高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法
2024-03-03 00:11:15
專利名稱：高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法
技術領域：
本發明涉及組合物中巰基化合物含量的檢測方法，以及甲酸的新用途，更具體的，涉及甲酸作為穩定劑，在使用高效液相色譜分析法測定組合物巰基化合物的含量及穩定其有關物質的應用。
背景技術：
巰基化合物中以二巰基類的有機化合物的實際應用較多見，它重要的代表是二巰丁二酸(DMSA)及其鈉鹽(Na-DMSA)、二巰丙磺酸及其鈉鹽(Na-DMPS)等，其主要的應用之一是作為金屬、類金屬解毒藥，用於治療銻、汞、砷、鉛、銅等急、慢性中毒及肝豆狀核變性(銅代謝障礙)。隨著現代工業、交通、電子產業的迅速發展以及對重金屬的大量開採和應用，自然界中空氣、土壤、水源及食物中的生物鏈受到重金屬的汙染日愈嚴重，人們對重金屬，尤其 是鉛的接觸和吸收在逐漸增加。目前我國兒童鉛中毒的發生率為30% 50%。鉛中毒普遍性和嚴重性，目前已成為嚴重危害我國兒童健康的重大隱患之一，嚴重影響到兒童的發育和健康成長。目前，臨床上最有代表性的重金屬解毒劑就是二巰丙磺酸鈉(Na-DMPS)、二巰丁二酸鈉(Na-DMS)、二巰丙醇(BAL)、二巰丁二酸(DMSA)等。其中二巰丁二酸因其口服有效，療效確切，毒性低，使用方便，已被國內外作為首選的重金屬解毒劑，用於解救鉛、汞、砷、鎳、銅等金屬中毒。國內臨床上解毒劑使用較多的劑型是注射液，例如二巰丙醇注射液、二巰丁二鈉注射液，而口服的目前只有二巰丁二酸成人膠囊，品種極少，尚未見適合兒童口服的專用劑型，所以開發此類藥品具有現實而迫切的意義。與此同時，目前該類藥品在對應的質量控制標準領域也缺乏簡便易行的方法，這可能與產品本身因含有巰基而導致不穩定等因素有關。對臨床口服應用最廣泛的二巰丁二酸而言，現行除《中國藥典》2000版和2010版有提出質量標準外，各國藥典包括USP (31版)、BP (2008年)以及JP (15改正版)均未收載該品種，而且《中國藥典》上收載的質控標準都過於簡單，含量測定採用沉澱滴定法，因其降解的有關物質很不穩定而使質控標準的制定難度加大。因為二巰類化合物分子結構中含有活潑的巰基官能團，尤其在含水的溶液中不穩定，其中一種不穩定現象之一包括巰基官能團分子內或分子間互相縮合形成雙硫鍵，例如申請人經質譜分析確定，二巰丁二酸在水中部分降解成雙硫化物(R-S-S-R)這種有關物質。而在採用反相高效液相色譜法分析該類化合物的含量和有關物質時，樣品供試液和流動相中必然含有水，這樣就無法避開產品的不穩定和有關物質增多的問題。顯然，在採用高效液相色譜分析過程中，如果因為流動相含水的問題以及樣品分析的前處理、測試過程中導致了二巰化合物含量的降低和有關物質的增大，那麼很容易給二巰類解毒藥品例如膠囊、片劑等固體製劑產品本身固有的穩定性造成誤會，因為固體產品的含量偏低或有關物質的增大都可能是分析測試過程中造成的，進而無法體現產品本來固有的準確含量，造成測試數據的偏差。以二巰丁二酸為例，現有的分析方法包括沉澱滴定法、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜螢光法(HPLC-FR)、高效液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)等。其中的沉澱滴定法，是中國藥典採用的方法，不但誤差大，對降解的雜質的測定也無能為力。螢光衍生化法是基於HPLC的方法，但是對樣品的螢光化處理程序繁瑣，還需要配備專門的螢光檢測器。液質聯用法操作成本高，也不便捷，不能普適於一般性藥廠對產品的質控要求。一些文獻中也儘管採用單獨的HPLC法，但是經申請人試驗發現，對樣品測試的穩定性難以達到滿意的水平，在含水的流動相中巰基化合物容易部分降解，特別是隨著測定時間的延長，巰基化合物不斷的降解，容易導致測得的含量比實際的含量偏低
發明內容
本發明的目的是公開一種高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。本發明還涉及甲酸的新用途，在使用高效液相色譜分析法測定組合物中巰基化合物的含量時作為穩定劑的應用。本發明所述的高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法，其特徵在於，流動相為含有甲酸的水相與有機相的混合物，色譜柱為反相色譜柱，檢測器為紫外檢測器；所述有機相為甲醇或乙腈；所述水相是磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、離子對試液或純水；有機相水相甲酸=50 500 949 460 I 40，體積比；以樣品供試液的體積計，樣品供試液中，甲酸體積百分比為O. 5 10. 0% ；樣品供試液的存儲環境優選為O 8°C的低溫存儲；所述磷酸鹽緩衝液為I 100mmol/L的磷酸鹽溶液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，磷酸二氫銨中的一種或幾種；所述醋酸鹽緩衝液為I lOOmmol/L的醋酸鈉、醋酸銨、醋酸鉀的一種或幾種；所述離子對試劑溶液為I lOOmmol/L的離子對試劑四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨、四甲基溴化銨或四甲基硫酸氫銨；所述的巰基化合物是所有含兩個或多個巰基官能團的有機化合物，優選為2，3- 二巰基丁二酸及其鈉鹽、2，3- 二巰基丙烷磺酸及其鈉鹽、2，3- 二巰基-I-丙醇或1，4- 二巰基-2，3- 丁二醇。進一步優選為2，3- 二巰基丁二酸；所述反相色譜柱為C18或C8填料的反相色譜柱,檢測波長是200 285nm，流速是0. 5ml/min I. 5ml/min ;流動相的洗脫方式為等度洗脫或梯度洗脫,優選為等度洗脫；採用上述的色譜柱、流動相和檢測器進行檢測的過程，為常規的，如《天麻飲片中天麻素的含量測定方法的研究》(徐金章、楊水新，《中成藥》2011,23(11)，P795-797)等文獻報導的過程；優選的，包括如下步驟(I)色譜條件
色譜柱填料為十八烷基矽烷鍵合矽膠(250mmX4. 6mm, 5 μ m)；流動相將甲醇、水和甲酸按以下體積比混合甲醇水甲酸= 200 400 796 588 4 12 ;洗脫方式單通道等度洗脫；流速0.8ml/min I. 2ml/min ；檢測波長210 254nm ；柱溫25 35°C ;進樣量:10 50 μ I ； (2)稀釋溶劑的配製向所述的流動相中添加甲酸，按體積計，甲酸添加量為流動相的O. 5 2. 0%，為稀釋用的溶液A ；(3)供試品溶液和對照品溶液的配製取含巰基化合物的樣品，用甲醇溶解，並用溶液A稀釋，配製成每ImL中含巰基化合物O. 05 3. Omg的供試品溶液；另取對應的含巰基化合物對照品，同法配製成每ImL中含巰基化合物O. 05 3. Omg的對照品溶液，並且均放置於4 8°C的低溫環境中待測；(5)取供試品溶液和對照品溶液各10 50 μ I注入液相色譜儀，進行檢測分析；檢測分析的過程，是公知的，本領域的技術人員，可以根據《HPLC測定二巰丁二酸的有關物質》(樂健等，《中國藥學雜質》2011，46(13) ,Ρ1030-1033)等文獻報導的方法，通過標準曲線進行分析檢測，本發明不再贅述；本發明所述的高效液相色譜法是指高效液相色譜法的單獨使用，不包括與質譜法的聯合使用，高效液相色譜-質譜法的聯合使用方法不在本專利約束的範圍內。本發明具有以下有益的效果與僅僅包含有磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、離子對試液或單獨的純水作流動相相比較而言，這些流動相中如果加入了適量的甲酸，可以明顯解決或減緩巰基化合物在供試液和流動相中的極端不穩定現象而造成的含量測定誤差，對二巰丁二酸而言，還可避免磷酸鹽緩衝液的色譜圖峰形造成分叉的影響，起到優化色譜圖峰形的好處。而且，同時在樣品供試液中也加入適量的甲酸，結合流動相中加入的甲酸，那麼，在整個樣品前處理和色譜分析測試過程，可以很好的保證巰基化合物的含量測定的穩定性和可重複性，為起草含巰基官能團化合物的質控標準提供了可靠的保證。同時為巰基化合物降解出的有關物質的精密測定提供了重要的參考價值。
圖I為實施例I的檢測結果。圖2為對比實施例I的檢測結果。圖3為實施例2的檢測結果之一。圖4為實施例2的檢測結果之二。
具體實施例方式實施例I二巰丁二酸的有關物質液相分析方法儀器和色譜條件
色譜儀Angilent 1100型高效液相色譜儀；色譜柱十八烷基矽烷鍵合矽膠為填料，Angilent SB C184. 6 X 250mm, 5 μ m ；檢測波長234nm，流速I. Oml/min ;洗脫方式為單通道等度洗脫；柱溫35°C。流動相和溶液A :流動相為甲醇、水和甲酸的混合物，體積比為，甲醇水甲酸=240 752 8 ；溶液A :採用流動相。實施步驟測定方法
取二巰丁二酸顆粒劑I. O克，約相當於二巰丁二酸66. 7mg,置於25ml量瓶中，加甲醇適量超聲約5min後，甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過後取續濾液作為母液，量取母液2ml，置於IOml量瓶中，加溶液A稀釋至刻度，搖勻，製成每ImL中約含二巰丁二酸530 μ g的溶液，作為供試品溶液；另量取該供試品溶液適量，加流動相製成每Iml中約含二巰丁二酸10. 6 μ g的溶液，作為對照品溶液。取對照品溶液50μ I注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的20% ;再準確量取上述兩種溶液各50 μ I注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4倍。靈敏度試驗方法逐級稀釋供試品溶液濃度，按信噪比3 1測定。實驗結果本方法具備較好的靈敏度，二巰丁二酸的最低檢出量為55ng。專屬性試驗鹼破壞取本品適量，置25ml量瓶中，加入O. lmol/L氫氧化鈉溶液適量，漩渦振蕩混勻，並置室溫下過夜24小時後，用甲醇定容到刻度後，照測定方法項下的方法及色譜條件進行測定，並記錄HPLC色譜圖。酸破壞取本品適量，置25ml量瓶中，加入4mol/L鹽酸溶液適量，漩渦振蕩混勻，並置室溫下過夜24小時後，用甲醇定容到刻度後，照測定方法項下的方法及色譜條件進行測定，並記錄HPLC色譜圖。氧化破壞取本品適量，置25ml量瓶中，加入5%過氧化氫溶液適量，漩渦振蕩混勻片刻後，加甲醇定容到刻度後，照測定方法項下的方法及色譜條件進行測定。高溫破壞取本品適量，置25ml量瓶中，加入去離子水約2ml，漩渦振蕩混合均勻，並置烘箱100°c的溫度下15min，取出，放冷，加甲醇定容到刻度後，照測定方法項下的方法及色譜條件進行測定，並記錄HPLC色譜圖。結果表明本品經強氧化劑、高溫、酸和鹼破壞後，各降解產物之間和降解產物與主藥之間，在有關物質項下的HPLC色譜條件下均能被檢出，且得到較好的分離。另外，二巰丁二酸的色譜峰形對稱性極好，出峰時間在4. 879min,其部分降解的有關物質(雙硫物R-S-S-R)的出峰時間在8. 639min,與二巰丁二酸之間得到良好的分離，且能被有效檢測出。按面積歸一化看，有關物質為O. 13%，沒有出現二巰丁二酸明顯的向該雙硫物部分降解的跡象，甲酸對促進二巰丁二酸穩定性起到重要作用。具體見附圖I。對比實施例I
儀器和色譜條件基本同實施例1，除了流動相和溶液A不同外。流動相甲醇-O. 04mol/l磷酸二氫鈉水溶液(加I. 6g/L硫酸氫四丁基銨，並以磷酸調pH至3. 2) =900-100，體積比。溶液A :採用流動相。實施步驟取實施例I中由甲醇稀釋製成的母液，加本流動相製成每Iml中約含二巰丁二酸530 μ g的溶液作為供試品溶液,另量取該供試品溶液適量,加流動相製成每Iml中約含二巰丁二酸10. 6 μ g的溶液，作為對照品溶液。同實施例I的方式進行分析。結果顯示，在沒有向流動相和溶液A中添加促穩定劑甲酸的情況下，二巰丁二酸的色譜峰的尾端有明顯的分叉，與實施例I比較，含量略低，而有關物質偏高達0.9%。具體見附圖2。實施例2 二巰丁二酸的液相分析的含量穩定性試驗儀器和色譜條件Angilent 1100型高效液相色譜儀及Angilent LC ChemStation色譜工作站；色譜柱Angilent C18 4. 6X250mm,5ym ;流速為I. Oml/min,單泵單通道走流動相；檢測波長為234nm ;柱溫35°C ;進樣量為50 μ I。流動相一(供含量測定和各項方法學驗證)為甲醇、水和甲酸的混合物，體積比，甲醇水甲酸=240 753 7 ；流動相二(供穩定性試驗項下的參照對比)體積比，甲醇25mmol/l醋酸鈉緩衝液(含lOmmol/1的四丁基硫酸氫銨，以乙酸調pH3. 5) = 350 650 ；含量測定的方法取二巰丁二酸顆粒劑I. O克(約相當於二巰丁二酸66. 7mg)，置於25ml量瓶中，力口甲醇適量，超聲5min後，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，量取續濾液1ml，置於25ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，製成每Iml中約含二巰丁二酸106. 7μ g的溶液。精密量取50 μ 1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取二巰丁二酸對照品適量，用甲醇適量溶解，並用流動相定量稀釋製成每Iml中約含二巰丁二酸106. 7μ g的溶液，同法測定，按外標法以峰面積計算。標準曲線取二巰丁二酸對照品適量，加甲醇配成濃度2. 88mg/ml的對照品貯備液。精密吸取上述貯備液適量，置25ml量瓶中，用流動相配成系列濃度的標準溶液，精密量取50 μ I注入液相色譜儀。照含量測定項下的方法和色譜條件測定，測定結果見表I。表I標準曲線測定結果
權利要求
1.甲酸在使用高效液相色譜分析法測定組合物中巰基化合物的含量時作為穩定劑的應用。
2.高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法，其特徵在於，流動相為含有甲酸的水相與有機相的混合物。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，色譜柱為反相色譜柱，檢測器為紫外檢測器。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述有機相為甲醇或こ腈；所述水相是磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、離子對試液或純水。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，有機相水相甲酸=50 500 949 460 I 40，體積比。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，以樣品供試液的體積計，樣品供試液中，甲酸體積百分比為0. 5 10. 0%。
7.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述磷酸鹽緩衝液為I lOOmmol/L的磷酸鹽溶液、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鉀、磷酸氫ニ鉀，磷酸ニ氫銨中的一種或幾種； 所述醋酸鹽緩衝液為I lOOmmol/L的醋酸鈉、醋酸銨、醋酸鉀的ー種或幾種； 所述離子對試劑溶液為I lOOmmol/L的離子對試劑四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨、四甲基溴化銨或四甲基硫酸氫銨。
8.根據權利要求2 7任一項所述的方法，其特徵在於，所述的巰基化合物是所有含兩個或多個巰基官能團的有機化合物。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的巰基化合物為2，3-ニ巰基丁ニ酸及其鈉鹽、2，3- ニ疏基丙燒橫酸及其鈉鹽、2，3- ニ疏基-I-丙醇或1，4- ニ疏基-2，3- 丁ニ醇。進ー步優選為2，3-ニ巰基丁ニ酸。
10.高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法，其特徵在於，包括如下步驟 (1)色譜條件 色譜柱填料為十八烷基矽烷鍵合矽膠(250mmX4. 6mm, 5 u m)； 流動相將甲醇、水和甲酸按以下體積比混合甲醇水甲酸=200 400 796 -588 4 12 ; 洗脫方式單通道等度洗脫；流速0. 8ml/min I. 2ml/min ； 檢測波長:210 254nm ； 柱溫25 35°C ； 進樣量10 50ii I ; (2)稀釋溶劑的配製向所述的流動相中添加甲酸，按體積計，甲酸添加量為流動相的-0.5 2. 0%，為稀釋用的溶液A ； (3)供試品溶液和對照品溶液的配製取含巰基化合物的樣品，用甲醇溶解，並用溶液A稀釋,配製成姆ImL中含巰基化合物0. 05 3. Omg的供試品溶液； 另取對應的含巰基化合物對照品，同法配製成姆ImL中含巰基化合物0. 05 3. Omg的對照品溶液， 並且均放置於4 8°C的低溫環境中待測；(5)取供試品溶液和對照品溶液各10 50iU注入液相色譜儀，進行檢測分析。
全文摘要
本發明公開了一種高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法，公開了甲酸在使用高效液相色譜分析法測定組合物中巰基化合物的含量時作為穩定劑的應用，流動相為含有甲酸的水相與有機相的混合物。本發明與僅僅包含有磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、離子對試液或單獨的純水作流動相相比較而言，可以明顯解決或減緩巰基化合物在供試液和流動相中因極端不穩定現象而造成的含量測定誤差，對有些巰基化合物還可避免磷酸鹽緩衝液的色譜圖峰形造成分叉的影響，起到優化色譜圖峰形的好處。可以很好的保證巰基化合物的含量測定的穩定性和可重複性。
文檔編號G01N30/06GK102759586SQ20121022592
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月2日 優先權日2012年7月2日
發明者倪睿, 史家駿, 陳志明, 馬晉隆 申請人:上海現代藥物製劑工程研究中心有限公司