用於防治細菌性陰道病的詹氏乳桿菌的製作方法

2024-01-26 03:52:15 1

專利名稱：用於防治細菌性陰道病的詹氏乳桿菌的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及詹氏乳桿菌及其應用，特別涉及一株分離自人體的用於防治細菌性陰道病的詹氏乳桿菌。
背景技術：
微生物棲息在人體幾乎每ー個部位，如皮膚、口腔、腸道、生殖道等各部位都存在著大量的細菌，其中包括多種不同種類的細菌，可粗略分為「有益菌」和「條件治病菌」兩大類，在健康人體這些細菌的數量和比例保持穩定的平衡狀態。婦女陰道內 可存在多種細菌，其中，乳酸桿菌是維持陰道健康微生態環境最常見和最重要的有益菌，乳酸桿菌佔健康婦女陰道細菌總量的90%以上。它們主要通過產酸、過氧化氫抑制病原菌和其他條件致病菌的生長。如果某些因素引起陰道內乳桿菌數量減少，甚至完全缺失，則可導致陰道內許多條件治病菌異常増殖，出現以明顯的陰道微生態環境紊亂為主要特徵的細菌性陰道病。細菌性陰道病是育齡期婦女最為常見但又未受到重視的多發病，在健康婦女中的患病率約為20%，孕婦約為15%。細菌性陰道病是「小疾病，大麻煩」，患者生活質量明顯下降，精神負擔很重；而且感染愛滋病、淋病、非淋菌性尿道炎等性病的風險明顯增加；患病孕婦可出現一系列妊娠併發症，如早產及絨毛膜羊膜炎等。目前，細菌性陰道病的治療主要依靠甲硝唑或林可黴素等抗生素，但治療效果不佳，治癒率不到50%，而且復發的比例高。一半患者即使大量應用抗生素亦不能治癒，臨床症狀持續存在，患者備受煎熬，醫生苦無良策。如何控制復發、徹底根治細菌性陰道病是婦產科醫生亟需解決的棘手問題。為了提高細菌性陰道病的治療效果，臨床上急需新的治療方案。由於抗生素治療細菌性陰道病效果欠佳和抗生素治療引起的肝、腎損害等毒副作用，國內外一直在努力探索基於益生菌乳桿菌製劑的微生態療法。微生態治療是將以殺滅微生物為主要的治療方法變為增加益生菌、恢復陰道正常微生態環境為目的的新型治療理念。即在利用抗生素清除致病菌後，直接補充自健康婦女陰道分離的乳桿菌活菌製劑，使其粘附定植下來，促進其天然的抵抗致病菌生長的能力。健康婦女陰道內存在多種乳桿菌，具有個體差異性，且詹氏乳桿菌各株間抗致病菌能力差異明顯。選擇乳桿菌益生菌時，需要綜合考慮乳桿菌的種類，其產酸、產H2O2能力，及與陰道上皮細胞粘附的能力，其中乳酸桿菌能否在陰道成功定植，是乳桿菌持續作用的基礎，也是乳桿菌發揮療效的關鍵因素。由於不同的乳桿菌株對陰道上皮細胞有不同的粘附親和力，親和カ強的菌株定植能力強，才能起到抑殺多種病原微生物的作用。如果乳桿菌活菌製劑不能定植在陰道上皮細胞，體外實驗中再強的抑殺多種病原微生物的作用都無從談起，變為空頭支票。—個完善而有效的益生菌菌種，其本身至少必須具備下述標準(I)須為宿主應用位置正常定植菌；(2)能在宿主應用位置存活並生長；(3)可提供宿主有益的作用；(4)相關產品製成及儲存期間須可維持活性及存活能力。目前，國內陰道益生菌菌劑只有ー種，其主要成分是德氏乳桿菌活菌。雖然它是從健康婦女陰道分離出來的ー種乳桿菌，但不是我國婦女陰道菌群中的主要有益菌，我國健康婦女陰道細菌以詹氏乳桿菌為主。

發明內容
本發明的目的是提供一株用於防治細菌性陰道病的詹氏乳桿菌。本發明所提供的詹氏乳桿菌具體為詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)頂J-1，該菌已於2012年9月11日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No. 6558。所述詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 大小約 1-2 毫米、不透明、突起的乳白色菌落，菌落邊緣整齊、較溼潤，大小形態穩定(圖I)。處於對數生長期的所述菌株頂J-1，經塗片、革蘭染色，光學顯微鏡下觀察菌體的形態 為革蘭染色陽性，無芽胞桿菌，無鞭毛。(圖 2)。詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)IMJ_1CGMCC No. 6558兼性厭氧，生長最適溫度37-42°C，最適pH5. 8-6. 2 ;可發酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖等多種糖。所述詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii)IMJ-1CGMCC No. 6558，在生產 H2O2 中的應用也屬於本發明的保護範圍。在所述應用中，將所述詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCCNo. 6558種於培養基後,米用先靜置再振蕩培養的方式培養；靜置培養為厭氧環境。在本發明的一個實施例中，所述培養基具體為MRS (deMan, Rogosa andSharpe, MRS)液體培養基；所述培養的溫度為37°C ;所述先靜置培養再振蕩培養具體為先靜置培養21h再振蕩培養3h ;所述振蕩培養的轉速為220rpm，旋轉半徑為2. 54cm。所述詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 在製備預防和/或治療細菌性陰道病的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。所述產品可為預防和/或治療細菌性陰道病的菌劑或藥物。所述詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 在製備具有陰道上皮細胞粘附功能的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明的再ー個目的是提供一種菌劑。本發明所提供的菌劑是以所述詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)IMJ-lCGMCCNo. 6558為活性成分的菌劑。所述菌劑在生產H2O2中的應用也屬於本發明的保護範圍。所述菌劑在製備預防和/或治療細菌性陰道病的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。所述菌劑在製備具有陰道上皮細胞粘附功能的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明的又ー個目的是提供一種預防和/或治療細菌性陰道病的產品。本發明所提供的預防和/或治療細菌性陰道病的產品的活性成分為所述詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558ο所述產品可為預防和/或治療細菌性陰道病的菌劑或藥物。
本發明的又ー個目的是提供ー種具有陰道上皮細胞粘附功能的產品。本發明所提供的具有陰道上皮細胞粘附功能的產品的活性成分為所述詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC N。· 6558。本發明根據益生菌菌種的公認標準，從我國健康婦女體內離了陰道內優勢菌群一詹氏乳桿菌，並從中篩選出了一株具有較高的產H2O2能力和與陰道上皮細胞粘附定植能力強的益生菌株一詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)IMJ-1CGMCC No. 6558。實驗證明，將所述詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558,按照 106cfu/ml 的密度接種於MRS液體培養基，於厭氧環境下37°C靜置培養21h後，轉換為振蕩培養3h，轉速為220rpm，最終所得培養液上清中H2O2的濃度高達362. 3 μ Μ。高效產生過氧化氫，可有效抑制外來的病原菌和其他條件致病菌的生長；對陰道上皮細胞較強的粘附作用保證了菌株在陰道上皮的定植。本發明所提供的詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCCNo. 6558在細菌性陰道病防治方面具有一定的應用前景。
保藏說明菌種名稱詹氏乳桿菌拉丁名(Lactobacillusjensenii )菌株編號MJ_1保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏日期2012年9月11日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 6558


圖I為從健康人引導分離的詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCCNo. 6558 菌落。圖2為光學顯微鏡下觀察詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCCNo. 6558的菌體形態。圖3 為詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 與陰道上皮細胞的粘附作用。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、詹氏乳桿菌菌株的分離和鑑定—、詹氏乳桿菌菌株的分離MRS培養基蛋白腖10. Og ;牛肉膏10. Og ;酵母膏5. Og ;檸檬酸氫ニ銨2. Og ;葡萄糖 20. Og ;吐溫 80，I. OmL ;こ酸鈉(CH3COONa ·3Η20) 5. Og ;磷酸氫ニ鉀(Κ2ΗΡ04 ·3Η20) 2. Og ；硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20) 0. 58g ;硫酸錳(MnSO4 ·Η20) 0. 25g ;蒸餾水 IOOOmL ;調至 pH 6. 2 6. 6。收集了 200餘例臨床檢測無陰道炎症狀體徵的健康婦女陰道分泌物樣品，將樣本依次編號，接種於MRS液體培養基,37°C厭氧培養24h。姆個樣本隨機挑選5個單菌落於2mL MRS液體培養基中培養增菌24h，並對菌落依次編號。擴增細菌用於細菌保種與DNA製備。將分離到的數百株細菌分別進行菌種鑑定、產過氧化氫及與陰道上皮細胞粘附作用的檢測，把其中一株具有較強粘附作用且產過氧化氫的詹氏乳桿菌命名為頂J-I。ニ、詹氏乳桿菌菌株的鑑定經鑑定，步驟一分離得到的菌株IMJ-I為詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii)。該詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-I 已於 2012 年 9 月 11 日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北 辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 6558。具體從以下幾方面對菌株頂J-I進行鑑定I、形態學鑑定在MRS乳酸桿菌培養基平板上，上述步驟一分離得到的菌株MJ-I表現為大小約
1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落邊緣整齊、較溼潤，大小形態穩定(圖I)。處於對數生長期的所述菌株MJ-1，經塗片、革蘭染色，光學顯微鏡下觀察菌體的形態為革蘭染色陽性，無芽胞桿菌，無鞭毛。(圖2)。2、生理生化特徵分析菌株MJ-I兼性厭氧，生長最適溫度37-42 °C，最適ρΗ5· 8-6. 2。根據API細菌鑑定標準利用API 50CHL培養基和API 50CH試劑條(bioMe ' rieux, Inc. , MarcyI』 Etoile, France)對檢測菌株MJ-I進行糖發酵反應判讀檢測菌株MJ-I的生理生化特徵。API50CHL是由49種可發酵碳水化合物的API 50CH試驗條組成的簡易培養基。以測定菌製成懸液接種試驗條的每ー個小管。當培養時，由於發酵碳水化合物產酸，PH下降，使指示劑變色。結果顯示，菌株IMJ-I可發酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖等多種糖。3、16s rDNA序列同源性分析常規方法培養上述步驟一分離得到的菌株MJ-1，提取菌株的總DNA作為基因擴增模板，採用通用引物27f 5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，1492r 5 ' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 '擴增細菌16S rRNA基因保守區。25 μ L擴增體系包括I XPCR反應緩衝液，200 μ mol/L dNTPs，上遊及下遊引物各O. 2 μ mol/L，IU Taq DNA聚合酶，I μ L模板DNA。反應條件94°C預變性5min ;94°C變性30s，55 °C退火40s，72°C延伸30s，共25個循環；72°C延伸lOmin。PCR產物用I %凝膠電泳檢測，陽性結果用27f 5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，1492r :5 ' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 '進行雙向測序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar軟體完成，序列比對通過美國國家生物技術信息中心 NCBI 資料庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)在線完成。菌株頂J-I的16s rDNA的序列詳見序列表中序列I。實施例2、詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 的功能分析I、詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)IMJ-1CGMCC No. 6558產H2O2 的檢測H2O2標準曲線製作首先用濃度為100mmol/L的哌嗪-N, N』 - ニ -こ磺酸(Piperazine-N, N_-Bis
2-ethanesulfonic acid, PIPES)將 30 % (v/v) H2O2 (相當於 9. 128mol/L)儲存液稀釋成lmol/L,再用 IOOmmoI/L PIPES 將 lmol/L H2O2 分別稀釋成 O μ mol/L,20 μ mol/L,40 μ mol/L.60 μ mol/L,80 μ mol/L, 100 μ mol/L的工作液；然後分別取100 μ L上述H2O2工作液與100 μ L濃度為20mmol/L的TMB(四甲基聯苯胺)、2 μ L辣根過氧化物酶(lmg/mL)混合，16°C孵育lOmin，測量OD 630值。最終得到H2O2濃度標準曲線y=0. 0033χ_0· 0496，R2=O. 992。詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 液體培養 H2O2 濃度檢測挑取詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 菌落,接種 ImL 培養48h的菌液於IOmL MRS液體培養基中，使培養液中菌株的濃度為106cfu/ml，於厭氧環境下37°C靜置培養21h後，轉換為37°C振蕩培養3h，轉速為220r/min，旋轉半徑為2. 54cm,培養結束後，收集發酵液，12000r/min離心2min，取100 μ L菌液上清測量OD 630值，根據標準曲線，計算菌液上清中H2O2濃度。實驗重複三次，結果取平均值。結果如表I 所示，詹氏乳桿菌(Lactobacillus jenseniiHMJ-1CGMCC No. 6558 在發酵培養液中能夠產生大量的H2O2，其濃度高達362. 3 μ M0
表I 詹氏乳桿菌(LactobaciIIus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 產生 H2O2 的能力檢測單位μ M
重複I 重複2 重複3 平均值 H2O2 產量 300.8 378.0 408. I 362.32、詹氏乳桿菌對陰道上皮細胞的粘附作用陰道上皮脫落細胞取自於200餘例健康(臨床檢測顯示無生殖系統感染)育齡期婦女，各細胞樣品標號後分別加入MEM培養基(pH 4. 0)，120g離心10分鐘，再重複離心2次，洗掉表面細菌，用MEM培養基調整陰道上皮脫落細胞濃度為IO5個/mL ;活化過夜培養詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 使其濃度為(108CFU/mL)。所述陰道上皮脫落細胞與所述詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1 CGMCC No. 6558各500 μ L等體積混合後置於37°C搖床(轉速為100r/min,旋轉半徑為2. 54cm)孵育Ih,然後用
0.8 μ m濾膜過濾，去掉游離詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii)IMJ-ICGMCC No. 6558,並將濾膜輕壓於蓋玻片上，固定細胞進行革蘭氏染色後油鏡觀察，分別計數三個細胞粘附細菌數，計算每個細胞平均粘附細菌數。同時將另外一株同樣採用實施例I的方法分離鑑定得到的，但與陰道上皮細胞粘附定植カ較弱的詹氏乳桿菌(LactobaciIIus jensenii)作為負對照。結果顯不，詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii)IMJ_1CGMCC No. 6558對分離自200餘例健康育齡期婦女的陰道上皮細胞均具有較強的粘附作用。圖3為粘附定植力不同的兩株詹氏乳桿菌與陰道上皮細胞的粘附作用革蘭氏染色後油鏡觀察圖，圖上半部為左右均為分離於健康育齡期婦女的陰道上皮脫落細胞；圖下半部為陰道上皮脫落細胞詹氏乳桿菌粘附作用，左下圖表示較強的粘附(詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1 CGMCCNo. 6558)，右下圖表示較弱的粘附(負對照)。從200餘例中，隨機選取4例，進行統計分析，計算得到每個陰道上皮細胞平均粘附詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1 CGMCCNo. 6558的數量達243個(見表2)。表2陰道上皮細胞粘附詹氏乳桿菌(LactobaciIIus jensenii)頂J-ICGMCCNo. 6558的數量統計
權利要求
1.詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii) IMJ-1,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 6558。
2.權利要求I 所述詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)IMJ-1CGMCC No. 6558，在生產H2O2中的應用。
3.權利要求I 所述詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 在製備預防和/或治療細菌性陰道病的產品中的應用。
4.權利要求I 所述詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 在製備具有陰道上皮細胞粘附功能的產品中的應用。
5.以權利要求I 所述詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558 %活性成分的菌劑。
6.權利要求5所述菌劑在生產H2O2中的應用。
7.權利要求5所述菌劑在製備預防和/或治療細菌性陰道病的產品中的應用。
8.權利要求5所述菌劑在製備具有陰道上皮細胞粘附功能的產品中的應用。
9.預防和/或治療細菌性陰道病的產品，其特徵在於所述產品的活性成分為權利要求 I 所述的詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558。
10.具有陰道上皮細胞粘附功能的產品，其特徵在於所述粘附產品的活性成分為權利要求 I 所述的詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii) IMJ-1CGMCC No. 6558。
全文摘要
本發明公開了一株詹氏乳桿菌及其應用。本發明所提供的詹氏乳桿菌具體為詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)IMJ-1，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.6558。本發明的詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)IMJ-1 CGMCC No.6558具有較強的產生H2O2的能力，可有效抑制外來的病原菌和其他條件致病菌的生長；同時又具有較強的對陰道上皮細胞的粘附作用，保證了菌株在陰道上皮的定植。本發明所提供的詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)IMJ-1 CGMCC No.6558在細菌性陰道病防治方面具有一定的應用前景。
文檔編號C12P3/00GK102851248SQ20121034771
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者朱寶利, 張瑞芬, 李晶, 王江 申請人:中國科學院微生物研究所