團的大小，從而使得誘變操作變得簡單易行。五是採用鬆散型胚性愈傷組織還因為其為胚性特性，生理狀態活躍，容易誘導其遺傳物質發生改變，在誘變上具有相應的優勢。除了以上優點，胚性愈傷組織還可以很容易獲得再生植株，一旦獲得突變的愈傷組織，隨後就可以獲得再生突變株，而不需要再進行愈傷組織再生的誘導，為育種節約了時間。因此本發明採用苜蓿的鬆散型胚性愈傷組織作為誘變對象可以獲得高效的誘變率。
技術實現要素：
本發明的目的在於克服現有技術的不足之處，提供一種利用鬆散型胚性愈傷組織誘變獲得耐鹽苜蓿新品種的方法。本發明為苜蓿體細胞誘變育種提供了一個高效、簡單易行的新途徑。此方法對於其它植物採用相同方法進行新品種選育也具有一定的參考價值。
本發明實現目的的技術方案如下：
一種利用鬆散型胚性愈傷組織誘變獲得耐鹽苜蓿新品種的方法，步驟如下
⑴獲取苜蓿無菌苗；
⑵苜蓿鬆軟愈傷組織的誘導
採用苜蓿組培苗的下胚軸為外植體，在1/2MS+0.5-1.0mg/L2.4-D+20g/L蔗糖培養基上誘導；培養條件為：溫度24-25℃，24h光照，光照強度為2000Lux，20-25d即可獲得理想的鬆軟型愈傷組織；
⑶苜蓿胚性愈傷組織的誘導
將步驟⑵中誘導出的鬆軟愈傷組織從外植體上分離下來，將其接種在事先配好的MS+1-2mg/LKT+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培養基上誘導愈傷組織；培養條件為：溫度22-23℃，24h光照，光照強度為2500Lux；接種14-16d後繼代一次，所用培養基和培養條件不變；在繼代時儘量轉移質地較硬的愈傷組織，大約經過3-5次繼代後，愈傷組織質地完全變硬，並在鏡檢時，愈傷組織基本由體積小、球形、細胞質濃、細胞核大並含有多個分裂相的細胞構成，此時說明已經誘導出了苜蓿的胚性愈傷組織；
⑷苜蓿鬆散型胚性愈傷組織的誘導
將步驟⑶中誘導出的苜蓿胚性愈傷組織分成直徑為3-5mm的小塊，然後將其接種到MS+1mg/LKT+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培養基上；在20-22℃下培養，並在7-10d繼代一次，經過5-8次繼代培養，愈傷組織在結構上出現明顯的變化，當出現結構鬆散、質地緊密，鏡檢為胚性愈傷組織時，此時即獲得了苜蓿鬆散型胚性愈傷組織；培養愈傷組織時採用24h光照，光照強度為2500Lux；
⑸誘變材料的製備
將誘導出的苜蓿鬆散型胚性愈傷組織在超淨臺中用解剖刀分成直徑大小為2-3mm的小塊，放到培養皿中備用；另將愈傷組織培養基(MS+1-0.5mg/LKT+1-0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖)在微波爐中融化，待其溫度降到50℃時，加入0.3％的EMS，然後分裝到100ml的三角瓶中，每瓶倒入20ml的培養基；待到培養基凝固後將愈傷組織接種到三角瓶中進行培養；培養條件為24℃,24h光照，光照強度為2000Lux；
⑹耐鹽細胞系的篩選
經過20d的誘變處理後，將生長正常的愈傷組織轉移到含有0.8-1.0％NaCl濃度的培養基上進行耐鹽篩選，經過20d的生長，從中篩選出生長正常並具備再生能力的愈傷組織；培養條件為23-24℃,24h光照，光照強度為3000Lux；
⑺耐鹽突變株的培養
將篩選出的耐鹽愈傷組織轉移到不含激素的MS培養基上誘導再生植株；培養基中加入濃度為0.8-1.0％NaCl，經過20-30d的生長，即可獲得生長健壯的耐鹽苜蓿再生植株；此過程的培養條件為24-25℃,24h光照，光照強度為3000Lux。
而且，所述步驟⑴獲取苜蓿無菌苗的方法如下：
選取飽滿的苜蓿種子，在70％酒精中浸泡30-40s，然後採用40％的安替福民水溶液進行表面消毒，消毒時間為10-15Min；將消毒處理後的種子用無菌水反覆衝洗5次，每次洗10Min，然後將消過毒的種子接種到1/2MS培養基上進行無菌苗的培養，在25℃溫度下培養7d就可以獲得生長健壯的組培苗。
本申請的優點和積極效果如下：
本發明主要內容是先誘導出苜蓿鬆散型胚性愈傷組織，再以化學誘變劑對愈傷組織進行體外誘變，並將誘變後的苜蓿鬆散型胚性愈傷組織轉移到含有一定濃度鹽的培養基上進行定向篩選，從而獲得耐鹽的苜蓿突變愈傷組織，經過再生培養，最終得到苜蓿耐鹽突變株。
附圖說明
圖1為苜蓿鬆散型胚性愈傷組織；
圖2為左側為苜蓿鬆散型愈傷組織，右側為耐鹽篩選出的苜蓿突變愈傷組織；
圖3為苜蓿耐鹽再生植株。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護範圍。
實例1
一種利用鬆散型胚性愈傷組織誘變獲得耐鹽苜蓿新品種的方法，步驟如下：本實施例利用上述方法篩選得到耐鹽「青睞」苜蓿的突變體
⑴苜蓿無菌苗的製備
選取飽滿的「青睞」苜蓿種子，在70％酒精中浸泡30s，然後採用40％的安替福民水溶液進行表面消毒，消毒時間為15Min。將消毒處理後的種子用無菌水反覆衝洗5次，每次洗10Min，然後將消過毒的種子接種到1/2MS培養基上進行無菌苗的培養。在25℃溫度下培養7d就可以獲得生長健壯的組培苗。
⑵苜蓿鬆軟愈傷組織的誘導
採用「青睞」苜蓿組培苗的下胚軸為外植體，在1/2MS+1.0mg/L2.4-D+20g/L蔗糖培養基上誘導。培養條件為：溫度24℃，24h光照，光照強度為2000Lux。20d即可獲得理想的鬆軟型愈傷組織。
⑶苜蓿胚性愈傷組織的誘導
將步驟⑵中誘導出的鬆軟愈傷組織從外植體上分離下來，小心地將其接種在事先配好的MS+1mg/LKT+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培養基上誘導愈傷組織。培養條件為：溫度23℃，24h光照，光照強度為2500Lux。接種14d後繼代一次，所用培養基和培養條件不變。在繼代時儘量轉移質地較硬的愈傷組織，大約經過5次繼代後，愈傷組織質地完全變硬，並在鏡檢時，愈傷組織基本由體積小、球形、細胞質濃、細胞核大並含有多個分裂相的細胞構成，此時說明已經誘導出了苜蓿的胚性愈傷組織。
⑷苜蓿鬆散型胚性愈傷組織的誘導
將步驟⑶誘導出的「青睞」苜蓿胚性愈傷組織分成直徑為5mm的小塊，然後將其接種到MS+1mg/LKT+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培養基上。在22℃下培養，並在7d繼代一次，經過8次繼代培養，愈傷組織在結構上出現明顯的變化，當出現結構鬆散、質地緊密，鏡檢為胚性愈傷組織時，此時即獲得了苜蓿鬆散型胚性愈傷組織。培養愈傷組織時採用24h光照，光照強度為2500Lux。
⑸誘變材料的製備
將誘導出的「青睞」苜蓿鬆散型胚性愈傷組織在超淨臺中用解剖刀分成直徑大小為3mm的小塊，放到培養皿中備用；另將愈傷組織培養基(MS+1mg/LKT+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖)在微波爐中融化，待其溫度降到50℃時，加入0.3％。的EMS，然後分裝到100ml的三角瓶中，每瓶倒入20ml的培養基。待到培養基凝固後將愈傷組織接種到三角瓶中進行培養。培養條件為24℃,24h光照，光照強度為2000Lux。
⑹耐鹽細胞系的篩選
經過20d的誘變處理後，將生長正常的愈傷組織轉移到含有0.8％NaCl濃度的培養基上進行耐鹽篩選，經過20d的生長，從中篩選出生長正常並具備再生能力的愈傷組織。培養條件為24℃,24h光照，光照強度為3000Lux。
⑺耐鹽突變株的培養
將篩選出的耐鹽愈傷組織轉移到不含激素的MS培養基上誘導再生植株。培養基中加入濃度為0.8％NaCl，經過30d的生長，即可獲得生長健壯的耐鹽「青睞」苜蓿再生植株。此過程的培養條件為25℃,24h光照，光照強度為3000Lux。