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具有改變性質的葡糖澱粉酶變體的製作方法

2023-10-25 11:25:17

專利名稱:具有改變性質的葡糖澱粉酶變體的製作方法
具有改變性質的葡糖澱粉酶變體相關申請的交叉引用本申請要求於2007年11月20日提 交的美國臨時申請第60/989,426號的權益。序列表還附加有包括SEQ ID NO :1_167的序列表,其以整體引入作為參考。 發明領域具有改變的性質(例如改善的熱穩定性和/或比活性)的葡糖澱粉酶變體。提 供了包含變體葡糖澱粉酶的組合物,編碼變體的DNA構建體,和在宿主細胞內生產葡糖澱 粉酶變體的方法。
背景技術:
葡糖澱粉酶(葡聚糖1,4-α-葡糖水解酶,EC3.2. 1.3)是澱粉水解的外切糖酶, 催化從澱粉或相關的寡糖和多糖分子的非還原末端移除連續的葡萄糖單元。葡糖澱粉酶可 以水解澱粉(例如直鏈澱粉和支鏈澱粉)的直鏈和分支的糖苷鍵。多種細菌、真菌、酵母和植物都生產葡糖澱粉酶。特別有趣的,且商業上重要 的是,葡糖澱粉酶是胞外生產的真菌酶,例如來自以下屬的菌株麴黴屬(Aspergillus) (Svensson 等人,(1983) Carlsberg Res. Commun. 48 :529_544 ;Boel 等人,(1984)EMBO J. 3 1097-1102 ;Hayashida 等人,(1989) Agric. Biol. Chem. 53 923~929 ;US 專利 5,024,941 ; US 專利 4,794,175 和 W088/09795);踝節菌屬(Talaromyces) (US 專利 4,247,637 ;US 專利 6,255,084 和 US 專利 6,620,924);根黴屬(Rhizopus) (Ashikari 等人,(1986) Agric. Biol. Chem. 50 :957_964 ;Ashikari 等人,(1989) App. Microbiol. Biotech. 32 129-133 和 US 專利 4, 863, 864);腐質黴屬(Humicola) (W0 05/052148 和 US 專利 4,618,579)和毛黴屬(Mucor) (Houghton-Larsen 等人,(2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 62 :210_217)。編碼這些酶 的許多基因都已經在酵母、真菌和/或細菌細胞內得到克隆和表達。在商業上,葡糖澱粉酶是非常重要的酶,已經在多種需要澱粉水解的應用中使用 (例如從澱粉中生產葡萄糖和其它單糖)。葡糖澱粉酶用於生產高果糖的玉米增甜劑.其 佔據超過50%的美國增甜劑市場。一般,在澱粉水解過程中,葡糖澱粉酶可以是且通常是與 α澱粉酶一起使用,將澱粉水解為糊精,再水解為葡萄糖。然後,葡萄糖可以通過其它酶轉 化為果糖(例如葡萄糖異構酶);結晶;或在發酵中使用來生產多種終產物(例如乙醇、 檸檬酸、乳酸、琥珀酸鹽、抗壞血酸中間體、穀氨酸、甘油和1,3丙二醇)。在含有澱粉和/或 纖維素的材料的發酵中使用葡糖澱粉酶生產的乙醇可以作為燃料來源或用於醇消費。雖然葡糖澱粉酶已經成功用於商業應用多年,但是仍然需要具有改變性質的新型 葡糖澱粉酶,所述性質例如改善的比活性和增加的熱穩定性。麴黴屬的葡糖澱粉酶已經產生了不同的突變,其增加了熱穩定性和比活性,參考 US 專利 6,537,792 ;US 專利 6,352,851 ;Chen 等人,(1996)Prot. Eng. 9 :499_505,Chen 等 人,(1995) Prot Eng. 8 :575_582 ;Fierobe 等人,(1996) Biochem. 35 :8698_8704 ;和 Li 等 人,(1997)Prot. Eng. 10 :1199_1204,但是仍然需要提供葡糖澱粉酶變體,相對於它們的親本具有改變的性質。發明概述本公開文本涉及親本葡糖澱粉酶的葡糖澱粉酶變體。葡糖澱粉酶變體在催化結構域和/或澱粉結合結構域含有胺基酸取代。變體表現出具有改變的性質,例如改善的熱穩 定性和/或比活性。在一個方面,本公開文本涉及這樣的葡糖澱粉酶變體,所述變體在相應於SEQ ID NO :2的第61、73、417、430、431、503、511、535、539或563位和/或親本葡糖澱粉酶中的等價 位置上具有兩個或多於兩個的胺基酸取代。在另一個方面,本公開文本涉及這樣的葡糖澱 粉酶變體,所述變體具有與SEQ ID N0:l、2、3、5、6、7、8或9的親本葡糖澱粉酶至少80%、 85%、90%、95%或99.5%的序列同一性。在一個實施方案中,親本葡糖澱粉酶具有這樣的 催化結構域,所述結構域與SEQ ID N0:l、2、3、5、6、7、8或9具有至少80%的序列同一性, 或者具有這樣的澱粉結合結構域,所述結構域與SEQ ID NO :1或2具有至少80%的序列同 一性。在其他方面,親本葡糖澱粉酶是SEQ ID NO :1或2。本公開文本的另一方面涉及這樣 的葡糖澱粉酶變體,所述變體還在相應於SEQ ID NO 2的第4、5、12、24、43、44、45、46、47、 49、51、70、75、6、94、100、108、114、116、119、122、124、125、137、141、143、146、148、169、171、 172、175、178、180、181、208、211、228、242、243、245、292、294、197、309、310、313、314、315、 316、317、321、340、341、350、353、356、363、368、369、375、376、395、398、401、408、409、412、 415、418、421、433、436或451位或親本葡糖澱粉酶中等價的位置,包含一個或多個胺基酸 取代。在一些方面,葡糖澱粉酶變體還在相應於SEQ ID N0:2的第4、5、24、29、43、44、49、 70、75、76、100、108、119、124、137、146、148、169、171、172、175、178、181、208、211、243、292、 294、297、314、316、317、340、341、350、356、363、368、369、376、395、401、412、433、436 或 451 位或親本葡糖澱粉酶中等價的位置,包含一個或多個胺基酸取代。在一些方面,葡糖澱粉酶 變體還在相應於 SEQ ID NO 2 的第 5、24、43、44、49、70、75、76、94、119、141、146、148、172、 175、178、180、181、208、211、243、294、309、314、353、369、375 或 409 位或親本葡糖澱粉酶中 等價的位置,包含一個或多個胺基酸取代。在一些方面,葡糖澱粉酶還在相應於SEQ ID NO 2的第43、44或294位或親本葡糖澱粉酶中等價的位置,包含一個或多個胺基酸取代。在本發明的其它方面,葡糖澱粉酶變體在對應於SEQ ID N0:2的N61I、G73F、 1^4171^、143(^/]\^43117035034/¥、0511!^5351 、45391 或陽631/1(的位置中,或親本葡 糖澱粉酶中等價的位置中,包括兩個或多於兩個的胺基酸取代。在一些方面,葡糖澱粉酶變 體還包括一個或多個下列取代SEQ ID NO 2 的 D4L/E/R/S/C/A/Q/W、F5C/M/N/R/S/T/V/W、 I12L/R、D24E/L/Y/T、F29L/I/D/C/S/V/W、I43F/R/D/Y/S/Q、D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C、Y47W、 Y49N、Q70R/K/M/P/G/L/F、Q75R/K/A、R76L/M/K/T/P、P94L、D100W/I/Q/M/P/A/N、N119P/T/ Y/D/E、N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/F/M、Q148V/Y/H/A/C/D/G/M/R/S/T、Y169D/F、Q172C/A/ D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V、F175H/A/G/R/S/T/C/W/Y, W178A/C/D/E/F/G/H/K/N/R/S/T/V/ Y、E180A/C/G/H/I/L/N/P/Q/R/S/T/V/Y/、V181E/C/D/G/H/I/P/T/Y/S/L/K/F/A、Q208L/A/ C/E/N/F/H/T、S211C/R/E/A/Y/W/M/H/L/I/R/Q/T, E243S/R/N/M/Y/A/L、R245A/E/M/I/P/ V、I292D/H/P/R/T/N/V/F/L、G294C/D/E/T/Q/I/A、K297F/L/P/T/M/D/N/Q/A/Y/H/S/R/W、 R309A/C/G/H/1/N/P/Q/S/T/ff/Y/L, Y310E/G/L/P/S/W/R/Q、D313Q、V314A/R/N/D/C/E/Q/G/ H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y、Y315F、Y316Q/R、N317T/H、K340D/T、K341F/D/P/V/G/S、T350S/E/A/N、Q356H/D/E、T363L/R/C/H/W、S368W/D/F/L、S369F、N376Q/T/H/S/V、Y395Q/R/S、A398S/ Ι/Τ、S401C/V、R408S、N409W/T/K、T412A/H/K/G、R433H/Q、Ι436Α/Τ 或 S451M/T/H,或在親本 葡糖澱粉酶中等價的位置中。在一些方面,葡糖澱粉酶變體還包括一個或多個下列取代 SEQ ID NO :2 的 I43F/R/D/Y/S/Q、D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C 或G294C/D/E/T/Q/I/A,或在親本 葡糖澱粉酶中等價的位置中。在一個方面,本公開文本涉及這樣的葡糖澱粉酶,其在對應於SEQ IDNO :2的I43Q/D44C、D44C/G294C、I43Q/G294C 或 I43Q/D44C/G294,或親本葡糖澱粉酶中的等價位置 的位置中包括胺基酸取代。葡糖澱粉酶變體具有與SEQ ID N0:l、2、3、5、6、7、8或9至少 80 %、85 %、90 %、95 %或99. 5 %的序列同一性。在一個實施方案中,親本葡糖澱粉酶具有 與SEQID N0:l、2、3、5、6、7、8或9至少80%序列同一性的催化結構域,或者具有與SEQ ID NO :1或2至少80%序列同一性的澱粉結合結構域。親本葡糖澱粉酶可以是獲得自任意下列屬的物種的酶木黴屬(Trichoderma)、 麴黴屬、腐質黴屬、青黴屬(Penicillium)、踝節菌屬(Talaromycese),或裂殖酵母屬 (Schizosaccharmyces)。在一些方面,親本葡糖澱粉酶可以來自木黴屬或麴黴屬的物種。在一個方面,與親本葡糖澱粉酶相比,變體葡糖澱粉酶表現出改變的熱穩定性。改 變的熱穩定性可以是增加的熱穩定性。可選的,或者此外,變體還表現出與親本葡糖澱粉酶 相比改變的比活性。改變的比活性可以是增加的比活性。本公開文本的另一方面是編碼所述變體的多核苷酸。另一方面是包含多核苷酸的 載體。另一方面是含有載體的宿主細胞。本公開文本的另一方面是包括葡糖澱粉酶變體的酶組合物。在一個方面,酶組合 物用於澱粉轉化過程或醇發酵過程中。發明的另一方面是生產變體葡糖澱粉酶的方法,這是通過在適合葡糖澱粉酶變體 表達和生產的條件下培養含有多核苷酸的宿主細胞,並生產變體。方法還可以包括從培養 物中回收葡糖澱粉酶變體的步驟。附圖簡述圖IA描述了具有632個胺基酸的裡氏木黴葡糖澱粉酶(TrGA)的親本葡糖澱粉酶 (SEQ ID NO :1)。信號肽用下劃線標出,催化區域(SEQ IDNO :3)用粗體標出,開始於胺基酸 殘基SVDDFI (SEQ ID NO 160),具有453個胺基酸殘基;接頭區用斜體標出;澱粉結合結構 域(SEQ IDNO 161)既用斜體又用下劃線標出。成熟的蛋白質由SEQ ID NO :2表示,包括催 化結構域(SEQ ID NO 3)、接頭區域和澱粉結合結構域(SEQ IDNO 161)。圖IB示例了編碼 TrGA 的 cDNA(SEQ ID NO 4)。圖 2 描述了質粒 pDONR-TrGA,其包括親本 TrGA 的 cDNA (SEQ IDNO 4)。圖 3 描述 了質粒 pREP3Y-DEST (A)和 pREP3Y_TrGA (C)。圖4A-4B描述了親本葡糖澱粉酶的催化結構域的比對比較,包括來自泡盛麴黴 (Aspergillus awamori) (AaGA) (SEQ ID NO 5);黑麴黴(Aspergillus niger) (AnGA) (SEQ ID NO 6);米麴黴(Aspergillus orzyae) (AoGA) (SEQ ID NO 7);裡氏木黴(Trichoderma reesei) (TrGA) (SEQ ID NO 3);灰腐質黴(Humicola grisea) (HgGA) (SEQ ID NO 8);和 Hypocrea vinosa(HvGA) (SEQ ID NO 9)的葡糖澱粉酶。用星號⑷指示了相同的胺基酸。圖4C-4D描述了親本葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域(SBD)的比對比較,包括裡氏木黴(TrGA) (SEQ ID NO 161);灰腐質黴(HgGA) (SEQID NO 162);太瑞斯梭孢殼 黴(Thielavia terrestris) (TtGA) (SEQ IDNO 163);疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus) (ThGA) (SEQID NO: 164);埃默森踝節菌(Talaromyces emersonii) (AnGA) (SEQID NO 165);黑麴黴(AnGA) (SEQ ID NO 166);和泡盛麴黴(AaGA) (SEQ ID NO 167)的 葡糖澱粉酶。用點號(.)指示了相同的胺基酸。圖5A描述了質粒pTrex 3g_DEST。圖5B描述了質粒PTrex3g_TrGA。質粒用作表 達載體,用於在裡氏木黴宿主中表達和生產變體葡糖澱粉酶。圖6描述了在60°C和32°C下,親本(野生型)TrGA和變體V314、S211R、Q172F和 Q208N之間的Vmax ( μ M葡萄糖/秒)比較,在實施例8中進一步進行討論。
圖7描述了組合變體對澱粉底物的活性。本文描述的組合變體包括ΕΤ7-1 (D24Y/ V181L/Q208C/G294A/T353R/N375N/N409W)、LR8 (Q172F/Q208N)、LR12 (Q172F/S211R)、 LR6(Q172F/Q208N/V314H)、ΕΤ8-1 (D24E/V181K/E243Y/I292V/G294Q/N409K)禾口 ΕΤ7-2 (Q24L/V181L/Q208C/G294A/T353R/N375Q/N409W)。活性以在 340nm 處作為所示納克 的葡糖澱粉酶變體的函數的吸收單位表示。圖8描述了單位點變體對玉米澱粉底物的活性。本文描述的單位點變體包括 V314H、G294Q、S211R、Q208N、Q172F、G294I 和 P94N。活性以在 340nm 處作為所示納克的葡 糖澱粉酶變體的函數的吸收單位表示。圖 9 描述了 TrGA 和 TrGA 變體 LR8 (Q172F/Q208N)對玉米醪液液化物(Iiquefact) (NE)樣品的葡糖澱粉酶活性。

圖10描述了 TrGA和TrGA變體LR8 (Q172F/Q208N)對玉米醪液液化物(BSE)樣品 的活性譜。圖11描述了 TrGA和TrGA變體LR8 (Q172F/Q208N)對可溶性玉米澱粉底物樣品的
活性譜。圖12是從側面觀察裡氏木黴葡糖澱粉酶(黑色)(SEQ ID NO 2)和泡盛麴黴葡糖 澱粉酶(灰色)三維結構的比較。圖13是從頂部觀察裡氏木黴葡糖澱粉酶(黑色)和泡盛麴黴葡糖澱粉酶(灰色) 三維結構的比較。圖 14A 描述了質粒 pTTT-Dest。圖 14B 描述了質粒 pTTT-TrGA(B)。發明的詳細描述葡糖澱粉酶是在多種需要水解澱粉的應用中,具有商業重要意義的酶。本文描述 的葡糖澱粉酶變體在催化結構域或澱粉結合結構域內含有胺基酸取代。變體可以表現出改 變的性質,例如改善的熱穩定性和/或比活性。具有改善的熱穩定性和/或比活性的變體 可以顯著增加從例如玉米澱粉生產葡萄糖和燃料乙醇的效率。I.定義除非另外定義,本文中使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域技術 人員常規理解的相應術語相同的含義。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,第 2 版,John Wiley and Sons,New York(1994),和 Hale & Markham, THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,N. Y. (1991)為技術人員 提供了本文中使用的許多術語的常規含義。但是,出於清楚和便於參考的原因,下文仍然定義了一些術語。如本文中使用的,術語「葡糖澱粉酶(EC 3. 2. 1. 3) 」指催化從澱粉和相關的寡糖和 多糖的非還原端釋放D-葡萄糖的酶。術語「親本」或「親本序列」指宿主細胞內天然的或天然存在的序列。親本系列包 括但不限於SEQ ID N0:l、2、3、5、6、7、8和9中提出的葡糖澱粉酶序列。 如本文中使用的,「等價的位置」意指基於對所討論的親本葡糖澱粉酶胺基酸序列 以及對所討論的親本葡糖澱粉酶三維結構與TrGA參照葡糖澱粉酶胺基酸序列(SEQ ID NO 2)和三維序列的比對,兩條親本序列共同的位置。術語「TrGA」指具有SEQ ID NO :2中所示成熟蛋白質序列的親本裡氏木黴葡糖澱 粉酶序列,其包括具有SEQ ID NO :3中所示序列的催化結構域。TrGA的分離、克隆和表達 描述在美國專利7,413,887中,其通過引入本文作為參考。在一些實施方案中,親本序列指 作為蛋白質工程起點的葡糖澱粉酶。本文的葡糖澱粉酶胺基酸的編號方式是基於葡糖澱粉 酶與 TrGA(SEQ ID NO 2 禾口 SEQ ID NO 3)的序列比對。詞組「蛋白質或多肽的成熟形態」指蛋白質或多肽的最終功能形態。作為示例, TrGA的成熟形態具有SEQ ID NO :2的胺基酸序列,包括催化結構域、接頭區域和澱粉結合 結構域。如本文中使用的,術語「葡糖澱粉酶變體」和「變體」用於指與親本葡糖澱粉酶序列 具有一定程度的胺基酸序列同一性,並可以保留葡糖澱粉酶的功能特徵的葡糖澱粉酶。變 體與親本序列相似,但在其胺基酸序列中具有至少一個取代、缺失或插入,使其不同於親本 葡糖澱粉酶的序列。在一些情況下,已操作和/或改造變體,使其在其胺基酸序列中具有至 少一個取代、缺失或插入,從而不同於親本的序列。「變體」意指當優化比對進行比較時,與多肽序列具有至少99. 5%、至少99%、至 少98%、至少97%、至少96%、至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91%、至 少90 %、至少88 %、至少85 %、至少80 %、至少75 %、至少70 %,至少65 %、至少60 %、至少 55%、至少50%或至少45%的序列同一性。在一些實施方案中,葡糖澱粉酶變體可以與親 本葡糖澱粉酶的催化結構域具有至少99. 5%、至少99%、至少98%、至少97%、至少96%、 至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91%、至少90%、至少88%、至少85%、至 少80%、至少75%、至少70%,至少65%、至少60%、至少55%、至少50%或至少45%的 序列同一性。在一些實施方案中,葡糖澱粉酶變體可以與親本葡糖澱粉酶的澱粉結合結構 域具有至少99. 5%、至少99%、至少98%、至少97%、至少96%、至少95%、至少94%、至 少93 %、至少92 %、至少91%、至少90 %、至少88 %、至少85 %、至少80 %、至少75 %、至少 70 %,至少65 %、至少60 %、至少55 %、至少50 %或至少45 %的序列同一性。可以在親本或 變體序列的全長測量序列同一性。使用本領域已知的標準技術確定序列同一性(參見例如,Smith和Waterman, Adv. App 1. Math. 2 482 (1981) ;Needleman 禾口 Wunsch,J. Mol. Biol. 48 443 (1970) ;Pearson 和 Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 2444(1988);程序例如 Wisconsin Genetics Software Package (GeneticsComputer Group, Madison, WI)中的 GAP、BESTHT、FASTA 禾口 TFASTA ;以及 Devereux 等人,Nucleic Acid Res.,12 :387_395 (1984))。「百分比(% )核酸序列同一性」或「百分比(% )胺基酸序列同一性」定義為候選序列中與起始序列(例如,TrGA)的核苷酸殘基或胺基酸殘基相同的核苷酸殘基或胺基酸 殘基的百分比。可以在起始序列(例如,SEQ ID NO 2)的全長上測量序列同一性。通過已知的序列比對方法確定序列同一性。常用的比對方法是Altschul等人描 述的 BLAST (Altschul 等人,J. Mol. Biol. 215 :403_410 (1990);禾口 Karlin 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787 (1993))。特別有效的 BLAST 程序是 WU-BLAST-2 程序(參見, Altschul 等人,Meth. Enzymol. 266 460-480 (1996)) WU-BLAST-2 利用 了一些搜索參數,其 中大部分都設定為預設值。用下列值設定可調節的參數重疊跨度(overlap span) = 1, 重疊分數(overlap fraction) = 0. 125,字節閾值(word threshold) = 11。HSP S 和 HSP S2參數是動態值,由程序本身根據特定序列的組成和進行目標序列搜索的特定資料庫的組 成來決定。然而,可以調節值來增加靈敏度。%胺基酸序列同一性值是由匹配相同的殘基 數除以比對區域內「較長」序列的殘基總數確定的。「較長」序列是在比對區域內具有最多 真實殘基的序列(忽視為了使比對分數最大化,由WU-Blast-2引入的空位)。其它方法也可以用於比對序列。一個有效算法的實例是PILEUP。PILEUP利用漸進 式成對比對,從一組相關序列中創建多重序列比對。它還可以繪製顯示群關係的樹圖,用於 創建比對。PILEUP利用了 Feng和Doolittle的漸進比對方法的簡化版(Feng和Doolittle, J. Mol. Evol. ,35 :351-360[1987])。所述方法與 Higgins 和 Sharp 描述的相似(Higgins 和 Sharp,CABIOS 5 151-153 [1989])。有用的PILEUP參數包括預設的空位權重3. 00,預設的 空位長度權重0. 10,和加權的末端空位。術語「優化比對」指產生最高百分比同一性分數的比對。如本文中使用的,術語「催化結構域」指多肽的結構性區域,其含有用於底物水解 的活性位點。術語「接頭」指通常具有3至40個胺基酸殘基之間的短胺基酸序列,其共價的連 接了包含澱粉結合結構域的胺基酸序列,和包含催化結構域的胺基酸序列。術語「澱粉結合結構域」指優選地與澱粉底物結合的胺基酸序列。如本文中使用的,術語「突變序列」和「突變基因」是可互換的使用的,指這樣的多 核苷酸序列,其具有存在於宿主細胞的親本序列中至少一個密碼子的改變。突變序列的表 達產物是相對於親本具有改變的胺基酸序列的變體蛋白質。表達產物可以具有改變的功能 能力(例如增加的酶活)。如本文中使用的,對於多肽,術語「性質」或其語法的等價體指可以被選擇或檢測 的多肽的任何性質或屬性。這些性質包括但不限於,氧化穩定性、底物特異性、催化活性、熱 穩定性、PH活性譜、蛋白水解的 耐受性、KM、Kcat, Kcat/Km比值、蛋白質摺疊、結合底物的能力 和分泌的能力。如本文中使用的,對於核酸,術語「性質」或其語法的等價體指可以被選擇或檢測 的核酸的任何性質或屬性。這些性質包括但不限於,影響基因轉錄的性質(例如啟動子強 度或啟動子識別),影響RNA加工的性質(例如RNA剪切和RNA穩定性),影響翻譯的性質 (例如調控,mRNA與核糖體蛋白質的結合)。術語「熱學上穩定的」和「熱穩定的」指本發明的葡糖澱粉酶變體,在暴露於一定 溫度下給定時間段後,仍然維持規定量的酶活性,其中處於在澱粉底物水解過程中常見的 條件下,例如暴露在改變的溫度下。
在涉及例如熱穩定性的性質時,術語「增加的穩定性」指經過一段時間後,與另一 個參照(即親本)葡糖澱粉酶相比,保留較高的澱粉水解活性。在涉及例如熱穩定性的性質時,術語「減少的穩定性」指經過一段時間後,與另一 個參照葡糖澱粉酶相比,保留較低的澱粉水解活性。術語「比活性」定義為每毫克葡糖澱粉酶蛋白質的活性。在一些實施方案中,通過本文描述的乙醇檢測法來測定葡糖澱粉酶的活性,表示為從澱粉底物產生的葡萄糖的量。 在一些實施方案中,可以使用本文描述的Caliper檢測法來測定蛋白質濃度。術語「活性」和「生物學活性」指與特定蛋白質相關的生物學活性。給定蛋白質的 生物學活性指本領域技術人員歸屬於所述蛋白質的任何生物學活性。例如,與葡糖澱粉酶 相關的酶活性是水解的,因此,活性葡糖澱粉酶具有水解活性。在本文中,術語「多核苷酸」和「核酸」可互換使用,指任意長度的核苷酸的多聚合 形式,不論是核糖核苷酸還是脫氧核糖核苷酸。這類術語包括但不限於單鏈、雙鏈或三鏈 DNA,基因組DNA,cDNA, RNA, DNA-RNA雜合體或包含嘌呤和嘧啶鹼基,或者其它天然、化學、 生物化學修飾的,非天然或衍生的核苷酸鹼基的聚合物。如本文中使用的,術語「DNA構建體」、「轉化DNA」和「表達載體」可互換使用,指用 於將序列引入宿主細胞或生物內的DNA。DNA可以通過PCR或任何其它本領域技術人員已 知的合適技術在體外產生。DNA構建體,轉化DNA或重組表達盒可以整合到質粒、染色體、線 粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常,表達載體、DNA構建體或轉化DNA的重組表 達盒部分包括將被轉錄的核酸序列和啟動子。在一些實施方案中,表達載體具有在宿主細 胞內摻入和表達異源DNA片段的能力。如本文中使用的,術語「載體」指設計用於將核酸引入一種或多種細胞類型中的多 核苷酸構建體。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、盒等。如本文中使用的,涉及將核酸序列引入細胞時,術語「引入」指適合將核酸序列轉 移到細胞內的任何方法。此類用於引入的方法包括但不限於原生質體融合、轉染、轉化、接 合和轉導。如本文中使用的,術語「轉化的」和「穩定轉化的」指這樣的細胞,所述細胞具有整 合到其基因組內,或作為附加體質粒維持至少兩代的非天然的(異源的)多核苷酸序列。如本文中使用的,術語「選擇性標記」和「選擇標記」指能夠在宿主細胞內表達的 核酸(例如基因),其允許方便的選擇含有載體的宿主。通常,選擇性標記是使宿主細胞 產生抗生素抗性或代謝優勢的基因,使含有外源DNA的細胞區別於在轉化過程中未接受任 何外源序列的細胞。如本文中使用的,術語「啟動子」指發揮指導下遊基因轉錄的功能的核酸序列。啟 動子,以及其它轉錄和翻譯調控核酸序列(也被稱為「控制序列」)是表達給定基因必需的。 一般,轉錄和翻譯調控序列包括但不限於啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序 列、翻譯起始和終止序列,以及增強子或激活子序列。當核酸與另一核酸序列處於功能性關聯時,它是「有效連接的」。例如,如果表達為 參與多肽分泌的前蛋白,則編碼分泌前導序列(即,信號肽)的DNA與多肽的DNA是有效連 接的。一般,「有效連接」意指所連接的DNA序列是連續的,在分泌前導序列的情況下,是連 續的且處於閱讀相(reading phase)。
如本文中使用的,術語「基因」指編碼多肽的多核苷酸(例如DNA片段),包括在 編碼區域前後的區域,和位於單個編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內含子)。如本文中使用的,「直向同源物」和「直向同源基因」指不同物種中從共同祖先基因 (即,同源基因)通過物種形成進化成的基因。通常,直向同源物在進化過程中保留了相同 的功能。直向同源物的鑑別可用於對新測序基因組中的基因功能進行可靠預測。 如本文中使用的,「旁系同源物」和「共生同源基因」指基因組內通過複製相關的基 因。直向同源物在進化過程中保留了相同的功能,而旁系同源物則進化出新的功能,雖然一 些功能通常是與原始功能相關的。共生同源基因的實例包括但不限於編碼胰蛋白酶、胰凝 乳蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因,它們都是絲氨酸蛋白酶,並同時存在於相同的物種 內。如本文中使用的,如本領域已知的,術語「雜交,,指核酸鏈通過鹼基配對與互補鏈 結合的過程。如果在中至高嚴謹雜交和洗滌條件下,兩條序列特異的彼此雜交,則認為核酸序 列與參照核酸序列是「選擇性可雜交的」。雜交條件是基於核酸結合複合體或探針的解鏈溫 度(Tffl)的。例如,「最大嚴謹」通常發生在約Tm-5°C (比探針的Tm低5°C);「高嚴謹」比Tm 低約5-10°C ;「中等嚴謹」比探針的Tffl低約10-20°C ;「低嚴謹」比Tffl低約20-250C。從功能 上講,最大嚴謹條件可用於鑑別與雜交探針具有嚴格同一性或接近嚴格同一性的序列;而 中等或低嚴謹條件可用於鑑別或檢測多核苷酸序列同源物。中等和高嚴謹雜交條件是本領域普遍已知的。高嚴謹條件的實例包括在約42°C 下,在50%甲醯胺、5XSSC、5XDenhardt氏溶液、0. 5% SDS和100 μ g/ml變性的載體DNA 中雜交,然後在室溫用2 X SSC和0. 5% SDS洗滌兩次,在42 °C用0. IX SSC和0.5% SDS再 洗滌兩次。中等嚴謹條件的實例包括在37°C下,在包含20%甲醯胺、5XSSC(150mM NaCl, 15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7. 6)、5XDenhardt氏溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ml 變性的剪切鮭精DNA中雜交過夜,然後在約37-50°C,用IXSSC洗滌濾膜。本領域技術人員 已知當需要適應例如探針長度等因子時,如何調節溫度、離子強度等。如本文中使用的,「重組」包括涉及細胞或載體,其已通過引入異源或同源的核酸 序列而修飾,或者細胞從所述修飾的細胞衍生而來。因此,例如,作為人類有意幹預的結果, 重組細胞表達在天然(非重組)形態的細胞中未發現相同形態的基因,或表達天然基因,其 否則異常表達,低表達或根本不表達。在本發明的實施方案中,在至少一個密碼子上用位點飽和誘變來產生突變的DNA 序列。在另一個實施方案中,位點飽和誘變實施於兩個或更多的密碼子。在其它的實施方 案中,突變DNA序列與親本序列具有多於50%,多於55%,多於60%,多於65%,多於70%, 多於75%,多於80%,多於85%,多於90%,多於95%,或者多於98%的同源性。在可選的 實施方案中,利用任何已知的突變方法在體內產生突變DNA,例如輻射、亞硝基胍等。然後 分離所需的DNA序列並用於本文中提供的方法。如本文中使用的,「異源蛋白質」指在宿主細胞內非天然存在的蛋白質或多肽。如果酶在細胞內表達的水平比在相應的野生型細胞內表達的水平更高,則酶在宿 主細胞內是「過表達」的。術語「蛋白質」和「多肽」在本文中可互換使用。在本公開文本和權利要求中,胺基酸使用常規的三字母和一字母代碼。胺基酸的3字母代碼與IUPAC-IUB生物化學命名聯合委員會(JCBN) —致。還應理解,由於遺傳密碼的簡併性,多肽可以由一個以上核苷酸序 列編碼。公開文本的變體按以下命名法描述[原始胺基酸殘基/位置/取代的胺基酸殘 基]。例如,亮氨酸取代第76位的精氨酸表示為R76L。當在一個給定位置取代多個胺基酸 時,取代表示為1) Q172C、Q172D或Q172R ;2) Q172C、D、或R或3) Q172C/D/R。當本文中鑑別 的適合取代的位置沒有提示特定的胺基酸時,應該理解任何胺基酸都可以取代所述位置上 出現的胺基酸殘基。當變體葡糖澱粉酶與其它葡糖澱粉酶相比,含有缺失時,用「*」表示缺 失。例如,R76位的缺失表示為R76*。兩個或多個連續的胺基酸的缺失表示為例如(76-78廣。「前序列」是位於信號肽和成熟蛋白質之間的胺基酸序列,是蛋白質分泌必需的。 前序列的切除可獲得成熟的活性蛋白。術語「信號序列」或「信號肽」指任何參與成熟蛋白質或蛋白質前體形態分泌的核 苷酸和/或胺基酸序列。該信號序列的定義是功能性的,意指包括由蛋白質基因的N-末端 部分編碼的所有胺基酸序列,其參與實現蛋白質的分泌。它們通常,但並非全部,結合在蛋 白質的N-末端部分,或結合在前體蛋白質的N-末端部分。信號序列可以是內源的或外源 的。信號序列可以是一般與蛋白質相關的(例如葡糖澱粉酶),或者可以是來自另一個編 碼分泌蛋白的基因。術語蛋白質或肽的「前體」形態指成熟形態的蛋白質,其具有與蛋白質的氨基端或 羧基端有效連接的前序列。前體還可以具有與前序列的氨基端有效連接的「信號」序列。前 體還可以具有在翻譯後活性中涉及的其它多核苷酸(例如從其上切除以留下成熟形態的 蛋白質或肽的多核苷酸)。「宿主株」或「宿主細胞」指適合含有根據本公開文本的DNA的表達載體的宿主。術語「來自」和「獲得自,,不僅指由討論的生物的株生產或可生產的葡糖澱粉酶, 而且還指由從此類株中分離的DNA序列編碼,並在含有此類DNA序列的宿主生物中生產的 葡糖澱粉酶。此外,術語還指由合成的和/或cDNA起源的DNA序列編碼的葡糖澱粉酶,並 具有討論的葡糖澱粉酶的已鑑別的特徵。在該定義範圍內的「衍生物」一般保留了在野生型、天然或親本形態中觀察到的特 徵性水解活性,達到使衍生物可用於與野生型、天然或親本形態相似目的的程度。葡糖澱粉 酶的功能衍生物涵蓋了天然存在的、合成或重組生產的肽或肽片段,其具有本發明的葡糖 澱粉酶的一般特徵。術語「分離的」指如果其是天然存在的,則從其天然環境中移出的材料。「純化的」蛋白質指至少部分純化為均質的蛋白質。在一些實施方案中,通過 SDS-PAGE確定,純化的蛋白質是超過10 %純的,任選的超過20 %純的,任選的超過30 %純 的。公開文本的其它方面涵蓋了通過SDS-PAGE確定,高度純化形態的蛋白質(S卩,超過40% 純的,超過60%純的,超過80%純的,超過90%純的,超過95%純的,超過97%純的,甚至超 過99%純的)。如本文中使用的,術語「組合誘變」指產生起始序列的變體文庫的方法。在這類文 庫中,變體含有選自預定義的突變集合的一個或多個突變。此外,方法提供引入隨機突變 的方式,所述突變不是預定義的突變集合的成員。在一些實施方案中,方法包括在US專利6,582,914中提出的,其通過引入本文作為參考。在可選的實施方案中,組合誘變方法涵蓋 了可商購的試劑盒(例如QuikChange Multisite,Stratagene, San Diego, CA)。如本文中使用的,術語「突變體文庫」指其基因組大部分相同,但包括一個或多個 基因的不同同源物的細胞群體。此類文庫可用於,例如,鑑別具有改善性狀的基因或操縱 子。如本文中使用的,術語「乾燥固體含量(DS或ds) 」指的是漿液的總固體基於乾重 的百分比。如本文中使用的,術語「初始命中(initial hit) 」指通過篩選組合共同誘變文庫 鑑別的變體。在一些實施方案中,與起始基因相比,初始命中具有改良的性能特徵。如本文中使用的,術語「改良命中(improved hit) 」指通過篩選增強的組合共同誘 變文庫鑑別的變體。如本文中使用的,術語「目標性質(target property) 」指待改變的起始基因的性 質。其不意味著本發明限於任何特定的目標性質。然而,在一些優選的實施方案中,目標特 性是基因產物的穩定性(例如對變性、蛋白水解或其它降解因素的抗性),而在其他實施 方案中,生產宿主中的生產水平得到改變。事實上,預期起始基因的任何特性都在本發明中 得到應用。其它術語定義也可以出現在說明書的全文。當提供數值範圍時,除非上下文另外清楚的指出,應理解為該範圍上下限之間的 每個中間值(到下限單位的十分之一),也都是具體公開的。任何陳述值之間的每個更小範 圍或陳述範圍內的中間值和任何其它公開的或所述公開範圍內的中間值都包括在本發明 內。這些更小範圍的上限或下限可以獨立地包括於或排除於該範圍,兩個端點之一,兩個端 點都不或都包括在更小範圍的每個範圍也包括在本發明之內,其受限於公開範圍內任何具 體排除的界限。如果公開的範圍包括一個或兩個端點,排除一個或者兩個所述被包括端點 的範圍也包括在本發明內。在詳細描述示例性的實施方案之前,還應理解本發明不限於所描述的特定的實施 方案,其當然可以變化。與本文公開的內容相似或等價的任何方法和材料都可用於實踐或 測試本公開文本,但目前仍描述了示例性的方法和材料。除非上下文另外清楚的指出,如本文中和所附權利要求中使用的單數形態「一 個」、「一種」和「這」都包括了複數的指示物。因此,例如,討論「基因」包括了複數的此類候 選物質,討論「細胞」包括了討論一個或多個細胞及其本領域技術人員已知的等價物,等等。本文中討論的出版物只有其公開早於本申請的申請日,才被提供。本文不承認本 發明無權由於是在先發明而早於此類出版物。2、親本葡糖澱粉酶在一些實施方案中,本發明提供 了葡糖澱粉酶變體。葡糖澱粉酶變體是親本葡糖 澱粉酶的變體,其同時包括催化結構域和澱粉結合結構域。在一些實施方案中,親本葡糖澱 粉酶包括這樣的催化結構域,所述結構域具有SEQ ID N0:l、2、3、5、6、7、8或9中所示的氨 基酸序列,或者具有與SEQ ID N0:l、2、3、5、6、7、8或9中所示一個或多個胺基酸序列有至 少80%序列同一性的胺基酸序列。在其他實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括由這樣的DNA 序列編碼的催化結構域,所述DNA序列在中、高或嚴謹條件下與編碼葡糖澱粉酶催化結構 域的DNA雜交,所述葡糖澱粉酶具有SEQ IDNO :1、2或3之一的胺基酸序列。
在一些實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括這樣的澱粉結合結構域,所述結構域具 有SEQ ID NO :1、2、161、162、163、164、165、166或167中所示的胺基酸序列,或者具有與SEQ ID NO 1、2、161、162、163、164、165、166或167所示一個或多個胺基酸序列有至少80%序列 同一性的胺基酸序列。在其他實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括由這樣的DNA序列編碼的 澱粉結合結構域,所述DNA序列在中、高或嚴謹條件下與編碼葡糖澱粉酶澱粉結合結構域 的DNA雜交,所述葡糖澱粉酶具有SEQ ID NO :1或2之一的胺基酸序列。
在真菌物種之間,葡糖澱粉酶的預測結構和已知序列都是保守的(Coutinho等 人,1994 Protein Eng.,7 :393_400 和 Coutinho 等人,1994,Protein Eng.,7 :749_760)。 在一些實施方案中,親本葡糖澱粉酶是絲狀真菌的葡糖澱粉酶。在一些實施方案中,親本 葡糖澱粉酶是獲得自木黴屬菌株(例如裡氏木黴、長梗木黴(T. longibrachiatum)、嚴 緊木黴(T. strictipilis)、棘孢木黴(T. asperellum)、康長木黴(T. konilangbra)和哈 茨木黴(T.hazianum)),麴黴屬菌株(例如黑麴黴(A. niger)、構巢麴黴(A. nidulans)、 A. kawachi、泡盛曲霄(Aspergillus awamori)禾口米曲霄(A. orzyae)),碟節菌屬菌株(例 如埃默森踝節菌(T. emersonii),溼熱踝節菌(T. thermophilus)和T. duponti),肉座菌 屬(Hypocrea)菌株(例如膠質肉座菌(H. gelatinosa),東方肉座菌(H. orientalis), H. vinosa和淡黃肉座菌(H. citrina)),鐮孢屬菌株(例如尖鐮孢(F. oxysporum)、粉 紅鐮孢(F.roseum)和腹狀鐮孢(F. venenatum)),脈孢屬(Neurospora)菌株(例如粗 糙脈孢菌(N. crassa))和腐質黴屬菌株(例如灰腐質黴、特異腐質黴(H. insolens) 和麵包腐質黴(H. Ianuginose)),青黴屬菌株(例如點青黴(P. notatum)或產黃青黴 (P. chrysogenum)),或者復膜孢酵母屬菌株(例如扣囊復膜孢酵母(S. f ibuligera)) 0在一些實施方案中,親本葡糖澱粉酶可以是細菌葡糖澱粉酶,例如,多肽可 以獲得自革蘭氏陽性菌株例如芽孢桿菌屬(例如嗜鹼芽孢桿菌(B.alkalophilus)、 解澱粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)、遲緩芽胞桿菌(B. Ientus)、地衣芽胞桿菌 (B. Iicheniformis)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(B. stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌和蘇雲金 芽孢桿菌),或鏈黴屬菌株(例如淺青紫鏈黴菌(Sti^ptomyces Iividans)) 0在一些實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括催化結構域,所述結構域與SEQ ID NO 3的TrGA胺基酸序列的催化結構域具有至少80%序列同一性,至少85%序列同一性,至少 90%序列同一性,至少95%序列同一性,至少97%序列同一性,至少98%序列同一性。在其它實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括催化結構域,所述結構域具有與SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6的麴黴屬親本葡糖澱粉酶的催化結構域至少90%序列同一性,至少 93%序列同一性,至少95%序列同一性,至少96%序列同一性,至少97%序列同一性,至少 98%序列同一性,和至少99%序列同一性。在其它實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括催化結構域,所述結構域具有與SEQ ID NO :8的灰腐質黴親本葡糖澱粉酶(HgGA)的催化結構域至少90%序列同一性,至少95%序 列同一性,至少97%序列同一性,和至少99%序列同一性。在一些實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括澱粉結合結構域,所述結構域具有與SEQ ID NO :1、2或161的TrGA胺基酸序列的澱粉結合結構域至少80%序列同一性,至少85%序 列同一性,至少90%序列同一性,至少95%序列同一性,至少97%序列同一性,和至少98% 序列同一性。
在其它實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括澱粉結合結構域,所述結構域具有與SEQ ID NO 162的灰腐質黴葡糖澱粉酶(HgGA)的催化結構域至少90%序列同一性,至少95% 序列同一性,至少97%序列同一性,和至少99%序列同一性。在其它實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括澱粉結合結構域,所述結構域具有與SEQ ID NO: 163的太瑞斯梭孢殼黴葡糖澱粉酶(TtGA)的催化結構域至少90%序列同一性,至少 95%序列同一性,至少97%序列同一性,和至少99%序列同一性。 在其它實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括澱粉結合結構域,所述結構域具有與SEQ ID NO 164的疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)葡糖澱粉酶(ThGA)的催化 結構域至少90%序列同一性,至少95%序列同一性,至少97%序列同一性,和至少99%序 列同一性。在其它實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括澱粉結合結構域,所述結構域具有與SEQ ID NO :165的埃默森踝節菌(Talaromyces emersoniit)葡糖澱粉酶(TeGA)的催化結構域 至少90%序列同一性,至少95%序列同一性,至少97%序列同一性,和至少99%序列同一性。在其它實施方案中,親本葡糖澱粉酶包括澱粉結合結構域,所述結構域具有與SEQ ID NO 166或167的麴黴屬親本葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域至少90%序列同一性,至少 93%序列同一性,至少95%序列同一性,至少96%序列同一性,至少97%序列同一性,至少 98%序列同一性和至少99%序列同一性。在一些實施方案中,親本葡糖澱粉酶具有與SEQ ID NO 2的TrGA胺基酸序列至少 80%序列同一性,至少85%序列同一性,至少88%序列同一性,至少90%序列同一性,至少 93%序列同一性,至少95%序列同一性,至少96%序列同一性,至少97%序列同一性,至少 98%序列同一性和至少99%的序列同一性。在其它實施方案中,可以自木黴屬或肉座菌屬菌株中獲得木黴屬葡糖澱粉酶的同 源物。一些優選的木黴屬葡糖澱粉酶同源物描述在美國專利7,413,887中,特別涉及所述 文獻中SEQ ID NOs 17-22和43-47所示的胺基酸序列。在一些實施方案中,親本葡糖澱粉酶是包含SEQ ID N0:2的胺基酸序列的TrGA, 或與TrGA序列(SEQ ID NO 2)具有至少80%,至少85%,至少88%,至少90%,至少93%, 至少95 %,至少96 %,至少97 %,至少98 %,至少99 %序列同一性的木黴屬葡糖澱粉酶同源 物。可以使用標準的重組DNA技術分離和/或鑑別親本葡糖澱粉酶。可以使用的任何 標準技術都是本領域技術人員已知的。例如,可以使用特異性針對葡糖澱粉酶保守區的探 針和/或引物來鑑別細菌或真菌細胞中的同源物(催化結構域,活性位點等)。可選的,可 以使用簡併PCR來鑑別細菌或真菌細胞中的同源物。在一些情況下,可以分析例如資料庫 中的已知序列與某一已知葡糖澱粉酶(包括SEQ ID NO 2)或已知澱粉結合結構域(包括 SEQ ID N0:161)的序列和/或結構同一性。還可以使用功能性測定來鑑別細菌或真菌細 胞中的葡糖澱粉酶活性。可以分離並反向測序具有葡糖澱粉酶活性的蛋白質,來分離相應 的DNA序列。此類方法是本領域技術人員已知的。3、葡糖澱粉酶結構同源性分子生物學的中心法則是,編碼特定酶的基因的DNA序列,決定蛋白質的胺基酸序列,該序列依次決定酶的三維摺疊。該摺疊將分離的殘基放到一起,形成催化中心和底物 結合表面,從而獲得所討論的酶的高特異性和活性。葡糖澱粉酶由三個不同的結構域組成,約450個殘基的催化結構域(其在所有葡 糖澱粉酶中都是結構上保守的),一般連接了由30至80個殘基組成的接頭區域,後者連接 至約100個殘基的澱粉結合結構域上。具有所有三個完整區域的裡氏木黴葡糖澱粉酶的結 構在本文中確定至1. 8埃解析度(參見表20和實施例13)。利用坐標(參見表20),將結 構與以前確定的泡盛麴黴菌株XlOO的催化結構域坐標進行比對(AleShin,A. Ε. ,Hoffman, C. , Firsov, L. Μ.,禾口 Honzatko, R. B.1994 Refined crystal structures ofglucoamylase from Aspergillus awamori var. X100. J Mol Biol 238:575-591)。泡盛麴黴的晶體結構 僅包括催化結構域。如圖12和13中所見,催化結構域的結構重疊非常緊密,基於該結構重 疊能夠鑑別等價的殘基。發明人相信,所有的葡糖澱粉酶共享圖12和13中描述的基本結 構。圖12是從側面觀察,SEQ ID NO=I的木黴屬葡糖澱粉酶(黑色)(胺基酸序列參 見圖1)和泡盛麴黴葡糖澱粉酶(灰色)的三維結構比較。在此觀察中可見催化結構域、接 頭區域和澱粉結合結構域之間的關係。圖13是從頂面觀察,木黴屬葡糖澱粉酶(黑色)和泡盛麴黴葡糖澱粉酶(灰色) 的三維結構比較。圖中所示的葡糖澱粉酶,和實際上目前所有已知的葡糖澱粉酶都享有該 結構同源性。結構的保守與所有葡糖澱粉酶的活性的保守和保守的作用機制相關。考慮到 該高同源性,引起功能變化的木黴屬葡糖澱粉酶位點特異性突變所導致的改變,將也具有 在其它葡糖澱粉酶中相似的結構,從而具有相似的功能結果。因此,何種變體產生理想優勢 的教導可用於其它葡糖澱粉酶。使用表20中的坐標還對澱粉結合結構域(SBD)生成了晶體結構。將TrGA的SBD 與黑麴黴的SBD進行比對。如圖13所示,黑麴黴和TrGA SBD的結構重疊緊密。發明人相 信,所有的澱粉結合結構域共享至少部分的圖13中所示的基本結構,而一些SBD在結構上 比其他的更相似。例如,TrGASBD可以分類在CAZY資料庫(cazy.org)的碳水化合物結合 模塊20家族中。CAZY資料庫描述了酶的結構相關的催化和碳水化合物結合模塊(或功能 性結構域)的家族,所述酶降解、修飾或創造糖苷鍵。考慮到高的結構同源性,引起功能變 化的TrGA SBD的位點特異性變體也將具有在其它具有與TrGA SBD結構相似的SBD (特別 是分類在碳水化合物結合模塊20家族中的那些)的葡糖澱粉酶中相似的結構,從而具有相 似的功能結果。因此,何種變體產生理想優勢的教導可用於具有結構相似性的其它SBD。因此,本文中討論的胺基酸位置數指那些指定給圖1所示成熟的裡氏木黴葡糖澱 粉酶序列的位置數。然而,本發明不限於木黴屬葡糖澱粉酶的變體,而延伸至包含這樣的 位置上的胺基酸殘基 的葡糖澱粉酶,所述位置上的胺基酸殘基與裡氏木黴葡糖澱粉酶(SEQ ID NO 2)中特定的已鑑別殘基是「等價的」的。在本公開文本的實施方案中,親本葡糖澱粉 酶是踝節菌屬葡糖澱粉酶,在踝節菌葡糖澱粉酶中等價的胺基酸殘基位置上如本文所述進 行取代。在其它實施方案中,親本葡糖澱粉酶是表1中列舉的任一個。在其它實施方案中, 親本葡糖澱粉酶是青黴屬葡糖澱粉酶,例如產黃青黴。結構同一性決定胺基酸殘基是否是等價的。結構同一性是當比對兩個結構(三維 和胺基酸結構)時,一對一的拓撲學等價。如果與裡氏木黴葡糖澱粉酶中的特定殘基或所述殘基的部分是同源(即,初級或三級結構中相應的位置)或者同功的(具有相同或相似的化學結合、反應或相互作用的功能能力),則葡糖澱粉酶的(胺基酸)殘基位置與裡氏木 黴葡糖澱粉酶的殘基是等價的。為了建立初級結構的同一性,可以將葡糖澱粉酶的胺基酸序列與裡氏木黴葡糖澱 粉酶的初級結構直接比較,特別是直接比較在序列已知的葡糖澱粉酶中已知不變的殘基集 合。例如,本文中的圖4A和B顯示了葡糖澱粉酶之間的保守殘基。本文中的圖4C和D顯示 了不同的葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域的比對。在比對保守殘基後,允許進行必要的插入 和刪除從而維持比對(即,避免通過隨意的刪除和插入而除去保守殘基),定義與裡氏木黴 葡糖澱粉酶的初級序列中特定胺基酸等價的殘基。保守殘基的比對典型地應該保守100% 的此類殘基。然而大於75%或少至50%的保守殘基的比對,也足以定義等價殘基。此外, 可以結合使用結構同一性和序列同一性來鑑別等價的殘基。例如,在圖4A和B中,比對了來自六種生物的葡糖澱粉酶的催化結構域,提供氨基 酸序列之間的最大量同源性。這些序列的比較顯示,每個序列中都含有多個保守殘基,用星 號指示。因此,這些保守殘基可用於在其它葡糖澱粉酶,例如來自黑麴黴的葡糖澱粉酶中, 定義與裡氏木黴葡糖澱粉酶相應的等價胺基酸殘基。相似的,圖4C和D顯示了比較來自7 種生物的葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域,來鑑別等價的殘基。結構同一性涉及在兩個結構之間等價殘基的鑑別。對於酶,可以通過在酶三級結 構水平上測定同源性(結構同一性)來定義「等價殘基」,所述酶的三級結構已經通過X射 線晶體學確定。等價殘基定義為,在比對後,與裡氏木黴葡糖澱粉酶(N對N,CA對CA,C對 C和0對0)的特定胺基酸殘基的兩個或多個主鏈原子的原子坐標在0. 13nm之內,優選的 在0. Inm之內的那些殘基。在將最佳模型定向和定位,使所討論的葡糖澱粉酶與裡氏木黴 葡糖澱粉酶的非氫蛋白質原子的原子坐標產生最大重疊之後,實施比對。最佳模型是在可 獲得的最高解析度下,對實驗衍射數據產生最低R因子的晶體學模型。
及因子=∑n|Fo(h)|-|Fc(h)|/∑h|Fo(h)|與裡氏木黴葡糖澱粉酶的特定殘基功能性類似的等價殘基定義為酶的那些氨基 酸,其可以採用這樣的構象,使得其以確定的和屬於裡氏木黴葡糖澱粉酶特定殘基的方式 改變,修飾或者促進蛋白質結構、底物結合或催化。進而,它們是酶(已經通過X射線晶體 學獲得了三級結構)的殘基,所述殘基佔據同功位置到這樣的程度儘管給定殘基的主鏈 原子可能不滿足以佔據同源位置為基礎的等價標準,但是該殘基的至少兩個側鏈原子的原 子坐標位於裡氏木黴葡糖澱粉酶相應側鏈原子的0. 13nm內。表15中提出了裡氏木黴屬葡 糖澱粉酶的三維結構的坐標,其可以如上述使用以確定三級結構水平上的等價殘基。一些鑑別用於取代的殘基是保守殘基,而另一些不是。在殘基不保守的情況下,一 個或多個胺基酸的取代被限於這樣的取代,其產生的變體具有與天然發現的序列不一致的 胺基酸序列。在保守殘基的情況下,此類取代不應當獲得天然存在的序列。4、變體根據本公開文本的變體包括在親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列中至少一個取代、缺 失或插入,使變體與親本葡糖澱粉酶的序列不同。在一些實施方案中,公開文本的變體具有SEQ ID NO :2的TrGA活性的至少20%、至少40%、至少60%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%和至少100%的葡糖澱粉酶活性。在一些實施方案中,根據本發明的變體包含在親本TrGA(SEQ IDNO :2)的至少一 個胺基酸位置上,或者在另一個親本葡糖澱粉酶序列的等價位置上的取代、缺失或插入,所 述另一個親本葡糖澱粉酶具有和TrGA序列至少80%的序列同一性,包括但不限於至少 90%、至少93%、至少95%、至少97%和至少99%序列同一性。
在其它實施方案中,根據公開文本的變體包含在親本TrGA片段的至少一個氨基 酸位置上的取代、缺失或插入,其中片段包含TrGA序列的催化結構域(SEQ ID N0:3),或者 在下述片段的等價位置上的所述取代、缺失或插入,所述片段包含親本葡糖澱粉酶的催化 結構域,其與TrGA序列的片段具有至少80%的序列同一性,包括但不限於至少90%、至少 95%、至少97%和至少99%序列同一性。在一些實施方案中,片段包含至少400、425、450 和/或500個胺基酸殘基。在其它實施方案中,根據公開文本的變體包含在親本TrGA片段的至少一個氨基 酸位置上的取代、缺失或插入,其中片段包含TrGA序列的澱粉結合結構域(SEQ ID NO 161),或者在下述片段的等價位置上的所述取代、缺失或插入,所述片段包含親本葡糖澱粉 酶的澱粉結合結構域,其與TrGA序列的片段具有至少80%的序列同一性,包括但不限於至 少90%、至少95%、至少97%和至少99%序列同一性。在一些實施方案中,片段包含TrGA 澱粉結合結構域(SEQ ID NO 161)的至少40、50、60、70、80、90、100和/或109個胺基酸殘 基。在一些實施方案中,當親本葡糖澱粉酶包括催化結構域、接頭區域和澱粉結合結 構域時,變體將在包括部分接頭區域的片段的至少一個胺基酸位置上包括取代、缺失或插 入。在一些的實施方案中,在TrGA序列(SEQID NO 2)片段的胺基酸序列中,變體可以包括 取代、缺失或插入。關於胺基酸取代的結構同一性,意指取代發生在同源葡糖澱粉酶或親本葡糖澱粉 酶中的等價胺基酸位置上。術語等價位置意指兩個親本序列共有的位置,這是基於討論的 親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列以及三維結構與TrGA序列葡糖澱粉酶的胺基酸序列和三維 結構的比對。例如,參考圖5,TrGA (SEQ ID N0:2或3)中的位置24是D24,黑麴黴(SEQ ID NO 6)的等價位置是位置D25,米麴黴(SEQ ID NO 7)的等價位置是位置D26。參見圖12 和13的三維序列的示例性比對。在一些實施方案中,葡糖澱粉酶變體在親本的胺基酸序列中包括至少一個取代。 在其它實施方案中,變體可以具有一個以上的取代(例如,2、3或4個取代)。在一些實施方案中,葡糖澱粉酶變體包括取代、缺失或插入,通常是取代,這是在 與圖5示例的非保守胺基酸區域相對應位置(例如對應於圖5中沒有用「*」指示的那些 位置的胺基酸位置)中的至少一個胺基酸位置上。儘管變體可以發生在成熟蛋白質序列(SEQ ID NO 2)中的任何位置,在一個實施 方案中,葡糖澱粉酶變體包含一個或多個取代,其在SEQ IDNO 2所示的胺基酸序列的下列 位置中4、5、12、24、29、43、44、45、46、47、49、51、61、70、73、75、76、94、100、108、114、116、 119、122、124、125、137、143、146、148、169、171、172、175、178、180、181、208、211、228、242、 243、245、292、294、297、309、310、313、314、315、316、317、321、340、341、350、353、356、363、368、369、375、376、395、398、401、408、409、412、415、417、418、421、430、431、433、436、451、 503、511、535、539或563 ;或者在親本葡糖澱粉酶的等價位置上。在一些實施方案中,親本 葡糖澱粉酶具有和SEQ ID NO: 2至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%,以 及至少99%的同一性。在其它實施方案中,親本葡糖澱粉酶可以是木黴屬葡糖澱粉酶同源 物。在一些實施方案中,葡糖澱粉酶變體包含一個或多個取代,其發生在SEQ IDNO 2 所示的胺基酸序列中的下列位置上D4、F5、112、D24、F29、143、D44、P45、D46、Y47、Y49、W51、N61、Y70、G73、Q75、R76、 P94、D100、K108、K114、F116、N119、R122、Q124、R125、G137、N146、Q148、Y169、N171、Q172、 F175、W178、E180、V181、Q208、S211、W228、N242、E243、R245、I292、G294、K297、R309、Y310、 D313、V314、Y315、Y316、N317、W321、K340、K341、T350、Q356、T363、S368、S369、N376、Y395、 A398、S401、R408、N409、T412、L417、H418、W421、T430、A431、R433、1436、S451、E503、Q511、 A535、A539或N563 ;或者在親本葡糖澱粉酶中的等價位置上(例如木黴屬葡糖澱粉酶同 源物)。在其它實施方案中,親本葡糖澱粉酶變體包含一個或多個取代,其在SEQ ID NO 2 所示的胺基酸序列的下列位置中:4、5、24、29、43、44、49、61、70、73、75、76、100、108、119、 124、137、146、148、169、171、172、175、178、181、208、211、243、292、294、297、314、316、317、 340、341、350、356、363、368、369、376、395、401、409、412、417、430、431、433、436、451、503、 511、535、539或563 ;或者在親本葡糖澱粉酶中的等價位置上(例如木黴屬葡糖澱粉酶同 源物)。在其它實施方案中,親本葡糖澱粉酶變體包含至少一個下列取代,其在SEQ ID NO :2 所示的胺基酸序列的下列位置中D4L/E/R/S/C/A/Q/W,F5C/M/N/R/S/T/V/W, I12L/ R, D24E/L/Y/T, F29L/I/D/C/S/V/W, I43F/R/D/Y/S/Q, D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C, Y47W, Y49N, N61D/I/L/Q/V/W, Q70R/K/M/P/G/L/F, G73F/C/L/W, Q75R/K/A, R76L/M/K/T/P, P94L, DlOOff/ I/Q/M/P/A/N, N119P/T/Y/D/E, N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/F/M, Q148V/Y/H/A/C/D/G/M/R/S/ Τ, Y169D/F, Q172C/A/D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V, F175H/A/G/R/S/T/C/W/Y, W178A/C/D/E/ F/G/H/K/N/R/S/T/V/Y, E180A/C/G/H/I/L/N/P/Q/R/S/T/V/Y/, V181E/C/D/G/H/I/P/T/Y/ S/L/K/F/A, Q208L/A/C/E/N/F/H/T, S211 C/R/E/A/Y/ff/M/H/L/1/R/Q/T, E243S/R/N/M/Y/A/ L, R245A/E/M/I/P/V, 1292D/H/P/R/T/N/V/F/L, G294C/D/E/T/Q/I/A, K297F/L/P/T/M/D/N/ Q/A/Y/H/S/R/ff, R309A/C/G/H/1/N/P/Q/S/T/ff/Y/L, Y310E/G/L/P/S/W/R/Q, D313Q, V314A/ R/N/D/C/E/Q/G/H/1/L/K/M/F/P/S/T/ff/Y, Y315F, Y316Q/R, N317T/H, K340D/T, K341F/D/P/ V/G/S, T350S/E/A/N, Q356H/D/E, T363L/R/C/H/W, S368W/D/F/L, S369F, N376Q/T/H/S/V, Y395Q/R/S, A398S/I/T, S401C/V, R408S, N409W/T/K, T412A/H/K/G, L417A/D/E/F/G/I/K/ Q/R/S/T/V/ff/Y, T430A/E/F/G/H/I/K/M/N/Q/R/V, A431C/E/H/I/L/M/Q/R/S/ff/Y, R433H/Q, I436A/T, S451M/T/H, E503A/C/D/H/S/V/W, Q511C/G/H/I/K/T/V, A535E/F/G/K/L/N/P/R/S/ T/V/ff/Y, A539E/H/M/R/S/W 或 N563/A/C/E/I/K/L/Q/T/V ;或者在親本葡糖澱粉酶同源物中 的等價位置上。在一些實施方案中,葡糖澱粉酶變體包含至少一個取代,發生在相應於下述SEQ ID NO :2 所示的胺基酸殘基位置的位置上:5、24、43、44、49、61、70、73、75、76、94、119、146、148、172、175、178、180、181、208、211、245、294、353、315、375、409、309、314、369、412、417、 430、431、503、511、535、539或563 ;或者在親本葡糖澱粉酶同源物中的等價位置上。
在一些示例性的實施方案中,葡糖澱粉酶變體包含對應於SEQ ID N0:2所示的 位置,或者同源的親本葡糖澱粉酶中的等價位置的至少一個選自以下的取代F5W,D24E, I43R, I43Y, I43Q, I43S, I43F, D44C, D44R, Y47W, Y49N, N61I, Q70K, G73F, Q75R, R76L, P94L, N119P/T/Y/D, N146S/D/T/E/W/L, Q148V N171D, Q172C/D/R/E/F/V/L/T, F175R/W/Y, W178K/ N/Y, E180H/N/V/R, V181E/F/G/I/H, Q208A/T/N, S211H/M/L/R, R245E, R245M, G294C, R309W, V314F/G/H/K/P/R/Y, Y315F, S369F, T412K, L417R, L417V, T430A, T430M, A431L, A431Q, E503A, E503V, Q511H, A535R, A539R, N563I 和 N563K。在其它特定的實施方案中,葡糖澱粉酶變體包含胺基酸殘基的至少一個取代,所 述胺基酸殘基選自與 SEQ ID NO 2 的位置 5、43、44、61、73、75、76、94、108、119、124、146、 148、171、172、175、178、180、181、208、211、294、297、314、316、412、417、430、431、503、511、 535、539或563,或者與木黴屬葡糖澱粉酶同源物中的等價位置對應的位置上。在一些實施 方案中,取代發生在與 SEQ ID NO 2 的位置編號 43、44、61、73、148、172、175、178、180、208、 211、294、297、314、412、417、430、431、503、511、535、539 或 563,或者與木黴屬葡糖澱粉酶 同源物的等價位置相對應的位置上。在一些示例性的實施方案中,取代是在與SEQ ID NO 2或同源的親本葡糖澱粉酶 (例如木黴屬葡糖澱粉酶同源物)的位置編號43、44、61、73、108、124、171、172、208、211、 294、314、316、417、430、431、503、511、535、539 或 563 對應的位置上。在一些實施方案中,葡糖澱粉酶變體包含多個取代。一些多個取代包括在一個或 多個位置上的取代,所述位置等價於且包括SEQ ID N0:2的位置24、43、44、108、124、171、 175、181、208、243、292、294、297、310、314、363、417、430、431、503、511、535、539 或 563。 一 些典型的多個取代包括一個或多個位置,所述位置等價於和對應於SEQ ID N0:2的位置 43、44、61、73、08、124、171、208、211、294、314、417、430、431、503、511、535、539 或 563。具有多個取代的變體的一些實例包括在以下位置的取代SEQ IDNO :2 的D24/I43/D44/F175/V181/V314/T363 ;D24/Q208/I292/G294/K297/Y310 ;V181/E243/I292/k297/N317/Y395 ;D24/V181/Q208/G294/T363/N376/N409 ;D24/V181/I292/G294/E243/N409 ;I43R/E243/I292/G294/K297 ;I43/D44/N61/L417/E503/Q511/A539 ;I43/D44/L417/E503/Q511/A539 ;I43/N61/L417/T430/Q511/A539 ;I43/N61/L417/E503/Q511/A539 ;I43/N61/T430/A431/Q511/A539 ;I43/N61/T430/Q511 ;I43/N61/T430/Q511/A539 ;
I43/N61/Q511 ;I43/N61/Q511/A539 ;I43/G73/T430 ; I43/L417/E503/Q511/A539 ;I43/L417/Q511 ;I43/L417/T430/A431/Q511/A539 ;I43/L417/T430/Q511 ;I43/L417/T430/Q511/A539 ;I43/L417/E503/A539 ;I43/L417/E503/Q511/A539 ;I43/T430 ;I43/T430/A431/E503/Q511 ;I43/T430/A431/Q511;I43/T430/A431/Q511/A539 ;I43/T430/E503/Q511 ;I43/T430/Q511 ;I43Q/T430/Q511/A539 ;I43/A431/Q511 ;I43/T430/E503/Q511/N563 ;I43/T430/E503/A535/N563 ;I43/E503/Q511/A539 ;I43/Q511/A539 ;D44/G73/L417/N563 ;D44/G73/E503/Q511 ;D44/G73/N563 ;D44/L417/N563 ;D44/T430/Q511/A535 ;D44/E503/Q511/N563 ;G73/T430/E503/Q511;G73/T430/Q511 ;G294/L417/A431 ;G294/L417/A431 ;G294/L417/A431/Q511 ;L417/T430/A431/Q511/A535/A539/N563 ;L417/A431/Q511 ;L417/T430/Q511/A535/N563 ;L417/T430/Q511/A539/N563 ;和E503/N563 ;或者在親本葡糖澱粉酶特別是木黴屬葡糖澱粉酶同源物中的等價位置上。
一些具有多個取代的變體可以包括以下位置上的取代SEQ ID NO 2 的Y47F/W, Y315F/W ;D24E, L/I43F, R/D44H, N/F175H/V181K, L/V314D, H, K/T363R ;D24L, W, Y/Q208F/I292F, N, V/G294A, I,Q/K297A/Y310F, Q, R ;V181F, K, L/E243A, N, M, R, Y/I292F, L, N, V/K297A, D, H, M, N, Q/N317H/Y395Q, R ;D24E, L, Y/V 181F, K, L/Q208C, F/G294A, I,Q/T363R/N376Q/N409K, W ;D24E, L, Y/V181F, K, L/I292F, L, N, V/G294A, I,Q/E243A, M, N, R, Y/N409K, W ;I43R/E243A, M, N, R, Y/I292F, L, N, V/G294A/K297A, D, H, M, N, Q, S, R, W, Y ;I43Q/D44C/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R ;I43Q/D44C/L417V/E503A/Q511H/A539R ;I43Q/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R ;I43Q/N61I/L417V/T430M/Q511H/A539R ;I43R/N61I/L417R, V/E503A/Q511H/A539R ;I43Q/N61I/T430A/A431L/Q511H/A539R ;I43Q/N61I/T430A/Q511H ;I43Q/N61I/T430A/Q511H/A539R ;I43Q/N61I/T430M/Q511H/A539R I43Q/N61I/Q511H ;I43Q/N61I/Q511H/A539R ;I43R/G73F/T430A ;I43Q/L417V/T430A/A431L/Q511H/A539R ;I43Q/L417V/T430A/Q511H ;I43Q/L417V/T430A/Q511H/A539R ;I43R/L417R/E503A/A539R ;I43R, Q/L417V/E503A/Q511H/A539R ;I43Q/L417V/Q511H ;I43R, Q/T430A ;I43Q/T430A/A431L/E503A/Q511H ;I43Q/T430A/A431L/Q511H ;I43Q/T430A/A431L/Q511H/A539R ;I43Q/T430A/E503A/Q511H ;I43Q/T430A/Q511H ;I43Q/T430A, M/Q511H/A539R ;I43R/T430A/E503A, V/Q511H/N563K ;I43Q/A431L/Q511H ;I43Q/E503A/Q511H/A539R ;I43Q/Q511H/A539R ;D44C/G73F/E503V/Q511H ; D44C/G73F/L417R/N563K ;
D44C/G73F/N563K ;D44C/L417R/N563K ;D44R/E503A/Q511H/N563I ; D44R/T430A/Q511H/A535R ;
G73F/T430A/E503V/Q5IlH ;G73F/T430A/Q511H ;G294C/L417R/A431L ;G294C/L417R/A431L, Q/Q511H ;G294C/L417V/A431Q ;L417R, V/A431L, Q/Q511H ;L417V/T430A/A431L, Q/Q511H/A535R/A539R/563I ;L417V/T430A/Q511H/A535R/N563I ;L417V/T430A/Q511H/A539R/N563I ;禾口E503A/N563I或者在親本葡糖澱粉酶特別是木黴屬葡糖澱粉酶同源物中的等價位置。已經比對了多個親本葡糖澱粉酶和TrGA的胺基酸序列。圖4A和4B包括下 列親本葡糖澱粉酶的催化結構域泡盛麴黴(AaGA) (SEQ ID NO 5);黑麴黴(AnGA) (SEQ ID NO 6);米麴黴(AoGA) (SEQ ID NO 7);灰腐質黴(HgGA) (SEQ ID NO 8)和 Hypocrea vinosa (HvGA) (SEQ ID NO :9)。下表1中顯示了催化結構域的%同一性。圖4C和4D包 括下列親本葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域裡氏木黴(TrGA)(SEQ ID NO 161);灰腐質黴 (HgGA) (SEQ ID NO 162);太瑞斯梭孢殼黴(Thielaviaterrestris) (TtGA) (SEQ ID NO 163);疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus) (ThGA) (SEQ ID NO 164);埃默森踝 節菌(Talaromycesemersonii) (TeGA) (SEQ ID NO: 165);黑麴黴(AnGA) (SEQ ID NO: 166) 和泡盛麴黴(AaGA) (SEQ ID N0:167)。在一些實施方案中,例如,變體葡糖澱粉酶來自是 麴黴屬葡糖澱粉酶的親本葡糖澱粉酶,並且變體將包括至少一個取代,其發生在與SEQ ID NO :2所示的位置等價的位置上,特別是在對應的0445、112、024、?29、143、044、?45、046、 Y47、Y49、W51、N61、Y70、G73、Q75、R76、P94、D100、K108、K114、F116、N119、R122、Q124、R125、 G137、N146、Q148、Y169、N171、Q172、F175、W178、E180、V181、Q208、S211、W228、N242、E243、 R245、I292、G294、K297、R309、Y310、D313、V314、Y315、Y316、N317、W321、K340、K341、T350、 Q356、T363、S368、S369、N376、Y395、A398、S401、R408、N409、T412、L417、H418、W421、T430、 A431、R433、1436、S451、E503、Q511、A535、A539 或 N563 的位置上。內切-H去除裡氏木黴葡糖澱粉酶的N-連接糖,具有穩定化效果(觀察Tm時)。 因此,具有N171D取代的變體與野生型相比,可具有增加的熱穩定性。在一些實施方案中, 提供了在具有N-連接糖的位置具有一個或多個取代的變體,包括裡氏木黴(SEQ ID NO 2) 中的N171D。表 1 本公開文本還提供與親本葡糖澱粉酶,特別是與TrGA相比,具有至少一個改變性 質(例如改善的性質)的葡糖澱粉酶變體。在一些實施方案中,至少一個改變的性質(例 如改善的性質)選自酸穩定性、熱穩定性和比活性。通常,改變的性質是增加的酸穩定性、 增加的熱穩定性和/或增加的比活性。通常,增加的熱穩定性是在較高溫度下。在一個實 施方案中,增加的PH穩定性是在高pH下。在另一個實施方案中,增加的pH穩定性是在低 PH下。與親本葡糖澱粉酶相比,本公開文本的葡糖澱粉酶變體還可以提供在低底物濃度 下,較高的澱粉水解速率。當在相同條件下測試時,變體可具有比親本葡糖澱粉酶較高的 Vfflax或較低的Km。例如,變體葡糖澱粉酶可具有在溫度範圍為25°C至70°C下較高的Vmax(例 如25°C至 35°C ;30°C至 35°C ;40°C至 50°C ;50°C至 55°C和 55°C至 62°C )。可以利用已知 的標準方法方便的確定米-曼常數(Michaelis-Menten constant)、Km和Vmax值。5、熱穩定件(熱穩定變體)在一個方面,公開文本涉及與親本或野生型相比,在改變的溫度下,具有改變的熱 穩定性的變體葡糖澱粉酶。改變的溫度包括增加的或降低的溫度。在一些實施方案中,葡 糖澱粉酶變體具有改善的熱穩定性,例如在暴露於改變的溫度下給定的時間後,保留至少 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98% 或 99% 酶活性,所述 時間例如至少60分鐘、120分鐘、180分鐘、240分鐘、300分鐘等。在一些實施方案中,變體 與親本葡糖澱粉酶相比,在40-80°C範圍內的選定溫度下,具有增加的熱穩定性,還可以是 50-750C的範圍內,和60-70°C的範圍內,並且pH範圍通常是4. 0-6. 0。在一些實施方案中, 按實施例描述的確定熱穩定性。在一些實施方案中,與熱穩定性的改良有關的特別有興趣的變體包括一個或多個 缺失、取代或插入,特別是取代,它們發生在SEQ ID NO :2所示的氫基酸序列的下列位置上 D4、F5、I12、D24、F29、143、D44、P45、D46、Y47、Y49、W51、N61,Y70、G73、Q75、R76、P94、D100、 K108、K114、F116、N119、R122、Q124、R125、G137、N146、Q148、Y169、N171、Q172、F175、W178、 E180、V181、Q208、S211、W228、N242、E243、R245、1292、G294、K297、R309、Y310、D313、V314、 Y315、Y316、N317、W321、K340、K341、T350、Q356、T363、S368、S369、N376、Y395、A398、S401、R408、N409、T412、L417、H418、W421、T430、A431、R433、1436、S451、E503、Q511、A535、A539 或N563 ;或親本葡糖澱粉酶中等價的位置上。在一些實施方案中,親本葡糖澱粉酶是木黴 葡糖澱粉酶同源物,在典型的實施方案中,親本葡糖澱粉酶具有與SEQ ID NO :2至少90%、 至少95%和至少98%序列同一性。6、嵌合的葡糖澱粉酶:本公開文本的葡糖澱粉酶變體還可以包括嵌合的或雜合的葡糖澱粉酶,具有例如 來自一種葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域(SBD)和來自另一種的催化結構域和接頭。例如, 可以通過將AnGA的SBD與TrGA的SBD互換,產生具有AnGA SBD和TrGA催化結構域和接頭 的雜化物,來製造雜合的葡糖澱粉酶。可選的,來自AnGA的SBD和接頭可以與TrGA的SBD 和接頭互換。7、比活件在另一方面,公開文本涉及與親本或野生型葡糖澱粉酶相比,具有改變的比活性 的變體葡糖澱粉酶。在一些實施方案中,與比活性的改良有關的特別有興趣的變體包括一個或多個缺 失、取代或插入,特別是取代,發生在SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列的下列位置上D4、 F5、112、D24、F29、143、D44、P45、D46、Y47、Y49、W51、N61、Y70、G73、Q75、R76、P94、D100、 K108、K114、F116、N119、R122、Q124、R125、G137、N146、Q148、Y169、N171、Q172、F175、W178、 E180、V181、Q208、S211、W228、N242、E243、R245、I292、G294、K297、R309、Y310、D313、V314、 Y315、Y316、N317、W321、K340、K341、T350、Q356、T363、S368、S369、N376、Y395、A398、S401、 R408、N409、T412、L417、T430、A431、H418、W421、R433、I436、S451、E503、Q511、A535、A539 或 N563 ;或在親本葡糖澱粉酶中等價的位置上。在一些實施方案中,具有改善的比活性的公 開文本的變體包括取代,其發生在SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列的下列位置上D4、D24、 143、D44、N61、Y70、G73、Q75、R76、D100、K108、N119、Q124、N146、Q148、N171、Q172、F175、 V181、Q208、S211、E243、R245、1292、G294、K297、V314、Y316、N317、K340、K341、T350、Q356、 T363、S368、N376、Y395、A398、S401、N409、T412、L417、T430、A431、I436、S451、E503、Q511、 A535、A539或N563 ;或在親本葡糖澱粉酶中等價的位置上。在一些實施方案中,親本葡糖澱 粉酶包含與SEQ ID NO :2的序列具有至少90%或95%序列同一性的序列。8、多核苷酸本公開文本還涉及編碼本發明的變體葡糖澱粉酶的分離的多核苷酸。編碼變體葡 糖澱粉酶的多核苷酸可以通過本領域已知的常規技術製備。可以合成製備多核苷酸,例如 通過自動化DNA合成儀。DNA序列可以是通過將片段連接在一起而製備的混合的基因組(或 cDNA)和合成的起源。多核苷酸還可以是通過聚合酶鏈式反應(PCR)利用特異引物製備的。 一般,參考Minshull J.等人,(2004),Engineered protein function by selectiveamino acid diversification,Methods 32(4) :416_427。而且,目前多家公司都合成 DNA,例如 Geneart AG,Regensburg,德國。本公開文本還提供包含下述核苷酸序列的分離的多核苷酸所述序列(i)具有與 SEQ ID NO :4至少70%同一性,或(ii)在中等至高嚴謹條件下,能夠與來自SEQ ID NO 4 所示的核苷酸序列的探針雜交,或(iii)與核苷酸序列互補,所述核苷酸序列與SEQ ID NO 4所示的序列具有至少90%序列同一性。根據本公開文本有效的探針可以包括SEQ ID NO4的至少50、100、150、200、250、300或更多個連續的核苷酸。
本公開文本還提供了編碼變體葡糖澱粉酶的分離的多核苷酸,所述變體葡糖澱粉 酶包含的胺基酸序列具有與SEQ ID NO :2至少80%胺基酸序列同一性。在一些實施方案 中,變體葡糖澱粉酶具有與SEQ ID NO :2至少80%胺基酸序列同一性。在一些實施方案中, 變體葡糖澱粉酶具有與SEQID NO :2至少90%胺基酸序列同一性。在一些實施方案中,變 體葡糖澱粉酶具有與SEQ ID NO :2至少93%胺基酸序列同一性。在一些實施方案中,變體 葡糖澱粉酶具有與SEQ ID NO :2至少95%胺基酸序列同一性。在一些實施方案中,變體葡 糖澱粉酶具有與SEQ ID NO :2至少97%胺基酸序列同一性。在一些實施方案中,變體葡糖 澱粉酶具有與SEQ ID NO :2至少98%胺基酸序列同一性。在一些實施方案中,變體葡糖澱 粉酶具有與SEQID NO :2至少99%胺基酸序列同一性。本發明還提供包含任何上述多核苷 酸的表達載體。本公開文本還提供編碼本文中提供的變體葡糖澱粉酶的DNA片段(S卩,部分)。這 些片段可用於獲得部分長度的DNA片段,其能夠用於從絲狀真菌細胞(例如木黴屬、麴黴 屬、鐮孢屬、青黴屬、裂殖酵母屬和腐質黴屬)中分離或鑑別編碼本文中描述的成熟的葡糖 澱粉酶或其具有葡糖澱粉酶活性的區段的多核苷酸。在一些實施方案中,DNA片段可以包 含至少50、100、150、200、250、300或更多個連續的核苷酸。在一些實施方案中,SEQ ID NO: 4中提供的DNA的部分可用於從其它物種,例如編碼葡糖澱粉酶的絲狀真菌中,獲得親本葡 糖澱粉酶,特別是木黴葡糖澱粉酶同源物。9、DNA構津體和載體根據公開文本的一個實施方案,組裝包括上述編碼本發明涵蓋的變體葡糖澱粉酶 的多核苷酸並且有效連接至啟動子序列的DNA構建體,用於轉移至宿主細胞內。可以利用載體將DNA構建體引入宿主細胞。載體可以是任何載體,當其被引入宿 主細胞時,通常被整合到宿主細胞基因組內並複製。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載 體、質粒、噬菌體顆粒、盒等。在一些實施方案中,載體是表達載體,其包含與葡糖澱粉酶編 碼序列有效連接的調控序列。Sambrook 等人,(1989)如上,和 Ausubel (1987)如上,和 van den Hondel 等人, (1991)在Bennett禾口 Lasure (編著)More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press 第396-428頁中,和美國專利5,874,276中提供了合適的表達和/或整合載體的實例。 Fungal Genetics Stock center catalogue of Strains (FGSC,〈WWW.fgsc.net>)也公幵 了有用的載體。特別有效的載體包括獲得自例如英傑生命科學公司(Irwitrogen)和普羅 米加公司(Promega)的載體。適合用於真菌宿主細胞的特定載體包括載體例如pFB6、pBR322、pUC18、pUClOO、 pD0NR 20U pD0NR 22U pENTR 、pGEM 3Z和pGEM 4Z。用於麴黴屬的通用表達載體包括 具有glaA啟動子的pRAX,在肉座菌屬/木黴屬中包括具有cbhl啟動子的pTrex3g。在細菌細胞中使用的合適質粒包括能在大腸桿菌(E. coli)中進行複製的PBR322 和pUC19,以及例如允許在芽孢桿菌屬中複製的pE194。在一些實施方案中,啟動子在細菌或真菌宿主細胞內表現出轉錄活性,可來自編 碼與宿主細胞同源或異源蛋白質的基因。啟動子可以是突變的、截短的和/或雜合的啟動 子。上述啟動子是本領域已知的。
用於真菌細胞,特別是絲狀真菌細胞例如木黴屬或麴黴屬細胞的合適的啟動子的 實例包括以下示例性啟動子,如裡氏木黴啟動子cbhl、cbh2、egll、egl2、eg5、xlnl和xln2。 其它有效的啟動子的實例包括來自泡盛麴黴和黑麴黴葡糖澱粉酶基因(glaA)的啟動子 (參見Nunberg 等人,(1984)Mol. Cell Biol. 4 :2306_2315 和 Boel 等人,(1984) EMBO J. 3 1581-1585),米麴黴TAKA澱粉酶啟動子,來自釀酒酵母的TPI (丙糖磷酸異構酶)啟動子, 來自構巢麴黴(Aspergillus nidulans)乙醯胺酶基因和米赫根毛黴(Rhizomucor miehei) 脂肪酶基因的啟動子。用於細菌細胞的合適的啟動子的實例包括自以下獲得的啟動子大腸桿菌lac操 縱子;地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) a澱粉酶基因(amyL),嗜熱脂肪芽孢桿菌 (B. stearothermophilus)澱粉酶基因(amyM);枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因,3 _內醯 胺酶基因,和tac啟動子。在一個實施方案中,啟動子是宿主細胞天然的啟動子。例如,當裡氏木黴是宿主 時,啟動子是天然的裡氏木黴啟動子。在另一個實施方案中,啟動子是真菌宿主細胞異源的 啟動子。在一些實施方案中,啟動子是親本葡糖澱粉酶的啟動子,例如TrGA啟動子。在一些實施方案中,DNA構建體包括編碼信號序列的核酸,所述信號序列是連接在 多肽氨基端的胺基酸序列,指導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核酸序列的編碼序列的 5』端可天然的包含信號肽編碼區,其在翻譯閱讀框中天然的連接至葡糖澱粉酶編碼序列的 區段上,編碼分泌的葡糖澱粉酶,或者核酸序列的編碼序列的5』端可以包括對該編碼序列 是外來性的信號肽。在一些實施方案中,DNA構建體包括與親本葡糖澱粉酶基因天然相關 的信號序列,其中從所述親本葡糖澱粉酶獲得變體葡糖澱粉酶。在一些實施方案中,信號序 列是SEQ ID NO :1描述的序列,或與其具有至少90%,至少94%和至少98%序列同一性的 序列。有效的信號序列可以包括自其它絲狀真菌酶的葡糖澱粉酶獲得的信號序列,例如來 自木黴屬(裡氏木黴葡糖澱粉酶),腐質黴屬(特異腐質黴的纖維素酶或灰腐質黴的葡糖澱 粉酶),麴黴屬(黑麴黴葡糖澱粉酶和米麴黴TAKA澱粉酶),和根黴屬。在其它實施方案中,包含信號序列的DNA構建體或載體與待被引入宿主細胞的啟 動子序列來自相同的來源。在一些實施方案中,可以使用木黴葡糖澱粉酶同源物的天然葡 糖澱粉酶信號序列,例如來自肉座菌屬菌株的信號序列。在一些實施方案中,表達載體還可以包括終止序列。本發明可以使用任何在宿主 細胞內有功能的終止序列。在一個實施方案中,終止序列和啟動子序列來自相同的來源。在 另一個實施方案中,終止序列是與宿主細胞同源的。有效的終止序列包括自以下基因獲得 的終止序列裡氏木黴cbhl ;黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(Nimberg等人,(1984)如上, 和Boel等人,(1984)如上),構巢麴黴的鄰氨基苯甲酸合酶,米麴黴TAKA澱粉酶,或構巢曲 黴 trpC(Punt 等人,(1987) Gene 56:117-124)。在一些實施方案中,表達載體包括選擇性標記。典型的選擇性標記的實例包括產 生抗微生物抗性(例如潮黴素和腐草黴素)的標記。營養擇性標記也可用於本發明,包 括本領域已知的標記,如amdS(乙醯胺酶),argB(鳥氨酸氨甲醯基轉移酶)和pyrG(乳清 苷-5』磷酸脫羧酶)。對於木黴轉化,在載體系統中有效的標記是本領域已知的(參見例 如Finkelstein, Biotechnology of Filamentous Fungi,第 6 章,Finkelstein 等編著, Butterworth-Heinemann, Boston, MA(1992) ;Kinghorn 等人,(1992)Applied MolecularGenetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic andProfessional, Chapman and Hall,London ;Berges禾口Barreau(1991)Curr. Genet. 19 :359_365 ;以及 van Hartingsveldt 等人,(1987)Mol. Gen. Genet. 206 :71_75)。在典型的實施方案中,選擇性標記是amdS基因, 其編碼乙醯胺酶,允許轉化的細胞以乙醯胺為氮源生長。使用構巢麴黴amdS基因作為選擇 性標記的應用描述在Kelley等人,(1985)EMBO J. 4 475-479和PenttilS等人,(1987)Gene 61 155-164 中。連接包含編碼變體葡糖澱粉酶的核酸序列的DNA構建體、啟動子、終止子和其它序列,並將它們插入合適的載體所使用的方法是本領域普遍已知的。一般通過在合適的限 制性酶切位點實現連接。如果不存在此類位點,則根據常規實踐使用合成的寡核苷酸接頭。 (參見 Sambrook(1989)如上,禾口 Bennett 禾口 Lasure,More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego (1991)第70-76頁)。此外,可以利用已知的重組技術構建載 體(例如英傑生命技術公司(Invitrogen Life Technologies),Gateway 技術)。10、宿主細胞本公開文本還涉及包含編碼本發明的變體葡糖澱粉酶的多核苷酸的宿主細胞,其 用於生產本發明的葡糖澱粉酶。在一些實施方案中,宿主細胞選自細菌、真菌、植物和酵母 細胞。術語宿主細胞既包括細胞,細胞的後代,以及從細胞產生的原生質體,它們用於生產 根據本發明的變體葡糖澱粉酶。在一些實施方案中,宿主細胞是真菌細胞,通常是絲狀真菌宿主細胞。術語「絲 狀真菌」指真菌亞門的所有絲狀體(參見Alexopoulos,C.J. (1962),Introductory Mycology, Wiley, New York)。這類真菌的特徵是營養菌絲體具有包含殼多糖、纖維素和其 它複雜多糖的細胞壁。本公開文本的絲狀真菌與酵母是在形態學上、生理學上和遺傳學上 不同的。絲狀真菌的營養生長是通過菌絲伸長,碳分解代謝是專性需氧的。在本公開文本 中,絲狀真菌親本細胞可以是但不限於以下種的細胞木黴屬(例如裡氏木黴,紅褐肉座 菌(Hypocrea jecorina)的無性型,原分類為長梗木黴;綠色木黴(Trichoderma viride); 康寧木β (Trichoderma koningii);哈茨木 (Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs ^ 人,(1984) Appl. Microbiol. Bioteehnol 20 46-53 ;ATCC No. 56765 和 ATCC NO. 26921);青 黴屬物種;腐質黴屬物種(例如特異腐質黴,麵包腐質黴(H. lanuginosa)和灰腐質黴); 金小孢子菌屬(Chrysosporium)物種(例如C. lucknowense);粘帚黴屬(Gliocladium) 物種;麴黴屬物種(例如米麴黴、黑麴黴、醬油麴黴(A sojae)、日本麴黴(A. japonicus), 構巢麴黴和泡盛麴黴)(Ward 等人,(1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 39 :738_743 和 Goedegebuur 等人,(2002) Genet 41 :89_98)鐮孢屬物種(Fusarium sp.)(例如 粉紅鐮孢、禾赤鐮孢(F. graminum), F. cerealis、尖鐮孢(F. oxysporuim)和腹狀鐮孢 (F. venenatum));脈孢屬物種(粗糙脈孢菌(N. crassa));肉座菌屬(Hypocrea)物種;毛黴 屬(Mucor)物種(米黑毛黴(Mmiehei));根黴屬物種和裸孢殼屬(Emericella)物種(還 參見=Irmis等人,(1985)Sci.228 :21_26)。術語「木黴」或「木黴屬」或「木黴菌」都指原 來或現在分類為木黴屬的任何真菌屬。在一些實施方案中,宿主細胞是革蘭氏陽性菌細胞。非限制性實例包括鏈黴 菌屬(例如淺青紫鏈黴菌(S. Iividans)、天藍色鏈黴菌(S. coelicolor)和灰色鏈黴 菌(S.griseus))和芽孢桿菌屬的菌。如本文中使用的,「芽孢桿菌屬」包括本領域技術人員已知的在「芽孢桿菌」屬中的所有種,包括但不限於枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、地 衣芽孢桿菌(B. licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B. lentus)、短芽孢桿菌(B. brevis)、 嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus)、嗜鹼芽孢桿菌(B. alkalophilus)、解澱 粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(B. clausii)、耐鹽芽孢桿菌 (B. halodurans)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、凝結芽孢桿菌(B. coagulans)、環狀芽孢 桿菌(B. circulans)、燦爛芽孢桿菌(B. lautus)和蘇雲金芽孢桿菌(B. thuringiensis)。認 識到芽孢桿菌屬不斷進行著分類重構。因此,意味著屬包括已經重分類的種,包括但不限於 如嗜熱脂肪芽孢桿菌一類的生物,其現在命名為「嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobacillusstear othermophilus),,。在一些實施方案中,宿主細胞是革蘭氏陰性菌株,例如大腸桿菌或假單胞菌屬物 種(Pseudomonas sp.)。在其它實施方案中,宿主細胞可以是酵母細胞,例如酵母屬物種 (Saccharomyces sp.)、裂殖酵母屬物種(Schizosaccharomyces sp.)、畢赤酵母屬物種 (Pichia sp.)或假絲酵母屬物種(Candida sp.)。在其它實施方案中,宿主細胞是遺傳改造的宿主細胞,其中天然的基因已經失活, 例如在細菌或真菌細胞內通過缺失。當希望獲得具有一個或多個失活基因的真菌宿主細胞 時,可使用已知的方法(例如在美國專利5,246,853,美國專利5,475,101和TO 92/06209 中描述的方法)。通過完全或部分缺失,插入失活或任何其它導致基因對於其意圖的目的無 功能的方法,都可以實現基因失活(使基因不能表達功能性蛋白質)。在一些實施方案中, 當宿主細胞是木黴屬細胞,特別是裡氏木黴宿主細胞時,cbhl、cbh2、egll和egl2基因將被 失活和/或通常被缺失。典型的,裡氏木黴宿主細胞具有四刪除的蛋白質,提出並描述在美 國專利5,847,276和恥05/001036中。在其它實施方案中,宿主細胞是蛋白酶缺陷的,或蛋 白酶減小的菌株。11、宿主細胞轉化將DNA構建體或載體引入宿主細胞內包括以下技術,例如轉化;電穿孔;核顯微 注射;轉導;轉染(例如脂質體介導和DEAE-Dextrin介導的轉染);用磷酸鈣DNA沉澱孵 育;用DNA-包被的微粒高速轟擊;和原生質體融合。常規的轉化技術是本領域已知的(參 見例如:Ausubel等人,(1987),如上,第9章;禾口 Sambrook(1989)如上和Campbell等人, (1989) Curr. Genet. 16 :53_56)。多個文獻都公開了用於芽孢桿菌的轉化方法,包括Anagnostopoulos C和 J. Spizizen (1961) J. Bacteriol. 81 :741_746,以及 W0 02/14490。用於麴黴屬的轉化方法描述在Yelton等人,(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 811470-1474 ;Berka ^ A, (1991), ^ Applications of EnzymeBiotechnology, Kelly 和 Baldwin 編著,Plenum Press (NY) ;Cao 等人,(2000) Science 9:991-1001 ;Campbell 等 人,(1989)Curr. Genet. 16 :53-56和EP 238023中。在木黴屬表達異源蛋白描述在美國專 利 6,022,725 ;美國專利 6,268,328 ;Harkki 等人,(1991) ;Enzyme Microb. Technol. 13 227-233 ;Harkki 等人,(1989)Bio Technol. 7:596_603;EP 244, 234 ;EP 215,594 ;和 Nevalainen 等人,"The Molecular Biology of Trichoderma and itsApplication to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes」為哪皿仙 ImusTRIAL MY⑶L0GY, Leong 和 Berka 編著,Marcel Dekkerlnc. ,NY(1992)第 129-148 頁。還可參考 W096/00787和 Bajar 等人,(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :8202_8212 用於鐮孢屬菌株轉化。
在一個特定的實施方案中,製備用於轉化的木黴屬物種涉及從真菌菌絲體製備 原生質體(參見Campbell 等人,(1989)Curr. Genet. 16 :53_56 ;Pentilla 等人,(1987) Gene 61 :155_164)。根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的絲狀真菌轉化是已 知的(參見de Groot 等人,(1998)Nat. Biotechnol. 16 :839_842)。還可參考美國專利 6,022,725和美國專利6,268,328的使用絲狀真菌宿主的轉化方法。典型的,使用載體系統構建基因穩定的轉化體,由此編碼變體葡糖澱粉酶的核酸 穩定整合到宿主菌株染色體中。然後利用已知技術純化轉化體。在其它一些實施方案中,宿主細胞是植物細胞,例如來自單子葉植物的細胞(例 如玉米、小麥和高粱),或來自雙子葉植物的細胞(例如大豆)。生產用於轉化植物的 DNA構建體的方法,和轉化植物的方法是已知的。一些這類方法包括根癌農桿菌介導的基 因轉移;微粒轟擊;PEG介導的原生質體轉化;電穿孔等。參考美國專利6,803,499,美國專 利 6,777,589 ;Fromm 等人(1990) Biotechnol. 8 :833_839 ;Potrykus 等人,(1985) Mol. Gen. Genet. 199 :169_177。12、蛋白質的牛產本公開文本還涉及生產變體葡糖澱粉酶的方法,包括用含有編碼本發明的變體葡 糖澱粉酶的多核苷酸的表達載體轉化宿主細胞,任選的在適合生產變體葡糖澱粉酶的條件 下培養宿主細胞,和任選的回收葡糖澱粉酶。 在本公開文本的表達和生產方法中,在合適條件下培養宿主細胞,在搖瓶培養,實 驗室或工業發酵罐的小規模或大規模發酵(包括連續發酵,批次發酵和補料分批發酵), 其中使用含有生理鹽和營養物的合適培養基(參見例如=Pourquie, J.等人,Biochemistey md Genetics ofcellulose Degradation' Aubert 編輯,J. P.等人,Academic Press,第 71—86 頁,1988 禾口 Ilmen,M.等人,(1997) Appl. Environ. Microbiol. 63 1298-1306) 本公開文本可使用常規 商業製備的培養基(例如酵母麥芽提取物(YM)培養基、Luria Bertani (LB)培養基和沙 氏葡萄糖(SD)培養基)。用於細菌和絲狀真菌細胞的典型培養條件是本領域已知的,可以 從科技文獻和/或真菌來源處獲得,例如美國典型培養物保藏中心(AmericanType culture Collection)和真菌品種中心(Fungal Genetics Stock Center)。當葡糖澱粉酶編碼序列 處於可誘導的啟動子控制下時,將誘導劑(例如糖、金屬鹽或抗微生物劑)以有效誘導葡糖 澱粉酶表達的濃度添加到培養基中。在一些實施方案中,本公開文本涉及生產變體葡糖澱粉酶的方法,包括在適合生 產變體的條件下,培養含有編碼本發明的變體葡糖澱粉酶的多核苷酸的植物或植物細胞, 和任選的回收葡糖澱粉酶。在一些實施方案中,為了評估已經用編碼本發明涵蓋的變體葡糖澱粉酶的多核苷 酸轉化的細胞系對變體葡糖澱粉酶的表達,在蛋白質水平、RNA水平進行測定,和/或使用 特別針對葡糖澱粉酶活性和/或生產的功能性生物測定。一些這類測定包括Northern印 跡、斑點印跡(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆轉錄酶聚合酶鏈式反應),或利用合適的標記 探針(基於核酸編碼序列)的原位雜交,和常規的Southern印跡和放射自顯影。此外,可以直接測量樣品中的變體葡糖澱粉酶的生產和/或表達,例如通過在培 養基中直接測量還原糖例如葡萄糖的測定,和通過測量葡糖澱粉酶活性、表達和/或生產的測定。特別的,可以通過3,5_二硝基水楊酸(DNS)方法(參見Goto等人,(1994)Biosci. Biotechnol. Biochem. 58 49-54)測定葡糖澱粉酶活性。在其它實施方案中,通過免疫學 方法評估蛋白質表達,例如細胞的免疫組織化學染色,組織切片或組織培養基的免疫測定 (例如通過Western印跡或ELISA)。此類免疫測定可用於定性和定量地評估葡糖澱粉酶 的表達。此類方法的細節是本領域技術人員已知的,許多用於實踐此類方法的試劑也是可 商購的。本發明的葡糖澱粉酶可以從培養基中通過本領域已知的多種方法回收或純化,包 括離心、過濾、提取、沉澱等。13、組合物變體葡糖澱粉酶可以用於酶組合物中,所述酶組合物包括但不限於澱粉水解和 糖化組合物,清潔和去汙組合物(例如衣物去汙劑、碗碟洗滌去汙劑,和硬表面清潔組合 物),醇發酵組合物,和動物飼料組合物。進一步的,變體葡糖澱粉酶可用於烘烤用途,例如 麵包和蛋糕生產、釀造、健康護理、紡織品、環境廢棄物轉化過程、生物漿處理,和生物質轉 化應用。在一些實施方案中,酶組合物包括本發明涵蓋的變體葡糖澱粉酶,其自培養基獲 得或從培養基中回收和純化,所述酶組合物任選的與任一種或組合的下列酶聯合使用 a澱粉酶、蛋白酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、環糊精葡糖 轉移酶(cyclodextringlycotransferase)、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角質酶 (cutinase)、木聚糖酶、粒狀澱粉水解酶和其它葡糖澱粉酶。在一個實施方案中,蛋白酶 是酸性真菌蛋白酶(AFP)。在另一個實施方案中,酸性真菌蛋白酶是來自木黴屬(例如 NSP-24,還參見US 2006/0154353,公開於2006年7月13日,通過整體引入本文作為參考)。 在另一個實施方案中,植酸酶來自Buttiauxiella物種(例如BP_17,還參見PCT專利公開 W0 2006/043178中公開的變體)。在一些典型的組合物中,公開文本的變體葡糖澱粉酶與a澱粉酶組合,例如真菌 a澱粉酶(例如麴黴屬)或細菌a澱粉酶(例如芽孢桿菌屬物種如嗜熱脂肪芽孢杆 菌、解澱粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌),及其變體和雜合體。在一個實施方案中,a澱粉酶 是酸穩定的a澱粉酶。在一個實施方案中,a澱粉酶是顆粒澱粉水解酶(GSHE)。在一個 實施方案中,a澱粉酶是Aspergillus kawachi的a澱粉酶(AKAA),參見US 7,037,704。 考慮用於本發明的組合物的可商購的a澱粉酶是已知的,包括GZYMEG997、SPEZYME FRED、 SPEZYME XTRA、STARGEN(美國丹尼斯克有限公司傑能科子公司(Danisco US、lnc、Genencor Division))、TERMAMYL 120-L 和 SUPRA(諾和酶生物技術公司(Novozymes,Biotech.))和 VIRIDIUM(Diversa)。在其它實施方案中,公開文本的變體葡糖澱粉酶可以與其它葡糖澱粉酶組合。在 一些實施方案中,公開文本的葡糖澱粉酶與一種或多種來自麴黴屬菌株(例如米麴黴、黑 麴黴、A. kawachi和泡盛麴黴)的葡糖澱粉酶;來自腐質黴屬菌株(特別是灰腐質黴)的葡 糖澱粉酶或其變體,例如與W005/052148中公開的SEQ ID NO :3具有至少90%、93%、95%、 96%、97%、98%和99%序列同一性的葡糖澱粉酶;來自踝節菌屬菌株的葡糖澱粉酶或其 變體,特別是埃默森踝節菌(T.emersonii)的葡糖澱粉酶;來自阿太菌屬(Athelia)菌株, 特別是羅氏阿太菌(A.rolfsii)的葡糖澱粉酶;來自青黴屬菌株,特別是產黃青黴的葡糖澱粉酶進行組合。14、用塗 特別的,變體葡糖澱粉酶可用於澱粉轉化過程,特別是生產用於果糖漿液的葡萄 糖、特製糖,以及從包含澱粉的底物發酵中來生產醇和其它終產物(例如有機酸、抗壞血酸 和胺基酸)中(G.M.A van Beynum 等人編著,(1985) Staech Conveesion Technology, Marcel Dekker Inc. NY)。利用本發明的變體葡糖澱粉酶組合物生產的糊精可以獲得至少80%、至少85%、 至少90%和至少95%的葡萄糖產量。利用本發明涵蓋的葡糖澱粉酶從澱粉底物發酵中生 產醇可以包括燃料用醇或可飲用醇的生產。在一些實施方案中,當使用變體葡糖澱粉酶時, 與親本葡糖澱粉酶在相同條件下,醇產量較大。在一些實施方案中,醇產量比親本葡糖澱 粉酶多約0. 5%和2. 5%之間,包括但不限於,比親本葡糖澱粉酶多0. 6%、0. 7%、0. 8%、 0. 9 %U. 0 1 %>1. 2 %U. 3 %U. 4 %U. 5 %U. 6 %U. 7 %U. 8 %U. 9 %,2. 0
2. 1%,2. 2%,2. 3%和 2. 4%。在一個典型的實施方案中,本公開文本的變體葡糖澱粉酶可用於從多種基於植物 的底物中水解澱粉,其用於醇生產。在一些實施方案中,基於植物的底物包括玉米、小麥、大 麥、黑麥、高粱、稻、甘蔗、馬鈴薯及其組合。在一些實施方案中,基於植物的底物可以是分級 分離的植物原料,例如穀類如玉米,其被分級分離為例如纖維,胚芽,蛋白質和澱粉(胚乳) 成分(美國專利6,254,914和美國專利6,899,910)。醇發酵的方法描述在TlffiAram Textbook, A Reference For The Beveeage Fuel and Industrial Alcohol Industries' ^ 3 IK K. A. Jacques1999 Nottingham University Press,UK中。在一些實施方案中,醇可以是乙醇。特別的,醇發 酵生產過程的特徵是溼磨或幹磨法。在一些實施方案中,變體葡糖澱粉酶可用於溼磨法發 酵過程,在其它實施方案中,變體葡糖澱粉酶可用於幹磨法。穀粒幹磨涉及多個基本步驟,一般包括研磨、蒸煮、液化、糖化、發酵和固液分離 來生產醇和其它副產品。植物材料,特別是全穀粒,例如玉米、小麥或黑麥是是被研磨的。在 一些情況下,穀類可以先被分級分離組分部分。研磨的植物原料可以被碾碎以獲得粗製的 或精細的顆粒。研磨的植物原料與液體(例如,水和/或酒槽水)在漿料槽中混合。漿體 在噴射蒸煮器中接受高溫(例如90°C到105°C或更高)和液化酶(例如,α澱粉酶)以溶 解和水解穀物中的澱粉為糊精。混合物被冷卻,進一步地,用糖化酶,例如包含在本發明中 的葡糖澱粉酶處理,以產生葡萄糖。含有葡萄糖的醪液於是在發酵微生物,例如生產醇的微 生物,尤其是酵母(釀酒酵母屬)存在條件下,發酵約24到120小時。從液相中分離醪液 中的固體,獲得醇例如乙醇和有用的副產品,例如酒糟。在一些實施方案中,將糖化步驟和發酵步驟組合,該過程被稱為同時糖化和發酵 或同時糖化、酵母增殖和發酵。在其它實施方案中,在澱粉水解的過程中使用變體葡糖澱粉酶,其中,所述過程的 溫度是在30°C和75°C之間的溫度下進行,以及在40°C和65°C之間的溫度下進行,其中pH 範圍在pH3. 0和pH6. 5之間。一些實施方案中的發酵過程包括碾磨穀物或分級分離穀物和 混合碾磨的穀物和液體以形成漿體,所述漿體接著在單獨容器中與根據本發明的變體葡糖 澱粉酶以及任選地,其它酶例如,但不限於,α澱粉酶、其它的葡糖澱粉酶、植酸酶、蛋白酶、 支鏈澱粉酶、異澱粉酶或其它具有顆粒澱粉水解活性的酶和酵母混合,以產生乙醇和其它 的副產品(美國專利 4,514,496,WO 04/081193 和 WO 04/080923)。
在一些實施方案中,發明涉及糖化液體澱粉溶液的方法,包括利用本發明的變體 葡糖澱粉酶的酶促糖化步驟。本公開文本還提供包含至少一種本公開文本涵蓋的變體葡糖澱粉酶的動物飼料。 2002年12月13日提交的WO 03/049550 (通過完整併入本文作為參考)中,提供了在生產 包含澱粉的飼料中利用葡糖澱粉酶的方法。簡而言之,葡糖澱粉酶變體與包含澱粉的飼料 混合。葡糖澱粉酶能夠降解抗性澱粉供動物使用。本發明的其它目標和優勢根據本說明書是顯而易見的。
實施例 提供下列實施例是為了證實並進一步示例一些典型的實施方案以及本公開文本 的一些方面,並非視為限制本發明的範圍。在下列公開內容和實驗部分,使用以下縮寫GA(葡糖澱粉酶);GAU(葡糖澱粉酶 單元);(重量百分比);V (攝氏度);rpm(每分鐘轉數);H20(水);dH20(去離子 水);dIH20(去離子水,Milli-Q過濾);aa或AA(胺基酸);bp (鹼基對);kb (千鹼基對); kD(千道爾頓);g或gm(克);Pg(微克);mg(毫克);yL(微升);ml和mL(毫升);mm(毫 米);ym(微米);M(摩爾);mM(毫摩爾);μ M(微摩爾);U(單位);V(伏特);麗(分子 量);Sec(S)或 S(S)(秒);min(s)或 m(s)(分鐘);hr(s)或 h(s)(小時);DO(溶解氧); ABS (吸光度);EtOH (乙醇);PSS (生理鹽溶液);m/v (質量/體積);和MTP (微量滴定板); N(正常);DPI (單糖);DP2( 二糖);DP >3(寡糖,具有聚合度大於3的糖);ppm(百萬分 之一)。下文描述了用於提供變體的方法。然而,應該注意到可以使用不同的方法提供親 本分子的變體,發明不限於實施例中使用的方法。意指可以使用任何適合產生變體和選擇 變體的方式。96孔微量滴定板的PNPG葡糖澱粉酶活性測定試劑溶液是=NaAc緩衝液200mM乙酸鈉緩衝液,pH4. 5 ;底物在NaAc緩衝液中 (0. 3g/20ml)的50mM對硝基苯-α -D-吡喃葡萄糖苷(SigmaN-1377),和終止溶液800mM 甘氨酸-NaOH緩衝液,pHIO。在新96孔平底MTP中置入30 μ 1過濾的上清液。每個孔加入 50 μ 1 NaAc緩衝液和120 μ 1底物,在50°C孵育30分鐘(Thermolab系統iEMS培養箱/搖床 HT)。通過加入100 μ 1終止溶液結束反應。在MTP讀板器(Molecular DevicesSpectramax 384 plus)中,測量405nm吸光度,利用0. 011 μ M/cm的摩爾消光係數計算活性。熱穩定性測定將粗製上清液(100 μ 1)加入到100 μ 1 150mM NaAc緩衝液(pH4. 5)中。將樣品 等分至2個MTP。一個MTP (初始板)在4°C孵育1小時,另一 MTP (剩餘板)在60°C孵育 (Thermolab系統iEMS培養箱/搖床HT) 1小時。剩餘板在冰上冷卻15分鐘。利用下文描 述的乙醇應用測定法測量兩種平板的活性,具有下列改變取作熱穩定性測定的樣品量是 25 μ l,30mM NaAc 緩衝液(pH4. 0)的量是 35 μ 1。如下計算熱穩定性為殘餘活性百分比邪風340)剩餘-空白χ100% J5S(340)初始-空白°在生長期後,就培養基中的剩餘葡萄糖測試粗製上清液材料。如果發現剩餘葡萄 糖,就從初始活性和剩餘活性的測量的吸光度值中減去該吸光度值。^h 96孔微量滴定板用Bradford測丨定定量蛋白質試劑溶液是Bradford Quickstart 工作溶液(BioRad cat#500_0205)。在新的 96 孔平底板中置入100 μ 1的IOkD-過濾的上清液。在每個孔中加入200 μ 1試劑,在室溫孵 育 5 分鐘。在 MTP 讀板器(Molecular DevicesSpectramax 384 plus)中,測量 595nm 吸光 度。根據牛血清白蛋白(BSA) (0-50 μ g/ml)標準曲線計算蛋白質濃度。己糖激酶活件測定 己糖激酶混合物在使用前10-15分鐘,向BoatIL容器葡萄糖HK Rl (IL檢測葡萄 糖(HK)試劑盒,Instrument Laboratory#182507-40)中加入 90ml 水,輕柔混合。將 85 μ 1 己糖激酶混合物加入到100 μ 1的dH20中。混合物中加入15 μ 1樣品,在黑暗室溫下孵育5 分鐘。在MTP讀板器中,讀出340nm處的吸光度。根據葡萄糖(Ο-lmg/ml)標準曲線計算葡 萄糖濃度。乙醇應用測定條件為了製備8%儲液將8g可溶性玉米澱粉(Sigma#S4180)在室溫下懸浮於40ml dH20中。在250ml的燒瓶中向漿液中加入50ml煮沸的dH20,煮5分鐘。將澱粉溶液冷卻至 25°C,用dH20調節體積至100ml。通過用100mMpH3. 7的乙酸鈉緩衝液稀釋儲液(1:1), 來製備4% (m/v)可溶性澱粉工作溶液。對於篩選測定,在平底的96孔MTP中,用175 μ 1的50mM NaAc緩衝液pH4. 5稀 釋5μ1粗製上清液。向120 μ 1 4%可溶性玉米澱粉中加入60 μ 1該稀釋液,並在32°C 900rpm(Thermolab系統iEMS培養箱/搖床HT)孵育2小時。加入90 μ 1 4°C -冷卻的終止 溶液(800mM甘氨酸-NaOH緩衝液,ρΗΙΟ.Ο)來終止反應。樣品置於冰上。在15°C,1118Xg 旋轉沉降澱粉5分鐘(SIGMA6K15),在上述己糖激酶活性測定中使用15 μ 1上清液,來確定 葡萄糖含量。在生長期後,就培養基中的剩餘葡萄糖測試粗製上清液材料。如果發現剩餘葡萄 糖,不計算由葡糖澱粉酶產生的葡萄糖的量。增甜劑應用測定條件為了製備8%儲液將8g可溶性玉米澱粉(Sigma#S4180)在室溫下懸浮於40ml 水中。在250ml的燒瓶中向漿液中加入50ml煮沸的dH20,煮5分鐘。將澱粉溶液冷卻至 25°C,用dH20調節體積至100ml。通過用100mMpH4. 5的乙酸鈉緩衝液1 1稀釋儲液,來 製備4% (m/v)可溶性澱粉工作溶液。在新的96孔平底板中放置50微升80mM NaAc緩衝液(pH4. 5)。每個孔加入120 μ 1 4%可溶性玉米澱粉和5 μ 1 IOkD-過濾的上清液,在60°C孵育1小時。加入90 μ 1 4°C冷 卻的終止溶液(800mM甘氨酸-NaOH緩衝液,pH10. 0)來終止反應。樣品置於冰上30分鐘。 在15°C,716rpm下旋轉沉降澱粉5分鐘(Sigma 6K15,離心),在上述己糖激酶活性測定中 使用15 μ 1上清液,來確定葡萄糖含量。實施例1
pREP3Y_TrGA 載體的構建 TrGA表達盒包括編碼TrGA信號肽,前序列和成熟蛋白質的DNA序列(SEQ ID NO :4),所述成熟蛋白質包括催化結構域、接頭區域和澱粉結合結構域,將所述表達盒克隆 到pD0NR 201中,它是Gateway 進入(Entry)載體(英傑生命科學公司(Invitrogen), Carlsbad, CA, USA)。通過Gateway LR重組反應將TrGA表達盒克隆到Gateway相容性目 標載體PREP3Y-DEST (圖3)中。pR印3Y-TrGA表達載體(圖3B)使TrGA蛋白質(SEQ ID NO 2)能夠在粟酒裂殖 酵母(Schizosaccharomyces pombe)中表達。利用pDONR-TrGA進入載體(圖2)作為模板,和表2中列舉的引物,構建65個TrGA 位點飽和誘變(SSM)文庫。在實驗中使用的誘變引物在下述位置均包含三聯體DNA序列密 碼子NNS(N = A、C、T、G和S = C或G),苷酸所述位置對應於TrGA序列(SEQ ID NO 2)中要 被突變的密碼子,並且該位置允許隨機摻入核苷酸。每個SSM文庫的構建都始於兩步PCR擴 增,所述PCR擴增利用Gateway正向引物(pD0NR201_FW)和特異的反向誘變引物(表3),和 Gateway反向引物(pD0NR201_RV)和特異的正向誘變引物(表2)(誘變引物的等價位置)。 根據法恩酶公司(Firmzymes)提供的方案,PCR擴增反應(0. 2 μ M引物,25個循環)使用 Phusion高保真DNA聚合酶(法恩酶公司(Finnzymes 0Υ),Espoo,Finland)。簡而言之,在 48μ 1新鮮的PCR反應溶液中,加入1μ 1(SEQ ID NO 1)都靶向相同密碼子的兩種特異PCR 混合物的DNA片段,以及引物Gatewav Fw和GatewayRV (英傑生命科學公司(Invitrogen)) 並混合。該融合PCR擴增(22個循環)獲得具有特異的隨機突變的TrGA密碼子,以及兩端 具有獨特的Gateway重組位點的線性表達盒DNA片段。該DNA片段的純化(ChargeSwitch PCR提純,英傑生命科學公司(Invitrogen),CarlsbadUSA),和與pD0NR201 (英傑生命科學 公司(Invitrogen))的BP重組反應(英傑生命科學公司(Invitrogen),Carlsbad, USA), 產生了環狀的多聚DNA (進入載體),其隨後被轉化至大腸桿菌Max efficiency DH5 α (英 傑生命科學公司(Invitrogen)),並放置於補充了 50yg/mL卡那黴素的2χΤΥ培養基中 [Bacto 胰蛋白腖(Difco) 16g/L,Bacto 酵母提取物(Difco) 10g/L, NaCL 5g/L]。表2.用於產生TrGA SSM文庫的正向引物
補充了 ο. 015% Tween-80的50mM NaAc pH4. 5稀釋至初始體積。該溶液用於不同的測定。實施例3
4種TrGA變體的組合文庫的構建(A)進行實驗構建攜帶下列單位點突變組合的TrGA變體Q172F ;Q208N ;S211R和 V314H。變體的概述顯示如下a)Q172F ;Q208Nb)Q172F ;S211Rc)Q172F ;V314Hd) Q208N ;S211Re)Q208N V314Hf)S211R ;V314Hg)Q172F ;Q208N ;S211Rh)Q172F ;Q208N ;V314Hi)Q172F ;S211R ;V314Hj)Q208N ;S211R ;V314Hk)Q172F ;Q208N ;S211R ;V314H使用Quikchange 多位點定向誘變(QCMS)試劑盒(Stratagene)構建文庫。用 於創建文庫的5』磷酸化引物顯示在表4中。通過使用HPLC、PAGE或任何其它類型的純化 引物(Irwitrogen),可以獲得全長引物摻入以及引物導致錯誤顯著降低的最佳結果。表4 用於構建選定的組合變體的引物 利用Stratagene的QCMS試劑盒,使用模板質粒pDONR-TrGA (圖2)構建組合 文庫。根據供應商描述,用反應中使用的改良的引物濃度,構建文庫。特別地,將4μ1 pDONR-TrGA (25-50ng)與 11 μ 1 無菌蒸餾水、1. 5 μ 1 的 dNTP、2. 5 μ 1 的 10 X QCMS-緩衝液、 ι μ 1酶混合物和ι μ 1各種突變引物混合物(在每種反應中提供總共Ioong的引物)混合。 PCR條件是在MJResearch熱循環儀中,使用薄壁的0. 2ml PCR管,在95°C下1分鐘,然後進 行30個循環的在95°C下1分鐘、55°C下1分鐘和65°C下6分鐘。用來自QCMS試劑盒的 1 μ 1的Dpnl在37°C孵育過夜,消化反應產物。使用PCR純化試劑盒(Qiagen)進行樣品純 化,並在37°C用Dpnl (Stratagene)進行1小時的第二輪消化。將反應混合物轉化到大腸桿菌Max efficiency DH5 α (Invitrogen)中,並在選擇 性瓊脂(補充了 50 μ g卡那黴素/mL的2xTY)上鋪板。在37°C孵育過夜後,挑取96個單個 菌落進行序列分析(BaseClear B. V.,Leiden, Netherlands)。克隆組合變體,並如下述和 W006/060062所述,在裡氏木黴宿主菌株中表達。(B)還通過Geneart公司(Regensburg,Germany)合成生產了其它6個組合文庫 (表5),測試熱穩定性,以及在如本文所述的乙醇和增甜劑應用測定中測試。表5:重組文庫 實施例4具有改善的熱穩定性的變體在所述條件下的親本TrGA分子具有在15和44%之間的殘留活性(日常變動)。 基於同一批次的TrGA熱穩定性計算性能指數。性能指數是商值PI=(變體殘留活性)/ (TrGA殘留活性)。性能指數> 1表示改善的穩定性。具有熱穩定性的性能指數大於1. 0 的變體顯示在下表6中。表6 熱穩定性篩選實施例5來自乙醇篩選測定的高性能變體在乙醇篩選測定中利用上述測定來測試變體。表7顯示了對與親本TrGA PI相比, 具有性能指數(PI) > ι. O的變體進行篩選測定的結果。PI是比活性(活性/mg酶)的測 量值。比活性的PI是「變體比活性/WT比活性」的商值。比活性的PI是1.0,並且具有PI > ι. O的變體具有大於親本TrGA的比活性。比活性是乙醇篩選測定測量的活性除以上述 Bradford測定獲得的結果。表7:乙醇篩選 實施例6來自增甜劑篩選測定的高性能變體在如上所述的增甜劑篩選測定中測試變體。表8顯示了篩選測定的結果,其中顯 示了與親本TrGA PI相比,具有性能指數(PI) > 1.00的變體。PI是比活性(活性/mg酶) 的測量值。比活性的PI是「變體比活性/WT比活性」的商值。比活性的PI是1. 0,並且具 有PI > 1. 0的變體具有大於親本TrGA的比活性。表8 增甜劑篩選實施例7載體構建和轉化裡氏木黴宿主細胞Α.含有編碼變體GA的多核苷酸的表達載體的構建將包含SEQ ID NO 4的DNA序列的TrGA表達盒克隆到pDONR 201中,其是 Gateway 進入載體(Invitrogen,Carlsbad, CA)。通過 Gateway LR 重組反應,將 TrGA 表達盒克隆到Gateway相容性目標載體pTrex3g_DEST (圖5)中,其公開於WO 06/060062 中。pTrex3g-TrGA表達載體(圖5)使得在裡氏木黴宿主中能夠表達TrGA蛋白質(SEQ IDNO 2)。構建載體,其包括編碼至少下列變體的修飾的TrGA cDNA (1)V314H ; (2)S211R ; (3)Q208N 禾口 (4)Q172F。
B.轉化 使用粒子轟擊,通過PDS-1000/Helium系統(BioRad目錄號165-02257),將含有 變體GA的表達載體轉化到來自RL-P37(IA52)並且具有多種基因缺失(Acbhl,Acbh2, Aegll, Aegl2)的裡氏木黴宿主菌株中。方案概述如下,還參考WO 05/001036的實施例6 和11。製備來自裡氏木黴菌株的孢子懸液(約5xl08孢子/ml)。將100至200微升的 孢子懸液塗布在基本培養基(MM)乙醯胺培養基的平板中央。MM乙醯胺培養基具有下列組 成0. 6g/L 乙醯胺;1. 68g/L CsCl ;20g/L 葡萄糖;20g/L KH2PO4 ;0. 6g/L CaCl2 · 2H20 ; lml/ L 1000X痕量元素溶液;20g/L瓊脂;和pH5. 5 ; lml/L 400X痕量元素鹽溶液檸檬酸175g/ L, FeSO4 · 7H20200g/L, ZnSO4 · 7H20 16g/L, CuSO4 · 5H20 3. 2g/L, MnSO4 · H2O 1. 4g/L, H3BO3 0. 8g/L。使孢子懸液在MM乙醯胺培養基的表面乾燥。按生產商的說明進行轉化。簡而言之,將60mg的MlO鎢顆粒置於微離心管中。加 入ImL乙醇,靜置15分鐘。顆粒在15,OOOrpm離心15秒。去除乙醇,在加入ImL的50% (v/v)無菌甘油前,用無菌dH20洗滌顆粒3次。將25 μ 1鎢微粒懸液置於微離心管中。當 持續旋轉時,加入下列成分0. 5-5 μ 1 (100-200ng/ μ 1)質粒DNA, 25 μ 1的2. 5Μ CaCl2和 10 μ 1的0. IM亞精胺。顆粒離心3秒。去除上清液,用200 μ 1的70% (ν/ν)乙醇洗滌顆 粒,離心3秒。去除上清液,加入24μ1 100%乙醇,吸液混合,將管置於超聲波浴中,移去 8μ1顆粒的等分試樣,將其放在乾燥器中的巨載體盤中央。一旦鎢/DNA懸液乾燥,就將微 載體盤與具有孢子的MM乙醯胺平板一起放於轟擊室中,根據生產商的指導實施轟擊過程。 在用鎢/DNA顆粒轟擊平板孢子後,在28°C孵育平板。在4天後,將轉化的茵落挑取到MM乙 醯胺的新鮮平板上(Pentilla等人,(1987) Gene 61 155-164).C.證實在轉化細胞中表達的變體TrGA的GA活性在匪乙醯胺平板上生長5天後,將表現出穩定形態的轉化體接種到含有30ml Proflo 培養基的 250ml 搖瓶中。Proflo 培養基含有30g/L α -乳糖;6. 5g/L (NH4)2SO4 ; 2g/L KH2PO4 ;0. 3g/L MgSO4 · 7H20 ;0. 2g/LCaCl2 · 2H20 ; lml/L 400X 痕量元素鹽溶液檸檬 酸 175g/L,FeSO4 · 7H20200g/L, ZnSO4 · 7H20 16g/L, CuSO4 · 5H20 3. 2g/L, MnSO4 · H2O 1. 4g/ L,H3BO3 0. 8g/L ;2ml/L 10% Tween 80 ;22. 5g/L ProFlo 棉籽粉(Traders 蛋白質公司, Memphis, TN) ;0. 72g/L CaCO30 在 28°C和 140rpm 下生長 2 天后,將 10% 的 Proflo 培養物轉 移到含有30ml乳糖確定成分培養基(LactoseDefined Media)的250ml搖瓶中。乳糖確定 成分培養基的組成如下5g/L (NH4)2SO4 ;33g/L 1,4_哌嗪雙(丙磺酸)緩衝液;9g/L酪蛋白 胺基酸;4. 5g/LKH2P04 ;1. Og/L MgSO4 ·7Η20 ;5ml/L Mazu DF60-P 消泡劑(MazurChemicals, IL) ;1000X痕量元素溶液;pH5. 5 ;在滅菌後向培養基加入40ml/L的40% (w/v)乳糖溶液。 乳糖確定成分培養基搖瓶在28°C,140rpm下孵育4_5天。將培養上清液的樣品與含有還原劑的合適體積的2x上樣緩衝液混合。通過離心 去除菌絲體,分析上清液的總蛋白(BCA蛋白質測定試劑盒,Pierce公司目錄號23225)。使用pNPG作為底物(Sigma N-1377),利用對硝基苯-α -D-吡喃葡萄糖苷(pNPG) 測定測量GA活性。在該測定中,測量了葡糖澱粉酶催化對硝基苯_ α -D-吡喃葡萄糖苷 (pNPG)水解為葡萄糖和對硝基酚的能力。在鹼性PH下,硝基酚形成黃色,這與葡糖澱粉 酶活性成比例,在405nm下監測,並與測量為GAU的酶標比較(Elder,Μ. Τ.和MontgomeryR. S. ,Glucoamylase activity in industrial enzyme preparations usingcolorimetric enzymatic method, Journal Of AOAC Internationiil,· 78 (2),1995) 。 —f GAU ■胃| 為產生Igm還原糖的酶量,其是按照pH4. 2和60°C每小時從可溶性澱粉底物產生的葡萄糖 (4% ds)而被計算的。在NuPAGE Novex 10 % Bis-Tris Gel 上,使用 MES SDS 運行緩衝液 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),通過 PAGE 電泳確定蛋白質譜。
實施例8選定變體對可溶性澱粉的小規模應用測試表達單個變體a)V314H、b)S211R、c)Q172F和d)Q208N的裡氏木黴宿主菌株,在 34°C、pH3. 5下,在補料分批的14L發酵罐中的營養培養基中生長,所述營養培養基包括葡 萄糖(Cerelose DE99),KH2PO4, MgSO4 · 7H20, (NH4)2SO4, CaCl2 · 2H20,痕量元素和 Mazu 消泡 劑(DF6000K)。在耗盡葡萄糖後,將生長溫度和pH分別調至28°C和4. O。通過過濾去除細 胞材料,收集培養上清液,濃縮至含有大於90%的葡糖澱粉酶(作為總蛋白)。確定在pH4.3,32°C和60°C下,在可溶性馬鈴薯澱粉上葡萄糖生產的多種動力學 性質,並與野生型TrGA比較。與野生型(TrGA)相比,四個變體的每一個都表現出增加的 Vmax(yM葡萄糖/秒)值,提示升高的催化速率G^JsecT1))。圖6顯示了每個測試溫度下 兩個重複的Vmax。實施例9確定變體EtOH生產性能的方法利用新型小規模乙醇應用測試,對鑑定為比親本TrGA具有更高性能指數的變體 (參見表7/8)實施篩選的驗證。選擇自點評估(site evaluation)和組合文庫(表9)的 24個變體,將它們直接轉化進裡氏木黴中用於大規模表達和測試。利用差示掃描熱量測定 法(如下文描述的DSC分析)測試變體的熱解摺疊,利用新型的次級小規模乙醇應用測定 來測試變體性能。方法包括兩步1)將變體注射至陰離子交換柱,精確的確定蛋白質濃度; 和2)用三種不同的TrGA濃度(0.3-0. 15-0. 075g/28g ds)滴定變體,從而計算它們相對於 野生型分子的乙醇生產性能。表9:組合變體列表 蛋白質純化和確定利用AKTA 探索 100 FPLC 系統(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)純化粗 酶製品。將 環糊精(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht, TheNetherlands ;85. 608-8)偶聯 到環氧-活化的瓊脂糖珠子(GE Healthcare, Diegem, Belgium ;17-0480-01)上。用柱捕 獲酶製品中的葡糖澱粉酶。使用含有10mM a-環糊精(Sigma,28705)的25mM Tris緩衝 液,pH7. 5或50mM乙酸鈉緩衝液,pH4. 3,從珠子上洗脫酶。通過SDS-PAGE分析純化的樣品。 為了精確確定變體的蛋白質濃度,開發了基於FPLC的蛋白質測定方法。首先利用標準的 Bradford方案(Bio-Rad cat#500-0205)確定純化的標記TrGA分子的蛋白質濃度。然後, 將純化的樣品注射到ResourceQ 1ml柱(GE Healthcare)上,用含有500mM NaCl的25mM Tris pH緩衝液洗脫酶。確定峰面積,相對於具有已知濃度的TrGA標準的峰面積,計算蛋白 質濃度。小規模EtOH應用表10總結了通過不同組合變體的乙醇和糖(DP1,DP2,DP > 3)的產量。獲得玉米 醪液液化物的樣品,並利用稀釜餾物稀釋至26% DS。利用4N硫酸將漿液的pH調至pH4. 3。 將100g醪液等分試樣置於32°C水浴中,使其平衡。在加入lOOyl 400ppm尿素後,向每個 玉米醪液樣品中加入1ml純化的變體TrGA酶樣品(150y g/ml)或純化的TrGA(300、150、 75 u g/ml)。最後,向每個樣品中加入333 u 1的在45ml DI水溶液中經過30分鐘水合的15g RedStar Red 酵母(Lesaffre 酵母公司(Lesaffre yeast Corp)Milwaukee,WI)。在 5、21、 28、48和52小時取樣,利用Aminex HPX-87H柱9 (Bio-Rad)進行HPLC分析。乙醇和碳水化合物測定2ml Eppendorf離心管中裝入發酵醪,在冰上冷卻10分鐘。樣品在14,OOOXg離心 3分鐘,將500 yl的上清液轉移到含有50 yl殺傷溶液(1. 1N硫酸)的試管中,靜置5分鐘。 向試管中加入5. 0ml的水,然後過濾到0. 22iim過濾平板(多屏,Millipore,Amsterdam, the Netherlands)中,運行HPLC。柱溫:60°C;移動相0. 01N硫酸;流速0. 6ml/分鐘;檢測 器RI ;注射體積20yl。柱基於電荷和分子量分離分子;DPI(單糖);DP2( 二糖);DP3(三糖);DP > 3 (具有聚合度大於3的寡糖);琥珀酸;乳酸;甘油;甲醇;乙醇。DSC 分析利用差示掃描熱量測定法(DSC)測定純化的酶樣品(0. 2-0.4mg/ml)的熔融溫度。表10.乙醇和糖類的生產 表11:乙醇產量 除ET7-2外,所有的組合變體都比TrGA野生型表現的更好。表現最好的LR8具有 1.56倍改善的性能。表12給出了利用小規模乙醇應用測定測試的單位點和組合誘變體的概述。表12 中陰影化的變體具有比TrGA更好的性能,還具有更高的熱解摺疊溫度(dTm)。表12 變體相對於TrGA的性能和熱解摺疊 結果顯示,色譜法(FPLC)是精確確定蛋白質濃度的有效工具。結果還顯示,用三 種濃度的TrGA滴定變體是小規模確定變體性能的有價值的方法。7個變體的表現好於TrGA 野生型(參見表12),還具有更高的熱解摺疊溫度,表現不如TrGA的變體則具有較低的Tm。實施例10 選定的組合和單位點變體集合的比活性測定,和LR8的底物特異性 分析了一組組合變體和一些用於構建組合變體的單位點變體的比活性(表13)。 進一步研究了 LR8(用小規模應用測定確定PI 1.56)的底物特異性。這是通過建立MTP測 定來確定GA變體的葡萄糖產率,和確定LR8變體的底物特異性實現的。發現變體之間的MTP 測定不同,且除ET7-1外,所有變體都顯示出比野生型(wt)裡氏木黴葡糖澱粉酶更高的速 率。另外,一些變體(LR8/ET8/Q172F)的實施效果比TrGA好20-30%。與野生型相比,LR8 在可溶性玉米澱粉和兩種不同的玉米醪液液化物樣品上效果更好。在下列實驗中使用的底物是可溶性玉米澱粉儲液,製備如下將8g可溶性玉米澱 粉(Sigma # S4180)溶解在100ml milliQ水中,微波爐加熱1分鐘。將分散體煮沸5分鐘, 冷卻後,調整體積至100ml。用IOOmM NaAc緩衝液、pH4,1 1稀釋儲液來製備4%可溶性 玉米澱粉。在一個實驗中,使用溼度分析儀測量% ds來製備玉米液化物底物(NE),然後用 50mM NaAc7. 5倍稀釋底物,最終獲得4% ds。底物在2000 X g離心5分鐘,用0. 22 μ m濾器 過濾上清液。在另一個實驗中,除了在離心前將底物10倍稀釋外,以相同方式製備玉米液 化物底物(BSE)。使用150 μ g酶/ml (3 μ g/180 μ 1反應混合物)的儲液稀釋酶。用50mMNaAc ρΗ4· 0 如下進一步稀釋溶液:300ng(10x)、200ng、150ng、100ng、75ng、50ng、25ng、10ng/180y 1 反
應混合物。如下實施測定每個孔加入40 μ 1 50mM NaAc ρΗ4. 0,120μ 1 4%可溶性玉米澱 粉,和20 μ 1酶。樣品在32°C,900rpm孵育2小時,並且加入90 μ 1800mM甘氨酸-NaOH緩 衝液PH105分鐘後,在冰上終止。平板在15°C,2000rpm離心5分鐘。向新鮮的平板中加 入85 μ 1 milliQ水和100 μ 1己糖激酶混合物(II測試葡萄糖(HK)試劑盒,Instrumental Laboratory # 182507-40)和20 μ 1上清液。對於葡萄糖(Ο-lmg/ml)校準線,則加入20 μ 1 葡萄糖儲液替代。平板在室溫黑暗中孵育10分鐘,然後利用Spectramax進行340nm處吸 光度測量。表13 相對於野生型的性能 利用PEG-原生質體方法(參見例如,Pentiim等人,(1987)Gene 61:155-164) 將SEL轉化到裡氏木黴中。裡氏木黴宿主是源自RL-P37(IA52)的菌株,具有四個基因缺失
(Acbhl, Acbh2,Aegll, Δ egl2 卩,「四重缺失」;參見美國專利 5,847,276、W0 92/06184
和TO05/001036)。在25 μ 1總體積的轉化混合物中,含有至多600ng的DNA和1_5X IO5原生質體,所述轉化混合物用200ml的25% PEG溶液處理,用2倍體積的1. 2M山梨糖醇溶 液稀釋,與含有乙醯胺的3%選擇性頂層瓊脂糖匪混合,並倒在含有乙醯胺的2%選擇性 瓊脂糖上,或在24孔微滴度平板上。平板在28°C孵育5-8天。利用0.85% NaCUO. 015% Tween 80的溶液,從平板收穫在各個單獨的孔再生的轉化體總群體的孢子。使用孢子懸浮 液接種96孔MTP中的發酵。在24孔MTP的情況下,為了富集孢子數量,引入了對含選擇性 乙醯胺匪的新24孔MTP額外的塗板步驟。
在MTP中發酵轉化體,使用含有表達蛋白質變體的培養上清液進行測定。簡而言 之,用表達TrGA變體的裡氏木黴轉化體的孢子懸浮液(超過IO4孢子/孔),一式四份地接 種含有200 μ 1的LD-GSM培養基的ΜΤΡ。平板在28°C用230rpm和80%溼度孵育6天。通 過真空過濾收穫培養上清。在不同的測定中使用上清,篩選具有改進性質的變體。表15-17中顯示了在熱穩定性、比活性以及同時在熱穩定性和比活性中表現出性 能指數大於1.0的變體。表15 其它TrGA變體的熱穩定性篩選 表17 同時表現出增加的熱穩定性和比活性的其它TrGA變體 實施例12 選定的單位點和組合變體的集合的表徵基於實施例4-6和11的結果,針對選定的組合變體和單位點變體的集合,進一步 表徵了它們的改變的性質。選定的集合包括具有以下位置取代的單位點和組合變體143、 D44、Ν61、G73、G294、L417、Τ430、Α431、Ε503、Q511、Α535、Α539 和 / 或 Ν563。從大規模發 酵中純化變體,並確定熱穩定性和比活性的ΡΙ。特別的,利用不同的底物確定比活性,包括 DP7、玉米澱粉和液化物。結果顯示在表18和19中。表18 選定的單位點變體集合的PI,每個變體來自500ml發酵物 表19 選定的組合變體集合的PI 對於蛋白質表達和純化,將編碼紅褐肉座茵GA的基因,根據美國專利7413,887 中描述的方案,進行克隆和表達。所有結晶實驗使用的TrGA蛋白質材料都如下通過陰離子交換色譜進行一步初 級純化包含180mg/ml總蛋白的、表達的TrGA的濃縮培養上清液通過在25mM Tris-HCI, pH8. 0緩衝液中1 10稀釋樣品來製備。使用HiPr印16/10 Q Sepharose FF柱(GE Helthcare)進行陰離子交換純化。用4倍柱體積(CV)的起始緩衝液(25mM Tris-HCl, pH8. 0)平衡HiPr印柱,然後,再使用IOml的稀釋的蛋白質樣品。使用在運行緩衝液 (25mMTris-HCl,pH8. 0)中的0_140mM NaCl的8CV線性梯度洗脫結合的蛋白質。在約80mM NaCl鹽濃度下從HiPr印Q瓊脂糖柱上洗脫結合的TrGA。合併含有純TrGA蛋白質的級分,並 使用具有10 kD分子量截留(cutoff) (MWCO)的25ml Vivaspin離心濃縮管(Viva Science) 將其濃縮至50mg/ml。使用DG-10脫鹽柱(Bio-Rad)(用50mM乙酸鈉緩衝液,pH4. 3平衡), 將純化和濃縮的TrGA材料進行緩衝液交換。通過測量280nm處的吸光度確定蛋白質濃度。 然後將初步純化和濃縮的TrGA蛋白質儲液儲存在-20°C。還引入了兩步額外的純化步驟,額外的陰離子交換純化和大小排阻純化,來增加 TrGA蛋白質材料的結晶能力(crystability)。如下進行這兩步額外的純化步驟首先,使 用IOml MonoQ柱(GE Helthcare)的陰離子交換純化步驟。將Iml初步純化和冷凍的TrGA 材料(50mg蛋白質)樣品解凍,通過將樣品在新鮮緩衝液中重複稀釋至6ml,再利用6ml 5 kD MWCO濃縮管將樣品再次濃縮至0.5ml,將緩衝液換為20mM Tris_HCl,pH8. O。在最後一 次濃縮步驟後,在蒸餾水中稀釋TrGA樣品,直到蛋白質樣品的電導率達到與陰離子純化的 起始緩衝液的電導率相對應,所述起始緩衝液即,25mM Tris-HCl,pH8. O。首先用4倍柱體積 (CV)的起始緩衝液平衡MonoQ柱,然後向柱內加入稀釋的蛋白質樣品。通過兩個不同的梯 度從MonoQ柱上洗脫結合的蛋白質。首先,使用4CV線性pH梯度,其中起始緩衝液的pH從 8.0降至6.0。在第二個梯度中,使用8CV長的鹽梯度,其中,運行緩衝液(25mM Tris-HCl, pH6. 0)中的鹽濃度從O增加至350mM NaCl。在第二個鹽梯度過程中,在約150mM NaCl濃 度處,發現從柱上洗脫了結合的TrGA。合併含有TrGA的級分,並使用6ml 5 kD MWCO的 Vivaspin濃縮管將其濃縮至2ml。然後,將濃縮的TrGA樣品用於Superdex 200 16/60大小 排阻柱(GE Helthcare)上,所述排阻柱用 4CV 的 20mM Tris-Cl, pH8. O 和 50mMNaCl 平衡, 所述平衡液還用做運行緩衝液。在大小排阻純化後,合併來自主洗脫峰的級分,並利用6ml 5 kD MWCO的Vivaspin離心濃縮管將其濃縮至約7. 5mg/ml的蛋白質濃度。對於蛋白質結晶,用來發現初步的TrGA結晶條件的蛋白質樣品是這樣的TrGA材 料樣品,其通過陰離子交換純化一次,然後儲存在-20C。在初步結晶實驗前,將TrGA蛋白質 樣品解凍,並用50mM乙酸鈉緩衝液,pH4. 3稀釋至約12mg/ml。正交晶的χ-射線數據集通 過分子替換(MR)用於解析TrGA的結構,而高解析度正交晶的數據集,用於最終的正交晶的 空間群TrGA結構模型。發現使用懸滴的蒸氣擴散方法(McPherson 1982),在20°C下,正交 晶的TrGA晶體生長在含有25% PEG 3350,0. 20M乙酸銨,0. IOM Bis-Tris pH5. 5 (池液) 的溶液中。通過將等量的蛋白質溶液(12mg/ml)和池液混合至終體積10μ 1,來製備結晶 化懸滴。發現TrGA晶體屬於正交晶的空間群Ρ212121,具有晶胞大小約a = 52. 2人,b = 99. 2人,c = 121. 2人,所述晶體具有計算的Vm為2. 3 (Matthews 1968),且一個分子在不對 稱單元中。
對於x-射線數據收集,在室溫,從固定在密封毛細管內的單晶體收集兩套正交晶 的TrGA數據集。在home X-射線源——具有聚焦鏡的MSC/Rigaku (Molecular Structures Corp.,The Woodlands, Texas) RaxisIV++成像板檢測器上,利用來自 Rigaku RU200 旋轉 陽極發生器的CuKa射線,收集初步Io-解析度正交晶的TrGA X-射線數據集,用於解析 通過分子替換方法(MR)的結構。使用由MSC/Rigaku提供的d*trek軟體來處理、衡量和 平均該數據集。在IOOK從單個冷凍的TrGA晶體收集C中心的單斜數據集,所述單個冷凍 的 TrGA 晶體在包含 25% PEG 3350,15%甘油,50mM CaCl2 和 0. IM Bis-Tris pH5. 5 的冷 凍保護劑(作為冷凍保護劑)中平衡,置於人造絲纖維環內,在轉移到同步加速器前浸入 液氮中冷凍。高解析度正交晶的(1.9A)數據集和C中心的單斜晶數據集(1.8A)都在 Lund,Sweden的MAX LAB同步加速器源,光束911 5處收集。用MOSFLM處理自同步加速 器源收集的兩套數據集,並用包含在CCP4程序包(Collaborative Computational Project Number 4 1994)中的程序SCALA衡量。除非另外提及,所有的後繼數據處理都使用CCP4程 序包實施(Collaborative Computational Project Number 4 1994)。從每套數據集留出 了一組 5% 的反射,用作為監控 R-free(Briinger,A (1992) Nature,355 :472_475)。
使用包括在CCP4程序包中的自動置換程序MOLREP (ColIaborativeComputatio nal Project Number 4 1994),通過MR,利用初步的Io-解析度正交晶的數據集,以及利 用泡盛麴黴 GA(AaGA)變體 X100(pdb 進入 IGLM(Aleshin 等人,(1994) J. Mol. Biol. 238 575-591)的坐標作為搜索模型,初步解析TrGA結構。編輯了泡盛麴黴GA搜索模型,以在進 行MR實驗前去除附著在蛋白質分子上的作為N-和O-糖基化的所有糖基化部分,以及所有 的溶劑分子。來自初步Io-解析度TrGA數據集的,所有解析度在36. 8和2. 8 Λ之間的反 射都用於MR解析。MR程序發現了單旋轉功能解析,具有高於背景最大11. 1 σ,高於背景的 次最大為3.8σ。翻譯功能解析產生了 48。7%的R-因子,並具有17. 4的對照因子。利用 程序 Refmac 5. O (Murshudov 等人,(1997) Acta Crystallogr. D53 :240_255)對 MR 解析進 行了 10輪限制性最小二乘精修法的優化。這將結晶學R-因子降低至31. 1%,同時R-自由 值從42. 2%降至41. 1%。精修的MR解析模型用於從Io-解析度正交晶的TrGA數據集計算初始密度圖。 在該電子密度圖中,可以方便的鑑別出在TrGA的19和26位殘基之間的二硫橋的電子密 度,所述二硫橋是泡盛麴黴變體XlOO結構模型中不存在的二硫橋。這提示所述電子密度 圖的質量足夠用於從胺基酸序列構建TrGA的結構模型。精修基於Io-解析度數據集的初 始 TrGA 結構模型,所述精修利用了 Coot (Emsley 和 Cowtan,(2004) Acta Crystallogr. D boiICrystalIogr· 60 =2126-2132)構建的交替循環模型,和Refmac 5. O的最大可能性精 修。通過利用程序Refmac 5. 0,針對高解析度數據集精修了初始TrGA結構模型(進 行10輪限制性精修),將初始TrGA結構模型的解析度延伸到了高解析度正交晶的數據 集(1.9人)的解析度。利用精修程序中的水選取方案,將結構模型中的大部分水分子 自動定位,然後通過肉眼檢查人工選取或剔除。所有結構比較都使用Coot (Emsley和 Cowtan (2004)如上)或 O (Jones 等人,(1991)Acta Crystallogr. A47 110-119),並用 PyMOL(Delanoff. L. (2002)The PyMOL Molecular Graphics System.Palo Alto, CA, USA ; Delano Scientific)製圖。
根據這些結果,可見TrGA催化核心區段與Aleshin等人,1992對AaGA的(α/ α )6-桶狀拓撲結構的描述一致,由α螺旋的兩個桶組成,其中外螺旋的C-末端通向內螺 旋的N-末端。能夠鑑別電子密度中的關鍵差異,例如在殘基19和26之間的二硫橋,和相 對於AaGA的插入(殘基257-260)。包含80-100的片段也經歷了延伸的模型重建。鑑別的 一個主要的糖基化位點是在Asn 171,其上附著了至多四個糖苷部分。在AaGA中也鑑別出 了相似的糖基化位點。此外,催化核心在殘基22-23、44-45和122-123之間,含有三個順式 肽,所述催化核心在TrGA和AaGA之間是保守的。總而言之,當比較TrGA和AaGA的催化核 心的坐標時,453個C α原子中的409個之間有0. 535人的rms差異。實施例14 =TrGA和AaGA之間的同源性
實施例13中鑑別的TrGA的晶體結構,與以前已鑑別的泡盛麴黴GA(AaGA)的晶體 結構重疊。AaGA晶體結構獲得自蛋白質資料庫(PDB),且結晶的AaGA的形式是僅含有催化 結構域的形式。在本文中,將具有所有三個區域完整的裡氏木黴葡糖澱粉酶的結構確定至 1.8埃解析度(參見表15和實施例12)。利用坐標(參見表20),將結構與已測定的泡盛曲 黴菌株XlOO的催化結構域的坐標進行了比對(Aleshin,A. E.,Hoffman,C.,Firsov,L.M.和 Honzatko, R. B. 1994 Refined crystal structures ofglucoamylase from Aspergillus awamori var. X100. J Mol Biol 238 :575_591 和 PDB)。如圖 12 和 13 中可見,催化結構域 的結構緊密重疊,並允許基於該結構重疊鑑別等價的殘基。基於該分析,鑑別了能夠在TrGA中突變,並且導致增加的穩定性和/或比活性的 位點。這些位點包括活性位點的108、124、175和316位。還鑑別了特定的成對變體Y47W/ Y315F 和 Y47F/Y315W。鑑別的其它位點是 I43、D44、P45、D46、R122、R125、V181、E242、Y310、 D313、V314、N317、R408和N409。由於高的結構同源性,預期在TrGA中的位點上發現的有 益變體,在泡盛麴黴和其它同源的葡糖澱粉酶中也將具有相似的效果。在不脫離本發明的範圍和精神的條件下,本發明所述方法和系統的不同修飾和變 化對本領域技術人員是顯而易見的。雖然描述本發明已經就特定的優選實施方案進行了描 述,應該理解,要求保護的發明不應過分限於此類特定的實施方案。實際上,對本領域技術 人員顯而易見的、實施本發明的所述模式的不同修飾,也意在下列權利要求的範圍內。表 20.CRYSTl 52. 185 99. 232 121. 240 90.00 90.00 90.000RIGX11.000000 0.000000 0.0000000.000000RIGX20.000000 1.000000 0.0000000.000000RIGX30.000000 0.000000 1.0000000.00000分值10.019163 -0.000001 -0.0000010.00000分值20.000000 0.010077 0.0000000.00000分值30.000000 0.000000 0.0082480.00000原子IN SER A 1 -30.485 30.567 -21.185 1.00 37.11原子2 CA SER A 1 -30.568 29.350 -20.326 1.00 37.00原子3 CB SER A 1 -31.953 28.707 -20.424 1.00 37. 27原子4 OG SER A 1 -32.137 28.089 -21.695 1.00 40.11原子5 C SER A 1 -29. 519 28. 345 -20. 772 1.00 35.91
原子60 SERA1-29.04328.415-21.9111.0035.46原子7N VAL A2-29. 17027.425-19.8671.0034. 51原子8CA VAL A2-28. 30226. 293-20. 1791. 0033. 56原子9CB VAL A2-28. 14225. 339-18.9551.0033.84原子10CGl VAL A2-27. 34924. 103-19. 3161.0034. 20原子11CG2 VAL A2-27.46826.057-17.8271.0034. 79原子12C VAL A2-28.84625. 506-21. 3631.0032.48原子130 VAL A2-28.08625. 109-22. 2451.0031. 10原子14N ASP A3-30. 16025. 286-21. 3811.0031.43原子15CA ASP A3-30. 79124. 530-22.4571.0031. 38原子16CB ASP A3-32.28324.323-22.1901.0032.17原子17CG ASP A3-32. 52223.492-20.9431.0035. 28原子18ODl ASP A3-32.41322. 251-21.0281.0036.80原子190D2 ASP A3-32. 78624.092-19.8701.0040.63原子20C ASP A3-30. 55625. 153-23.8181.0030. 59原子210 ASP A3-30. 28224.446-24. 7781.0030. 19原子22N ASP A4-30.64426.477-23.8751.0029.89原子23CA ASP A4-30. 36927. 244-25.0831.0029.99原子24CB ASP A4-30.60128. 731-24.8221.0031. 12原子25CG ASP A4-32.08829. 121-24. 7851.0034. 16原子26ODl ASP A4-32.99128. 260-24.9251.0036.06原子270D2 ASP A4-32. 34030. 332-24.6081.0039.96原子28C ASP A4-28.92527.049-25. 5791.0028.65原子290 ASP A4-28.69726.881-26. 7701.0028. 51原子30N PHE A5-27.96127.096-24.6601.0026. 74原子31CA PHE A5-26. 55326.860-24.9941.0025. 21原子32CB PHE A5-25.66627.110-23.7641.0025. 59原子33CG PHE A5-24. 24426.646-23.9311.0026.03原子34CDl PHE A5-23. 39527. 259-24.8541.0027. 29原子35CEl PHE A5-22.06326.823-25.0091.0027. 33原子36CZ PHE A5-21.59325.783-24.2281.0026. 77原子37CE2 PHE A5-22.42525. 181-23. 2861.0028.42原子38CD2 PHE A5-23. 74925.617-23. 1441.0028.42原子39C PHE A5-26. 35225.438-25. 5391.0024. 23原子400 PHE A5-25.65925. 244-26. 5441.0023. 56原子41N ILE A6-26.97424.458-24.8921.0022. 71原子42CA ILE A6-26.83523.065-25. 3121.0022. 36原子43CB ILE A6-27.49122. 106-24. 2991.0021.86原子44CGl ILE A6-26. 74422. 181-22.9561.0022. 27
原子45 CDlILE A6-27. 384 21. 347-21.8341.0022. 36原子46 CG2ILE A6-27.57120.669-24.8481.0021.69原子47 CILE A6-27. 38822.855-26. 7231.0022.84原子48 0ILE A6-26 . 75322. 216-27. 5731.0021. 76原子49 NSER A7-28. 55623.420-26.9961.0023. 10原子50 CASER A7-29. 14623. 175-28. 3091.0023.90原子51 CBSER A7-30.62723. 570-28. 3201.0025.04原子52 OGSER A7-30. 71724.982-28. 2821.0030.08原子53 CSER A7-28. 34023.874-29.4221.0022. 78原子54 0SER A7-28. 18623. 337-30. 5081.0022.94原子55 NTHR A8-27.80025.053-29. 1401.0022. 50原子56 CATHR A8-26.984 25.780-30.1151.0023.05原子57 CBTHR A8-26.834 27. 247-29.6981.0023.65原子58 OGlTHR A8-28. 13827.839-29. 7001.0027.60原子59 CG2THR A8-25.93928.018-30.6601.0026. 76原子60 CTHR A8-25.60125. 159-30. 3071.0021.46原子61 0THR A8-25. 10925.051-31.4371.0021. 38原子62 NGLU A9-24.97824.768-29.2001.0019.11原子63 CAGLU A9-23. 59624. 269-29. 2431.0018.01原子64 CBGLU A9-22.95924. 334-27.8471.0017. 76原子65 CGGLU A9-21.44923.945-27. 7941.0017. 71原子66 CDGLU A9-20.53624.892-28.6091.0020.86原子67 OElGLU A9-20.94926.010-28.9711.0019.89原子68 0E2GLU A9-19. 38924. 500-28.9091.0019. 22原子69 CGLU A9-23.46222.846-29. 7841.0017. 77原子70 0GLU A9-22.42322. 505-30. 3681.0018.05原子71 NTHR A10-24.48522.020-29. 5931.0015.87原子72 CATHR A10-24.404 20.609-29.9581.0017. 31原子73 CBTHR A10-25.67719.823-29. 5251.0017.46原子74 OGlTHR A10-25. 76819.860-28.0901.0017.46原子75 CG2THR A10-25.61618. 374-30.0371.0018.42原子76 CTHR A10-24.02620.346-31.4301.0017.40原子77 0THR A10-23.07319.615-31.6821.0017. 22原子78 NPRO A11-24.764 20.934-32.4121.0018.30原子79 CAPRO A11-24.34620.649-33.7981.0018.11原子80 CBPRO A11-25.44021.317-34.6621.0018.57原子81 CGPRO A11-26.094 22.310-33.7711.0019.16原子82 CDPRO A11-25.97521.779-32.3611.0018.54原子83 CPRO A11-22.96321.231-34.1421.0017.81
原子84 0 PRO A11-22.24120.655-34.9641.0017.74原子85 N ILE A12-22.60122. 353-33. 5201.0016.85原子86 CA ILEA12-21.27922.936-33.7311.0016.66原子87 CB ILEA12-21.16124.319-33.1121.0017.25原子88 CGl ILE A12-22. 19425. 267-33. 7511.0019. 25原子89 CDl ILE A12-22. 28926.635-33. 1011.0021.45原子90 CG2 ILE A12-19. 71424.855-33. 2701.0018. 75原子91 C ILE A12-20. 17022.023-33. 1781.0016. 30原子92 0 ILE A12-19. 15521. 798-33.8481.0014.64原子93 N ALA A13-20. 36021. 527-31.9511.0015. 28原子94 CA ALA A13-19. 37520.627-31. 3041.0015. 19原子95 CB ALA A13-19.78820.332-29.8831.0015.31原子96 C ALA A13-19.20419.326-32.0921.0015.37原子97 0 ALA A13-18.08318.834-32.2971.0013.56原子98 N LEU A14 -20.32018.743-32.5311.0015.13原子99 CA LEU A14 -20.22517.503-33.2851.0016.06原子IOOCB LEU A14 -21.63016.921-33.5101.0017.33原子101CG LEU A14 -21.68915.563-34.2121.0020.02原子102 CDl LEU A14 -20.94614.460-33.4711.0023.09原子103 CD2 LEU A14 -23.15015.225-34.3901.0021.86原子104 C LEU A14 -19.50617.749-34.6231.0015.61原子105 0 LEU A14 -18.65116.947-35.0391.0014.82原子106 N ASN A15-19.85318.852-35.2851.0015.30原子107 CA ASN A15-19. 23619. 228-36. 5671.0016. 34原子108 CB ASN A15-19.84820. 545-37.0731.0016.07原子109 CG ASN A15-19. 23221.010-38. 3881.0018. 31原子110 ODl ASN A15-19.56520.487-39.4311.0017.60原子111 ND2 ASN A15-18.31221.987-38.3251.0021.40原子112 C ASN A15-17.73619.450-36.4051.0015.35原子113 0 ASN A15-16.92618.954-37.1981.0015. 29原子114 N ASN A16-17.38520.180-35.3551.0014.82原子115 CA ASN A16-15.99220.555-35.1441.0015.27原子116 CB ASN A16-15.87221.693-34.1481.0015.41原子117 CG ASN A16-16.27623.023-34.7371.0016.53原子118 ODl ASN A16-16.51723.136-35.9541.0018.08原子119 ND2 ASN A16-16.32624.050-33.8961.0016.35
原子120 C ASN A16-15. 15919. 362-34. 7231.0014.91原子121 0 ASN A16-13.97519. 261-35.0991.0015. 34原子122 N LEU A17-15. 77118.460-33.9561.0014. 29
原子123 CA LEU A17—15.11417.191—33.6101.0013.90原子124 CB LEU A17-16.00316. 346-32.6721.0013.94原子125 CG LEU A17-15. 35115.065-32. 1331.0016.81原子126 CDl LEU A17-15.93314.708-30.7791.0020.06 原子127 CD2 LEU A17-15.48413.880-33.0971.0019. 31原子128 C LEU A17-14. 76316.409-34.8801.0014.06原子129 0 LEU A17-13.61315.957-35.0731.0012.69原子130 N LEU A18-15. 77416. 215-35. 7301.0013. 19原子131 CA LEU A18-15. 58915.441-36.9571.0014. 25原子132 CB LEU A18-16.95215.027-37. 5451.0013. 56原子133 CG LEU A18-17. 71714.013-36.684 1.0016.49原子134 CDl LEU A18-19. 17113.874-37. 1651.0016. 33原子135 CD2 LEU A18-17.02012.647-36.6551.0018. 51原子136C LEU A18-14.70316.132-38.0071.0013.49原子137 0 LEU A18-14.08315.435-38.8201.0014.69原子138 N CYS A19-14.61317.462-37.964 1.0013.01原子139 CA CYS A19-13.62918. 223-38. 7601.0013. 22原子140 CB CYS A19-13. 79619. 738-38. 5561.0014. 20原子141 SG CYS A19-15. 12520.407-39.6421.0016. 22原子142C CYS A19-12. 18217.808-38.4501.0013.86原子143 0 CYS A19-11.27818.043-39.2591.0013.42原子144 N ASN A20-11.96817.219-37.2721.0013. 21原子145 CA ASN A20-10. 59416.850-36.8301.0013.62原子146 CB ASN A20-10.39417.184-35.324 1.0013. 52原子147 CG ASN A20-10. 24218.687-35.0551.0016. 17原子148 ODl ASN A20-10.03519.119-33.8971.0017. 34原子149 ND2 ASN A20-10.34319.486-36.0901.0011.87原子150 C ASN A20-10.26215.381-37.1161.0013.99原子151 0 ASN A20_9· 23814.857-36.6461.0014. 28原子152 N VAL A21-11.12314.705-37.8751.0013.41原子153 CA VAL A21-10.92313. 287-38. 1671.0014. 20原子154 CB VAL A21-12. 17712.448-37.8271.0014. 30原子155 CGl VAL A21-11.95310.971-38.1891.0015.30原子156 CG2 VAL A21-12.51712.553-36.3121.0014. 17原子157 C VAL A21-10. 55113. 136-39.644 1.0014. 35原子158 0 VAL A21-11.25513.642-40.4911.0015.68原子159 N GLY A22_9· 46112.449-39.9531.0015.67原子160 CA GLY A22_9.06112. 300-41. 3771.0015. 70原子161 C GLY A22-9.84311.182-42.0601.0017.34
原子162 0GLYA22-10.45310. 358-41. 3971.00 17. 15原子163 NPROA23-9.80611.117-43.4041.00 18.42原子164 CAPROA23-9.00911.946-44.2781.00 18. 20原子165 CBPROA23_8. 71610.990-45.4461.00 18.64原子166 CGPROA23-9.98310.171-45.5601.00 18.81原子167 CDPROA23-10. 56810.092-44. 1531.00 18. 59原子168 CPROA23_9. 76113. 182-44. 7531.00 19.05原子169 0PROA23_9. 18314.055-45.4261.00 19. 36原子170 NASPA24-11.03413.288-44.3851.00 18.76原子171 CAASPA24-11.87814.305-44.9961.00 19.39原子172 CBASPA24-13.01513.636-45. 7811.00 20.87原子173 CGASPA24-13.92012. 784-44.9131.00 24. 34原子174 ODlASPA24-13. 50212. 291-43.8391.00 27. 70原子175 0D2ASPA24-15.07912. 580-45. 3301.00 28.83原子176 CASPA24-12.45215.372-44.0611.00 18.08原子177 0ASPA24-13. 20816. 245-44. 5091.00 17. 78原子178 NGLYA25-12. 10015. 331-42. 7751.00 16.65原子179 CAGLYA25-12.63416. 343-41.8521.00 16.02原子180 CGLYA25-12. 15217. 718-42. 2921.00 15. 70原子1810GLYA25-11.03317.849-42.8111.00 16.22原子182 NCYSA26-12.97918. 752-42.0861.00 15. 10原子183 CACYSA26-12.69820.078-42.6371.00 15.46原子184 CBCYSA26-13.89921.037-42.4751.00 15.47原子185 SGCYSA26-14. 14721. 739-40. 7861.00 16.91原子186 CCYSA26-11.40720.731-42.1161.00 15.65原子187 0CYSA26-10.89621.643-42. 7631.00 15.80原子188 NARGA27-10.87920. 259-40.9731.00 15.02原子189 CAARGA27_9.61520.808-40.4431.00 14. 56原子190 CBARGA27_9.81921.480-39.0661.00 15.00原子191 CGARGA27-10.69522. 728-39. 1641.00 15. 15原子192 CDARGA27-10.82623. 551-37.8881.00 14. 30原子193 NEARGA27-11.87424.566-38.0801.00 15.05原子194 CZARGA27-13. 16024.420-37. 7611.00 17.96原子195 NHlARGA27-13.62323.293-37.2111.00 17.37原子196 NH2ARGA27-14.00925.415-38.0251.00 19.55原子197 CARGA27-8.48919.776-40.3941.00 15.49原子198 0ARGA27-7.38920.079-39.8881.00 15.40原子199 NALAA28-8.76818.5 77-40.9101.00 15.17原子200 CAALAA28-7.80517.484-40.9881.00 16.06
原子201 CBALA A28-8.16316.374-39.9751.0015.52原子202 CALA A28—7.74416.913-42.3941.0016.96原子203 0ALA A28-7.45315.730-42.5811.0017.60原子204 NPHE A29-8.02817.756-43.3801.0017.45原子205 CAPHE A29_8. 18817. 272-44. 7441.0018.68原子206 CBPHE A29-8.72818.376-45.6361.0019.45原子207 CGPHE A29_9. 29917.864-46.9191.0020.86原子208 CDlPHE A29_8. 51517.827-48.0711.0023. 76 原子209 CElPHE A29-9.04217. 343-49. 2671.0025.46原子210 CZPHE A29-10. 35716.889-49. 3181.0022.85原子211 CE2PHE A29-11.15116.924-48.1801.0024.78原子212 CD2PHE A29-10.61117.408-46.9731.0022.71原子213 CPHE A29_6.85316. 783-45. 2961.0019. 10原子214 0PHE A29_5.86217. 501-45. 2241.0019.40原子215 NGLY A30_6.83015. 558-45.8161.0018. 73原子216 CAGLY A30-5.60315.008-46.3981.0019.00原子217 CGLY A30_4. 71714. 307-45. 3991.0019.69原子218 0GLY A30_3.65713.809-45. 7681.0019.61原子219 NTHR A31_5. 13314. 255-44. 1231.0018.86原子220 CATHR A31_4.45013. 384-43. 1651.0019. 14原子221 CBTHR A31_4.84613.689-41.6891.0018. 79原子222 OGlTHR A31_6. 26513. 579-41. 5591.0018.61原子223 CG2THR A31_4.41015. 106-41. 2621.0016.47原子224 CTHR A31-4.81211.925-43.4981.0019.11原子225 0THR A31-5.71311.661-44.3131.0019.69原子226 NSERA32-4.10710.982-42.8811.0019.74原子227 CASER A32-4. 3679. 554-43.0941.0020.00原子228 CBSERA32-3.4118.722-42.2481.0020.73原子229 OGSER A32_2.0648.973-42.6121.0021. 56原子230 CSER A32_5.8069. 217-42. 7041.0020. 57原子231 0SER A32_6. 3349. 778-41. 7321.0020. 70原子232 NALA A33_6.4438. 319-43.4521.0019.94原子233 CAALA A33~7. 7687.823-43.0681.0019.61原子234 CBALA A33_8. 2326. 729-44.0351.0019. 31原子235 CALA A33~7. 7647. 285-41.6371.0019. 10原子236 0ALA A33-6.9066.482-41.2641.0019.49原子237 NGLY A34_8. 7427. 719-40.8561.0017. 74原子238 CAGLY A34_8.8787. 282-39.4731.0018. 31原子239 CGLY A34~7.9888.020-38.4731.0018.48
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原子318 CGASP A463.60121. 161-33.8181.0016. 17原子319 ODlASP A462. 54320. 787-34. 3891.0015.61原子320 0D2ASP A464. 71220.641-34.0541.0020. 18原子321 CASP A461.43621. 303-31. 7481.0013.83原子322 0ASP A462.08120.489-31.0891.0013. 59原子323 NTYR A470.12621.165-31.9921.0011.86原子324 CATYR A47-0.62119.975-31.5801.0012. 11原子325 CBTYR A47-1.89520.387-30.8541.0011.69原子326 CGTYR A47-1.77320.722-29.3771.0012. 59原子327 CDlTYR A47_0. 58921. 236-28.8271.0013. 54原子328 CElTYR A47_0. 52421. 586-27.4621.0012.81原子329 CZTYR A4765221.407-26.6731.0013.40原子330 OHTYR A4762021. 755-25. 3541.0013.08原子331 CE2TYR A47_2.82520.887-27. 2081.0012.02原子332 CD2TYR A47_2.87620. 540-28. 5321.0012. 76原子333 CTYR A47-0.99419.090-32.7721.0011.46原子334 0TYR A47-1.88518.239-32.6921.0011.66原子335 NTYR A48_0. 31619. 301-33.8931.0012. 26原子336 CATYR A48-0.69718.639-35.1321.0012.80原子337 CBTYR A48_0. 32319. 509-36. 3481.0012. 75原子338 CGTYR A4813419. 146-37. 5691.0013. 21原子339 CDlTYR A48_2.49219.482-37.6521.0014.46原子340 CElTYR A48_3. 25419. 124-38. 7671.0015.86原子341 CZTYR A48_2.64318.453-39.8231.0014.62原子342 OHTYR A48_3. 39018. 106-40.9361.0016. 20原子343 CE2TYR A4829518.086-39. 7561.0015.86原子344 CD2TYR A48_0. 54318.456-38.6381.0013.44原子345 CTYR A48_0.07217. 245-35. 1871.0013.47原子346 0TYR A480.87716.986-35.9401.0013.95原子347 NTYR A49_0. 59216. 360-34. 3381.0013. 13原子348 CATYR A49_0. 13114.987-34. 1711.0013. 51原子349 CBTYR A490.88714.842-33.0091.0013.11原子350 CGTYR A492. 13315.662-33. 2161.0013.90原子351 CDlTYR A493. 19315. 174-33.9961.0013. 54原子352 CElTYR A494. 35415.964-34. 2161.0013.41原子353 CZTYR A494.41917. 225-33.6651.0014.69原子354 OHTYR A495.51118.016-33.8831.0017.21原子355 CE2TYR A493. 36517. 737-32.9061.0013.49原子356 CD2 TYR A492.22716.952-32.6981.0013.78
原子357CTYR A49_1· 34914. 181-33. 7831.0013.93原子3580TYR A49_2· 39014. 759-33.4061.0013.00原子359NMET A50_1· 20312.857-33.8391.0013.66原子360CAMET A50-2.24111.940-33.3651.0014.56原子361CBMET A50_2· 44710.822-34. 3811.0015. 21原子362CGMET A50-3.5329.811-33.9471.0015.64原子363SDMET A50_3.9968.804-35. 3611.0019. 52原子364CEMET A50_5. 2047. 742-34. 5661.0017. 12原子365CMET A50-1.79711.323-32.0601.0014.38原子3660MET A50_0.80610.583-32.0241.0013.80原子367NTRP A51-2.52811.608-30.9841.0013.47原子368CATRP A51_2. 26510.965-29. 7201.0013. 13原子369CBTRP A51-2.59811.930-28.5851.0012.85原子370CGTRP A51-1.47812.809-28.1161.0013.64原子371CDlTRP A51-0.67112.604-27.0111.0013.49原子372NElTRP A510.21113.657-26.8641.0012. 36原子373CE2 TRP A51_0.02314.573-27.8581.0011.83原子374CD2 TRP A5107614.065-28.6741.0013. 12原子375CE3 TRP A51-1.50614.825-29.7721.0011.07原子376CZ3 TRP A51-0.85916.061-30.0351.0012.87原子377CH2 TRP A510. 19316. 522-29. 2181.0013. 24原子378CZ2 TRP A510.61815.806-28. 1271.0012.61原子379CTRP A51_3. 1369. 732-29. 5751.0013. 35原子3800TRP A51_4. 3229. 769-29.9071.0012.89原子381NTHR A52_2. 5768.652-29.0241.0013. 20原子382CATHR A52_3. 3867.462-28. 7531.0013.02原子383CBTHR A52_2. 5206. 300-28. 2351.0013.66原子384OGlTHR A525535.999-29. 2461.0015.07原子385CG2 THR A52_3. 3415.026-27.9521.0012. 21原子386CTHR A52-4.5337.807-27.8001.0012.48原子3870THR A52_5.6707.402-28.0341.0012. 78原子388NARG A53_4. 2248. 556-26. 7471.0012.03原子389CAARG A53-5.2388.868-25.7371.0011.89原子390CBARG A53-4.6079.570-24.5451.0011.46原子391CGARG A53-5.61110.330-23.6181.0013.19原子392CDARG A53-4.89610.881-22.3751.0011.14原子393NEARG A53-3.79311.694-22.8191.0012.52原子394CZARG A53-2.50911.330-22.7691.0013.67原子395NHlARG A53-2.14810.182-22.1801.00 13.97
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原子434 CAPHE A59-13. 7667.477-30. 7131.0015. 23
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子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子子 原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原原
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原子 原子 原子 原子 原子 原子 原子 原子 原子 原子 原子 原子 原子 原子 原子
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53-15.9785.366-12.1931.0026.02原子47070WAT W 54_1· 6379. 365-26.0351.0014.42原子47080WAT W 55-10. 75927. 212-30.8981.0017. 28原子47090WAT W 56-11.5090.756-13.1011.0020.70原子47100WAT W 57-16.95015. 1084. 7271.0023.86原子47110WAT W 58-25.36826.009-7.1061.0025.08原子47120WAT W 59-16.87022.937_3· 6511.0017. 56原子47130WAT W 60-14. 38813. 258-40.8971.0027.90原子47140WAT W 61_1· 509_4· 779_6· 7231.0031.01原子47150WAT W 62-1.97327.723-11.5211.0021.99原子47160WAT W 63-1.159-10.623-29.5921.0036.68原子47170WAT W 64_1· 94316.930-42.9571.0021. 57原子47180WAT W 65_1· 50725. 238-40.0321.0031. 36原子47190WAT W 66_4· 0235.499-31. 7871.0020.03原子47200WAT W 67-13. 38313.873-21.0651.0012.01原子47210WAT W 68-15.09810. 726-24.4671.0024. 34原子47220WAT W 69_2· 12213.975-13.4351.0012. 51原子47230WAT W 70_4· 80719. 360-43. 2701.0020.93原子47240WAT W 71-26.02826. 143-33. 7681.0028. 78[5240]原子4725 0WAT W 72-19. 34721.6383.4821.0019.92原子4726 0WAT W 73-27.29924.219-6.0451.0020.97原子4727 0WAT W 74-21.114-0.343-28.0501.0022.38原子4728 0WAT W 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0.89813.920-6.5211.0027.38原子4903 0WATW 250 20.42730.852-45.4461.0035.54原子4904 0WATW 251-1.39712.400-44.6171.0039.33原子4905 0WATW 252-27. 35424.696_3· 1621.0035. 38原子4906 0WATW 253 17.58720. 557-31.0691.0041.51原子4907 0WATW 254_7· 93635.055_7· 3541.0039.02原子4908 0WATW 255-22.4697. 215_2· 0441.0038. 25原子4909 0WATW 256 2.03815.474-52.9631.0050.04原子4910 0WATW 257 10.88910. 184-21. 7001.0044.84原子49110WATW 258-11.71410.5834.1361.0042.70原子4912 0WATW 259-14. 7196. 5742.9591.0043. 18原子4913 0WATW 260-16.69425. 390-37.6881.0036. 77原子4914 0WATW 261_9· 21213. 388-48. 3631.0038.05原子4915 0WATW 264-0.611-1.965-3.2531.0037.95原子4916 0WATW 265-16. 38030.998-14.2621.0032.44原子4917 0WATW 266 9.42016.012-61. 3681.0035. 22原子4918 0WATW 267_4· 976-15. 180-21. 2231.0045. 50原子4919 0WATW 268-16.63133. 287-14. 2011.0034. 50[5435]原子4920 OWAT W269-16.88334.052-32. 2491.0036.88原子4921 OWAT W270_8· 293-16.006-14. 5351.0034.80原子4922 OWAT W2730. 2404. 589-13.8681.0032. 34原子4923 OWAT W2753.65714.447-55. 5161.0043. 54原子4924 OWAT W276-17.60220. 784-51.4711.0038.88原子4925 0WAT W277-10.47931.683-30. 5131.0040. 35原子4926 0WAT W278-10.974 4. 308-5.7451.0040.30原子4927 0WAT W280_4· 33636.908-17.6661.0034.01原子4928 0WAT W2816. 72033.970-53. 5721.0038.81原子4929 0WAT W282-30.45723. 527_0· 6211.0034.61原子4930 0WAT W28316.96917. 394-30.8161.0055. 74原子4931 0WAT W284-24. 3915.834-24.9091.0037.92原子4932 0WAT W2854. 5679.814_4· 4381.0044.83原子4933 0WAT W286-24. 370_7· 328-27.8751.0056. 18原子4934 0WAT W287-21.60511.8879.7151.0043.15原子4935 0WAT W2888.6030.412-37.8871.0040.47原子4936 0WAT W290-20.05621.4956.0731.0041.68原子4937 0WAT W291_3· 22128. 158-33.4481.0044. 24原子4938 0WAT W2929. 1719. 103-38. 7351.0034. 30原子4939 0WAT W2932.89422. 763-25.8291.0038. 57原子4940 0WAT W294-29.90119.604-14.9291.0037.66原子4941 0WAT W296-4.57930.229-29.1101.0040. 57原子4942 0WAT W297-23.82111.441-33.1871.0042.81原子4943 0WAT W298-26. 753_3· 087-31. 2431.0039.08原子4944 0WAT W300-10.82035.024-53.0501.0055. 39原子4945 0WAT W302_1· 9927. 169-31.6921.0039. 12原子4946 0WAT W303-15.282-19.000-23.7701.0034.62原子4947 0WAT W30412.10610.568-25.1121.0039.04原子4948 0WAT W3052. 5852. 7661.8801.0053.88原子4949 0WAT W3063.68021. 122-19.8181.0046. 35原子4950 0WAT W30722. 75924. 721-48.0991.0040. 35原子4951 0WAT W309-17.062_6· 726-19. 2021.0041. 54原子4952 0WAT W31112.594 1.109-31.4611.0047.85原子4953 0WAT W31223. 34725.060-50.6381.0049.64原子4954 0WAT W314-18. 2914.422-19. 1511.0039. 17 [5470]原子4955 0WAT W315-11.815-7.807-8.6761.0037.74原子4956 0WAT W316-25.1471.885-4.6491.0044. 72原子4957 0WAT W317-36.47313. 5925. 3151.0044. 38原子4958 0WAT W318-17. 58720.023-46. 2311.0048. 30[5474]原子4959 OWAT W319-16.08129.024-54.6681.0039.40原子4960 OWAT W320-14. 21032. 143_5· 4941.0042. 73原子4961 OWAT W321-15. 274 28.830-38.9161.0046.47原子4962 OWAT W322-32. 79222. 221-3.4331.0041. 52 原子4963 OWAT W323-32.47516.905-12.4011.0046. 29原子4964 OWAT W32515. 34122. 212-60.4901.0034.67原子4965 0WAT W326-12.6688. 518-41. 7231.0036. 26原子4966 0WAT W3274.70920.490-10.5681.0038.04原子4967 0WAT W32813.93710.625-29. 3121.0038. 32原子4968 0WAT W329-21.964 9.615-24.8961.0040.43原子4969 0WAT W33019. 32525.925-40. 1991.0051. 36原子4970 0WAT W331-19.0108.073-45. 2551.0046.06原子4971 0WAT W332-25.024 _2· 892-29. 3061.0041. 74原子4972 0WAT W333-16. 593_7· 067-23. 2971.0038. 54原子4973 0WAT W334-17. 51724.0782. 1571.0045.82原子4974 0WAT W335-19. 12331.9410.0101.0038.91原子4975 0WAT W33710.67721.901-62. 7401.0044. 31原子4976 0WAT W3384.51015.230-51.8101.0042. 12原子4977 0WAT W33913.97914. 161-43. 3801.0046.42原子4978 0WAT W3415.979-11.625-28.7391.0043.09原子4979 0WAT W342-19.45313. 34710. 3941.0042.44原子4980 0WAT W3437.08523.050-30. 7961.0034.94原子4981 0WAT W3456.47124.087-63.9431.0045. 16原子4982 0WAT W3473. 73422.842-12.0311.0043.85原子4983 0WAT W348-17. 7397. 5645. 7231.0043. 77原子4984 0WAT W351-22.014 31. 372-24. 7081.0042.69原子4985 0WAT W35225.01625. 103-46.9671.0040. 51原子4986 0WAT W3537.96932.464-67.6371.0057.78原子4987 0WAT W354-27.444 5. 1015.8611.0048. 31原子4988 0WAT W3568.01211.087-40.8671.0047. 51原子4989 0WAT W3574.97429.116-17.4331.0043.72原子4990 0WAT W358-0.4579.488-45. 2881.0045.63原子4991 0WAT W360_3· 09036. 536-12. 1381.0046. 29原子4992 0WAT W36120.07219. 772-36.8961.0038. 73原子4993 0WAT W363-26. 21715. 345-28. 7351.0049.07原子4994 0WAT W365-25. 3080. 100-48.6021.0060.01原子4995 0WAT W36719.36929.586-58.4381.0048.19原子4996 0WAT W36912.80811.144-54.4271.0048.48原子4997 0WAT W3709.4102.674-16.1151.0044.59[5513]原子4998 0WAT W 372-10.24938.564-13.2151.0048.60[5514]原子4999 0WAT W 373-24.15116.21110.6171.0042.16原子5000 0WAT W 375-6.45931.697-48.1061.0046.03原子5001 0WAT W 376-11.60527.116-1.5621.0044.58原子5002 0WAT W 377-4.70324.150-62.6731.0048. 70原子5003 0WAT W 3796.8890.036-7.5301.0045.35原子5004 0WAT W 381-13.60132.742-32.0021.0051.37原子5005 0WAT W 383-28.0775. 243-4.6881.0037.4權利要求
在下述殘基位置處包含兩個或多於兩個的胺基酸取代的葡糖澱粉酶變體,所述殘基位置對應於SEQ ID NO2的第61、73、417、430、431、503、511、535、539或563位,或親本葡糖澱粉酶的等價位置,其中葡糖澱粉酶變體與SEQ ID NO1、2、3、5、6、7、8或9具有至少80%序列同一性。
2.在下述殘基位置處包含胺基酸取代的葡糖澱粉酶變體,所述殘基位置對應於SEQID NO 2 的 I43Q/D44C、D44C/G294C、I43Q/G294C 或 I43Q/D44C/G294C,或親本葡糖澱粉酶的等 價位置,其中葡糖澱粉酶變體與SEQ ID N0:l、2、3、5、6、7、8或9具有至少80%序列同一性。
3.權利要求1或2的葡糖澱粉酶變體,其中親本葡糖澱粉酶具有與SEQIDN0:l、2、3、 5、6、7、8或9有至少80%序列同一性的催化結構域,或者具有與SEQ ID NO :1或2有至少 80%序列同一性的澱粉結合結構域。
4.權利要求1或2的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體具有與SEQIDNO :1、2、3、 5、6、7、8或9至少85%序列同一性。
5.權利要求1或2的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體具有與SEQIDNO :1、2、3、 5、6、7、8或9至少90%序列同一性。
6.權利要求1或2的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體具有與SEQIDNO :1、2、3、 5、6、7、8或9至少95%序列同一性。
7.權利要求1或2的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體具有與SEQIDNO :1、2、3、 5、6、7、8或9至少99. 5%序列同一性。
8.權利要求1或2的葡糖澱粉酶變體,其中親本葡糖澱粉酶是SEQIDNO :1或2。
9.權利要求1的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體還在下述殘基位置處包含一個 或多個胺基酸取代,所述殘基位置對應於SEQ ID N0:2的第4、5、12、24、43、44、45、46、47、 49、51、70、75、6、94、100、108、114、116、119、122、124、125、137、141、143、146、148、169、171、 172、175、178、180、181、208、211、228、242、243、245、292、294、197、309、310、313、314、315、 316、317、321、340、341、350、353、356、363、368、369、375、376、395、398、401、408、409、412、 415、418、421、433、436或451位,或親本葡糖澱粉酶的等價位置。
10.權利要求1的葡糖澱粉酶變體,其中變體還在下述殘基位置處包含一個或多個氨 基酸取代,所述殘基位置對應於SEQ ID NO 2的第4、5、24、29、43、44、49、70、75、76、100、 108、119、124、137、146、148、169、171、172、175、178、181、208、211、243、292、294、297、314、 316、317、340、341、350、356、363、368、369、376、395、401、412、433、436 或 451 位,或親本葡 糖澱粉酶的等價位置。
11.權利要求1的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體還在下述殘基位置處包含一 個或多個胺基酸取代,所述殘基位置對應於SEQ ID N0:2的第5、24、43、44、49、70、75、76、 94、119、141、146、148、172、175、178、180、181、208、211、243、294、309、314、353、369、375 或 409位,或親本葡糖澱粉酶的等價位置。
12.權利要求1的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體還在下述殘基位置處包含一 個或多個胺基酸取代,所述殘基位置對應於SEQ ID N0:2的第43、44或294位,或親本葡糖 澱粉酶的等價位置。
13.權利要求1的葡糖澱粉酶變體,其中變體還在下述殘基位置處包含兩個或多於 兩個的胺基酸取代,所述殘基位置對應於SEQ ID NO 2的N61I、G73F、L417R/V、T430A/M、A431L/Q、E503A/V、Q511H、A535R、A539R或N563I/K,或親本葡糖澱粉酶的等價位置。
14.權利要求15的葡糖澱粉酶變體,其中變體還包括一個或多個下列取代SEQID NO 2 的 D4L/E/R/S/C/A/Q/W、F5C/M/N/R/S/T/V/W、I12L/R、D24E/L/Y/T、F29L/I/D/C/S/ V/W、I43F/R/D/Y/S/Q、D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C、Y47W、Y49N、Q70R/K/M/P/G/L/F、Q75R/K/ A、R76L/M/K/T/P、P94L、D100ff/I/Q/M/P/A/N、N119P/T/Y/D/E、N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/F/ M、Q148V/Y/H/A/C/D/G/M/R/S/T、Y169D/F、Q172C/A/D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V, F175H/A/ G/R/S/T/C/ff/Y、W178A/C/D/E/F/G/H/K/N/R/S/T/V/Y、E180A/C/G/H/1/L/N/P/Q/R/S/T/V/ Y/、V181E/C/D/G/H/I/P/T/Y/S/L/K/F/A、Q208L/A/C/E/N/F/H/T、S211C/R/E/A /Y/W/M/H/ L/I/R/Q/T、E243S/R/N/M/Y/A/L、R245A/E/M/I/P/V、I292D/H/P/R/T/N/V/F/L、G294C/D/E/ T/Q/I/A、K297F/L/P/T/M/D/N/Q/A/Y/H/S/R/W、R309A/C/G/H/1/N/P/Q/S/T/ff/Y/L, Y310E/ G/L/P/S/W/R/Q、D313Q、V314A/R/N/D/C/E/Q/G/H/1/L/K/M/F/P/S/T/ff/Y, Y315F、Y316Q/R、 N317T/H、K340D/T、K341F/D/P/V/G/S、T350S/E/A/N、Q356H/D/E、T363L/R/C/H/W、S368W/D/ F/L、S369F、N376Q/T/H/S/V、Y395Q/R/S、A398S/I/T、S401C/V、R408S、N409W/T/K、T412A/H/ K/G、R433H/Q、I436A/T或S451M/T/H,或親本葡糖澱粉酶中的等價位置。
15.權利要求15的葡糖澱粉酶變體,其中變體還包括一個或多個下列取代SEQID NO 2 的 I43F/R/D/Y/S/Q、D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C 或 G294C/D/E/T/Q/I/A,或親本葡糖澱粉 酶中的等價位置。
16.權利要求1-15任一項的葡糖澱粉酶變體,其中親本葡糖澱粉酶選自從木黴屬物 種、麴黴屬物種、腐質黴屬物種、青黴屬物種、踝節菌屬物種或裂殖酵母屬物種獲得的葡糖 澱粉酶。
17.權利要求16的葡糖澱粉酶變體,其中親本葡糖澱粉酶獲得自木黴屬物種或麴黴屬 物種。
18.權利要求1-17任一項的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶 相比,表現出改變的熱穩定性。
19.權利要求18的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶相比,表 現出增加的熱穩定性。
20.權利要求1-17任一項的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶 相比,表現出改變的比活性。
21.權利要求20的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶相比,表 現出增加的比活性。
22.權利要求1-17任一項的葡糖澱粉酶變體,其中葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶 相比,表現出增加的熱穩定性和增加的比活性。
23.編碼權利要求1-22任一項的變體的多核苷酸。
24.包括權利要求23的多核苷酸的載體。
25.包括權利要求24的載體的宿主細胞。
26.包括權利要求1-22任一項的葡糖澱粉酶變體的酶組合物。
27.權利要求26的酶組合物,其中酶組合物用於澱粉轉化過程中。
28.權利要求26的酶組合物,其中酶組合物用於醇發酵過程中。
29.在宿主細胞內生產葡糖澱粉酶變體的方法,包括在適合表達和生產葡糖澱粉酶變體的條件下培養權利要求25的宿主細胞,和生產葡糖澱粉酶變體。
30.根據權利要求29的方法,還包括從培養物中回收葡糖澱粉酶變體。
全文摘要
本公開文本涉及具有改變性質(例如改善的熱穩定性和/或比活性)的親本葡糖澱粉酶的變體。特別的,本公開文本提供包含變體葡糖澱粉酶的組合物,包括澱粉水解組合物和清潔組合物。公開文本還涉及編碼變體的DNA構建體,和在宿主細胞內生產葡糖澱粉酶變體的方法。
文檔編號C12N15/56GK101868537SQ200880116695
公開日2010年10月20日 申請日期2008年11月20日 優先權日2007年11月20日
發明者C·弗勒門, M·舍費爾斯, P·范索林恩, R·R·博特, W·埃赫勒 申請人:丹尼斯科美國公司

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一種實現縮放的視頻解碼方法

專利名稱:一種實現縮放的視頻解碼方法技術領域:本發明涉及視頻信號處理領域,特別是一種實現縮放的視頻解碼方法。背景技術: Mpeg標準是由運動圖像專家組(Moving Picture Expert Group,MPEG)開發的用於視頻和音頻壓縮的一系列演進的標準。按照Mpeg標準,視頻圖像壓縮編碼後包

基於加熱模壓的纖維增強PBT複合材料成型工藝的製作方法

本發明涉及一種基於加熱模壓的纖維增強pbt複合材料成型工藝。背景技術:熱塑性複合材料與傳統熱固性複合材料相比其具有較好的韌性和抗衝擊性能,此外其還具有可回收利用等優點。熱塑性塑料在液態時流動能力差,使得其與纖維結合浸潤困難。環狀對苯二甲酸丁二醇酯(cbt)是一種環狀預聚物,該材料力學性能差不適合做纖

一種pe滾塑儲槽的製作方法

專利名稱:一種pe滾塑儲槽的製作方法技術領域:一種PE滾塑儲槽一、 技術領域 本實用新型涉及一種PE滾塑儲槽,主要用於化工、染料、醫藥、農藥、冶金、稀土、機械、電子、電力、環保、紡織、釀造、釀造、食品、給水、排水等行業儲存液體使用。二、 背景技術 目前,化工液體耐腐蝕貯運設備,普遍使用傳統的玻璃鋼容

釘的製作方法

專利名稱:釘的製作方法技術領域:本實用新型涉及一種釘,尤其涉及一種可提供方便拔除的鐵(鋼)釘。背景技術:考慮到廢木材回收後再加工利用作業的方便性與安全性,根據環保規定,廢木材的回收是必須將釘於廢木材上的鐵(鋼)釘拔除。如圖1、圖2所示,目前用以釘入木材的鐵(鋼)釘10主要是在一釘體11的一端形成一尖

直流氧噴裝置的製作方法

專利名稱:直流氧噴裝置的製作方法技術領域:本實用新型涉及ー種醫療器械,具體地說是ー種直流氧噴裝置。背景技術:臨床上的放療過程極易造成患者的局部皮膚損傷和炎症,被稱為「放射性皮炎」。目前對於放射性皮炎的主要治療措施是塗抹藥膏,而放射性皮炎患者多伴有局部疼痛,對於止痛,多是通過ロ服或靜脈注射進行止痛治療

新型熱網閥門操作手輪的製作方法

專利名稱:新型熱網閥門操作手輪的製作方法技術領域:新型熱網閥門操作手輪技術領域:本實用新型涉及一種新型熱網閥門操作手輪,屬於機械領域。背景技術::閥門作為流體控制裝置應用廣泛,手輪傳動的閥門使用比例佔90%以上。國家標準中提及手輪所起作用為傳動功能,不作為閥門的運輸、起吊裝置,不承受軸向力。現有閥門

用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置的製作方法

專利名稱:用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置的製作方法背景技術:1-本發明所屬領域本發明涉及一種用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置,其中的管狀容器被放在循環於配送鏈上的文檔匣或託架裝置中。本發明特別適用於,然而並非僅僅專用於,對引入自動分析系統的血液樣本試管之類的自動識別。本發明還涉及專為實現讀