通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組dna的方法
2024-04-05 22:49:05
專利名稱：通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組dna的方法
技術領域：
本發明涉及通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，屬於分子生物學技術領域。
背景技術：
濃香型白酒的生產過程與微生物菌群的演化交替密不可分，酒醅是白酒釀造過程中微生物生長基質，主要原料包擴高粱、糯米、小麥、玉米糠殼等根據不同工藝和傳統其原料成分不同，其中含有大量醇、酸、酯等白酒風味物質和其他澱粉、多糖、色素等物質。微生物與窖池微生態環境相互作用並在窖池中進行複雜的物質能量代謝，積累了豐富多樣的代謝產物，這些代謝產物是濃香型白酒酒體風味與口感形成的重要物質基礎，探討發酵過程中濃香型白酒酒醅微生物群落特性的差異及其變化規律對濃香型白酒生產有著重要的指導意義。運用分子生物學相關方法進行酒醅環境中微生物生態研究，能克服經典培養方法 的不足以及引起種群丟失等局限，可以更加可靠、快速地獲得環境樣品中各種微生物的菌落指紋，確定微生物的多樣性及其分類地位，揭示和豐富生態環境的微生物資源。高質量DNA提取是採用分子生物學方法進行微生物種群研究的基礎，能否快速成功提取酒醅樣品多種微生物的DNA以及所提DNA質量的高低直接影響整個實驗的成敗。目前提取酒醅中微生物基因組DNA方法大多使用商品化的試劑盒。商品化的試劑盒適用範圍比較專一，存在特異性的局限。試劑盒大多針對他對某一類菌提取效果好，且在多菌種存在的酒醅中試劑盒不能保證提取豐度和效果的穩定。雖然在PCR擴增可通過稀釋模板濃度來降低雜質對實驗操作的影響，但也會影響擴增效果，不利於後續分析(微生物的鑑定、多樣性分析等)工作的進行。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法。本發明的技術方案是通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，包括如下步驟酒醅樣品的預處理，微生物基因組DNA的提取；其中，所述酒醅樣品的預處理包括如下步驟取酒醅樣品，加入玻璃珠，加入磷酸緩衝液，渦旋，4°C低速離心，取上清液，重複操作3飛次；合併所有上清，4°C高速離心，收集菌體沉澱。進一步的，所述玻璃珠與酒醅樣品的質量比為I : f 2，玻璃珠的直徑為f 2mm。進一步的，所述酒醅樣品與磷酸緩衝液的質量比為I : 3 5。進一步的，所述磷酸緩衝液成分為13(Tl40mM NaCl，2 3mM KCl，l(Tl2mM Na2HPO4,I 2mM KH2PO4, pH 為 7. 0 8· O。進一步的，所述的低速離心是指200 400g離心3 5min。進一步的,所述的高速離心是指9000 14000rpm離心5 lOmin。進一步的，所述的微生物基因組DNA的提取採用商品化試劑盒、SDS高鹽提取法及其衍生方法、CTAB提取法及其衍生方法中的一種。本發明還提供了上述方法在製備基因組DNA提取試劑盒中的用途。本發明方法簡單快捷，易於操作，成本低廉。採用本發明方法進行預處理後，不僅沒有影響用以提前基因組DNA的微生物的多樣性，反而使提取基因組DNA純度高，雜質少。本發明方法適於酒醅微生物的鑑定、分類、多樣性研究等。
圖I、未經預處理提取獲得酒醅樣品DNA擴增16S rDNA的瓊脂糖電泳圖；1為上層酒醅樣品；2為中層酒醅樣品；3為下層酒醅樣品；Nr為空白樣；Mr為DNA Maker。圖2、經預處理後提取獲得酒醅樣品DNA擴增16S rDNA的瓊脂糖電泳圖；1為上層酒醅樣品；2為中層酒醅樣品；3為下層酒醅樣品；Nr為空白樣；Mr為DNA Maker。
圖3、未經預處理提取獲得酒醅樣品DNA擴增16S rDNA的變性梯度凝膠電泳圖；I為上層酒醅樣品；2為中層酒醅樣品；3為下層酒醅樣品。圖4、經預處理後提取獲得酒醅樣品DNA擴增16S rDNA的變性梯度凝膠電泳圖；1為上層樣酒醅品；2為中層酒醅樣品；3為下層酒醅樣品。圖5、未經預處理提取獲得酒醅樣品DNA擴增18S rDNA的瓊脂糖電泳圖；1為50年樣品；2為100樣品；3為200樣品；4為300年樣品；Nr為空白樣；Mr為DNA Maker。圖6、經預處理提取獲得酒醅樣品DNA擴增18S rDNA的瓊脂糖電泳圖；I為50年樣品；2為100年樣品；3為200年樣品；4為300年樣品；Nr為空白樣；Mr為DNA Maker。圖7、未經預處理提取獲得酒醅樣品DNA擴增18S rDNA的變性梯度凝膠電泳圖；I為50年樣品；2為100年樣品；3為200年樣品；4為300年樣品。圖8、經預處理提取獲得酒醅樣品DNA擴增18S rDNA的變性梯度凝膠電泳圖；I為50年樣品；2為100年樣品；3為200年樣品；4為300年樣品。
具體實施例方式本發明通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，包括如下步驟酒醅樣品的預處理，微生物基因組DNA的提取；其中，所述酒醅樣品的預處理包括如下步驟取酒醅樣品，加入玻璃珠，加入磷酸緩衝液，渦旋，4°C低速離心，取上清液，重複操作:Γ5次(儘可能多收集菌體細胞減少菌體流失)；合併所有上清，4°C高速離心，收集菌體沉澱。進一步的，所述玻璃珠與酒醅樣品的質量比為I : f 2，玻璃珠的直徑為廣2mm。進一步的，所述酒醅樣品與磷酸緩衝液的質量比為I : 3 5。進一步的，所述磷酸緩衝液成分為130 140mM NaCl，2 3mM KC1，10 12mMNa2HPO4,1 2mM KH2PO4, pH 為 7. 0 8· O。進一步的，所述的低速離心是指200 400g離心3 5min。進一步的,所述的高速離心是指9000 14000rpm離心5 lOmin。進一步的，所述的微生物基因組DNA的提取採用商品化試劑盒、SDS (十二烷基磺酸鈉)高鹽提取法及其衍生方法、CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取法及其衍生方法中的一種。本發明還提供了上述方法在製備基因組DNA提取試劑盒中的用途。
本發明中，低速離心主要是沉澱雜質獲得菌體上清液，高速離心主要是為了讓菌體上清液中菌體細胞沉澱下來。經發明人研究發現，在20(T400g下離心3飛min，可以很好的除去樣品中的雜誌，獲得菌體上清液；經9000 HOOOrpm離心5 10min，能收集到菌體上清液中菌體細胞，同時又不會影響後續操作中菌體細胞的重懸。低溫條件(4°C)離心是防止離心過程中DNA降解。本發明中，玻璃珠在使用前最好經滅菌處理，以儘量減少DNA提取過程中雜菌的帶入。酒醅樣品中加入玻璃珠、磷酸緩衝液後的渦旋相當於研磨過程，主要作用是洗脫菌體。玻璃珠的直徑以f 2mm為宜，玻璃珠太大或太小均會讓樣品研磨不夠充分，不能充分洗脫菌體。低速離心主要是沉澱雜質，玻璃珠與雜質一起沉降在下層沉澱中，取上層菌液進行後續操作。磷酸鹽緩衝液的效果穩定能且保存時間長，且磷酸緩衝液適於細胞的洗滌等處理，因此在本發明中選用磷酸鹽緩衝液。本發明方法通過預處理，將菌體和雜質通過離心分離，最終獲得純淨的菌體用於 後續基因組DNA的提取。實施例I採用本發明方法提取酒醅中微生物的基因組DNA將酒醅填入新窖池中，發酵完畢後，取上、中、下層出窖酒醅為樣品。本發明方法分別稱取O. 5g酒醅樣品於50ml離心管，向離心管加入3mL磷酸緩衝液(PBS )(137mMNaCl,2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, ρΗ8· O)和 O. 3g 玻璃珠(直徑 2mm)，漩渦震蕩5min, 200 X g離心5min,吸取上清液,重複上述操作三次，合併上清液，4°C下12000rpm離心5min，取沉澱作為基因組DNA提取材料。提取基因組DNA採用蛋白酶K與SDS高鹽組合方法沉澱中加入ImLDNA抽提液(IOOmmoI/L Tris-HCl pH8. 0,100mmol/L EDTA, IOOmmoI/LNa3PO4,1. 5mol/L NaCl)和5μ 蛋白酶k (20mg/mL), 200r/min搖床37 下30min (—方面給蛋白酶k提供合適的反應溫度，另外可以讓菌體重懸)，在加入500 μ L10%SDS 65 °C水浴Ih。水浴後的樣品4°C下6000 X g離心lOmin，小心吸取上清於2ml離心管，加入等體積酚氯仿異戊醇(25 24 I)抽提一次，12000rpm離心IOmin,取上清加入等體積氯仿:異戍醇(24 : l)12000rpm離心IOmin,取上清，重複兩次。上清液加入O. 6體積預冷的異丙醇_20°C沉澱lh, 12000rpm離心IOmin,小心倒掉液體。沉澱用70%乙醇洗滌數次。洗滌後的DNA用吹風吹乾後TE溶解，-20°C保存。對照方法直接稱取O. 5g酒醅作為基因組DNA提取材料，不做預處理處理直接採用蛋白酶K與SDS高鹽組合提取酒醅基因組DNA。使用核酸蛋白儀(Eppendorf公司生產)測定得到的基因組DNA純度,根據核酸的最大吸收波長為260nm，蛋白質為280nm，在波長260nm時，IOD值相當於雙鏈DNA濃度為50 μ g/ml，單鏈寡核苷酸的含量為30 μ g/ml，可以據此來計算核酸樣品的濃度，通過測定在260nm和280nm的OD值的比值(0D260/0D280)，估計核酸的純度。純淨DNA的比值為
I.8^1. 9。若比值高於I. 9說明DNA樣品中的RNA尚未除盡，若比值低於I. 8，若樣品中含有酚和蛋白質等雜質。表I表明，預處理後提取的酒醅微生物基因組DNA的純度更高。
表I提取得到的酒醅樣品中微生物基因組DNA的純度
OD260/280
上層酒醅樣晶中層酒醅樣品下層酒醅樣晶本發明方法 Γ88L82L82 對照方法 L46 L28 L54以提取得到的酒醅微生物基因組DNA為模板，以細菌16S rDNA V3區的通用引物P2 (SEQ IDNol:5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3，)和 P3—GC (SEQ ID No2:5，-CGC CCGCCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3』)作為引物，擴增16S rDNA。PCR模板量為10ng，擴增體系為ExTaq(takara公司生產)體系，擴增條件為94°C預變性4min ;94°C變性lmin，應用降落PCR，65°C開始退火，每兩輪降低1°C，最終降至 56°C，退火 lmin ;72°C延伸 Imin ;再 94°C變性 lmin ;55°C退火 lmin ;72°C延伸 lmin,共10個循環，72°C終延伸6min。結果見圖I、圖2，預處理後提取的基因組DNA樣品的擴增 產物條帶明亮，帶型佳，表明擴增效果好。同時將擴增產物經Dcode系統(Bi0-Rad公司生產的變性梯度凝膠電泳系統)進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，尿素和甲醯胺濃度為3(T50%，200V電壓下電泳210min，SYBR(賽伯公司生產的染色劑)染色30min。結果見圖3、圖4。經預處理後提取的基因組DNA樣品的擴增產物的條帶明顯比未做處理提取的基因組DNA樣品的擴增產物的條帶更加清晰明亮，條帶數目多，能用於單一條帶切膠回收進行後續試驗，說明獲得的基因組DNA能很好反映酒醅中細菌微生物多樣性，此外，經過預處理並沒有影響用於提取基因組DNA的微生物的多樣性。實施例2採用本發明方法提取酒醅中微生物的基因組DNA將酒醅分別填入50、100、200、300年窖齡的濃香型白酒釀造窖池發酵，發酵完畢後取出窖酒醅為樣品。分別稱取O. 5g出窖酒醅樣品於50ml離心管，向離心管加入3mL磷酸緩衝液(PBS)(137mM NaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4,ρΗ8· O)和 O. 3g 玻璃珠(2mm)，漩渦震蕩5min, 200 X g離心5min,吸取上清液,重複上述操作三次，合併上清液，4°C下12000rpm離心5min，取沉澱。基因組DNA提取採用蛋白酶k與CTAB組合方法沉澱加入ImLCTAB抽提液(2%CTAB, 5moI/LNaCLUmoI/LTris-hcI (ρΗ=8)、0· 5mol/LEDTA)和 20 μ L 巰基乙醇，65 °C恆溫混勻儀振蕩30min,加入5μ I蛋白酶k (20mg/mL), 55°C恆溫混勻儀振蕩30min,室溫5000rpm離心IOmin,收集的上清加入等體積酹氯仿異戍醇(25 : 24 : I)抽提一次，12000rpm離心IOmin,取上清加入等體積氯仿異戍醇(24 : : I) 12000rpm離心IOmin,取上清，重複兩次。上清液加入O. 6體積預冷的異丙醇_20°C沉澱lh, 12000rpm離心IOmin,小心倒掉液體。沉澱用70%乙醇洗滌數次。洗滌後的DNA用吹風吹乾後TE溶解。對照方法直接稱取O. 5g酒醅作為基因組DNA提取材料，不做預處理直接採用蛋白酶k與CTAB組合提取酒醅基因組DNA。使用核酸蛋白儀(Eppendorf公司生產)測定得到的基因組DNA純度。結果見表2，結果顯示本發明提取獲得DNA純度高，且質量穩定。表I提取得到的酒醅樣品中微生物基因組DNA的純度
OD260/280
50年窖齡 100年窖齡 200年窖齡 300年窖齡 本發明方法 LB2L88L85L81
對照方法 L43L62L21L39 以提取得到的DNA為模板，引物為真菌18S rDNA通用引物NS3-GC (SEQ IDNo3:5，-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GGC AAG TCT GGT GCCAGC AGC C-3，)和 YM951r (SEQ ID No4:5，_TTG GCA AAT GCT TTC GC-3，)，擴增 18S rDNA。PCR模板量為10ng，擴增體系為ExTaq體系，擴增條件為95°C預變性4min ;93°C變性lmin，應用降落PCR，55°C開始退火，每兩輪降低1°C，最終降至45°C ;退火lmin，72°C延伸3min ;再93°C變性lmin ;45°C退火lmin ;72°C延伸3min，共5個循環，72°C終延伸6min。結果見圖5和圖6。未處理提取的基因組DNA樣品的PCR產物的條帶較暗，而預處理後提取的基因組DNA的樣品PCR產物的條帶清晰明亮，擴增效果明顯好於未處理提取的基因組DNA樣品。採用伯樂Dcode系統進行變性梯度凝膠電泳，變性濃度為10 50%，200V電壓下電泳240min，SYBR染色30min，結果見圖7、圖8。未處理樣品DGGE凝膠圖譜條帶暗，且條帶數目少。而預處理後提取的基因組DNA樣品擴增產物DGGE凝膠圖譜中的條帶清晰明亮，能很好反映不同窖齡窖池酒醅中真菌的群落變化情況，可切膠回收用於後續研究。
權利要求
1.通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特徵在於包括如下步驟酒醅樣品的預處理，微生物基因組DNA的提取；其中，所述酒醅樣品的預處理包括如下步驟取酒醅樣品，加入玻璃珠，加入磷酸緩衝液，渦旋，4°C低速離心，取上清液，重複操作3^5次；合併所有上清，4°C高速離心，收集菌體沉澱。
2.根據權利要求I所述的通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特徵在於所述酒醅樣品與玻璃珠的質量比為I : f 2，玻璃珠的直徑為f 2mm。
3.根據權利要求2所述的通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特徵在於所述磷酸緩衝液與酒醅樣品的質量比為I : 3 5。
4.根據權利要求2或3所述的通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特徵在於所述磷酸緩衝液成分為13(Tl40mM NaCl，2 3mM KCl，l(Tl2mM Na2HPO4, T2mMKH2PO4, pH 為 7· 0 8· O。
5.根據權利要求2 4任一項所述的通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特徵在於所述的低速離心是指20(T400g離心3 5min。
6.根據權利要求2飛任ー項所述的通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特徵在於所述的高速離心是指9000 14000rpm離心5 lOmin。
7.根據權利要求2飛任ー項所述的通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特徵在於所述的微生物基因組DNA的提取採用商品化的DNA提取試劑盒、SDS高鹽提取法及其衍生方法、CTAB提取法及其衍生方法中的ー種。
8.權利要求f7所述的通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法在製備基因組DNA提取試劑盒中的用途。
全文摘要
本發明涉及通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，屬於分子生物學技術領域。本發明要解決的技術問題是提供一種通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法。本發明的技術方案是通過預處理獲得高質量酒醅微生物基因組DNA的方法，包括如下步驟酒醅樣品的預處理、微生物基因組DNA的提取。採用本發明方法提取的酒醅中微生物基因組DNA純度高，雜質少，可用於酒醅微生物的分類、多樣性研究等。
文檔編號C12N15/10GK102816757SQ20121034442
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
發明者李德林, 許正宏, 敖宗華, 史勁松, 王松濤, 陸震鳴, 林鋒 申請人:瀘州品創科技有限公司