用於治療性克隆的人體細胞組織器官保存方法
2024-02-01 04:34:15 1
專利名稱：用於治療性克隆的人體細胞組織器官保存方法
技術領域：
本發明涉及凍存技術，尤其是人體細胞組織器官(如臍帶組織和臍帶相關細胞)的體外凍存技術，其中凍存的細胞被用於治療性克隆及其它用途。通過本發明的凍存技術，凍存的組織和細胞可以在復甦使用前無限期保存。當凍存的組織和細胞被復甦後，可用於治療性克隆和移植、功能基因組學研究、疾病相關基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料。
目前，生物材料的儲存時間是由生物材料降溫至冷凍保存溫度的過程所決定的。降溫過程中細胞內外的水分從液體狀態到固體狀態要經歷結冰過程，包括水分子的有序排列——結晶化或非結晶化過程。對於冷凍學家而言，其技術關鍵在於使細胞進入冷凍溫度後仍能使其回到生理狀態而沒有損傷。
細胞和組織凍存的兩個關鍵步驟是凍融和結晶。凍融技術要求細胞外液體結冰，但採用了很多步驟來減少細胞內結冰。有人建議採用全樣本凍存，但仍無法防止細胞內結冰，正是這些冰晶在凍融中對細胞造成致命的損傷。另一技術是結晶技術，其中試圖採用高濃度液體和/或多聚體來減少冰晶形成。然而長久地暴露於高濃度甚至毒性水平的結晶添加劑中對細胞的損害亦很大。
在人體的各種細胞組織器官中，臍帶組織和臍帶相關細胞一直被認為是生物學廢物，在胎兒出生後予以廢棄，儘管有些臍帶組織和臍帶相關細胞可作為人體細胞來源而用於體外研究，但通常為短期研究。並沒有將臍帶組織和臍帶相關細胞經過凍存，解凍後再用於研究的報導。
近年來，隨著體細胞克隆技術、治療性器官克隆和同種或異種移植技術的發展和成功，要求一種能長期保存臍帶組織和臍帶相關細胞的方法，確保臍帶組織和臍帶各種細胞在長期乃至無限期的保存後能安全復甦，並且保持其理化性質不變，以便為臍帶提供者本人或他人提供器官克隆、移植、功能基因組學研究、疾病相關基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料所用。
因此，本發明的目的在於提供一種對用於治療性克隆的人體細胞組織器官進行凍存的方法，用該方法進行凍存的人體細胞、組織和器官，在解凍後能安全復甦並且保持理化性質不變，從而用於各種用途如製備治療性克隆。
在本發明的一個方面，提供了一種對用於治療性克隆的人體細胞、組織或器官進行凍存的方法，該方法包括以下步驟(a)將獲取的人體細胞、組織或器官浸入冷凍保護液，充分混勻冷凍保護液，使冷凍保護液充分滲透入該細胞、組織、器官；(b)起始溫度設為20±5℃，以5-15℃/分鐘降溫至5-8℃，然後持續15-30分鐘，進行點冰；(c)點冰以後，維持5±3分鐘以使冷凍溫度仍保持在5-8℃；(d)調整降溫速度至-0.5至-1.5℃/分鐘並將溫度降至-8±1℃，維持30±20分鐘；(e)以-0.1至-0.5℃/分鐘的速度下降至低於-70℃的保存溫度。
較佳地，步驟(b)-(e)是在CO2緩衝環境中進行；而且，用液氮冷卻的金屬探棒點冰而形成細胞外點冰。較佳地，在冰晶形成後，溫度以每分鐘0.5至1.5℃(如1度)的速度下降至約-8℃，並保持10-50分鐘以保證冷凍組織進入冷凍狀態之前，在冷凍保護液中達到物理和生物學平衡狀態。
本發明還提供了將凍存的人體細胞、組織、器官解凍，用於製備治療性克隆供核的方法，它包括將上述凍存的人體細胞組織器官在1-3分鐘內快速解凍，然後在體外培養用作供核。
在生物材料的凍存過程中，冷凍保護劑起的作用是保護結冰過程中細胞的活性。冷凍保護劑的主要通過以下方式起到保護作用，即當水轉變成冰且鹽離子濃度升高時，起稀釋作用。結冰量取決於溫度和溶液組分。另外，冷凍保護劑還能降低細胞內的結冰溫度、穩定細胞膜和蛋白。
所有的溶液在形成冰晶核心之前都能在低於其冰點的溫度下過冷而不凍結。當用凍融法凍存時，細胞外介質的凍結出現在過冷低點時的點冰。非點冰引起的結冰是在溶液溫度大大地低於冰點時的自髮結冰。因為該過程是自發的，結冰隨機發生於無法預見的溫度下，因此在同樣的凍存程序下細胞的存活力差異很大。
另外，當極度過冷時發生的快速結冰易造成細胞和組織損傷。另外，如果細胞外結冰發生極度過冷時，細胞內冰形成的可能性大大增加。這一現象源於結冰導致的細胞脫水延遲發生，進一步增加細胞內水的瀦留，從而使細胞內結冰的可能性又大大地增加了。
一旦細胞外點冰完成，樣品被冰包圍，樣品就能降溫至凍存狀態。
降溫步驟是凍融法中的關鍵點。部分結冰的細胞外溶液濃度高於細胞內溶液，為達到熱力學平衡，細胞丟失水分而脫水。隨著細胞外冰的逐漸增多，脫水愈加嚴重。細胞的三個特性決定其脫水的速度(1)細胞膜的水滲透率(水滲透率愈差，細胞脫水的時間愈長)；(2)細胞膜水滲透率的溫度依賴性(所有細胞膜在溫度降低時其水滲透率下降)；(3)細胞的大小(大細胞比小細胞需要更長的時間發生脫水)。由於各細胞的特性各不相同，其凍存的優選條件就有一定的差異。
儘管，凍存時細胞損傷的確切機制尚未完全闡明，然而通過細胞活力測定發現，非常快和非常慢的冷卻速度都大大地降低細胞活力，中等冷卻速度產生最優選的結果。儘管對於不同的細胞，其優選冷卻速度和降溫曲線可以差別很大，但冷凍的總體程度是相近的。過快冷凍細胞沒有足夠的時間脫水而形成細胞內冰，細胞損傷主要歸因於細胞內冰。過慢冷凍時，細胞損傷主要因為過長時間暴露於高濃度的細胞內和細胞外的鹽分以及冷凍保護液，或細胞外冰和細胞之間的相互作用。
在細胞內冰核形成之前必須使細胞脫水。當細胞在1M和2M濃度的冷凍保存液內時，細胞脫水這一事件多發生在-50℃-40℃之間。值得一提的是，細胞內的結冰量在降溫中可能不會對細胞造成傷害，但如果解凍不夠快的話，細胞會因為溶解時發生腫脹而死亡。
利用本發明的組織和細胞冷凍方法，可以在低溫下避免細胞內冰晶形成和細胞毒性化學試劑的使用，利用程序冷凍儀在適當降溫速度下進行冷凍保護組織。該組織和細胞的冷凍保存方法使組織和細胞能無限期保持其活力和生理特性，以供器官克隆、移植、體外檢測以及其他功用方面的應用。
本發明提供的對用於治療性克隆的人體細胞組織器官進行凍存的方法，包括步驟(a)將獲取的人體細胞、組織或器官浸入冷凍保護液，充分混勻冷凍保護液，使冷凍保護液充分滲透入該細胞、組織、器官；(b)起始溫度設為20±5℃，以5-15℃/分鐘降溫至5-8℃，然後持續15-30分鐘，進行點冰；(c)點冰以後，維持5±3分鐘以使冷凍溫度仍保持在5-8℃；(d)調整降溫速度至-0.5至-1.5℃/分鐘並將溫度降至-8±1℃，維持30±20分鐘；(e)以-0.1至-0.5℃/分鐘的速度下降至低於-70℃的保存溫度。
適用於本發明方法的人體細胞組織器官可以是任何的人體細胞、組織和器官，其中包括(但並不限於)臍帶相關細胞、皮膚細胞、乳腺細胞、輸卵管細胞、耳細胞、卵巢細胞、上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、卵丘細胞、肌肉細胞、神經細胞、成骨細胞；臍帶組織、皮膚、乳腺等。
在本申請中，「臍帶相關細胞」指來源於臍帶的各種細胞，包括消化後體外培養的臍帶組織的各種細胞，如血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞等。「臍帶組織」指臍帶的全部組織，包括小段、切片等。
在本發明方法中，凍存溫度一般為低於-70℃，較佳地為不大於-120℃，更佳地為不大於-140℃，最佳地為不大於-196℃。如為短期保存(運輸途中)可置於-76℃(乾冰的溫度)。長期保存時，溫度宜更低，例如採用液氮保存(-196℃)。
適用於本發明方法的冷凍保護液包括細胞滲透性晶體形成試劑或非細胞滲透性的晶體形成試劑合適的細胞滲透性晶體形成試劑的例子包括(但並不限於)丙二醇、乙二醇、二甲亞碸、甘油，較佳地是甘油。非細胞滲透性的晶體形成試劑的例子包括(但並不限於)高分子量複合糖比如硫酸軟骨素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或羥乙基澱粉等。
通常，冷凍保護液被稀釋於稀釋劑中。合適的稀釋劑例子包括磷酸緩衝液和細胞培養液如DMEM、IDMEM、MEM、M199、RPMI1640、Ham′s F-10、NCTC109、NCTC135培養液、或以上稀釋劑的混合物。較佳地，該稀釋劑是DMEM培養液。為了在凍融過程中保持最佳的細胞活力，冷凍保護液和稀釋劑可根據各個不同的細胞加以調整。
一種優選的冷凍保護溶液是稀釋於DMEM培養液的1.5M到2.5M甘油，最好是2M的甘油。
在本發明的一個實例中，冷凍保護劑為1.5-2.5M甘油稀釋於DMEMF培養基中；冷凍組織，細胞浸入冷凍保護液時在20℃中完成，然後，降低溫度從20℃至6℃。降溫速度為-5至-15℃/分鐘。
在將細胞組織樣品與冷凍保護溶液混勻時，可使用任何機械攪動方式進行，從而增強冷凍保護液的滲透性。合適的混勻方法例子包括振蕩、水平搖動、離心、真空泵抽吸等。通常，要有足夠的時間以保證冷凍保護液的充分滲透，因此混勻時間通常為1-4小時。較佳地為2-3小時。
當稀釋冷凍保護液的培養基為碳酸氫鈉緩衝體系，較佳地可採用CO2緩衝環境，因為在冷凍保護液滲透入組織和細胞的滲透過程中，需要CO2緩衝環境以確保溶液的酸鹼度穩定。CO2緩衝環境中的CO2的具體含量可根據不同的組織和細胞加以調整，以期保持最佳的細胞活力。通常，CO2濃度為含5％或10％或更高。
在本發明方法中，宜先將樣品溫度從室溫降至約-5℃至-10℃。這是可採用快凍或慢凍程序，較佳地是降溫速度為5-12℃/分鐘，更佳地降溫速度為8-10℃/分鐘。
在點冰以促發冰晶形成時，可用液氮冷卻的金屬探針接觸裝有組織或細胞的凍存管，也可直接接觸管內的冷凍保護液或通過冷凍室內的機械臂操作，也可在冷凍室內注入氟立昂或乾冰進行點冰。
在點冰之後的降溫過程中，宜採用慢凍程序，即降溫速度低於0.1-0.5℃/分鐘，更佳地降溫速度為0.2-0.5℃/分鐘，更佳地降溫速度為0.2-0.4℃/分鐘，最佳地降溫速度約為0.2-0.3℃/分鐘。
在溶解凍存組織或細胞時，宜以較高速度升溫，在1-3分鐘內將溫度升至37℃。一種解凍方法是將凍存管直接置入37℃水浴。也可採用其他直接而快速的加熱方法。
在解凍後，為避免冷凍保護液在常溫下對細胞的毒性作用，須在解凍後15分鐘內，最好是在解凍後立即去除冷凍液。
解凍後的組織或細胞，可用於製備治療性克隆，以及作為功能基因組學研究，疾病相關基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料。
下面結合實施例進一步詳細地描述本發明，應理解，這些實施例僅用於闡述目的而不用於限制本發明範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照本領域常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人臍帶組織和臍帶相關細胞的凍存將臍帶組織浸入至少等量的冰上預冷的2.0M甘油的DMEM培養基凍存保護液中，持續1-2小時。或者，將臍帶內皮細胞的懸浮液與等量的冰上預冷的同上凍存保護液，持續0.5小時。期間充分混勻冷凍保護液，可置於CO2緩衝環境中，以50-70rpm搖床搖勻，或在管中輕輕震搖。
然後移入凍存管並真空封口。凍存管置入程序冷凍儀(Planer)，起始溫度設為20℃，以5-15℃/分鐘降溫至6℃，然後持續20分鐘，接著進行點冰。持續20分鐘以確保整體組織溫度一致(至少要維持15分鐘)，為6℃。點冰的接觸點在冷凍管的液面以下。
點冰以後，維持5分鐘以使冷凍室內溫度仍保持在6℃。調整降溫速度至-1℃/分鐘並將溫度降至-8℃，維持30分鐘。然後以-0.3℃或更慢速度下降至預定的保存溫度，可以是-70℃，也可以是更低溫度如為-120℃或-140℃下，則對細胞的損傷較小。
凍存組織(或細胞)從程序冷凍儀中移入-196℃冷凍庫或冷凍室內保存，直至使用。
實施例2人臍帶組織和臍帶相關細胞的凍存樣品的解凍凍存組織溶解要求在1-3分鐘內快速完成。在該實施例中，將含人臍帶組織和臍帶相關細胞的凍存樣品的凍存管直接置入37℃水浴，或其他直接而快速的加熱方法。
解凍後，立即用1000rpm離心10分鐘的方法，去除冷凍液。
實施例3人臍帶內皮細胞進行體細胞克隆1、獲得供核的人臍帶內皮細胞將實施例2或者直接培養獲得的人臍帶內皮細胞，用M199或RM1640等培養液(加10％胎牛血清)培養，傳代，遺傳分析，冷凍保存或直接作供核。
2、奶山羊超排與寄母羊同步奶山羊超排每隻動物肌注PG,0.06-0.1mg/次，間隔10-14天後注射第二次，在第二次注射PG 10-14天後開始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg計(不同種動物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時。間隔24小時發情時注射LRH,25ug/次，根據羊的體重作適當調整。
寄母羊的同步為與提供卵母細胞胞質的供質母羊同步，受體母羊間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質母羊超排注射PG前24小時，受體也同時注射PG，受體注射LRH的時間及劑量同供體。
3、卵母細胞的回收奶山羊注射LRH後28-30小時後手術回收卵母細胞。按手術常規剪毛、消毒、打開腹腔、拉出子宮與輸卵管，用10ml針筒7號針頭，衝卵液為含5％BSA的F10培養液，衝出輸卵管內的卵子接於園杯內。在體視解剖鏡下，將卵母細胞檢出置於CZB培養液中，37℃,5％二氧化碳培養箱中培養。
4、卵母細胞去核與注射人的體細胞將卵母細胞移於含7.5ug/ml細胞鬆弛素B的CZB培養液中20min，再移至CZB(含20mM HEPES)培養液中，同時將已消化成球形的臍帶內皮細胞或成纖維細胞亦移至該液中。按常規將卵母細胞去核，去核後再將人的臍帶內皮細胞直接注入卵母細胞的胞質內，形成的細胞被稱之為重構卵。重構卵置於CZB液中培養30分鐘，然後激活。
5、激活與包埋重構卵於CZB+細胞鬆弛素B(7.5μg/ml)+離子黴素(10μm)中，37℃培養5分鐘。移至CZB+細胞鬆弛素B(7.5μg/ml)+6-DMAP(2μm)370C，液滴法培養2-6小時。激活後的重構卵移至CZB中，待包埋。
包埋採用雙層包埋。所用的包埋液是0.8％與1.0％瓊脂糖(低熔點膠，約40℃)溶液。該包埋液是這樣製備的在10ml錐形玻璃離心管內將適量的瓊脂糖與生理鹽水混合煮沸，至完全溶解後置於42℃，水浴待用。
包埋時，在一塑料平皿中加入含Ca2+、Mg2+的PBS液，在PBS液底部用吸管加入胎牛血清，將待包埋的卵母細胞移入血清層，使其自然下沉，待位於底壁，吸出。然後移入另一含剛倒出的0.8％瓊脂糖的小平皿中，將卵母細胞的位置移動2-4次(起到洗滌作用)，再均勻吸卵(卵與卵之間有一定的距離，但相靠不是太遠)，移至PBS中。讓其自然凝固，再分割，換一口徑稍大的吸管，按相同方法進行第二層包埋，不同點在於包埋液的瓊脂糖濃度為1.0％。
6、移植與回收應用手術的方法，將包埋後的重構卵吸入移卵管，從輸卵管喇叭口處插入移卵管，將卵移進輸卵管內。隨後在輸卵管與子宮連接部用縫線結紮。在體內培養6天後，剪下輸卵管，用培養液衝出胚胎，觀察胚胎發育情況。
7、發育胚胎檢驗與保存採用PCR方法對發育的胚胎進行驗證，即該胚胎是否是來自人體細胞。方法如下從發育至桑椹或囊胚的胚胎取其部分細胞進行PCR檢測，所用的隨機單引物(10bp)的序列為5′-ACCCCCGAAG-3′，PCR反應程序是先94℃4分鐘，然後94℃10秒→36℃15秒→72℃30秒(共40個循環)，最後是72℃4分鐘。
發育至囊胚的胚胎的保存可利用其內細胞團細胞進行體外培養，建立ES細胞；或者將發育的胚胎液氮冷凍保持備用。結果如下(一)超數排卵
1、超排奶山羊總數20隻2、奶山羊超排效果卵巢發育率(以卵巢直徑＞1cm計)85％(17/20)平均每隻奶山羊排卵數11.2枚(225/20)平均每隻奶山羊回收卵數11.7枚(235/20)回收卵效率104％(235/225)(在計排卵點數時有誤，有的幾個排卵點緊靠在一起)(二)受體同步發情通過PG處理後，羊的同步率為78％(20/26)。
(三)體細胞培養建立嬰兒臍帶內皮細胞或成纖維細胞系。在傳代供過程中進行了染色體數分析。觀察了100分裂相，2倍體(46條染色體)佔75％。
本試驗所用的人體細胞是臍帶內皮細胞或臍帶成纖維細胞，未進行冷凍與飢餓處理。
(四)卵母細胞去核與注射人的體細胞去核總卵數153枚，其中成活148枚，成活率96.7％體細胞注射後成活卵數133枚重構卵存活率89.8％(五)重構胚發育情況重構胚早期發育情況表
結果表明，將人嬰兒臍帶內皮細胞移植入去核卵母細胞的發育率達到75.5％，正常發育率達到60.2％。
(六)發育胚胎的驗證用發育胚胎的細胞與山羊胚胎(囊胚)的DNA，分別進行隨機引物PCR分析，其檢測結果見
圖1，其中goat1和2分別為莎能奶山羊細胞、和本地山羊細胞，human1和human2為來自2個治療性克隆植入前胚胎的細胞。
結果表明，發育胚胎的細胞的兩個樣品間是一致的，兩種山羊囊胚間亦是一致的；而山羊囊胚與發育胚胎(其基因組來自人體細胞)之間的差別是很明顯的。因此，這證實發育胚胎來自人，即胚胎細胞中含有的是人的染色體和基因組。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1．一種對用於治療性克隆的人體細胞、組織或器官進行凍存的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(a)將獲取的人體細胞、組織或器官浸入冷凍保護液，充分混勻冷凍保護液，使冷凍保護液充分滲透入該細胞、組織、器官；(b)起始溫度設為20±5℃，以5-15℃/分鐘降溫至5-8℃，然後持續15-30分鐘，進行點冰；(c)點冰以後，維持5±3分鐘以使冷凍溫度仍保持在5-8℃；(d)調整降溫速度為-0.5至-1.5℃/分鐘並將溫度降至-8±1℃，維持30±20分鐘；(e)以-0.1至-0.5℃/分鐘的速度下降至低於-70℃的保存溫度。
2．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(b)-(e)是在CO2緩衝環境中進行；而且，用液氮冷卻的金屬探棒點冰而形成細胞外點冰；
3．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，冰晶形成後，溫度以每分鐘1度的速度下降至-8℃，並保持10-50分鐘以保證冷凍組織進入冷凍狀態之前，在冷凍保護液中達到物理和生物學平衡狀態。
4．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，人體細胞組織器官選自下組臍帶相關細胞、皮膚細胞、乳腺細胞、輸卵管細胞、耳細胞、卵巢細胞、上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、卵丘細胞、肌肉細胞、神經細胞、成骨細胞；臍帶、皮膚、乳腺。
5．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，凍存狀態的溫度為不高於-120℃。
6．如權利要求5所述的方法，其特徵在於，凍存狀態的溫度為不高於-140℃。
7．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，冷凍保護液含有細胞滲透試劑、晶體形成試劑或非晶體形成試劑，並且稀釋於選自下組的培養基或介質中DMEM、IDMEM、MEM、M199、RPMI1640、Ham′s F12、Ham′s F10、NCTC109、NCTC135或磷酸緩衝鹽。
8．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，細胞滲透試劑、晶體形成試劑或非晶體形成試劑選自下組硫酸軟骨素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙二醇、羥乙基澱粉、甘油、丙二醇、乙烯乙二醇、二甲亞碸。
9．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，冷凍保護劑為1.5-2.5M甘油稀釋於DMEMF培養基中；冷凍組織，細胞浸入冷凍保護液時在20℃中完成，然後，降低溫度從20℃至6℃，降溫速度為-5至-15℃/分鐘。
10．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，將凍存的人體細胞組織器官解凍，用於製備治療性克隆的供核，其步驟包括在1-3分鐘內快速解凍，然後在體外培養用作供核。
全文摘要
本發明涉及對人活細胞、活組織和活器官以及原代細胞、繼代細胞和細胞株的體外保存技術。它包括將人各種組織細胞浸入冷凍保護液,與冷凍保護液充分混勻,冷凍保護液有效地滲透入組織,分階段地將溫度降至預定溫度。冷凍組織細胞在使用前可無限期保存。可用於治療性器官克隆的供體細胞或細胞核。此外凍存的人體組織,細胞解凍復甦後體外培養可作為功能基因組學研究,疾病相關基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料。
文檔編號A01N1/02GK1302542SQ00111408
公開日2001年7月11日 申請日期2000年1月3日 優先權日2000年1月3日
發明者成國祥 申請人:上海中路生物工程有限公司