抑制成澱粉樣蛋白的作用的方法

2024-02-02 04:55:15

專利名稱：抑制成澱粉樣蛋白的作用的方法
阿爾茨海默症(AD)是一種腦變性疾病，其臨床特徵在於逐漸喪失記憶、認知、推理、判斷力和情緒穩定性，這將逐漸導致極度精神衰退並最終死亡。AD是老年人進行性精神衰退(痴呆)的常見原因，並且據信在美國它是第四位最常見的醫學死因。AD已經廣泛地發現於世界範圍的不同人種及人群中，並且表明是目前和將來主要的公共健康問題。目前估計僅在美國就有約2-3百萬人患有此疾病。迄今為止證明AD是不能治癒的。
AD患者的腦顯示出神經元變性，以及被不同地稱作為成澱粉樣(amyloidogenic)斑、血管澱粉樣血管病和神經原纖維昆布(tangles)的各種特徵損傷。大多數這類損傷、特別是成澱粉樣斑和神經原纖維昆布一般發現於AD患者有關記憶和認知的幾個重要人腦區。在更限制的解剖學分布中更少數的這類損傷發現於大多數臨床未患有AD的老年人的大腦中。成澱粉樣斑和血管澱粉樣血管病也是Trisomy21(唐氏症候群)和具有Dutch-Type澱粉樣變性的遺傳性大腦出血(HCHWA-D)患者腦的特徵。目前，確診AD通常需要觀察患有上述疾病的已死亡患者的大腦組織中的上述損傷，或者偶爾有時觀察侵入性神經外科手術過程中取出的少量腦組織的活檢樣品中的上述損傷。
幾種證據表明，具體的成澱粉樣蛋白，β-澱粉樣蛋白(βAP)的進行性大腦沉積在AD的發病機理中扮演了種子的作用，並且可能先於認知症狀幾年或幾十年。參見Selkoe，(1991)Neuron6487。近來已表明βAP從培養基中生長的神經元細胞中釋放出來，並且既存在於正常人的腦脊髓液(CSF)中也存在於AD患者的腦脊髓液中。參見Seubert等人，(1992)Nature359325-327。
除了阿爾茨海默症和其他與成澱粉樣肽βAP有關的疾病之外，還存在與其他成澱粉樣肽有關的疾病，這些成澱粉樣肽結構上類似於βAP，但是與βAP無同源序列。近來的研究已證明了與神經毒性有關的許多這些成澱粉樣肽的功能互換性。P.C.May等人，JournalofNeurochemistry，(1993年12月)；未決美國專利申請08/109，782，1993年8月19日申請(Docket-X-9342)。
儘管在了解AD和其它成澱粉樣相關疾病的根本機理方面已經取得了進展，仍然需要尋找治療這些疾病的組合物和方法。治療方法應該有利地以藥物為基礎，這些藥物能夠抑制成澱粉樣蛋白的產生或影響。
本發明包括抑制與成澱粉樣蛋白有關的生理疾病的方法，該方法包括給需要這種治療的人施用有效量的式Ⅰ化合物，或其藥學上適用的鹽或溶劑化物，
其中R1和R3獨立地為氫、-CH3、 (C1-C6烷基)或 ，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷子基(pyrrolidino)、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
本發明還提供了抑制成澱粉樣蛋白產生的方法，該方法包括給需要這種抑制的人施用有效量的式Ⅰ化合物。
本發明還提供了抑制澱粉樣斑沉積的方法，該方法包括給需要這種抑制的人施用有效量的式Ⅰ化合物。
本發明還提供了抑制阿爾茨海默症(AD)的方法，該方法包括給需要這種治療的人施用有效量的式Ⅰ化合物。
本發明涉及發現了式Ⅰ的一組經選擇的苯並噻吩類化合物適用於抑制成澱粉樣蛋白的影響，尤其是該化合物抑制成澱粉樣蛋白形成。本發明包括的用途是通過給需要抑制與成澱粉樣蛋白特別是β-澱粉樣蛋白有關的生理疾病的人施用抑制有效劑量的式Ⅰ化合物或其藥學上適用的鹽或溶劑化物來實施。
術語「抑制」包括其通常可接受的意義，包括阻止、防止、遏制和減緩、終止或逆轉疾病的進程、嚴重程度或者所發生的症狀。因此該方法包括治療和預防給藥。
術語「與成澱粉樣蛋白有關的生理疾病」包括至少一種成澱粉樣蛋白在例如腦、肝、腎或其他器官中不適當的或不希望的沉積，因此包括AD(包括家族的AD)、唐氏症候群，HCHWA-D以及腦高度衰老等。
術語「有效量」視具體情況是指抑制與成澱粉樣蛋白有關的生理影響或疾病、或者抑制成澱粉樣蛋白產生或沉積、或者抑制阿爾茨海默症所需化合物的量。
本文所用術語「成澱粉樣蛋白」是指能夠自締合成更高度有序的聚集體並最終聚集為澱粉樣斑的那些肽。優選的目的成澱粉樣蛋白是β-澱粉樣蛋白。
通常可以將本發明化合物與普通的賦形劑、稀釋劑或載體一起配製，並壓製成片劑、或者配製成方便口服給藥的酏劑或溶液劑；或者通過肌內或靜脈途徑給藥。該化合物可以經皮給藥，並且可以配製成緩釋劑型等。
本發明方法所使用的化合物可以按已有的和類似的方法(例如US4，133，814、4，418，068和4，380，635中所述的方法，這些專利引入本文作為參考)製備。一般，該方法用具有6-羥基和2-(4-羥苯基)基團的苯並[b]噻吩開始。將起始化合物保護、烷基化並脫保護，得到式Ⅰ化合物。在上述美國專利中以及該申請的實施例中提供了這些化合物的製備實例。任意取代的苯基包括苯基和由C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羥基、硝基、氯、氟或三(氯或氟)甲基取代一次或二次的苯基。
本發明包括下式化合物，即雷洛昔芬 用於本發明方法的化合物可以與多種有機和無機酸、鹼生成藥學上適用的酸和鹼加成鹽，藥學上適用的酸和鹼加成鹽包括通常用於藥物化學上的生理上適用的鹽。所述鹽也包括在本發明的範圍內。用於生成上述鹽的典型的無機酸包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、連二磷酸等。可以應用由有機酸生成的鹽，有機酸包括脂肪族一或二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸和羥基鏈烷二酸，以及芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸。因此所述藥學上適用的鹽包括乙酸鹽、苯基乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙烯酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、氯代苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、鄰-乙醯氧基苯甲酸鹽、萘-2-苯甲酸鹽、溴化物、異丁酸鹽、苯基丁酸鹽、β-羥基丁酸鹽、丁炔-1，4-二酸鹽、己炔-1，4-二酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、氯化物、肉桂酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、羥基乙酸鹽、庚酸鹽、馬尿酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、羥基馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、異煙酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、對苯二甲酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、丙炔酸鹽、丙酸鹽、苯基丙酸鹽、水楊酸鹽、癸二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、焦硫酸鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磺酸鹽、苯磺酸鹽、對溴苯磺酸鹽、氯代苯磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、甲磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、酒石酸鹽等。優選的鹽是鹽酸鹽。
藥學上適用的酸加成鹽一般可通過式Ⅰ化合物與等摩爾或過量的酸反應製得。反應物通常於互溶劑如乙醚或苯中進行反應。鹽一般在約1小時～10天內從溶液中析出，並且可以經過濾分離，或者按常規方法除去溶劑。
通常用於生成鹽的鹼包括氫氧化銨、鹼金屬和鹼土金屬氫氧化物、碳酸鹽，以及脂肪族和芳香族胺，脂肪族二胺和羥基烷基胺。用於製備加成鹽的鹼尤其包括氫氧化銨、碳酸鉀、碳酸氫鈉、氫氧化鈣、甲胺、二乙胺、乙二胺、環己胺和乙醇胺。
與化合物(由該化合物衍生得到鹽)相比較，藥學上適用的鹽通常有提高溶解度的性質，因此通常更適用於配製成液劑或乳劑。
藥物製劑可按本技術領域已知的方法製備。例如，將化合物與常用的賦形劑、稀釋劑或載體一起配製，並可配製成片劑、膠囊劑、混懸液劑、粉劑等。適用於上述製劑的賦形劑、稀釋劑和載體包括填充劑和增量劑如澱粉、糖、甘露糖醇以及矽衍生物；粘合劑如羧甲基纖維素和其他的纖維素衍生物，藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；溼潤劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣和碳酸氫鈉；阻滯溶解劑如石蠟；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如鯨蠟醇、單硬脂酸甘油酯；吸附載體如高嶺土和膨潤土；以及潤滑劑如滑石、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂以及固體聚乙二醇。
本發明的化合物也可以配製成方便口服給藥的酏劑或溶液劑，或者配製成適於非經胃腸道(如經肌內、皮下或靜脈途徑)給藥的溶液劑。另外，本發明化合物還非常適用於配製成緩釋劑型等。緩釋製劑可以這樣構成，以使它們僅僅或最好在腸道的特定部位，可能在一定時間內釋放活性成分。包衣、包膜和保護基質可以由例如聚合物質或蠟製成。
可以施用式Ⅰ化合物預防和/或治療與一種或多種成澱粉樣蛋白有關的疾病，例如阿爾茨海默症、唐氏症候群和腦高度衰老。當用於治療時，給已患病的宿主施用該化合物。該化合物的用量足以抑制與成澱粉樣蛋白、特別是β-澱粉樣蛋白有關的生理影響或疾病。
當用於預防時，給對與成澱粉樣蛋白有關的疾病(尤其是阿爾茨海默症)敏感的、但不是已患有該疾病的宿主施用式Ⅰ化合物。這些宿主可以按照醫學文獻(參見例如Goate，Nature，349:704-706(1991))中所述的基因篩選和臨床分析識別。該化合物在症狀早期抑制澱粉樣蛋白斑，甚至優選防止與該疾病有關的成澱粉樣蛋白的初始階段。對於預防或治療目的，優選接受本發明化合物的一組人是絕經後的婦女。
根據本發明，式Ⅰ化合物的具體劑量取決於由主治醫生確定的疾病嚴重程度、給藥途徑和有關因素。一般來講，每天可接受的有效劑量為約0.1至約1000mg/天，更通常為約50-200mg/天。可以每天一次至約三次給需要治療的患者施用上述劑量，或者根據需要更經常地施用，用藥時間達到足以抑制該疾病或症狀。
經常希望或需要將藥物組合物直接或間接引入腦中。直接引入技術通常包括將藥物釋放導管置於宿主的腦室系統中以繞開血-腦屏障。間接引入技術(通常優選這種技術)包括配製該組合物，以通過親水性藥物轉化為脂溶性藥物使藥物潛伏(latentiation)下來。一般來說，通過保護藥物上存在的羥基、羧基和伯胺基，使得藥物脂溶性更強並且順利地通過血-腦屏障，實現所述潛伏。或者，可以通過動脈內輸注高滲溶液(該溶液可以瞬時打開血-腦屏障)促進親水藥物的釋放。
如施用帶有鹼性基團(如哌啶子基環)的藥物時慣用其酸加成鹽一樣，通常優選施用酸加成鹽形式的式Ⅰ化合物。為此目的，以下劑型是適用的。
製劑在以下製劑中，「活性成分」是指式Ⅰ化合物。
製劑1明膠膠囊劑硬明膠膠囊劑按下面方法製備成分量(mg/膠囊)活性成分0.1-1000澱粉,NF0-650可流動的澱粉粉末0-650聚矽氧烷流體(350釐沲)0-15將上述成分混合，通過美國45號篩並將其裝入硬明膠膠囊。
已經製備的化合物雷洛昔芬的具體膠囊劑實施例包括下列製劑製劑2雷洛昔芬膠囊劑成分量(mg/膠囊)雷洛昔芬1澱粉,NF112可流動的澱粉粉末225.3聚矽氧烷流體(350釐沲)1.7
製劑3:雷洛昔芬膠囊劑成分量(mg/膠囊)雷洛昔芬5澱粉,NF108可流動的澱粉粉末225.3聚矽氧烷流體(350釐沲)1.7製劑4:雷洛昔芬膠囊劑成分量(mg/膠囊)雷洛昔芬10澱粉,NF103可流動的澱粉粉末225.3聚矽氧烷流體(350釐沲)1.7製劑5:雷洛昔芬膠囊劑成分量(mg/膠囊)雷洛昔芬50澱粉,NF150
可流動的澱粉粉末397聚矽氧烷流體(350釐沲)3.0按照合理的改變，還可以將上述具體的製劑進行變化。
用下述成分製備片劑製劑6片劑成分量(mg/片)活性成分0.1-1000微晶纖維素0-650煅制的二氧化矽0-650硬脂酸0-15將上述成分混合併壓製成片劑。
另外，每片含0.1～1000mg活性成分的片劑可以按下法製備製劑7片劑成分量(mg/片)活性成分0.1-1000澱粉45微晶纖維素35聚乙烯吡咯烷酮(為10%的水溶液)4
羧甲基纖維素鈉4.5硬脂酸鎂0.5滑石1將活性成分、澱粉和纖維素通過美國45號篩，並充分地混合。使聚乙烯吡咯烷酮溶液與得到的粉末混合，然後再通過美國14號篩。得到的顆粒於50～60℃乾燥並通過美國18號篩。將預先通過美國60號篩的羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂和滑石加到顆粒中，在混合以後將其在壓片機上壓製成片劑。
每5ml劑量含0.1-1000mg藥物的各個混懸液劑可按下示製備製劑8混懸液劑成分量(mg/5ml)活性成分0.1-1000mg羧甲基纖維素鈉50mg糖漿1.25mg苯甲酸溶液0.10ml調味劑適量著色劑適量純水加至5ml將藥物通過美國45號篩並與羧甲基纖維素鈉和糖漿混合，得到調勻的糊狀物。苯甲酸溶液、調味劑和著色劑用一部分水稀釋，並在攪拌下加入糊狀物中。然後加入足夠的水到所需體積。
試驗方法實驗設計對於試驗1和2，進行下列實驗設計。
澱粉不溶素可以從Bachem，Inc.(Torrance，California)、Peninsula Laboratories，Inc.(Belmont，California)、Sigma Chemicals(St.Louis，MO)購得，或者如下文所述合成。澱粉樣蛋白-β(1-40)[Lot#ZK052]和逆β-澱粉樣肽(40-1)[Lot#ZX299]可以從Bachem，Inc.購得。β2-小球蛋白可以從Sigma Chemicals(St.Louis，Missouri)購得。
用無熱源無菌水即時配製肽貯液(1mM)，用確定的培養基稀釋至指定濃度。將大鼠海馬培養物(體外10-14天)用肽或賦形劑處理4天。通過相襯顯微鏡目視估測大鼠皮質培養物的存活力，並通過測量釋放在培養基中的乳酸脫氫酶(LDH)進行定量。
用肽或賦形劑處理人皮質培養物(體外19-22天)三天。用相襯顯微鏡目視評估細胞存活力，並通過測量四唑鎓鹽XTT的減少進行定量。
本領域專業人員能夠理解，可以用其他技術(例如監測鈣離子水平)測量細胞的存活力，以及隨後測量毒性。下文描述了LDH和XTT技術以及鈣離子水平監測試驗。
試驗1測定鈣離子水平的神經毒性試驗將各等份ED18皮質細胞體外接種於塗覆有聚亞乙基亞胺的組織培養皿中保持3-5天，然後用25μMβ-澱粉樣肽溶液處理，該溶液可以是新溶解的(主要是無規則的螺旋狀)也可以是製備好的(7天，主要是β-片狀)。於補充有胎牛血清的、化學確定的、HEPES緩衝的DMEM中進行神經毒性試驗。
用β-澱粉樣肽培養2天後，用螢光鈣染料測定穀氨酸脈衝後胞液鈣離子(Ca+2)濃度的上升(J.Wahl等人，Journal of Neurochemistry，53:1316(1989))。胞內Ca+2水平的上升損害細胞的完整性。再次進行上述操作，不同的是採用本發明化合物。與第一次操作相比，胞內Ca+2水平的下降說明了本發明化合物的活性。
試驗2測定XTT的神經毒性試驗將各等份ED18皮質細胞體外接種於塗覆有聚亞乙基亞胺的組織培養皿中保持3-5天，然後用25μMβ-澱粉樣肽溶液處理，該溶液可以是新溶解的(主要是無規則的螺旋狀)也可以是製備好的(7天，主要是β-片狀)。於補充有胎牛血清的、化學確定的、HEPES緩衝的DMEM中進行神經毒性試驗。
將這些細胞體外培養3-5天，然後用25μMβ-澱粉樣肽溶液處理，該溶液可以是新溶解的(主要是無規則的螺旋狀)也可以是製備好的(7天，主要是β-片狀)。培養2天後，採用N.Roehm等人所述方法(JournalofImmunologicalMethods，142257(1992))，通過測量四唑鎓鹽XTT[2，3-二(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑鎓-5-甲醯苯胺內鹽]的減少評估細胞的存活力。再次進行上述操作，不同的是採用本發明化合物。與第一次操作相比，細胞的存活力的增加說明了本發明化合物的活性。
試驗3測定LDH的神經毒性試驗在96孔檢測板中，使用標準340mm動力學LDH測驗系統(assay)(SigmaCatalogNumber#228-20)在20μ1各等份條件限定的DMEM中測定乳酸脫氫酶(LDH)。在37℃，於PC驅動的EL340MicroplateBiokinetics板閱讀器(Bio-TekInstruments)中進行測定，用DeltaSoftⅡ軟體(V.3.30B，BioMetallics，Inc.)進行數據分析。每次試驗都運行含有正常和升高的血清LDH水平的質量控制標準(例如，SigmaEnzymeControls2N和2E)。向一部分孔中加入不同濃度的本發明化合物。結果以LDH/L為單位表示，其中1單位定義為在試驗條件下每分鐘催化形成1微摩爾煙醯胺腺嘌呤二核苷酸的酶量。與對照相比，神經毒性指示劑水平的下降表明了本發明化合物的活性。
試驗4用能夠形成澱粉樣沉積的VV99或VV42感染細胞，(如WO91/04339中所述，1991年4月4日公開，該專利引入本文作為參考)，並將細胞鋪在96孔微滴板上。為了進行合適的稀釋和添加，使用自動移液管將待試的式Ⅰ化合物引入細胞中。在37℃，於組織培養器中將各種濃度的所述化合物與細胞一起培養(或預培養)預定的時間，或者培養3-72小時。
培養後，除去培養基，並如下所述製備細胞，進行Preamyloid測定。固定細胞，用澱粉樣蛋白抗體進行免疫細胞化學印染。引入一級抗體，然後用標記的二級抗-抗體進行培養，並用ELISA板閱讀器測定一級與二級抗體間的結合水平，以記錄標記抗體的光密度。與無試驗藥物存在下生長的細胞對照樣品相比，較小的光密度讀數表明了該藥物抑制澱粉樣蛋白沉積的能力。可以對該進行方法改變，以便採用校正的酶標記物檢測preamyloid的溶解。與對照相比，preamyloid測量中的下降表明了式Ⅰ化合物的活性。
試驗5選擇5-50名婦女進行臨床研究。這些婦女均為絕經後婦女，即在研究開始前已停止行經6-12個月，並且已診斷出患有早期阿爾茨海默症(AD)，預期在研究階段其AD症狀會惡化，但是總的來說其它方面是健康的。該研究設安慰劑對照組，即將這些婦女分為兩組，一組接受本發明的活性劑，另一組接受安慰劑。對患者的與AD有關的記憶、認知、推理和其他症狀測定基準點。試驗組的婦女每天口服50-200mg活性劑。連續治療6-36個月。準確記錄各組基準點症狀的情況，在研究結束時對這些結果進行比較。在每組受試者之間進行結果比較，還將每位患者的症狀與研究開始前每位患者報告的症狀進行比較。通過抑制了攝取試驗藥物的患者中AD的任何一或多個症狀，說明了試驗藥物的活性。
通過至少一個上述試驗中的活性說明了式Ⅰ化合物的效用。
權利要求
1.適於抑制與成澱粉樣蛋白過量有關的生理疾病的藥物組合物，該組合物含有式Ⅰ化合物或其藥學上適用的鹽或溶劑化物作為活性成分， 其中R1和R3獨立地為氫、-CH3、 ，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷子基、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
2.權利要求1的藥物組合物，其中所述化合物是下式化合物或其鹽酸鹽，
3.適於抑制成澱粉樣蛋白產生的藥物組合物，該組合物含有式Ⅰ化合物或其藥學上適用的鹽或溶劑化物作為活性成分， 其中R1和R3獨立地為氫、-CH3、 (C1-C6烷基)或 ，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷子基、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
4.權利要求3的藥物組合物，其中所述化合物是下式化合物或其鹽酸鹽，
5.適於抑制澱粉樣斑沉積的藥物組合物，該組合物含有式Ⅰ化合物或其藥學上適用的鹽或溶劑化物作為活性成分， 其中R1和R3獨立地為氫、-CH3、 (C1-C6烷基)或 ，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷子基、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
6.權利要求5的藥物組合物，其中所述化合物是下式化合物或其鹽酸鹽，
7.適於抑制阿爾茨海默症的藥物組合物，該組合物含有式Ⅰ化合物或其藥學上適用的鹽或溶劑化物作為活性成分， 其中R1和R3獨立地為氫、-CH3、 (C1-C6烷基)或 ，其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷子基、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
8.權利要求7的藥物組合物，其中所述化合物是下式化合物或其鹽酸鹽，
全文摘要
本發明公開了抑制與成澱粉樣蛋白有關的生理疾病的方法，該方法包括給需要這種抑制的人施用式I化合物或其藥學上適用的鹽或溶劑化物，其中RR
文檔編號A61K31/445GK1109750SQ94112880
公開日1995年10月11日 申請日期1994年11月30日 優先權日1993年12月1日
發明者W·H·W·倫 申請人:伊萊利利公司