用於疫苗和基因治療的重組流感病毒的製作方法

2023-04-23 13:09:16

專利名稱：用於疫苗和基因治療的重組流感病毒的製作方法
技術領域：
本申請涉及用於疫苗和基因治療的重組流感病毒。
背景技術：
由克隆的cDNA產生感染性RNA病毒的能力極大地促進了從生物學角度對這些病 原體的理解，因而改進了疾病控制的方法(Palese等人，1996)。然而，與正義RNA病毒相 比，這種進步對負義RNA病毒是相對有限的，因為負義RNA病毒的基因組病毒RNA (vRNA)或 反基因組互補RNA(cRNA)都不可能作為蛋白質合成的直接模板。而且，vRNA在被病毒核蛋 白(NP)包裹之後，必然被病毒RNA多聚酶複合物轉錄成正義mRNA。因而，由基因組vRNA與 NP和多聚酶蛋白形成了最小複製單位。儘管存在這些障礙，已建立了反向遺傳學方法以產 生非區段的負義RNA病毒，包括狂犬病毒(Snell等人，1994)、水皰性口炎病毒(Lawson等 人，1995)、麻疹病毒(Radecke等人，1995)、呼吸道合胞病毒(Collins等人，1995)、仙臺病 毒(Garcin等人，1995 ；Kato等人，1996)、牛瘟病毒(Baron等人，1997)、人副流感病毒3型 (Hoffman 等人，1997)和 SV5 (He 等人，1997)。正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviradae)和布尼亞病毒科 (Bunyaviridae)含有區段負鏈RNA基因組，並包括一些人類和動物病原體如流感病毒A、B 和C型(正粘病毒科)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)(沙粒病毒科)和腦炎病毒 和出血熱病毒(布尼亞病毒科、沙粒病毒科)。它們的基因組由兩條(沙粒病毒科)、三條 (布尼亞病毒科)或者六到八條(正粘病毒科)負極性(與mRNA互補)單鏈RNA分子組 成。vRNA與NP和依賴於病毒RNA的RNA聚合酶相互反應形成了核糖核蛋白複合物(RNPs)。 RNPs由宿主細胞的脂肪雙分子層包圍。嵌在這個包膜中的病毒糖蛋白是受體結合和進入宿 主細胞所必需。因此，從克隆的cDNA產生區段負義RNA病毒提出了一個艱難的挑戰，因為 各個基因區段必須分別產生一個vRNA。Bridgen和Elliott (1996)從編碼反基因組正義vRNA的三個區段克隆的cDNA制 得了布尼奧羅病毒(布尼亞病毒科)。然而，病毒回收率低。沒有完全地從克隆cDNA中得 到一個正粘病毒(包含6個(Thogoto病毒)、7個(流感C型病毒)或8個(流感A型和 B型病毒)〕的負義RNA。在控制流感傳染的努力中人們已最尖銳地感覺到進步中的這種滯後。
palese和他的同事(Enami等人，1990)率先採用流感A型病毒(圖1A)的反向遺 傳學和依賴於輔助病毒的系統。在他們的方法中，在純化的聚合酶和NP蛋白的存在下從體 外vRNA合成產生RNP複合物，然後用來轉染真核細胞。接著用流感A型輔助病毒感染導致 產生含有衍生自克隆的cDNA—個基因的病毒。另一方法是Neumann等人(1994)發展的， 該方法的基礎是以RNA聚合酶I體內合成vRNA(圖1B)，聚合酶I (Pol I)是種能轉錄缺少 5'加帽和3'聚A尾的核糖體RNA的胞內酶。用流感病毒感染並用含有側接小鼠RNA聚合 酶I啟動子和終止子序列的克隆的流感病毒cDNA的質粒轉染細胞，導致了病毒轉染子的產 生。然而，在這兩種方法中，必須從大量的背景輔助病毒中挑選轉染子，這就需要強的選擇 系統並使產生具有生長缺陷的病毒變得複雜。Mena等人發展了一種產生複製不全病毒樣顆粒(VLP)的系統(1996)，在該系統 中，將編碼一報導基因的流感病毒樣vRNA體外轉錄，並轉染入真核細胞中。在T7 RNA聚 合酶啟動子的控制下，表達了質粒的所有十種流感報導蛋白質。當被轉染的細胞用表達T7 RNA聚合酶的重組牛痘病毒感染時，它們產生了流感VLP。然而，該系統效率低在25%的 試驗中，研究者沒有檢測到報導基因的表達。而且，牛痘病毒表達80種以上的蛋白質，其中 的任何一個都可能影響流感病毒的生命周期。因此，需要一種方法來從克隆的cDNA中製備區段負鏈RNA病毒，如流感A型病毒 等正粘病毒科病毒。

發明內容
本發明提供至少一種下列已分離和純化的載體即含有操作性連接於已連接了轉 錄終止序列的流感病毒PA cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序 列的流感病毒PB1 cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感 病毒PB2 cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒HA cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒NP cDNA的啟 動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒NA cDNA的啟動子的載 體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒M cDNA的啟動子的載體、含有操 作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒NS cDNA的啟動子的載體。相對於該啟動子， 該cDNA可以是有義或反義取向。因而，本發明的一個載體可編碼正粘病毒蛋白質(有義) 或vRNA (反義)。可採用啟動子來表達病毒蛋白質。編碼vRNA的載體所含的較佳啟動子包 括但不限於RNA聚合酶I啟動子、RNA聚合酶II啟動子、RNA聚合酶III啟動子、T7啟動子 和T3啟動子。另外，優選RNA聚合酶I啟動子是人RNA聚合酶I啟動子。編碼vRNA的載 體的優選轉錄終止序列包括但不限於RNA聚合酶I轉錄終止序列、RNA聚合酶II轉錄終止 序列、RNA聚合酶III轉錄終止序列或者核酶。雖然可以預見病毒的基因可用於本發明的 方法中或載體中，但是優選該載體包含流感cDNA，如流感A型(如包括15HA或9NA亞型之 一的流感A型基因)、B型或C型DNA〔見Fields等人(編輯)的Virology第45章和第 46 章，Lippincott-Raven Publ.，Philadelphia, PA(1996)，本文特別引入作為參考〕。本發明提供一種含有多個本發明正粘病毒載體的組合物。在本發明的一個實施例 中，該組合物包括a)至少兩種選自以下的載體，含有操作性連接於已連接了轉錄終止序 列的流感病毒PA cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒PB1 cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒PB2 cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒HA cDNA的啟 動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒NP cDNA的啟動子的載 體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒NA cDNA的啟動子的載體、含有操 作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒M cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接 於已連接了轉錄終止序列的流感病毒NS cDNA的啟動子的載體；b)至少兩種選自以下的載 體，編碼流感病毒PA的載體、編碼流感病毒PB1的載體、編碼流感病毒PB2的載體、編碼流 感病毒NP的載體。優選編碼病毒蛋白質的該載體還包括轉錄終止序列。含有流感病毒cDNA 的載體的啟動子優選包括RNA聚合酶I啟動子、RNA聚合酶II啟動子、RNA聚合酶III啟 動子、T7啟動子和T3啟動子。同樣，含有流感病毒cDNA的各載體優選包含轉錄終止序列， 如RNA聚合酶I轉錄終止序列、RNA聚合酶II轉錄終止序列或RNA聚合酶III轉錄終止序 列，或者核酶。優選該載體包含流感病毒DNA，如流感病毒A、B或C型DNA。更優選，包含多個正粘病毒載體的該組合物包括a)至少兩種選自以下的載體， 含有操作性連接於已連接了 RNA聚合酶I轉錄終止序列的流感病毒PA cDNA的RNA聚合酶 I啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了 RNA聚合酶I轉錄終止序列的流感病毒PB1 cDNA的RNA聚合酶I啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了 RNA聚合酶I轉錄終止序 列的流感病毒PB2 cDNA的RNA聚合酶I啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了 RNA聚 合酶I轉錄終止序列的流感病毒HAcDNA的RNA聚合酶I啟動子的載體、含有操作性連接於 已連接了 RNA聚合酶I轉錄終止序列的流感病毒NP cDNA的RNA聚合酶I啟動子的載體、含 有操作性連接於已連接了 RNA聚合酶I轉錄終止序列的流感病毒NA cDNA的RNA聚合酶I 啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了 RNA聚合酶I轉錄終止序列的流感病毒M cDNA 的RNA聚合酶I啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了 RNA聚合酶I轉錄終止序列的 流感病毒NS cDNA的RNA聚合酶I啟動子的載體；和b)至少兩種選自以下的載體，編碼流 感病毒PA的載體、編碼流感病毒PB1的載體、編碼流感病毒PB2的載體、編碼流感病毒NP 的載體、編碼流感病毒HA的載體、編碼流感病毒NA的載體、編碼流感病毒Ml的載體、編碼 流感病毒M2的載體和編碼流感病毒NS2的載體。本發明另一實施例包括還含有載體的本發明上述組合物，該載體包含連接於正 粘病毒5'非編碼序列的啟動子，該非編碼序列連接在已連接了轉錄終止序列的正粘病毒 3'非編碼序列的理想的接頭上。在能進行正粘病毒複製的宿主細胞中導入這種組合物產 生了重組病毒，該重組病毒包含對應於該載體序列的vRNA，該載體包含連接於cDNA的正粘 病毒5'非編碼序列，而該cDNA連接於正粘病毒3'非編碼序列。較佳的是，該cDNA是反義 取向的。同樣優選該啟動子是RNA聚合酶I啟動子、RNA聚合酶II啟動子、RNA聚合酶III 啟動子、T7啟動子和T3啟動子。同樣優選該轉錄終止序列是RNA聚合酶I轉錄終止序列、 RNA聚合酶II轉錄終止序列或RNA聚合酶III轉錄終止序列，或者核酶。例如，該cDNA可 以編碼一個免疫原性表位，如用於癌症治療或疫苗的表位。本發明多個載體可以用物理方法連接或者各載體可以以單個質粒或其他(如線 性核酸傳送載體)形式存在。本發明還提供一種製備流感病毒的方法。該方法包括使細胞與本發明的多種載體 依次或同時接觸，例如，使用足以產生感染性流感病毒的量的本發明組合物。本發明還包括從與該組合物接觸的細胞中分離出病毒。因而，本發明還提供分離的病毒以及與本發明組 合物或分離的病毒接觸的宿主細胞。如下所述，流感A病毒可完全由克隆的cDNA製得。本文所描述的反向遺傳方法是 高效的，並能用於將突變導入任何基因節段，以及用於發展以流感病毒為基礎的基因傳送 系統。例如，用8個質粒轉染人胚腎細胞(293T)，各個質粒編碼A/WSN/33(H1N1)病毒或A/ PR/8/34 (H1N1)病毒的病毒RNA，兩側連接有人RNA聚合酶I啟動子和小鼠RNA聚合酶I終 止子，以及用編碼病毒核蛋白和PB2、PB1和PA病毒聚合酶的質粒一起轉染。該方法在轉 染後48小時每毫升上清液中產生了 1X103噬斑形成單位(pfu)以上的病毒。取決於所產 生的病毒，加入能表達所有其餘病毒結構蛋白質的質粒導致了大量病毒的產生，產率大於 3X 104pfu/ml。還用該反向遺傳方法來產生含有A/PR/8/34病毒的PB1基因以及所有代表 A/WSN/33其他基因的重輔助病毒。通過此方法產生的其他病毒在PA基因中含有突變，或者 在神經氨酸酶蛋白質的頭部可有外源表位。而且，也可以對其他病毒使用同樣的方法完全地從克隆的cDNA中產生非區段負 鏈RNA病毒(即副粘病毒科、彈狀病毒科和線狀病毒科)，或者其他區段負鏈RNA病毒，如沙 粒病毒科和布尼亞病毒科。另外，在細胞中表達cRNA而不是vRNA可以提高病毒產生的效率。本發明方法基於對流感病毒進行操作，如將減毒突變導入病毒基因組中。另外，由 於流感病毒能誘導強烈的體液和細胞免疫力，本發明極大地提高了這些病毒作為疫苗載體 的能力，特別是從該病毒的自然變種的可獲得性看，可以依次使用這些載體，並允許在基因 治療中反覆使用。因而，本發明提供了分離的和純化的載體或質粒，它們表達或編碼流感病毒的蛋 白質，或者表達或編碼天然或重組的流感vRNA。因此，本發明的載體或質粒可包含一個感興 趣的基因或開放讀框，如編碼可用作疫苗的免疫原性肽或蛋白質的外源基因。優選表達流 感vRNA的載體或質粒包含適合於在具體宿主細胞如鳥或哺乳動物(如犬、貓、馬、牛、羊) 或包括人細胞的靈長類動物細胞中表達的啟動子，如RNA聚合酶I啟動子。同樣，該包含用 於製備流感vRNA的DNA的載體或質粒優選包含RNA聚合酶I轉錄終止序列。對於含有一 個感興趣的基因或開放讀框的載體或質粒，該基因或開放讀框優選兩側連接有流感病毒的 5'和3'非編碼序列，更優選，該基因或開放讀框操作性連接於RNA聚合酶I啟動子和RNA 聚合酶I轉錄終止序列。如下所述，用編碼流感A型病毒結構蛋白的質粒和兩側連接有RNA聚合酶I啟動 子和終止子的含有綠螢光蛋白(GFP)報導基因的質粒轉染293T。這些結構在胞內通過RNA 聚合酶I轉錄，產生了包裝在流感病毒樣顆粒中的GFP vRNA。每毫升上清液產生104以上 感染顆粒的該系統，可以用來研究流感病毒複製和顆粒的形成。它還可以很好地用於疫苗 的生產和開發改進的基因治療載體。因此，本發明還提供一種宿主細胞，該細胞的基因組穩定地增加了(augment)至 少一種重組DNA分子。該重組DNA分子至少包括下列分子中的一種含有在宿主細胞中能 發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有轉錄停止或終止序列的 DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒HA編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有轉錄停止或終止序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接 於流感病毒NA編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組 DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有轉錄停止或終止序列的DNA節段的第一 lox位點 上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒Ml編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細 胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有轉錄停止或終止 序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒NS2編碼區域 的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接 在已連接於含有轉錄停止或終止序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在 已連接於流感病毒M2編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子 的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有停止或終止序列的DNA節段的第一 lox位 點上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒PA編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主 細胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有停止或終止序 列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒PB1編碼區域的 第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在 已連接於含有停止或終止序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接 於流感病毒PB2編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重 組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有轉錄停止或終止序列的DNA節段的第一 lox位 點上，該DNA節段連接在已連接於流感病毒NP編碼區域的第二 lox位點上。優選該宿主細胞中增加了下述含有在該宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組 DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有轉錄終止序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該 DNA節段連接在已連接於流感病毒HA編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發 揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有轉錄終止序列的DNA節段 的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒NA編碼區域的第二 lox位點上； 含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有轉 錄終止序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒Ml編碼 區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子 連接在已連接於含有轉錄終止序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已 連接於流感病毒NS2編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子 的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有轉錄終止序列的DNA節段的第一 lox位點 上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒M2編碼區域的第二 lox位點上。優選該lox位 點是loxP位點。本發明還提供一種製備感染性複製缺陷性流感病毒的方法。該方法包括使經增加 了至少一種本發明重組DNA分子(如編碼HA、NA、Ml、M2、NS2、PA、PB1、PB2或NP)的宿主 細胞與重組流感病毒接觸，該病毒包括含有Cre開放讀框的vRNA以及含有宿主細胞不表達 的流感病毒基因的vRNA。然後從受到接觸的細胞中回收病毒。優選該重組病毒還包括含有 所需開放讀框的vRNA。或者，使增加了重組DNA分子的宿主細胞與一種載體接觸，該載體包 含操作性連接於編碼Cre的DNA節段的在宿主細胞中能發揮功能的啟動子，和與各含有操 作性連接於在宿主細胞中不存在的流感病毒cDNA的啟動子的多個載體接觸。然後回收病
本發明還提供一種宿主細胞，該宿主細胞的基因組中增加了一個下述重組DNA分 子含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含 有終止序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接於宿主細胞表面結 合蛋白編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分 子，該啟動子連接在已連接於含有終止序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連 接在已連接於融合蛋白編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動 子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有終止序列的DNA節段的第一 lox位點上， 而該DNA節段連接在已連接於流感病毒Ml編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中 能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有終止序列的DNA節段 的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒NS2編碼區域的第二 lox位點 上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含 有終止序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒M2編碼 區域的第二 lox位點上。優選該lox位點是loxP位點。另一實施例是一種宿主細胞，在該宿主細胞的基因組中增加了下列一種重組DNA 分子含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於 含有終止序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接於宿主細胞表面 結合和融合蛋白編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重 組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有終止序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該 DNA節段連接在已連接於流感病毒Ml編碼區域的第二 lox位點上；含有在宿主細胞中能發 揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有終止序列的DNA節段的第 一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒NS2編碼區域的第二 lox位點上；含 有在宿主細胞中能發揮功能的啟動子的重組DNA分子，該啟動子連接在已連接於含有終止 序列的DNA節段的第一 lox位點上，而該DNA節段連接在已連接於流感病毒M2編碼區域的 第二 lox位點上。優選該lox位點是loxP位點。上述增加了重組DNA分子的宿主細胞可用於製備感染性複製缺陷性流感病毒。例 如，使經編碼HA、NA、Ml、M2和NS2的重組DNA分子穩定轉化的宿主細胞與多個載體接觸， 即與表達含有Cre開放讀框的vRNA、含有PA的vRNA、含有PB1的vRNA、含有PB2的vRNA的 載體，以及可任選地表達含有感興趣基因的vRNA的載體；以及編碼PA、PB1、PB2和NP的載 體接觸。不需要輔助病毒感染的生產本文所述病毒的方法可用於病毒誘變研究、疫苗生產 (如治療AIDS、流感、B型肝炎、C型肝炎、鼻病毒、線狀病毒、瘧疾、皰疹及口蹄疫)和基因 治療載體(如治療癌症、AIDS、腺苷脫氨酶缺陷、肌肉營養不良、鳥氨酸轉氨甲醯酶缺陷和 中樞神經系統腫瘤)。因而，提供了一種用於醫學治療(如用於疫苗或基因治療)的病毒。例如，本發明 提供了一種免疫接種個體以抵抗病原體如細菌、病毒或寄生生物或惡性腫瘤的方法。該方 法包括給予個體一定量的至少一種本發明的分離病毒，可任選地與能有效增強個體免疫力 的佐劑組合給藥。該病毒包括含有由病原體編碼的多肽或腫瘤特異性多肽的vRNA。還提供了一種方法，該方法能提高或增強由於其內源性蛋白質缺乏或量減少而出 現疾病或症狀的哺乳動物的該內源蛋白質的表達。該方法包括給予哺乳動物一定量的本發明的分離的病毒，以有效提高或增加該哺乳動物的此內源蛋白質。較佳的是，哺乳動物是 人。本發明還提供重組產生和正鏈病毒(如正義RNA病毒)的載體和方法。因而，本 發明提供了一種含有DNA節段的載體，該DNA節段包含操作性連接於另一含有正義RNA病 毒序列的DNA節段的RNA聚合酶I轉錄起始序列，任選地操作性連接於含有RNA聚合酶I 轉錄終止序列的第三個DNA節段。本發明還提供了一種使用該載體製備重組病毒的方法。 該方法特別可用於克隆的DNA和轉染技術，因而避免了 RNA操作。而且，RNA聚合酶I轉錄 高效並高度逼真。對於那些基因組RNA未加帽(uncap)的正義RNA病毒(如瘟病毒、丙型 肝炎病毒；小RNA病毒，包括脊髓灰質炎病毒、鼻病毒、A型肝炎病毒，以及口蹄疫病毒)，將 編碼全長基因組的cDNA以基因組取向方式導入RNA聚合酶I啟動子和終止子序列之間。 將產生的質粒轉染到允許的宿主細胞中，產生用於病毒複製的基因組RNA。大量的正義RNA 病毒含有加帽的基因組RNA (如黃病毒，包括登革熱病毒和幾種腦炎病毒)。當RNA聚合酶 I轉錄物沒有加帽結構時，使編碼具有加帽基因組RNA的RNA病毒的全長基因組的cDNA，以 反基因組取向方式導入RNA聚合酶I轉錄載體中。將所得到的質粒轉染後，胞內RNA聚合 酶I轉錄了反基因組(未加帽)RNA。而且，為了複製所需的蛋白質而進行的蛋白質表達質 粒的共轉染導致反基因組RNA的複製，由此產生得到基因組RNA和最終的傳染性病毒。


圖1.已建立的反向遺傳學系統的示意圖。在RNP轉染方法㈧中，用體外合成 vRNA將純化的NP和聚合酶蛋白質裝配到RNP中。用RNP轉染細胞，接著用輔助病毒轉染。 在RNA聚合酶I方法(B)中，將含有RNA聚合酶I啟動子的質粒、編碼待拯救的vRNA的cDNA 以及RNA聚合酶I終止子轉染到細胞中。RNA聚合酶I的胞內轉錄產生了合成的vRNA，該 vRNA被包裝在用輔助病毒感染後的子代病毒顆粒中。通過這兩種方法，從輔助病毒種群中 選出轉染子病毒(即含有衍生自克隆的cDNA的RNA的病毒)。圖2.產生RNA聚合酶I構建物的示意圖。通過PCR擴增得自流感病毒的cDNA， 用 BsmBI 消化並克隆到 pHH21 載體的 BsmBI 位點上(E. Hoffmann, Ph. D. thesis, Justus, Liebig-University, Giessen, Germany)，該載體含有人RNA聚合酶I啟動子(P)和小鼠RNA 聚合酶I終止子(T)。該終止子序列上遊的胸苷核苷酸CT)代表該流感病毒RNA的3'端。 流感A型病毒序列用粗體字表示。圖3.提出了用來產生區段負義RNA病毒的反向遺傳方法。將含有RNA聚合酶I 啟動子的質粒、8個病毒RNA節段每一節段的cDNA和RNA聚合酶I終止子與蛋白質表達質 粒一起轉染到細胞中。雖然可用表達PA、PB1、PB2和NP的質粒產生傳染性病毒，但是所有 其餘結構蛋白質(列在方括弧中)的表達提高了依賴於所產生病毒的病毒生產效率。圖4.檢測感染了轉染子病毒的細胞中的FLAG肽。用抗體染色來鑑別感染了 PR8-WSN-FL79 (A, D)或A/WSN/33野生型病毒(B，E)的MDCK細胞中，或者模擬感染的MDCK 細胞(C，F)中的NA。感染9個小時後，用多聚甲醛固定細胞，用Triton X-10處理並在抗 FLAG(A-C)或抗WSN NA(D-F)單克隆抗體中培育。在陽性樣品中(A、D和E)出現了強烈的 高爾基染色(紅色)。圖5. PA突變體的回收。通過RT-PCR用引物擴增了各病毒的PA基因，產生1226bp
10的節段(mRNA的第677位到1903位，在第1、3和5泳道)，然後用限制性內切酶Bspl20I (在 mRNA的第846位，第4和7泳道)或PvuII (在mRNA的第1284位，第2和6泳道)消化。 PCR產物中Bspl20I或PvuII位點的存在分別產生了 169bp和1057bp,或607bp和619bp 的節段。MW =標記物分子量。圖6.用於擴增流感病毒序列的引物。圖7.用於產生編碼GFP蛋白的流感病毒樣RNA的pPoII-GFP質粒。這個質粒含有 在流感A型病毒節段5的5'和3'非編碼區域之間以反義取向形式存在的GFP基因(從 pEGFP-Nl獲得；Clontech，Palo Alto, CA)，該基因兩側連接連有人RNA聚合酶I啟動子和 小鼠RNA聚合酶I終止子。圖8. VLP產生策略示意圖。將表達單個蛋白質的質粒和含有RNA聚合酶I啟動子、 編碼GFP報導基因的cDNA和RNA聚合酶I終止子的質粒轉染到293T細胞中。通過RNA聚 合酶I的胞內轉錄產生負極性的GFP vRNA，以倒寫字表示。收集含有VLP的上清液，與流感 輔助病毒混合併接種到MDCK細胞中。圖9.流感A型病毒的PA、PB1、PB2和NP蛋白質將RNA聚合酶I產生的GFP vRNA 中包入衣殼，引起了 GFP的表達。用表達PB2、PB1、PA和NP蛋白(A)的質粒或者用除表達 NP蛋白(B)之外的所有質粒，和報導基因vRNA胞內合成的RNA聚合酶I-GFP基因質粒一起 轉染293T細胞。轉染48小時後將細胞固定，用螢光顯微鏡測定GFP表達。圖10.傳染性流感VLP的產生。用各達不同病毒結構蛋白(A)的9種質粒或者刪 去NP(B)結構的8種質粒，和RNA聚合酶I-GFP基因質粒一起轉染293T細胞。轉染48小 時後，收集含有VLP的上清液，與A/WSN/33輔助病毒混合，並接種到MDCK細胞中。感染10 個小時後將細胞固定，用螢光顯微鏡測定GFP表達。圖11.使用Cre重組酶在其基因組中增加了重組DNA分子的細胞中表達流感NS2 蛋白的示意圖。該細胞的基因組含有一個重組DNA分子，該分子包含連接於一個位點特異 性重組位點(如loxP)的一個啟動子，該重組位點連接於轉錄終止序列上，該終止序列以與 第一個位點特異性重組位點連接於NS2基因的同樣取向，連接到第二個位點特異性重組位
；卜.o圖12.複製缺陷性流感病毒的製備。
具體實施例方式^X本文所用的「分離的和/或純化的」指在體外製備、分離和/或純化本發明的載體 和/或質粒，使其不與體內的物質相結合，或者主要地從體外物質中純化。本文所用「重組 核酸」或「重組DNA序列或節段」指一種核酸(如DNA)，該核酸雖衍生於或分離自其來源，但 隨後在體外發生了化學變化，因此其序列不是天然產生的，或者只是相應於天然產生的序 列，但其所處的位置不是它們在天然基因組中應處的位置。衍生自其來源的DNA的例子應 是經鑑定認為是有用片段的DNA序列，該序列然後可用化學方法合成成為基本純的形式。 「分離」自某來源的DNA的例子是通過化學方法(如使用限制性核酸內切酶)從所述來源中 切下或取得的有用的DNA序列，這樣可通過基因工程方法作進一步處理(如擴增)而用於 本發明。
本文所用「位點特異性重組」包括以下3種情況1)刪除兩側連接有位點特異性重 組位點或序列(如loxP位點)的靶DNA節段；2)倒置兩側連接有位點特異性重組位點或 序列(如loxP位點)的靶DNA節段的核苷酸序列；3)相互交換位於在不同DNA分子中最 接近位點特異性重組位點或序列(如loxP位點)的靶DNA節段。位點特異性重組酶系統 包括但不限於噬菌體P1的Cre/loxP系統(美國專利第5658772號)。為了補正位點特異性重組反應的可逆性，可以改變該重組系統的結構。位點特異 性重組序列有可能以該重組反應的產物不再被認為是該逆反應的底物的方式來產生突變， 因此使此種整合或切除穩定化。例如，為去除不需要的序列，將同樣取向的lox位點置於該 不需要序列的兩側。其他lox位點包括從大腸桿菌中分離得到的核苷酸序列的loxB、loxL和loxR位 點〔Hoess 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 3398 (1982)〕。lox 位點還可通過本領域熟知 的各種合成技術來產生。例如，產生lox位點的合成技術公開在Ito等人[Nuc.Acid. Res., 10，1755(1982)〕和 Ogilvie 等人〔Science, 214, 270 (1981)〕的著作中。本文所用表達「lox位點」，指一核苷酸序列，其中的ere基因的基因產物能催化位 點特異性重組。loxP是一個有34個鹼基對的核苷酸序列，可通過本領域熟知的方法將其 從噬菌體 P1 中分離出來〔見,如 Hoess 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,3398 (1982)〕。 loxP由被8個鹼基對間隔區分開的兩條13個反向重複鹼基對所組成。本文所用的表達「ere基因」，指編碼某酶基因產物的核苷酸序列，該產物影響真核 細胞中lox位點外的位點特異性DNA重組。可以通過本領域熟知的方法從噬菌體P1中分 離得到 ere 基因〔見 Abremaid 等人，Cell, 32，1301-1311 (1983)〕。流感病毒的複製流感A型病毒基因組擁有8條編碼總共10種蛋白質的單鏈負義病毒RNA(vRNA)。 流感病毒的生命周期始於血凝素(HA)與宿主細胞表面含唾液酸的受體相結合，隨後發生 受體介導的胞吞作用。晚期(late)內體中的低pH引發了 HA構像改變，因而暴露了 HA2亞 單位(即所謂的融合肽)的N末端。該融合肽啟動了病毒和內體膜的融合，基質蛋白(Ml)和 RNP複合體被釋放到細胞質中。RNP由包裹vRNA的核蛋白(NP)和PA、PB1和PB2蛋白形成的 病毒聚合酶複合體組成。RNP被轉運到細胞核中，在那發生轉錄和複製。RNA聚合酶複合體 催化3種不同的反應具有5'加帽和3'聚A結構的mRNA的合成、全長互補RNA(cRNA)的 合成和用cDNA作為模板的基因組vRNA的合成。新合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白質然後裝 配到RNP中，從細胞核中運出，轉運到質膜上，在那裡發生子代病毒顆粒出芽。神經氨酸酶 (NA)蛋白通過去除唾液酸寡糖的唾液酸在以後的感染中起著重要的作用，從而從細胞表面 釋放出新裝配的病毒顆粒，並防止病毒顆粒的自我凝集。雖然病毒裝配涉及蛋白質-蛋白 質和蛋白質-vRNA之間的相互作用，但是這些相互作用的性質很大程度上還是未知的。ThoRQto 病毒Thogoto病毒(TH0V)代表正粘病毒科的一個新種。它們由蜱傳播並已在馴養動 物中(包括駱駝、山羊和牛)發現，因此，TH0V能在蜱和脊椎動物中複製。TH0V基因組包含 6段單鏈負義RNA節段。由3條最大節段編碼的蛋白質顯示與流感病毒聚合酶蛋白質PB2、 PB1和PA有顯著的同源性。節段5編碼一個與流感病毒NP有關的蛋白質。節段4編碼的 TH0V糖蛋白與流感病毒HA或NA都沒有同源性，但是它的序列顯示與杆狀病毒糖蛋白有相似性。認為最小節段編碼基質蛋白並且不與任何流感病毒蛋白質相似。與流感病毒相似， 啟動子活性需要該vRNA的3'和5'端二者，此活性分別位於該vRNA的3'和5'端的末 端14和15核苷酸上。TH0V的mRNA合成最初由宿主細胞衍生的帽結構開始。然而，與流感病毒相反， 只從細胞的mRNA中切割下該帽結構(沒有額外的核苷酸)(Albo等人，1996 ；Leahy等人， 1997 ;Weber等人，1996)。體外的切割試驗揭示vRNA的5『和3'端都是核酸內切酶活性 所需要(Leahy等人，1998)，但是如流感病毒所顯示的那樣(Cianci等人，1995 ；Hagen等 人，1994)，加入模擬的cRNA啟動子並不激發核酸內切酶活性(Leahy等人，1998)。已提議 對TH0V使用「鉤狀」結構(Leahy等人，1997 ；Weber等人，1997)，這與提議對流感病毒使用 螺旋塞結構相類似(Flick等人，1996)。然而，這種「鉤狀」結構僅見於THOV vRNA啟動子 中。cRNA啟動子序列不允許其5'端的2和9位之間以及3和8位之間形成鹼基對。替換 3位或8位以允許在這些核苷酸之間形成鹼基配對會激發核酸內切酶活性，這是對提出的 「鉤狀」結構強有力支持的證據(Leahy等人，1998)。而且，該結構可能對TH0V生命周期的 調控是關鍵性的；形成該「鉤狀」結構的vRNA啟動子可以激發PB2核酸內切酶的活性，因而 可進行轉錄。相反，cRNA啟動子可能不形成「鉤狀」結構，因此可能不能激發核酸內切酶的 活性，因而引起複製。布尼亞病毒科布尼亞病毒科包括導致人出血熱或腦炎熱(如裂谷熱、漢坦病(Hantaan)、La Crosse和Crimean-Congo出血熱)幾種病毒。球狀和有包膜的病毒粒子含有3段單鏈負 義RNA節段(見Elliott，1997)。最大的節段(L)編碼病毒RNA聚合酶蛋白(L蛋白)，而 M節段編碼G1和G2兩個病毒糖蛋白以及一個非結構性蛋白質(NSm)。最小節段(S)編碼 核衣殼蛋白質(N)和另一非結構性蛋白質(NSs)。病毒的複製和轉錄發生在細胞質中，新裝 配的病毒粒子通過高爾基體的膜出芽產生。Bridgen和Elliott (1996)已建立了一種反向遺傳系統，以從克隆的cDNA完整地 產生傳染性布尼奧羅病毒。他們採用了首先由Schnell等人(1994)描述的用於狂犬病毒 的策略在表達病毒聚合酶和核蛋白的細胞中進行編碼正義反基因組RNA(而不是負義基 因組RNA)的cDNA的胞內轉錄。Bridgen和Elliott (1996)用表達T7聚合酶的牛痘病毒轉 染HeLaT4+細胞，然後用表達S、M和L節段編碼的蛋白質的質粒轉染這些細胞。接著他們 用3個編碼兩側連接T7聚合酶啟動子和8肝炎病毒核酶的全長反基因組cDNA的質粒轉 染這些細胞。為了增加布尼亞病毒相對於牛痘病毒顆粒的數目，該作者使用了蚊子細胞，在 該細胞中複製的是布尼奧羅病毒而不是牛痘病毒。這個方案不僅能用基因工程來改造布尼 亞病毒，還可以產生用不同的布尼亞病毒株共傳染不易獲得的重配輔助病毒。為了研究轉錄與複製所需要的布尼亞病毒啟動子元件和病毒蛋白質，Dunn等人 (1995)以負義取向克隆了布尼奧羅S RNA節段5'和3'非翻譯區域之間的CAT基因。用 表達L和S節段編碼蛋白質的結構建鉤轉染細胞，然後在體內用轉錄的RNA轉染，這樣導致 了 CAT活性。布尼亞病毒S節段在重疊的讀框中編碼兩種蛋白質，即N和NSs。為確定這兩 種蛋白質是否都是轉錄和複製所需要，檢測了僅表達N或NSs構建物的CAT活性。N蛋白與 L蛋白一起表達導致CAT活性，而用NSs構建物沒有檢測到CAT活性。因此，對布尼亞病毒 樣RNA的轉錄和複製，L蛋白和N蛋白足以發揮作用。
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對於流感病毒而言，布尼亞病毒RNA的末端序列是互補的且高度保守。也因此 假定這些序列建明確定義了布尼亞病毒啟動子並且對於啟動子活性有關鍵作用。該病毒 RNA3'端5個核苷酸的刪除極大地減少了 CAT表達(Dunn等人，1995)。相反，在5'端加入 2個核苷酸，或者在3'端加入11個或35個核苷酸並不消除CAT表達(Dunn等人，1995)。 因此，與流感病毒聚合酶複合體一樣，布尼亞病毒聚合酶蛋白能明顯地在內部啟動轉錄和/ 或複製。本發明將在下面的實施例中作進一步的描述。實施例1材料和方法細胞和病毒.293T人胚腎細胞和Madin-Darby犬腎細胞(MDCK)分別培育在增加 了 10%胎牛血清的Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)中和含有5%新生牛血清的改進 的Eagle培養基中。所有的細胞在37°C和5%0)2中培養。使流感病毒A/WSN/22 (H1N1)和 A/PR/8/34(HlNl)在10日齡雞蛋中增殖。質粒的構津.為產生RNA聚合酶I構建物，將從A/WSN/33或A/PR/8/34病毒RNA 得到的克隆的cDNA導入RNA聚合酶I的啟動子和終止子序列之間。簡言之，通過PCR用 含有BsmBI位點的引物擴增該克隆的cDNA，用BsmBI消化，並克隆到含有人RNA聚合酶I 啟動子和小鼠RNA聚合酶I終止子的pHH21載體的BsmBI位點中，再通過BsmBI位點分離 (圖2)。通過PCR擴增A/WSN/33株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因，擴增時分別 使用下列質粒pSCWPB2、pGff-PBl和pSCWPA(所有的都從加利福尼亞洛杉磯大學的Debi Nayak 博士得到)；pWH17、pWNP152、pT3WNA15 (Castrucci 等人，1992) ；pGT3WM 和 pWNSl。使 用pcDNA774(PBl, Perez等人，1998)作為模板擴增流感A/PR/8/34病毒的PB1基因。引 物的序列見圖6。為確保該基因沒有不要的突變，根據製造商建議的方案用其自動測序儀 (Applied Biosystem Inc.，CA，USA)測序 PCR 得到的節段。如 Huddleston 等人(1982) 所述克隆了編碼A/WSN/33病毒的HA、NP、NA和Ml基因的cDNA，並亞克隆到真核表達載體 pCAGGS/MCS中(由雞3 -肌動蛋白啟動子控制，Niwa等人，1991)，分別產生了 pEWSN_HA、 pCAGGS-WSN-NP0-14、pCAGGS-WNA15 和 pCAGGS-WSN-Ml-2/l。通過 PCR 擴增 了 A/PR/8/34 病 毒的M2和NS2基因，並克隆到pCAGGS/MCS中，產生pEP24c和pCA_NS2。最後，在巨細胞病 毒啟動子的控制下，用 pcDNA774(PBl)、pcDNA762 (PB2)和 pcDNA787 (PA)表達 PB2、PB1 和 PA蛋白質。傳染件流感顆粒的產牛.用最多17種質粒以不同的量以及根據製造商的說明書 用 Trans IT LT-1 (Panvera，Madision, Wisconsin)轉染 293T 細胞(1X106)。簡言之，將 DNA和轉染試劑混合(每微克DNA用2微升Trans IT-LT-1)，室溫共培育45分鐘，然後加到 細胞中。6小時之後，用含有0. 3%牛血清蛋白和0.01%胎牛血清的0pti-MEM(Gibco/BRL， Gaithersburg, Maryland)替換該DNA-轉染試劑混合物。在轉染後的不同時間裡，從上清 液中收集病毒並在MDCK細胞上滴定。由於這個步驟不需要輔助病毒，回收的轉染子病毒的 分析不必進行麻煩的純化。質粒-轉染細胞產生病毒的百分比的確定.轉染後24小時，用0. 02% EDTA將 293T細胞分散成單個細胞。將該細胞懸液稀釋10倍，轉移到鋪滿MDCK單層細胞的24孔板 中。用血凝試驗檢測病毒。
免疫染餼試驗.細胞用流感病毒感染9小時後，用磷酸緩衝鹽溶液(PBS)洗滌兩 次，並在室溫下用3. 7%多聚甲醛(PBS溶液)固定20分鐘。接著，用0. Triton X-100 處理，並如Neumann等人(1997)所述的方法進行操作。MM誦i寸翩RNA汰艮口 3禾口 NP■■表汰，^ 牛感染件病毒.雖然用從純化的病毒顆粒中抽提得到的RNP的混合物轉染細胞，產生了感 染性流感顆粒，但是當用8種不同的體外產生的RNP轉染時，這種策略不可能有效。為了完 全從克隆的cDNA中產生感染性流感病毒，在體內產生了 8種病毒RNP。因而，製備了含有 A/WSN/33病毒的全長病毒RNA的cDNA，其兩側連接人RNA聚合酶I啟動子和小鼠RNA聚合 酶I終止子。原理上，將這8種質粒轉染到真核細胞中應能導致所有8種流感vRNA的合成。 蛋白表達質粒共轉染產生的PB2、PBUPA和NP蛋白應將vRNA裝配到可被複製和轉錄的功 能性vRNP中，最後形成感染性流感病毒(圖3)。用蛋白表達質粒〔1微克pcDNA762(PB2)、 1 微克 pcDNA774(PBl)、0. 1 微克 pcDNA787 (PA)和 1 微克 pCAGGS-ffSN-NPO/14)和 1 微克的 各下列 RNA 聚合酶 I 質粒(pPoII-WSN-PB2、pPoII-WSN-PBl、pPoII-WSN-PA、pPoII-WSN-HA、 pPoII-WSN-NP、pPoII-WSN-NA、pPoII-ffSN-M 和 pPoII-WSN-NS)轉染 1 X 106 個 293T 細胞。 使用減少量的pcDNA787(PA)的決定是根據以前的觀察(Mena等人，1996)和產生病毒樣顆 粒(VLP)最優化條件的數據(未給數據)。293T細胞轉染24小時後，發現在每毫升上清液 中有7X 103pfu的病毒(實施例1，表1)，這第一次證明了反向遺傳方法能夠完整地從質粒 中產生流感A型病毒。^！^用於從克隆的cDNA中產生流感病毒的質粒
15 *用所示的質粒轉染293T細胞。24小時(實驗1或2)或48小時(實驗3_8)後， 測定MDCK細胞上清液中的病毒滴度。!除非有另外的說明，質粒用代表A/WSN/33病毒RNA的cDNA構建而成。流感病毒的產牛和所有病毒結構蛋白質共表汰的效率.雖然病毒NP和聚合酶蛋 白的表達對質粒驅動產生的流感病毒已足夠，但其效率改進還有可能。在前面的研究中， 所有流感病毒結構蛋白質(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、Ml、M2和NS2)的表達產生了含有編 碼報導物氯黴素_乙醯基轉移酶基因的人造VLP (Mena等人，1996)。因而，獲得完全互補的結構蛋白質而不是僅僅那些RNA複製和轉錄所需的蛋白質，可能增加病毒產生的效率。 為此，293T細胞用下列最優化的病毒蛋白表達質粒轉染(如由VLP產物所判斷；未公開數 據)1 微克 pcDNA762 (PB2)和 pcDNA774 (PB1) ；0. 1 微克 pcDNA787 (PA)，1 微克 pEWSN-HA， pCAGGS-WSN-NPO/14 和 pCAGGS_WNA15 ；2 微克 pCAGGS-WSN-Ml-2/l ；0. 3 微克 pCA_NS2 ；和 0. 03微克pEP24c (M2)，以及1微克各RNA聚合酶I質粒(實驗2，表1)。用同樣一組的RNA 聚合酶I質粒(但PB1基因例外，其以pPoII-PR/8/34-PBl替代來產生重配輔助病毒)和只 表達PA、PB1、PB2和NP的質粒(實驗3，表1)或者表達所有流感結構蛋白的那些質粒(實 驗4，表1) 一起轉染另一批細胞。轉染後24小時(實驗1和2，表1)或36小時(未給數 據)的WSN病毒產量並未有明顯的差異。然而，當提供所有的流感病毒結構蛋白時(實驗3 和4，表1)，發現PR/8/34-PB1的病毒產量增加10倍以上。而缺少表達PA、PB1、PB2和NP 蛋白的質粒之一的諸陰性對照都不產生任何病毒(實驗5-8，表1)。因而，取決於所產生的 病毒，所有流感A型病毒結構蛋白的表達明顯地促進了該反向遺傳系統的效率。接著，使用用來產生具有A/PR/8/34-PB1基因的病毒的一組質粒側定了細胞轉染 後病毒產生的動力學。在3次實試驗的二次中，轉染後24小時首先側到病毒，該時間測得 的滴度為> 103pfu/ml，轉染後48小時增加到> 106pfu/ml (表2)。為評估正在產生病毒的 質粒轉染的細胞的百分比，轉染後24小時用EDTA(0. 02% )處理293T細胞以使其分散，然 後進行有限稀釋研究。這一試驗中，在此時間點上沒有發現培養上清液中有游離病毒。該 結果表明在103 3個細胞中有1個細胞產生感染性病毒顆粒。MJ^質粒轉染入293T細胞*後病毒產生的動力學 *用8種編碼從A/WSN/33病毒(例外的是PB1基因，它衍生於A/PR/8/34病毒) 基因的RNA聚合酶I質粒和9種文中描述的蛋白表達質粒轉染293T細胞。在不同的時間 點滴定MDCK細胞培養上清液中的病毒。ND表示未進行測試。含有NP蛋白FLAG表位的流感病毒的回收.為驗證該新的反向遺傳系統能將突變 導入流感A型病毒的基因組中，產生了含有NA蛋白FLAG表位(Castrucci等人，1992)的病毒。用RNA聚合酶I質粒(pPoII-WSN-NA/FL79)與所需的RNA聚合酶I和蛋白表達質粒一 起轉染293T細胞，該RNA聚合酶I質粒含有編碼NA蛋白及其頭部底端FLAG表位的cDNA。 為證實該回收的病毒(PR8-WSN-FL79)確實表達NA-FLAG蛋白，進行用PR8-WSN-FL79或A/ WSN/33野生型病毒感染細胞的免疫染色試驗。用抗FLAG表位的單克隆抗體檢測感染了 PR8-WSN-FL79而非感染了野生型病毒的細胞(圖4)。PR8-WSN-FL79病毒的回收與未加尾 的野生型病毒的回收一樣有效(未給數據)。這些結果表明這種新反向遺傳系統允許將諸 突變體導入流感A型病毒基因組中。含有PA突奪的感染件、流感病毒的產牛.為測試含有PA基因突變的病毒，導 入了兩個沉默突變，產生了限制性核酸內切酶新的識別序列(Bspl20I識別mRNA的846位、 PvuII識別第1284位)。通過反向遺傳學修飾這個基因在以前是不可能的，因為缺少可靠 的選擇系統。回收得到轉染子病毒PA-T846C和PA-A1284。用兩次連貫的有限稀釋生物學 方法克隆了該回收的轉染子病毒。為證實該回收病毒是真正的具有PA基因突變的轉染子， 通過反轉錄PCR獲得PA基因的cDNA。如圖5所述，PA-T846C和PA-A1284C病毒含有預期 的PA基因內的突變，如存在新導入的限制性位點所證明的那樣。不用反轉錄步驟而以同樣 的病毒和引物作PCR沒有產生任何產物(未給數據)，這表明PA cDNA確實起源於vRNA而 不是用於產生病毒的質粒。這些結果闡明了具有突變基因的病毒可在不使用輔助病毒的條 件下產生和回收。碰本文所述的反向遺傳學系統允許人們完全從克隆的cDNA中有效地產生流感A型 病毒。Bridgen和Elloitt(1996)還使用反向遺傳方法產生了布尼奧羅病毒(布尼亞病毒 科)，但是它僅含有負義RNA的3個節段，且產率低，為102pfu/107細胞。雖然在諸實驗中病 毒產量不同，但是所觀察的含有8個節段的流感病毒的產量均為> 103pfu/106細胞。對於 上述反向遺傳學系統的高效有幾種解釋RNP不是在體外產生(Luytjes等人，1989)，而是 在體內通過使用RNA聚合酶I的vRNA的胞內合成和病毒聚合酶蛋白與NP的質粒驅動的表 達而產生。而且，採用易於用質粒轉染的293T細胞(Goto等人，1997)確保大量的細胞接受 了病毒產生所需的所有的質粒。另外，生長細胞表達最豐富的酶中的RNA聚合酶I產生的大 量轉錄產物可能對該系統的整個效率有貢獻。這些特徵導致產生了相當豐富量的vRNA轉 錄產物和足量的包裹vRNA的病毒蛋白、細胞核中RNP的形成和這些複合體輸出到細胞膜， 在那裝配並釋放新的病毒。先前建立的反向遺傳學系統(Enami等人，1990 ；Neumann等人，1994 ；Luytjes等 人，1989 ；Pleschka等人，1996)需要輔助病毒感染和為此而建立的允許從大量的輔助病 毒中回收少量轉染子的選擇方法。已採用這些策略來生產具有下列cDNA驅動的基因之 一的流感病毒PB2 (Subbarao 等人，1993)、HA (Enami 等人，1991 ；Horimoto 等人，1994)、 NP(Li 等人，1995)、NA (Enami 等人，1990)、M(Castrucci 等人，1995 ；Yasuda 等人，1994)和 NS (Enami等人，1991)。除了那些用於HA和NA基因的選擇方法外，大多數選擇方法都依賴 於生長溫度、宿主範圍限制或藥物敏感性，因而限制了反向遺傳方法在基因產物功能分析 中的應用。即使具有HA和NA基因(可靠的抗體驅動選擇系統對此二基因是可利用的)， 還是難於測試具有顯著生長缺陷的病毒。相反，本文所述的反向遺傳系統不需要輔助病毒， 並允許產生任一基因節段中具有突變或具有嚴重生長缺陷的轉染子。這個優點顯示在圖5中，該圖表示具有PA突變基因的轉染子病毒的回收。將活的突變導入流感A型病毒基因組 的技術將使研究者能夠說明許多長時間存在的問題，如病毒基因非翻譯區域中的調節序列 的性質、病毒蛋白的結構-功能關係，以及宿主範圍限制和病毒病原性的分子基礎。雖然可得到無活的流感疫苗，但是它們的效力是次優的，部分原因是它們引起局 部IgA和細胞毒T細胞應答能力有限。現在正在進行的冷適應活流感疫苗的臨床試驗提 示，這種疫苗已被最佳地減毒，所以它們將不會引起流感症狀，但是仍將誘導保護性免疫力 (參見Keitel和Piedra的綜述，1998)。然而，初步的結果表明這些活病毒疫苗將不會比最 好的無活疫苗有效得多(參見Keitel和Piedra，1998)，這留下了進一步改進的空間。一種 可能性是用上述反向遺傳系統修飾冷適應疫苗。或者，可通過使用反向遺傳從零(scratch) 開始，測試一種在編碼內部蛋白的基因中具有多個減毒突變的「主要」流感A株。本發明上 述的反向遺傳系統最引起興趣的應用是在涉及流感病毒新的HA或NA亞型的可疑流行性疾 病的情況下快速測試減毒活病毒疫苗。這種新反向遺傳系統將有可能提高作為疫苗載體的流感病毒的用途。該病毒可進 行基因工程改造，以表達除了流感病毒蛋白質之外的外來蛋白質或免疫原性表位。例如可 以測試具有作為第九個節段的外來蛋白質的病毒(Enami等人，1991)並使用它們作為活疫 苗。流感病毒不僅能激發強烈的細胞介導和體液免疫應答，它們還提供了病毒粒子表面HA 和NA蛋白質的廣闊陣列(如15種HA和9種NA亞型以及它們的流行性變體)，允許對同一 靶群反覆免疫接種。具有編碼報導基因的人造vRNA的流感VLP已通過用牛痘苗_T7聚合酶系統表達 病毒結構蛋白和vRNA而製得(Mena等人，1996)。現在，使用反向遺傳系統能產生含有編碼 vRNA轉錄和複製所需蛋白質(即PA、PBUPB2和NP)的vRNA以及編碼感興趣蛋白的vRNA 的VLP。這樣的VLP可用作基因傳送載體。重要的是，它們缺乏編碼病毒結構蛋白的基因將 確保不會在VLP-基因治療後產生感染性病毒。由於流感病毒基因組沒有整合到宿主細胞 的染色體中，該VLP系統將適合於只需要細胞短期轉導的基因治療(如癌症治療)。與腺病 毒載體相反(Kovesdi等人，1997)，流感VLP可包含HA和NA兩種變體，允許對靶群體的重 復治療。正粘病毒科包括流感A型、B型和C型病毒，以及近來歸類的Thogoto病毒。本文 完全地從克隆的cDNA中產生感染性流感A型病毒的策略可用於任何正粘病毒，也許還可用 於其他區段負義RNA病毒(如布尼亞病毒、沙粒病毒)。這種不受技術限制地操縱病毒基因 組的能力，在病毒生命周期及其調控、病毒蛋白的功能和病毒致病性的分子機制的研究中 有著深遠的意義。實施例2流感病毒蛋白PB2、PB1、PA和NP的表達導致人造病毒RNA的複製和轉錄.為產生 流感VLP，體內流感病毒RNA胞內合成採用了 RNA聚合酶I系統(圖7)。在這個系統中，反 義取向的編碼報導基因的cDNA兩側連接流感病毒RNA的5'和3'非編碼區。將這個盒子 插在RNA聚合酶I啟動子和終止子之間。將該構建物轉染入真核細胞中導致通過胞內RNA 聚合酶I的作用轉錄該報導基因，因而產生了流感病毒樣RNA (Neumann等人，1994)。流感 病毒感染後，病毒聚合酶複合體複製和轉錄該人造vRNA，導致該報導基因的表達。為確定PB2、PB1、PA和NP蛋白的表達是否引起RNA聚合酶1_衍生的轉錄產物
19所編碼的報導基因的表達，將在雞0肌動蛋白啟動子(pCAGGS-WSN-NPO/14)控制下表達 A/WSN/33 (H1N1)的NP蛋白的質粒(各1微克)、在巨細胞病毒啟動子〔pcDNA762 (PB2)、 pcDNA774(PBl)和pcDNA787 (PA)〕控制下表達A/PR/8/34病毒的聚合酶蛋白的質粒和RNA 聚合酶I報導基因構建物(pPoII-GFP)轉染人胚腎細胞(293T)中。48小時後，有30-40% 的細胞表達GFP(圖9)。相反，在缺少聚合酶或NP蛋白的轉染細胞中不能檢測到GFP的表 達。這些結果表明，NP蛋白和3種流感病毒聚合酶蛋白形成了複製和轉錄RNA聚合酶I-衍 生的GFP vRNA的一種功能性複合體。最佳的vRNA轉錄和複製.為確定最佳報導物GFP表達所需的質粒DNA的量，我們 調整了聚合酶蛋白和NP蛋白的表達。先前的研究已表明，大量的PA減少了報導基因在轉錄 /複製系統中的表達程度(Mena等人，1996)。因此，逐步減少質粒中PA的表達，確定了 0. 1 微克的pcDNA787 (PA)作為模板產生了最強的GFP表達。對NP這種RNP複合體中的主要結 構成分可能需要大量的蛋白表達質粒。然而，更高數量的質粒並沒有明顯地影響GFP陽性 293T細胞的數量。另外，不同量的PB2和PB1蛋白表達質粒(從1. 0到0. 03微克)也沒有 影響293T細胞中的GFP表達。因此，在接下來的所有實驗中，採用0. 1微克pcDNA787 (PA) 和 1. 0 微克的 pcDNA774 (PB1)、pcDNA762 (PB2)和 pcCAGGS-WSN-NPO/14。從克降的cDNA中形成流感VLP.前面牛痘苗T7RNA聚合酶系統的研究表明，流感 VLP的形成需要9種流感病毒蛋白？82、？81、？4、擬、嫩、呢、] 1、]\12和賂2(]^皿等人，1996)。 相反，NS1蛋白對顆粒形成是不必要的(Mena等人，1996)。為建立一個有效的VLP產生的質 粒驅動系統，製備了編碼HA、NA、Ml、M2和NS2基因的cDNA。將該cDNA克隆到真核表達載 體pCAGGS/MCS中(受雞3 -肌動蛋白啟動子控制)，分別產生了 pEWSN-HA、pCAGGS-WNA15、 pCAGGS-WSN-Ml-2/U pEP24c和pCA_NS2。通過蛋白質印跡分析證實了各蛋白質的表達。為產生VLP，採用1.0微克的各蛋白表達質粒〔對於pcDNA787(PA)例外，採用0. 1 微克〕和1微克報導基因構建物pPoII-GFP轉染106個293T細胞。轉染48小時後收集培養 上清液，並將其與A/WSN/33病毒混合，以提供GFP vRNA複製和轉錄所需的流感病毒蛋白。 然後將該混合物接種到MDCK細胞中。培育10小時後，檢測到GFP陽性MDCK細胞，相應於 450個顆粒/毫升上清液(表3)。因而，所有流感病毒結構蛋白的質粒-驅動表達導致了 含有GFP vRNA的感染性流感VLP的形成。而且，GFP vRNA被傳送到MDCK細胞中。流感病毒的最佳裝配.還研究了表達不同量RNA聚合酶I報導基因構建物以及 HA、NA、Ml、M2和NS2質粒DNA的細胞中VLP的形成。在採用pPoII-GFP的實驗中，1. 0微 克的質粒DNA能非常有效地產生VLP，而2. 0微克或3. 0微克效率顯著較少。因為在感染後 NS2和M2蛋白表達量低，最佳VLP的形成可能需要相對少量的表達質粒。將M2表達構建物 從1. 0微克減少到0. 1微克，導致GFP陽性MDCK細胞數量增加10倍以上(表3)。進一步 減少質粒到0.03微克並不增加VLP的數目。對於NS2，測試的質粒量較低(0. 1微克)，VLP 的形成效率較低(表3)。Ml蛋白是病毒粒子的主要結構成分。因而，有效形成VLP需要Ml蛋白高水平表 達。在用1. 0微克或2. 0微克Ml質粒DNA轉染的細胞中進行VLP形成比較實驗中檢驗了 這一預言。如表3所示，較大量的質粒導致GFP陽性MDCK細胞增加10倍以上。表達HA和 NA蛋白的質粒的兩種不同量(1微克2微克)比較，並沒有揭示VLP形成有任何顯著差 異，因此在接下來的實驗中各質粒(pEWSN-HA和pCAGGS-WSN15)選用1微克。總而言之，這
20些研究導致了 VLP形成效率增加100倍以上，並最終導致每毫升上清液中產生104個以上 的感染性流感病毒粒子(圖10)。表3.用於形成感染性VLP*的質粒DNA的最佳量 *用所有9種流感病毒病毒結構蛋白的表達質粒和RNA聚合酶I-GFP基因質粒轉 染293T細胞。轉染48小時後，收集含有VLP的上清液，使其與A/WSN/33輔助病毒混合接 種到MDCK細胞中。感染10小時後固定細胞，並用螢光顯微鏡檢測GFP表達。僅改變Ml、 M2和NS2質粒的量(粗體字)以測定它們在MDCK細胞中GFP表達的最佳用量。!通過計數5個顯微鏡視野中的GFP陽性細胞數測定VLP形成的相對效率。選擇 含有1微克各種質粒的樣品(產生450個感染性VLP/毫升上清液)作為參照(值1)。完全從質粒產生VLP的可靠性.為驗證VLP以真正流感病毒相同的方式開始感 染，用抗WSN HA抗體中和VLP。將從質粒轉染的293T細胞得到的含有VLP的上清液與抗 WSN HA混合單克隆抗體或與抗水泡性口炎病毒(VSV，負控制)G蛋白的單克隆抗體室溫共 培育1小時。將沒有被抗WSN HA混合單克隆抗體中和的A/PR/8/34輔助病毒加到該混合 物中，並接種到MDCK細胞中。只有抗-WSN-HA-特異性單克隆抗體中和了 VLP，這表明HA介 導了 VLP附著和進入細胞。接著，確定了 VLP形成所需的最小蛋白組。其他學者已確定vRNA複製和轉錄必 需的3種流感病毒聚合酶和NP(Houda等人，1988)。因此，包括了這4種蛋白中的每一種， 但順次刪去HA、NA、Ml、M2或NS2。排除這些質粒的任何一種都不影響轉染293T細胞中的 GFP vRNA的複製/轉錄。從缺少HA、NA、Ml或NS2蛋白的轉染293T細胞得到的上清液並 不促進感染的MDCK細胞中的GFP表達，這表明不存在感染性VLP。刪去M2能檢測到感染 性VLP，但量少(與整套結構蛋白相比減少500倍)。因而，與從牛痘苗-病毒系統研究得 到的數據一致，有效形成感染性VLP需要所有流感病毒結構蛋白。VSV糖蛋白可取代VLP產生中的HA和NA蛋白.用VSV的G蛋白替換流感病毒HA
和NA蛋白，該G蛋白具有受體結合和融合的功能。在轉染了 pPoII-GFP的293T細胞中、最佳量的PB2、PB1、PA、NP、M1、M和NS2表達構建物、1微克VSV-G構建物(pCAGGS-VSV-G)中， 用VSV-G蛋白替換流感病毒糖蛋白並沒有對VLP的形成有不利的影響。相反，反覆發現當 用VSV-G而不是HA和NA作為病毒糖蛋白時，產生了較高數量的GFP陽性細胞。因而，VSV G蛋白能有效地摻入流感病毒粒子中，並在病毒的釋放和進入中具有與HA和NA —樣的功 能。一種產生感染性流感病毒顆粒的有效系統可能是研究該病毒的財富(asset)，並 有可能用於疫苗和基因治療載體的生產。與現有的牛痘苗病毒系統相反，本文所述的VLP 產物策略在細胞最初的轉染和VLP的產量(> 104感染性顆粒/毫升上清液)都是非常有 效的。而且，該系統可完全地由表達流感病毒蛋白的質粒(即缺少其他病毒蛋白)所驅動， 這極大地簡化了結果的解釋。另一主要的優點是能夠研究病毒粒子形成、RNP複合體的包 裹、病毒複製的出芽和結合與融合過程中致命突變的影響。另外，上述系統的操作可能與其 他病毒(如副粘病毒和彈狀病毒)同等地好。流感病毒HA和NA蛋白在功能上能被VSV糖蛋白G替換。先前已報導當用重組 SV40病毒提供G蛋白時流感病毒不能摻入VSV G蛋白(Nairn等人，1993)。本文所描述的 結果表明HA和NA都不是VLP形成所必需的，雖然不能排除這些糖蛋白在與病毒其他蛋白 的相互作用中起作用，因而影響病毒粒子的結構，正如表達短尾HA、NA及兩者的形狀伸長 的病毒所提示的那樣(Garcia-Sastre等人，1995 Jin等人，1994 Jin等人，1997 ；Mitnaul 等人，1996)。上述以質粒為基礎的系統可能特別有用於治療基因的傳送。可製備含有編碼轉錄 和複製所需蛋白質(即NP和聚合酶)的vRNA以及編碼感興趣蛋白質的vRNA的VLP。這些 顆粒是感染性的並可將指定的基因傳送到靶細胞中，在那進行複製和轉錄。因為這些顆粒 不含有完整互補的病毒基因，所以它們不能產生感染性子代病毒。這個特徵以及病毒基因 組沒有整合到宿主染色體中將確保在人和非人類動物中基因傳送的生物學安全性。最後， 15種HA和9種NA亞型及其變體的可獲得性將允許VLP的反覆給藥，因此克服了對載體產 生蛋白質的免疫抗性，這是反覆使用其他病毒載體(如腺病毒)所面臨的主要障礙之一。該 質粒驅動系統的另一優點是可在僅需要外來蛋白短期表達的情況下(如癌症治療)使用。實施例3通過使用Cre-loxP系統可產生包裝細胞系來進行複製缺陷性病毒的生 產。例如，可製備含有轉錄終止盒和一個病毒基因的蛋白表達載體(如PBS302 of LifeTechnologies,Bethesda,Maryland ；禾口 Sauer 等人，1993 ；Lasko 等人，1992 ；Pichel 等 人，1993 ；Bolivar 等人，1977 ；Stuhl 等人，1981 ；Stuhl 等人，1985 ；Fiers 等人，1978)，該轉 錄終止盒兩側連接有兩個loxP位點。從啟動子序列開始的轉錄在轉錄終止位點被阻斷。 因而，病毒基因沒有被轉錄和翻譯。受這種載體穩定轉染的細胞再以缺少vRNA其編碼克隆 到loxP系統中的基因的流感病毒感染。此病毒還含有編碼Cre蛋白的另一 vRNA。因為缺 乏自己的vRNA，此病毒在正常細胞中不能存活。然而，在包裝細胞系中，由vRNA表達的Cre 蛋白導致在loxP位點產生重組，結果該轉錄終止位點被刪除。因而，各病毒基因現在被轉 錄和表達，使病毒能在這些細胞中擴增(圖11)。另外，製備了表達受loxP系統控制的晚期病毒蛋白(即HA、NA、M1、M2和NS2)的 包裝細胞系(圖12)。可用其他病毒受體結合和融合蛋白(如伊波拉病毒GP、馬爾堡病毒GP、布尼亞病毒糖蛋白GP1和GP2、彈狀病毒和副粘病毒的G和/或F蛋白、Thogoto病毒糖 蛋白和正鏈RNA病毒的糖蛋白)替換HA和NA。產生了病毒樣顆粒，它含有編碼複製/轉錄 所需蛋白質(即聚合酶和NP蛋白)的vRNA、編碼感興趣基因的vRNA和編碼Cre的vRNA。 在該包裝細胞系中這些vRNA被包裹到病毒樣顆粒裡。這些病毒樣顆粒可用於疫苗及基因治療目的，因為(i)它們不含有完整互補的病 毒基因，因而不能形成感染性子代病毒，符合嚴格的安全性要求；(ii)它們將有可能表達 高水平的外來蛋白；(iii)它們不表達主要抗原的病毒糖蛋白(HA和NA)；因此，宿主對病 毒蛋白的免疫應答應是有限的。參考文獻Albo,, C. , Martin, J.和 Protela, A. , T. Virol. ,70,9013-9017(1996)。Baron，M.D.& Barrett, T.，T. Virol. ,71,1265—1271 (1997)。Bolivar 等人，Gene, 2,95 (1977)。Bridgen，A.& Elliott, R. M. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,93, 15400-15404(1996)。Castrucci，M. R. & Kawaoka, Y. , T. Virol. , 69, 2725-2728 (1995)。Castrucci, M. R.，Bilsel, P. & Kawaoka，Y.，T. Virol. , 66,4647-4653 (1992)。Collins, P. L. ，Hill, M. G. ， Camargo, E. ， Grosfeld, H. ， Chanock, R. M. Murphy, B. R.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,92,11563-11567(1995)。Cozelmann，K. K. & Schnell, M.，T. Virol. ,68,712—719(1994)。Dunn, E. F. ， Pritlove, D. C. ， Jin, H.禾口 Elliott， R. M. ， ViroloRY, 211, 133-143(1995)。Elliott, R. M.，Mol.Med.，3，572-577 (1997)。Enami, M. , Sharma, G.，Benham，C. & Palese，P.，ViroloRY, 185, 291-298 (1991)。Enami, M.和 Palese, P.，J. Virol.，65，2711-2713 (1991)。Enami, M. ,Luytjes,ff. ,Krystal,M.和 Palese, P. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 87,3802-3805(1990)。Fiers 等人，Nature, 273,113(1978)。Garcia-Sastre, A.和 P. Palese, Virus Res.，37，37-47(1995)。Garcin, D. ，Pelet, T. ，Calain, P. ，Roux, L. ，Curran, J.禾口 Kolakofsky，D. ，EMBO 14,6087-6094(1995)。Goto, H. , Bethell, R. C.禾口 Kawaoka，Y. ，ViroloRY, 238，265—272 (1997)。Hagen, M. Chung, T. D. Y.，Butcher, J. A.禾口 Krysral，M.，J. Virol.，M， 1509-1515(1994)。He,B. ,Paterson,R. G. ,ffard,C. D.禾口 Lamb，R. A.，ViroloRY, 237，249-260 (1997)。Hoffman, M. A.和 Banerjee, A. K.，J. Virol.，71，4272-4277 (1997)。Honda, A. , K. Ueda, K. Nagata 禾口 A, Ishihama, J. Biochem. (Tokyo)，104, 1021-1026(1988)。Horimoto, T.和 Kawaoka, Y.，J. Virol.，68，3120-3128 (1994)。Huddleston, J. A.和 Brownless，G. G.，Nucl. Acids Res.，10，1029-1037。
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權利要求
一種基於質粒的系統，用於從克隆的病毒cDNA產生感染性流感病毒，其中，該系統含有多個足以在缺少輔助病毒時產生所述病毒的流感病毒載體，其特徵在於，所述載體包含(i)至少六種載體，其選自含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒PA cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒PB1 cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒PB2 cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒HA cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒NP cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒M cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒NA cDNA的啟動子的載體、含有操作性連接於已連接了轉錄終止序列的流感病毒NS2 cDNA的啟動子的載體；(ii)含有操作性連接於編碼流感病毒PA多肽的DNA節段的啟動子的載體；(iii)含有操作性連接於編碼流感病毒PB1多肽的DNA節段的啟動子的載體；(iv)含有操作性連接於編碼流感病毒PB2多肽的DNA節段的啟動子的載體；和(v)含有操作性連接於編碼流感病毒NP多肽的DNA節段的啟動子的載體。
2.如權利要求1所述的基於質粒的系統，其特徵在於，所述病毒cDNA是突變的。
3.如權利要求1所述的基於質粒的系統，其特徵在於，所述基於質粒的系統產生至少 1 X 103pfu/ml感染性流感病毒。
4.如權利要求3所述的基於質粒的系統，其特徵在於，所述基於質粒的系統產生至少 3X104pfu/ml感染性流感病毒。
5.如權利要求1所述的基於質粒的系統，其特徵在於，所述啟動子選自RNA聚合酶I啟 動子、RNA聚合酶II啟動子、RNA聚合酶III啟動子、T7啟動子和T3啟動子。
6.如權利要求5所述的基於質粒的系統，其特徵在於，所述啟動子是RNA聚合酶I啟動子。
7.如權利要求6所述的基於質粒的系統，其特徵在於，所述啟動子是人RNA聚合酶I啟 動子。
8.如權利要求1所述的基於質粒的系統，其特徵在於，所述轉錄終止序列選自RNA聚合 酶I轉錄終止序列、RNA聚合酶II轉錄終止序列、RNA聚合酶III轉錄終止序列和核酶。
9.如權利要求1所述的基於質粒的系統，其特徵在於，兩個或多個載體以物理方法連接。
10.如權利要求1所述的基於質粒的系統，其特徵在於，所述一個或多個載體在分開的 質粒上。
11.一種宿主細胞，它含有權利要求1所述的基於質粒的系統。
12.—種生產流感病毒病毒粒子的方法，該方法包括在使病毒蛋白和vRNA或cDNA生產 的條件下培養權利要求11所述的宿主細胞。
13.一種製備流感病毒特異性免疫原性組合物的方法，其特徵在於，該方法包括從含有 多個權利要求1所述的流感病毒載體的宿主細胞中純化出病毒粒子，其中，所述載體在不 存在輔助病毒的情況下或在不存在體外核糖核蛋白複合物的情況下被導入所述宿主中。
14.一種免疫原性組合物，其特徵在於，它含有根據權利要求13所述的方法製得的流感病毒病毒粒子。
15.權利要求14所述的免疫原性組合物的用途，其特徵在於，用於製備用於免疫個體 以抗流感病毒感染的藥劑。
16.一種分離的流感病毒，它由權利要求12或13的方法製得。
17.一種無輔助病毒的基於質粒的系統，用於從克隆的病毒cDNA產生感染性流感病 毒，該系統含有足以產生所述病毒的多個權利要求1所述的流感病毒載體。
全文摘要
本發明提供一種用於(如在沒有輔助病毒的情況下)製備流感A型病毒的組合物。
文檔編號A61K39/00GK101851636SQ20101015562
公開日2010年10月6日 申請日期2000年4月5日 優先權日1999年4月6日
發明者G·紐曼, Y·川岡 申請人:威斯康星校友研究基金會