一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系的製作方法

2024-03-28 01:13:05

本發明屬於生物醫藥
技術領域：
，具體涉及一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系
背景技術：
：間充質幹細胞是普遍存在於不同組織的多潛能成體幹細胞，目前已經從骨髓、脂肪、牙髓、羊膜、絨毛膜、蛻膜、臍帶、臍血等組織中分離培養出間充質幹細胞。已有研究表明間充質幹細胞具有分化能力強，倍增時間短，具有免疫調節作用和低下的免疫原性，易於轉染的特性，是再生醫學的一種理想種子細胞和基因治療載體，已成為幹細胞臨床轉化應用研究的熱點。目前，使用的間充質幹細胞主要為骨髓間充質幹細胞，其來源方便快捷，可是該來源間充質幹細胞具有如下缺陷：1.在骨髓中含量低（約0.1～0.01‰），而且隨著年齡增加，其擴增、分化能力和細胞數量出現明顯下降趨勢；2.存在倫理問題，來源受到限制；3.供者有不適感，不易接受；4.病毒感染機會大；5.異體移植的免疫排斥強。人胎盤絨毛膜間充質幹細胞是一種能替代骨髓間充質幹細胞,並可彌補其缺陷的間充質幹細胞。人胎盤絨毛膜間充質幹細胞有如下優勢：1.取材幾乎不受限制。胎盤為「廢棄」物，只要在正常分娩的健康產婦知情同意的基礎上，都能夠提供胎盤。供者無痛苦，汙染機會少；2.胎盤絨毛膜間充質幹細胞更加原始，免疫原性更低，獲得的原代間充質幹細胞數量大；3.不涉及社會、倫理及法律方向的更多爭論。因此人胎盤絨毛膜間充質幹細胞受到再生醫學領域的廣泛關注。間充質幹細胞是繼造血幹細胞之後，第二種用於臨床治療的幹細胞，國外已經有7種間充質幹細胞產品用於臨床。我國在間充質幹細胞的基礎研究方面起步早，有些基礎研究還處於國際領先水平，但是我國的臨床轉化水平不足，沒有相關臨床細胞產品。因此，必定激發我國科研人員和臨床醫師需要大量的間充質幹細胞進行基礎和臨床轉化應用研究；另一方面，間充質幹細胞傳代過程影響細胞質量，目前公認的最有效的細胞代數為p3～p8代間充質幹細胞。如何體外簡便地培養出大量原代間充質幹細胞是間充質幹細胞基礎研究和轉化應用的關鍵之一，也是間充質幹細胞研究領域中的重要研究方向。本發明通過三次培養，提高了p0代細胞數量，為將來的研究提供材料保障，同時減少了同一研究中，使用不同批次細胞產生的差異。因此建立一種簡便的能獲得大量p0代細胞的人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系是亟需解決的問題。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，能夠提高p0代細胞產量。為實現上述目的，本發明所採用的技術方案如下：一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，包括以下步驟：（1）人胎盤絨毛膜組織處理後，進行初次培養，7天後倒置顯微鏡下觀察培養情況，更換培養基；（2）初次培養瓶中的組織塊、培養液和衝洗液離心後重新接種，進行再次培養，7天後倒置顯微鏡下觀察培養情況，更換培養基；（3）再次培養瓶中的組織塊、培養液和衝洗液離心後重新接種，進行第三次培養，7天後倒置顯微鏡下觀察培養情況，更換培養基；（4）待三次培養細胞融合度達到80-90%時，用胰酶消化傳代，即得人胎盤絨毛膜間充質幹細胞。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（1）所述7天是指培養瓶置於培養箱中處於完全靜止狀態，不移動、不用顯微鏡觀察和不進行培養液更換。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（1）所述更換培養基是指全量換液。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（2）所述初次培養瓶中的組織塊、培養液和衝洗液是指初次培養7天後，第一次換液時，培養瓶中的組織塊和培養液，以及用生理鹽水衝洗培養瓶底的衝洗液。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（2）所述離心為1500r/min，5min。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（2）所述再次培養接種的培養瓶為初次培養接種培養瓶數量的一半。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（2）所述7天是指培養瓶置於培養箱中處於完全靜止狀態，不移動、不用顯微鏡觀察和不進行培養液更換。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（2）所述更換培養基是指全量換液。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（3）所述再次培養瓶中的組織塊、培養液和衝洗液是指再次培養7天後，第一次換液時，培養瓶中的組織塊和培養液，以及用生理鹽水衝洗培養瓶底的衝洗液。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（3）所述離心為1500r/min，5min。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（3）所述7天是指培養瓶置於培養箱中處於完全靜止狀態，不移動、不用顯微鏡觀察和不進行培養液更換。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（3）所述第三次培養接種的培養瓶為再次培養接種培養瓶數量的一半。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養體系，其特徵在於，所述步驟（3）所述更換培養基是指全量換液。根據權利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質幹細胞分離培養方法，其特徵在於，步驟（4）所述胰蛋白酶消化前，先用生理鹽水清洗細胞以除去培養基。本發明的培養過程中，除了接種培養的七天，每天應該用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態，培養基營養不夠應及時補充或更換，細胞達到80-90%融合狀態時，及時傳代。本發明適用無血清培養基，不含血清，未引入外源動物蛋白，使培養的細胞更利於臨床應用。本發明沒有適用抗生素，使培養的細胞更利於後繼研究和臨床應用。本發明取得的優點和積極效果：1.簡便：初次培養和再次培養的第一次換液時，原本廢棄的組織塊、培養液和衝洗液離心後重新接種培養，只要注意無菌操作即可，無需特別的處理程序。2.提高了p0代細胞的產量：經過三次培養，共獲得的p0代細胞數量比僅僅進行過初次培養獲得的細胞數量翻倍。有利於人胎盤絨毛膜間充質幹細胞的後繼研究和應用，以及人胎盤絨毛膜間充質幹細胞庫的建立奠定基礎。3.充分利用了標本：一次標本處理，三次接種培養，三次細胞收穫，提高了標本的利用率；由於目前絨毛膜間充質幹細胞培養前的分離處理操作比較繁瑣，阻礙了人絨毛膜間充質幹細胞的基礎研究和轉化應用。本發明使得一次分離處理能夠進行三次細胞培養，獲得比初次培養翻倍的細胞數，有利於絨毛膜間充質幹細胞的應用研究。附圖說明圖1為倒置顯微鏡下p3代人胎盤絨毛膜間充質幹細胞細胞形態圖。符合國際細胞治療學會推薦的間充質幹細胞標準。圖2是三次培養p3代人胎盤絨毛膜間充質幹細胞生長曲線的比較。三次培養獲得細胞的生長曲線沒有統計學差異（p＞0.05）。圖3是三次培養p3代人胎盤絨毛膜間充質幹細胞誘導分化脂肪細胞，紅油o染色陽性；成骨細胞，茜素紅染色陽性。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不是視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。有用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過購買獲得的常規產品。本發明所述的無血清培養基購自gibco公司，貨號為a10334-01。本發明所述的胰蛋白酶購自gibco公司，貨號為25200056。本發明所述的膠原酶ⅱ購自ibco公司，貨號為17101-015。本發明所述的細胞凍存混合液，購自wak-chemiemedicalgmbh，貨號為wak-dex40-50-5。實施例1：人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養人胎盤絨毛膜組織處理後，進行初次培養，靜止培養7天後，全量更換培養基，初次培養瓶中的組織塊、培養液和衝洗液離心後重新接種，進行再次培養，靜止培養7天後全量更換培養基；再次培養瓶中的組織塊、培養液和衝洗液離心後重新接種，進行第三次培養，靜止培養7天後全量更換培養基；待三次培養細胞融合度達到80-90%時，用胰酶消化傳代，即得人胎盤絨毛膜間充質幹細胞。初次培養、再次培養和第三次培養獲得的細胞數、收穫時間見表1。培養批次獲得時間（d）單瓶細胞數（×106）總細胞數（×106）初次培養12.00±0.641.12±0.1511.73±2.09再次培養8.87±0.632.10±0.1611.12±1.42第三次培養12.33±0.801.04±0.162.69±0.71表1比較實施例2：人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養人胎盤絨毛膜組織處理後，進行初次培養，靜止培養7天後，全量更換培養基，待培養細胞融合度達到80-90%時，用胰酶消化傳代，即得人胎盤絨毛膜間充質幹細胞。比較實施例3：人胎盤絨毛膜間充質幹細胞培養人胎盤絨毛膜組織處理後，進行初次培養，靜止培養7天後，全量更換培養基，初次培養瓶中的組織塊、培養液和衝洗液離心後重新接種，進行再次培養，靜止培養7天後全量更換培養基；再次培養瓶中的組織塊、培養液和衝洗液離心後重新接種，進行第三次培養，靜止培養7天後全量更換培養基；將第三次培養的培養基和衝洗的生理鹽水，離心（1500r/min，5min）後的沉澱用於第四次接種，培養瓶的數量為初次培養的八分之一，7天後，置於倒置顯微鏡下觀察，基本看不到有部分細胞貼壁生長，微小組織塊基本懸浮於培養基中。培養至第20天，細胞未到80%融合度，生長曲線分析，明顯同其他批次培養不同。共進行過5例第四次培養，到20天時，均未達到80%融合度，生長緩慢。故本專利申請的方法只進行三次接種培養。實施例4：人胎盤絨毛膜間充質幹細胞的傳代、凍存和復甦當培養瓶中細胞達到80-90%融合狀態時，移除培養基，用生理鹽水衝洗培養瓶兩次，加入3ml胰蛋白酶，置於37℃培養箱中消化約3-5分鐘，加入培養基15ml，終止胰酶消化作用，取100ul用於計細胞活率和細胞數。離心（1500r/min，5min）後按1:2傳代接種，置於飽和溼度、37℃、體積分數為5%co2的培養箱中，一般2-3天即可達到80-90%融合狀態，需要再次傳代。達到需要凍存的代數時，按照傳代消化後，根據細胞數量，加入培養基和細胞凍存液，使得細胞濃度為1×106/ml，細胞凍存液為10%。混勻後，分裝於2ml的凍存管中，轉移至程序降溫儀中，按照第一步降溫速度為5℃/min，降到4℃，第二步降溫速度為1℃/min，降到-45℃，第三步降溫速度為5℃/min，降到-100℃。當溫度到達-100℃，取出凍存盒，轉移至-196℃液氮中。需要復溫時，從液氮中取出凍存管，立即置於37-42℃水浴箱中並不斷搖晃凍存管，吸取溶化後的細胞懸液於離心管中，加入5-10ml培養基，然後離心（1500r/min，5min），去除上清液，沉澱加入培養基後置於飽和溼度、37℃、體積分數為5%co2的培養箱中靜止培養，第二天即可見細胞貼壁生長，細胞達到80-90%融合狀態時，進行傳代。實施例5：人胎盤絨毛膜間充質幹細胞的生物學特性鑑定以及三次培養細胞的比較獲得的間充質幹細胞需要進行病原學檢查，排除包括B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、hiv、梅毒等感染，並排除細菌、真菌和支原體等汙染，另外，按照國際細胞治療學會推薦間充質幹細胞認證標準，獲得的人胎盤絨毛膜間充質幹細胞的cd45、cd34、、cd14、cd19和hla-dr的表達率≤2%，而cd90、cd105、cd73的表達率≥95%，成骨和成脂誘導分化檢測陽性，同時比較三次培養是否存在差異，故進行如下檢測：（1）人胎盤絨毛膜間充質幹細胞表面標記物檢測分別取三次培養至第三代人胎盤絨毛膜間充質幹細胞，抗體標記後進行檢測。所有標本達到cd90、cd105和cd73的表達率大於95%，cd45、cd34、、cd14、cd19和hla-dr的表達率小於2%，符合國際細胞治療學會推薦的間充質幹細胞認證標準，同時，對三次培養細胞表面標記物進行比較，沒有統計學差異（p＞0.05），見表2。培養批次cd34cd45cd14cd19hla-drcd73cd90cd105初次培養0.81±0.121.24±0.101.21±0.150.11±0.091.15±0.2410099.17±0.1499.71±0.09再次培養0.78±0.211.21±0.271.23±0.130.11±0.121.12±0.3110099.21±0.1899.82±0.03第三次培養0.82±0.151.10±0.141.14±0.130.10±0.111.21±0.1110098.67±0.1399.52±0.08表2（2）人胎盤絨毛膜間充質幹細胞誘導分化檢測分別取三次培養至第三代人胎盤絨毛膜間充質幹細胞，接種於24孔培養板，當細胞長到80%融合度時，換成成骨或成脂誘導培養基，培養四周後，分別用茜素紅染色試劑盒或紅油o染色試劑盒染色。誘導後的細胞經茜素紅染色，可見紅色礦化沉著物，而油紅o染色可見胞漿內脂滴染成紅色。說明人胎盤絨毛膜間充質幹細胞在體外特定環境下具有向成骨細胞或脂肪細胞分化的潛能。三次培養的細胞均分化陽性。（3）人胎盤絨毛膜間充質幹細胞生長曲線檢測分別取三次培養至第三代人胎盤絨毛膜間充質幹細胞接種於96孔板上，設置7組，每組7孔，置於37℃、5%co2的培養箱中培養，每隔24h，任意選擇一組，加入10ulcck-8溶液，酶標儀檢測各組細胞吸光度值（激發波長450nm），用無細胞的培養基做空白對照，連續7天，每天取7孔的吸光度均值繪製生長曲線。三次培養細胞的生長曲線比較沒有差異（p＞0.05）。（4）人胎盤絨毛膜間充質幹細胞病原學檢查分別取三次培養至第三代人胎盤絨毛膜間充質幹細胞，用培養基吹打成單細胞懸液進行病原學檢查，排除包括B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、hiv、梅毒等感染，並排除細菌、真菌和支原體等汙染。以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改造，這些變化和改造都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。當前第1頁12