Wnt10-來源肽及其用途的製作方法

2023-12-01 20:58:51

專利名稱：Wnt10-來源肽及其用途的製作方法
WNT10-來源肽及其用途
技術領域：
本發明涉及一種WNTio-來源肽及包含該肽的改善脫髮及改善皮膚的組合物以及WNTlO信號傳遞-關聯疾病及DKK-I蛋白質-衍生疾病治療用組合物。
背景技術：
毛囊作為哺乳動物皮膚的獨特器官，是原始表皮的下部成長，並延伸到更深的皮膚層的器官。在毛囊的基部存在著嗉囊或者被稱為真皮乳頭細胞的細胞的塞子(Stenn andPaus, Physiol. Rev. ,81 :449 (2002)),乳頭對 於毛囊的正常循環(Oliver, Embryol. Exp.Morph. 15 :331(1966) ；01iver, Embryol. Exp. Morph. 16 :231(1967))及毛幹的生長而言是所必需的。毛幹是一種踏面形狀的結構，該踏面形狀的結構由角蛋白絲和纖絲成束蛋白質填充的緊緊地緊貼的上皮細胞所製備。人類的毛髮按周期反覆生長期、萎縮期及休息期，並會經過毛髮脫落再生成的過程。毛髮的周期通過激素調節或者很多的生長因子等的調節而完成。另一方面，由於過度的壓力或者營養缺乏等，導致毛髮提早經過萎縮期進入到休息期，從而引發嚴重的脫髮症狀(Vladimir A. Botchkarev,American Journal of Pathology,162 (3) :709-712 (2003))。對於男性型禿頭來說，頭皮的前表面及上部的毛囊受到雄激素的很大影響。因此，就男性型禿頭而言，比起毛囊的破壞，更相當於毛囊的小型化，其原因是，由於作為男性荷爾蒙的雄激素的過度分泌，導致5-a還原酶(5-alpha reductase)激活，從而睪酮變形為雙氫睪酮(dihydrotestosterone, DHT),如此生成的雙氫睪酮縮短毛髮生長的期限,且將使毛囊實現小型化，來減少粗而結實的成毛的數，從而引發脫髮。並且，脫髮女性的20%常常顯出頭皮上部的毛髮變薄的特徵，由此能夠推定出她們一生可能經歷幾個種類的脫髮。隨著上年紀，脫髮面積也會擴大。追加地，例如，像傷疤脫髮症、燒傷或者與壓迫傷害相關的傷疤形成狀態的不同的疾病狀態可能引起明顯的脫髮。與原因無關的，隨著越來越多的現代女性走向社會，男性也開始注重外貌，因此脫髮最終會導致喪失自尊心和自豪心的同時，在精神上、社會上及性上產生深刻的影響。到現在為止，為了治療這種脫髮症狀，將多種物質等作為醫藥品來使用，但是這些醫藥品價格昂貴，並且引發多種副作用。而且，這種醫藥品需要持續使用，中斷使用時，存在重新引起脫髮的缺點。並且，存在著對每個人的療效差異很大，且每個人的副作用也出現差異的缺點。此外，利用為化妝品的原料具有價格便宜的優點，但，由於是由植物提取物來源成分構成的，所以具有實際上其療效不大的缺點。因此，為了彌補對人體缺乏穩定而有效的功效且價格昂貴的缺點，開發有利用化學的合成方法，比蛋白質更便宜的價格大量生產療效優秀的具有與WTN10類似的功能的WNT10來源肽的方法，並開發有為了能夠更容易地滲透到皮膚內，利用納米微脂囊技術，由於皮膚內滲透度高而能夠見到很大的效果的產品。該肽誘導在能夠生成毛根的皮膚組織的毛髮卵泡(hair follicle-毛囊)的幹細胞的增殖，且誘導分化以便向毛根移動，從而能夠使新的毛囊生成。並且，即使在存在從雙氫睪酮衍生的DKK-I脫髮基因，而抑制WNT功能的狀況下，肽使WNT-P -聯蛋白的信號激活，來表達生發促進基因。並且，肽起到促進作為生成毛髮且生長的時期的生長期的作用，且使因各種環境因素向萎縮期進入的毛髮的周期停留在生長期，從而顯現出脫髮抑制效果，在正常毛髮中，對毛髮的生長有很大的影響，且給毛髮供應營養素，從而對健康的毛髮有著很大的影響。目前為止為人所知的兩種可利用的藥物(米諾地爾及非那雄胺)能夠延遲追加的脫髮，但是實際上為了誘導再生新的毛囊，不能利用其中的任何一種。並且，在很多頭髮化妝品中，有很多利用植物提取物等的防止脫髮產品出品，特別是，含有苦參、辣椒、當藥、桑白皮、桑葉、人參、甘草、芍藥、地黃、茴香、山茱萸、大蒜等的提取物的產品，添加含有黃嘌呤及生長激素的組合物來改善雙氫睪酮過剩而導致的細胞代謝抑制的同時，隨著生長激素促進毛髮生長，防止脫髮及再生毛髮，來呈現毛髮生長促進效果的產品，即，為了促進生發及毛髮的生長，開發含有礦物質及維生素類、綠茶、迷迭香、艾草、甘草提取液的產品，給頭皮和毛髮供應營養，且混合對預防脫髮及毛髮生長促進有效的生發促進用產品，即，混合維生素B、維生素C、維生素D、維生素E、煙酸、泛酸、生物素及 葉酸等物質和植物提取物，來抑制人體內的
5-a還原酶，以便在男性荷爾蒙的代謝過程中防止形成雙氫睪酮，並且幫助毛髮的新陳代謝作用開發有男性型脫髮產品，但是很難找到影響至新生毛髮生成的產品。另一方面，開發利用被日本的東京慈惠會醫科大學健康醫學中心研究團體臨床組判定為對糖尿病等有很好的療效的科羅索酸(Corosolic Acid)等的產品，來開發抑制人體內的5_ a還原酶，且對毛髮生長具有卓越的功能的產品。在毛髮的生長及退化過程中有很多因素相互聯繫，本研究者執行了，促進對毛根的生成最為重要的毛髮的角質細胞的增殖，用於誘導向毛髮的分化的研究及供應毛髮周圍的營養素，利用用於促進血管內皮生長因子的活性的一連的生長因子的研究。特別是，在推薦毛髮的周期的各種生長因子中，人類來源WNTlO在細胞中傳遞信號來影響毛髮，這樣的WNTlO的信號傳遞路徑藉助分泌的WNTlO與作為它們的受體的捲曲(Frizzled)蛋白質之間的相互作用來進行激活，此時，作為LDL (低密度脂蛋白-LOW DENSITY LIPOPROTEIN)受體-關聯蛋白質的LRP5(遲受體電位5-LATE RECEPTOR P0TENTIAL5)及LRP6(遲受體電位
6-LATERECEPTOR POTENT IAL6)作為輔助受體起作用(Clin Cancer Res 2007 ; 13 (14) July15，2007，WNT信號通路與幹細胞信號網絡)。WNT10信號傳遞的下流影響，包含蓬亂蛋白(DVL, Disheveled)的激活，來使蛋白激酶B (Akt)激活之後，調動為軸蛋白(Axin)-^-K蛋白-GSK3 P -複合體(Fukumoto et al.，J. Biol. Chem.，276 :17479-17483 (2001))。此後，GSK3P實現磷酸化及惰性，導致￠-聯蛋白的磷酸化及分解受到抑制。蓄積的￠-聯蛋白轉位成核，與淋巴增強因子-T細胞因子(LEF-TCF)類的轉印因子相互作用來誘導目標基因的轉印。如此表達的蛋白質重要地作用於毛髮的生長和分化，並能夠使毛細胞重新生成。並且，降低由於男性荷爾蒙的雙氫睪酮(DHT,Dihydrotestosterone)的功能,從而具有防止脫髮的功能。本說明書的全部內容參照多數的論文及專利文獻，且表示對其的引用。引用的論文及專利文獻的公開內容以其全部的內容作為參照插入到本說明書中，能夠更加明確地說明本發明所屬的技術領域的水準及本發明的內容。

發明內容本發明人員是為了開發能夠起到與天然WNTlO相同或者類似的功能或者作用，且相比WNTlO蛋白質，活性、皮膚滲透度及穩定性更為優秀的物質而努力的。其結果，在很多肽候選物質中，通過合成不僅生理活性(例如，改善脫髮、細胞成長促進能力、纖連蛋白的表達促進等)優秀，而且穩定性及皮膚滲透度也優秀的WNTlO-來源肽，來完成本發明。因此，本發明的目的在於，提供一種序列目錄第一序列的肽。本發明的再一個目的在於，提供一種脫髮改善用組合物。本發明的另一個目的在於,提供一種皮膚狀況(skin condition)改善用組合物。本發明的還有一個目的在於，提供一種WNTlO信號傳遞-關聯疾病改善或者治療用組合物。 本發明的又一個目的在於，提供一種DKK-I蛋白質-衍生疾病治療用組合物。本發明的其他目的及優點將通過下述的發明的詳細說明、權利要求範圍及附圖而更為明確。本發明人員是為了開發能夠起到與天然WNTlO相同或者類似的功能或者作用，且相比WNTlO蛋白質，活性、皮膚滲透度及穩定性更為優秀的物質而努力的。其結果，在很多肽候選物質中，合成了不僅生理活性(例如，改善脫髮、細胞成長促進能力、纖連蛋白的表達促進等)優秀，而且穩定性及皮膚滲透度也優秀的WNTlO-來源肽。就本發明人員而言，即使WNTlO蛋白質的效能非常出色，但是為了得到激活型WNTlO蛋白質，需要再摺疊的補充工序和時間，在純化過程中需要用於除去大腸菌來源的汙染源的複雜的純化過程，為了彌補因穩定性及高分子量而難以超越毛髮的保護膜的問題以及因昂貴的價格而相應地降低利用度的缺點，開發出具有與WNTlO蛋白質類似的功能且穩定性優秀的肽，並應用於產品上，從而開發出新穎，且能夠具有經濟競爭力的類似物。本發明的肽包含從由WNTlO-來源的胺基酸序列組成的組中選擇的胺基酸序列。優選地，本發明中的肽必需由序列目錄第一序列的胺基酸序列構成。本說明書中的術語「肽」是指，藉助肽結合，胺基酸殘基相互結合而形成的線形分子。本發明的肽能夠根據在本發明技術領域公知的化學合成方法來製備，特別是可以根據固相合成技術(solid-phase synthesis techniques)來製備(Merrifield, J. Amer.Chem. Soc. 85 :2149-54(1963) ；Stewart, et al. , Solid Phase Peptide Synthesis,2nd.ed. , Pierce Chem. Co. Rockford,111(1984)) 就本發明的肽而言，對存在於WNTlO蛋白質內的多個部位進行隨機部分合成，並對受體蛋白質的可結合部位進行一次探索之後，對預測到的該部位的胺基酸序列進行最優化，並選定、製備為本發明的肽，從這些候選肽中篩選出活性最優秀的肽，從而提供本發明的肽。序列目錄第一序列肽是執行與天然WNT10類似的作用，並與受體結合，執行與生長因子相同的功能的肽。根據本發明的優選實施例，本發明的肽具有角質細胞及纖維芽細胞的成長促進能力。根據本發明的優選實施例，本發明的肽促進纖連蛋白的表達。 並且，本發明的肽具有激活WNT信號的功能。根據本發明的優選實施例，本發明的肽將￠-聯蛋白傳遞至核內。本發明的肽其本身與天然的WNT10蛋白質相比具有更為出色的穩定性。但是，藉助氣基酸的變形，其能夠進一步提聞穩定性。
根據本發明的優選實施例，在上述肽的N-末端結合有從包含乙醯基、芴甲氧羰基、甲醯基、棕櫚醯基、十四烷基、硬脂基及聚乙二醇(PEG)的組中選擇的保護基。根據本發明的優選實施例，本發明的肽能夠與從包含乙醯基、芴甲氧羰基、甲醯基、棕櫚醯基、十四烷基、硬脂基及聚乙二醇(PEG，Polyethylene Glycol)的組中選擇的保護基結合，提供穩定性高於天然(naturally occurring)變形生長因子的肽。如上所述的胺基酸的變形起到大幅度改善本發明的肽的穩定性的作用。本說明書中的術語「穩定性」不僅意味著「在體內」的穩定性，而且還意味著儲存穩定性(例如，常溫儲存穩定性)。上述保護基起到從生物體內的蛋白質裂解酶的攻擊中保護本發明的肽的作用。
根據本發明的再一個實施例，本發明提供一種將上述本發明的肽作為有效成分包含在內的脫髮治療或者改善用組合物。根據本發明的另一個實施例，本發明提供一種將上述本發明的肽作為有效成分包含在內的皮膚狀況(skin condition)改善用組合物。由於本發明的組合物將上述本發明的生長因子-關聯肽作為有效成分包含在內，因此為了避免本說明書的過度的複雜性，省略這兩種之間共同的內容。根據本發明的優選實施例，本發明的組合物額外包含具有序列目錄第二序列的胺基酸序列的肽或具有序列目錄第三序列的胺基酸序列的肽，或者將上述肽全部包含在內。根據本發明的優選實施例，藉助本發明的肽的治療或者改善脫髮是促進生發或者生成毛髮。如下述實施例中所證實，本發明的肽具有纖維芽細胞及角質細胞成長促進能力，促進作為WNT蛋白質的代表性信號的￠-聯蛋白信號。並且，確認到了即使存在稱為DKK-I的WNT抑制劑，藉助本發明的肽處理，WNT的信號也能夠正常工作。作為WNT的目標基因的纖連蛋白的表達也藉助本發明的肽處理而增加，並且，確認到即使存在DKK-1，如果進行本發明的肽處理，則纖連蛋白的表達量也能夠增加。通過以這樣的結果為基礎實施的動物實驗，能夠知道本發明的肽能夠顯著地促進毛髮生長。因此，本發明的組合物對毛髮的生長及皮膚狀況的改善非常有效。根據本發明的優選實施例，藉助本發明的肽的皮膚狀況的改善是改善皺紋、改善皮膚彈力、防止皮膚老化、改善皮膚保溼、除去傷疤或者皮膚再生。根據本發明的還一個實施例，本發明提供一種將上述本發明的肽作為有效成分包含在內的WNT10信號傳遞-關聯疾病改善或者治療用組合物。根據本發明的又一個實施例，本發明提供一種將上述本發明的肽作為有效成分包含在內的DKK-I蛋白質-衍生疾病治療用組合物。由於本發明的組合物作為有效成分包含上述的本發明的生長因子-關聯肽，因此為了避免本說明書的過度的複雜性，省略這兩種之間共同的內容。根據本發明的優選實施例，上述的WNT10信號傳遞-關聯疾病是眼疾病、脂肪-調節疾病(lipid-modulated disorder)、骨疾病或者腫瘤疾病，更優選為骨疾病或者腫瘤疾病。根據本發明的優選實施例，上述骨疾病從包含骨疾病、骨折、老年性骨損傷、軟骨營養障礙、高鈣血症、骨質增生症、骨脆症、骨軟化症、骨髓炎、骨質疏鬆症、變形性骨炎、骨關節炎及佝僂病的組中選擇。根據本發明的優選實施例，上述的腫瘤疾病是大腸腫瘤、乳房腫瘤或者是黑瘤。根據本發明的優選實施例，上述的脂肪-調節疾病從包含心臟狀態、動脈粥樣硬化、家族性脂蛋白脂肪酶缺乏症、高脂蛋白血症III型、家族性高膽固醇血症、家族性高甘油三脂血症、多發性脂蛋白型高脂蛋白血症、透析和/或糖尿病的脂肪增加及家族性脫輔基蛋白質C II缺乏症的組中選擇。根據本發明的優選實施例，上 述DKK-I蛋白質-衍生疾病是糖尿病或者肌肉恢復及再生，並且上述的糖尿病與耐胰島素性及低胰島素血症的治療相關聯。根據本發明的優選實施例，本發明的組合物是一種藥劑學的組合物，該藥劑學的組合物包含(a)上述的本發明的生長因子-關聯肽的藥劑學的有效量；以及(b)藥劑學所容許的擔體。本說明書中的術語「藥劑學的有效量」是指，能夠實現上述生長因子-關聯肽的效能或者活性的充分的量。包含在本發明的藥劑學的組合物的藥劑學上容許的擔體是在製藥時通常被利用的，包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、刺槐樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、微晶性纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、甲基羥基苯甲酸、羥苯丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物質油等，但是不局限於這些。本發明的藥劑學的組合物除了上述成分以外還可以額外包含潤滑劑、溼潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑以及保鮮劑等。適合的藥劑學上容許的擔體及製劑詳細記載在雷明頓的製藥科學(Remington' sPharmaceutical Sciences, 19th ed. , 1995)中。本發明的藥劑學的組合物是根據本發明所屬技術領域的普通技術人員容易實施的方法，利用藥劑學上容許的擔體和/或賦形劑進行製劑化，從而製備成單位容量形態或者放入大容量容器內而進行製備。此時，劑型可以是油或者水性媒質中的溶液、懸浮液或者乳化劑形態，或者也可以是提取物、粉末劑、顆粒劑、片劑、膠囊或者膠狀(例如，水凝膠)形態，並且可以額外包含分散劑或者穩定劑。根據本發明的優選實施例，本發明的組合物是一種化妝品組合物，該化妝品組合物包含(a)上述的本發明的生長因子-關聯肽的化妝品學的有效量(cosmeticallyeffective amount);以及(b)化妝品學上容許的擔體。本說明書中的術語「化妝品學上的有效量」是指，實現上述的本發明的組合物的皮膚改善效能而充分的量。本發明的化妝品組合物還可以製備成在該本發明屬於技術領域中通常製備的任意劑型。例如，可以劑型化成溶液、懸浮液、乳濁液、糊劑、凝膠、乳霜、乳液、散粉、肥皂、含表面活性劑洗面液、油、粉末粉底、乳濁液粉底、蠟粉底及噴劑等，但是不局限於這些。更詳細的，可以製備成柔軟化妝水、營養化妝水、營養乳霜、按摩乳霜、精華素、眼霜、洗面霜、潔面泡沫、潔膚水、面膜、噴劑或者散粉的劑型。本發明的劑型是糊劑、乳霜或者凝膠時，作為擔體成分可以利用動物油、植物油、蠟、石蠟、澱粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、矽、皂土、二氧化矽、滑石粉或者氧化鋅
坐寸o
本發明的劑型是散粉或者噴劑時，作為擔體成分可以利用乳糖、滑石粉、二氧化矽、氫氧化鋁、矽酸鈣或者聚醯胺散粉，特別是噴劑時，可以額外包含如含氯氟烴、丙烷/ 丁烷或者二甲醚的推進劑。本發明的劑型是溶液或者乳濁液時，作為擔體成分利用溶劑、溶解化劑或者乳濁化劑，比如說存在水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇油、丙三醇脂肪族酯、聚乙二醇或者甘油酯的脂肪酸酯。本發明的劑型是懸浮液時，作為擔體成分可以利用如水、乙醇或者丙二醇的液相的稀釋劑、如乙氧基異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚乙二醇甘油酯的懸浮劑、微晶性纖維素、偏氫氧化鋁、皂土、瓊脂或者西黃蓍膠等。本發明的劑型是含表面活性劑的清潔 劑時，作為擔體成分可以利用脂肪族醇硫酸鹽、脂肪族醇醚硫酸鹽、磺基琥珀酸單酯、羥乙磺酸鹽、咪唑啉鹽衍生物、甲基牛磺酸鈉、肌氨酸、脂肪酸醯胺醚硫酸鹽、烷基醯胺甜菜鹼、脂肪族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇醯胺、植物性油、羊毛脂衍生體或者乙氧基化脂肪酸甘油酯等。包含在本發明的化妝品組合物的成分除了作為有效成分的肽類和擔體成分以外，包含通常利用在化妝品組合物的成分，例如能夠包含，如抗氧化劑、穩定劑、溶解化劑、維生素、顏料及香料的通常的輔助劑。歸納本發明的特徵及優點如下(i)本發明的WNTlO-來源肽起到與天然的WNTlO蛋白質相同或類似的作用。(ii)就本發明的肽而言，與天然的WNTlO蛋白質相比，其穩定性更加優秀，皮膚滲透度非常優秀。(iii)因此，包含本發明的肽的組合物不僅對改善脫髮(例如，促進生發或者生成毛髮)具有非常優秀的功效，也能夠對治療WNTlO信號傳遞-關聯疾病及DKK-I蛋白質-衍生疾病發揮卓越的功效。(iv)就上述的本發明的肽的優秀的活性及穩定性而言，能夠使其非常有利地適用於醫藥、醫藥外用品及化妝品。

圖I是表示藉助本發明的合成例製備的序列目錄第一序列肽的高性能液相色譜法分析結果圖。圖2a是表示處理藉助本發明的合成例製備的肽的角質細胞的細胞成長促進效果的圖表。圖2b是表示處理藉助本發明的合成例製備的肽的纖維芽細胞的細胞成長促進效果的圖表。圖3是表示用顯微鏡確認處理本發明的肽的角質細胞及纖維芽細胞的細胞成長促進效果的照片。圖4表示在處理本發明的肽時，ki-67細胞增殖蛋白質的表達量有所增加的免疫染色結果。圖5a表示與對根據本發明的合成例來製備的各肽進行單獨處理的情況相比較，對肽複合體進行處理時，角質細胞的成長得到更大促進的結果。
圖5b表示與對根據本發明的合成例來製備的各肽進行單獨處理的情況相比較，對肽複合體進行處理時，纖維芽細胞的成長得到更大促進的結果。圖6a表示測量基於本發明的肽的P -聯蛋白的表達變化的蛋白印跡結果，是表示被WNT抑制劑及脫髮基因的DKK-I所減少的P -聯蛋白的表達藉助本發明的肽處理而恢復，且再增加的蛋白質印跡結果。圖6b表示藉助本發明的肽，P -聯蛋白的活性增加的免疫染色結果。圖7表示與對根據本發明的合成例來製備的各肽進行單獨處理的情況相比較，對肽複合體進行處理時，P-聯蛋白的表達更加有所增加的蛋白質印跡結果。圖8表示藉助本發明的肽，^ -聯蛋 白的活性增加，與對根據本發明的合成例來製備的各肽進行單獨處理的情況相比較，對肽複合體進行處理時，^ -聯蛋白的活性更能增加的細胞免疫染色結果。圖9a是藉助本發明的肽的處理表示纖連蛋白的表達變化的圖表，隨著肽的處理時間，纖連蛋白的表達也有所增加。圖9b是測量基於本發明的肽的纖連蛋白的表達變化的結果，被WNT抑制劑及為脫髮基因的DKK-I減少的纖連蛋白的表達，藉助本發明的肽處理而恢復，且再增加。圖10表示與對根據本發明的合成例來製備的各肽進行單獨處理的情況相比較，對肽複合體進行處理時，纖連蛋白的表達更加增加的蛋白質印跡結果。圖11是表示對本發明的肽的列穩定性進行比較的圖表。圖12是表示處理本發明的肽的老鼠等皮膚的毛髮生長效果圖。圖13a是表示，白老鼠的毛髮卵泡培養中，不僅藉助本發明的肽複合體處理生成毛髮卵泡，被DKK-I蛋白質所退化的毛髮卵泡還由於同時處理肽複合體，從而毛髮卵泡不退化反而生成的結果。圖13b表示在白老鼠的毛髮卵泡培養中，基於本發明的肽複合體處理，在毛髮卵泡的￠-聯蛋白的表達有所增加的結果。圖13c表示在白老鼠的毛髮卵泡培養中，基於本發明的肽複合體處理，在毛髮卵泡中WNT蛋白質的表達增加的結果。圖13d表示在白老鼠的毛髮卵泡培養中，基於本發明的肽複合體處理，在毛髮卵泡中Ki-67蛋白質的表達增加的結果。
具體實施方式以下，將通過實施例對本發明進行更詳細的說明。這些實施例僅僅是為了更加具體說明本發明，根據本發明的要旨，本發明的範圍不局限於這些實施例，這對本發明所屬技術領域的普通技術人員來說是顯而易見的。實施例合成例I :Arg-Gln-Thr-Arg-Val-Gln-Arg-Cys-His-Cys (序列目錄第 I 序列)的合成將700mg 氯三苯甲基氯樹脂(Chloro trityl chloride resin ；CTLresin, Novabiochem Cat No. 01-64-0021)放入反應容器內，加入IOml 二氯甲烷(MC)攪拌3分鐘。除去溶液，放入IOml 二甲基甲醯胺(DMF)攪拌3分鐘後，再除去溶劑。在反應器中放入IOml的二氯甲燒溶液,放入200mmole的Fmoc-Cys (trt)-OH(巴亨公司，瑞士)及400mmole的二異丙基乙胺(DIEA)後攪拌且進行溶解，攪拌I個小時並進行反應。反應後清洗，在DCM(dichloromethane，二氯甲烷)溶解甲醇和DIEA(2 I)並反應10分鐘，用過量的DCM/DMF(1 I)清洗。除去溶液，放入IOml的二甲基甲醯胺攪拌3分鐘後，再除去溶劑。將IOml脫保護溶液(20%的哌啶(Piperidine)/DMF)放入反應容器內，在常溫下攪拌10分鐘後除去溶液。放入同量的脫保護溶液再維持10分鐘的反應後除去溶液，用DMF清洗兩次、用MC清洗一次、用DMF清洗一次，上述清洗分別進行3分鐘來製備Cys(trt)-CTL樹月旨。在新的反應器中放入IOml的DMF溶液,放入200mmole的Fmoc-His (trt)-OH(巴亨公司，瑞士)、200mmole 的 I-輕基苯並三唑(HoBt, NHydroxybenzotrizole)和 200mmole 的苯並三氮唑-I-基氧基三(二甲基氨基) 磷鎗六氟磷酸鹽(Bop)後通過攪拌進行溶解。將400mmole的DIEA分2次放入到反應器後，至少攪拌5分鐘，直到所有固體溶解。在經過脫保護的樹脂的反應容器中放入溶解的胺基酸混合溶液，在常溫下攪拌I小時並進行反應。除去反應液，用DMF溶液按每次5分鐘，進行3次攪拌後除去。取少量的反應樹脂，利用茚三酮測試(Nihydrin Test)來檢查反應程度。按照上述步驟，用脫保護溶液進行2次脫保護反應來製備His (trt) -Cys (trt) -CTL樹脂。用DMF和MC充分清洗後再執行一次茚三酮測試之後，按照上述步驟執行以下的胺基酸附著實驗。依據被選定的胺基酸序列，依次對Fmoc-Cys(trt)、Fmoc_Arg、Fmoc-Gln(trt)、Fmoc-Val、Fmoc_Arg、Fmoc-Thr、Fmoc-Gln(trt)及Fmoc-Arg(Pbf)進行連鎖反應。用脫保護溶液將Fmoc-保護基按每次10分鐘，進行2次反應後，充分清洗並除去。放入乙酸酐和DIEA及HoBt執行I小時的乙醯化後，將製備的肽基樹脂用DMF、MC和甲醇分別清洗三次，慢慢流出氮空氣來進行乾燥，然後在P2O5下用真空減壓，完全乾燥後，放入30ml的脫漏溶液[三氟乙酸(Trifluroacetic acid)95%、蒸懼水2. 5%、茴香硫醚(Thioanisole) 2. 5% ]後，在常溫下通過間歇性搖晃維持進行2小時反應。進行過濾來過濾樹脂，用少量的三氟乙酸(TFA)溶液清洗樹脂後與母液合併。利用減壓蒸餾成全部體積剩一半，加入50ml的涼的乙醇來誘導沉澱後，進行離心分離來聚集沉澱，再用更涼的乙醇清洗2次。除去母液，在氮下充分乾燥後，純化前合成0. 65g的NH2-Arg-Gln-Thr-Arg-Val-Gln-Arg-Cys-His-Cys-OH 肽 I (遷移數92. 6% )0 利用分子量檢測儀檢測的分子量為1287. I (理論值1286. 5)。合成例2:其他肽的合成利用與上述合成例I相同的方法合成序列目錄第2序列及第3序列的肽。上述的肽的序列如下序列目錄第 2 序列(Ac-Tyr-Lys-Ser-Lys-Lys-Gly-Gly-Trp-Thr-HisAc-YKSKKGGWTH)及序列目錄第 3 序列(Glu-Leu-Ile-Glu-His-接頭-Arg-Pro-Ala-Asp ELIEH-接頭-RPAD，接頭Gly-Gly-Gly)。(表 I)試驗例I:合成肽的細胞成長效果為了對在合成例I及合成例2中合成的序列肽的生長因子的類似功效及抑制功效進行分析，參照立蒂諾等方法(Rizzino, et al. Cancer Res. 48 :4266 (1988))來通過採用HaCaT角質細胞株(韓國細胞株銀行)和NIH3T3纖維芽細胞(韓國細胞株銀行)的SRB (硫酸鹽還原細菌，Sulforhodamine B,西格瑪公司)比色法來測量。將HaCaT角質細胞株及NIH3T3纖維芽細胞，分別利用250ml容量的組織培養用燒瓶，在包含10%牛胎血清(FBS, fetal bovine serum,西格瑪公司)的達爾伯克氏改良伊格爾培養基(DMEM, Dulbecco 』 s modified Eagle' s medium,翰步科公司(Gibco),美國)中進行培養。利用1%的胰蛋白酶溶液將培養的細 胞株從培養容器底面拿下來後，進行離心分離來僅聚集細胞沉澱物。在不包含胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中再將此懸浮後，按每孔3 X IO3的細胞放入到96-孔組織培養用平板，並在37°C、5%的CO2條件下培養24小時。24小時後，以完全除去血清的相同的培養液替換培養基之後，在用於確定標準的10%的DMSO(二甲基亞碸，dimethy sulfoxide)中，按上述條件,對溶解成滅菌狀態的供試料、合成肽(lng/ml、10ng/ml、100ng/ml、l ii g/ml 及 10 ii g/ml)及肽複合體(I U g/ml)進行 72小時培養。結束培養後，除去培養上層液，並利用乙醇將細胞固定化，然後結束細胞固定後，用PSB(磷酸鹽緩衝液,phosphate buffer saline)清洗3次。除去清洗溶液後,用青瓷綠SRB溶液進行處理，並用1%乙酸(acetic acid)充分清洗後，用顯微鏡觀察細胞來觀察生存細胞的狀態，且在590nm紫外線中測量吸光度來測量細胞的生存狀態。並且，按上述方法培養後，將組織使用ki-67抗體(聖克魯茲公司，美國)來執行免疫染色化學法，來觀察作為細胞增殖標誌的ki-67蛋白質的表達量。圖2顯示本發明的肽處理很大程度地增加了角質細胞(圖2a)及纖維芽細胞(圖2b)的成長。圖3表示在細胞進行肽處理後，72小時後用顯微鏡觀察細胞的形狀變化的結果。顯示出本發明的肽使角質細胞及纖維芽細胞的成長及形態學上的模樣產生變化。圖3表示本發明的肽使角質細胞及纖維芽細胞的成長及形態學上的模樣產生變化。圖4表示本發明的肽使角質細胞中細胞增殖標誌(ki-67蛋白質)的表達增加的結果。圖5是對肽處理後的角質細胞(圖5a)及纖維芽細胞(圖5b)的成長的結果。由圖5a和圖5b可以看出，與僅處理各肽的情況相比較能夠確認出，處理本發明的肽複合體的情況下，角質細胞和纖維芽細胞的成長具有很大的增加。試驗例2:分析合成肽的P -聯蛋白表達量增加效果在進行48小時培養的HaCaT細胞上處理在合成例I中所合成的肽且經過5小時後，用WNT蛋白質的代表性的信號測量作為對生發促進所必需的信號物質的P -聯蛋白的表達度。利用￠-聯蛋白的抗體(聖克魯茲公司，美國)通過蛋白質印跡觀察表達量，利用相同的抗體，利用免疫染色化學法觀察￠-聯蛋白是否向核內傳遞。確認了處理本發明的肽時￠-聯蛋白的表達隨之增加，確認了即使存在DKK-I的WNT抑制劑及￠-聯蛋白信號抑制劑，在處理肽時仍出現P -聯蛋白的活性(圖6a)。並且，可以確認在肽在HaCaT細胞上利用免疫染色化學法來測量是否傳遞至￠-聯蛋白的核內時，￠-聯蛋白也被肽從細胞質傳遞至核內，仍然存在於細胞質中從而具有活性(圖6b)。圖6a顯示在處理本發明的肽時β -聯蛋白的表達有所增加，顯示在與DKK-I基因同時處理時聯蛋白的表達也再有所增加。圖6b是藉助本發明的肽，用免疫染色化學法觀察β_聯蛋白的核內傳遞過程的結果，顯示β_聯蛋白傳遞至核內。由圖7及圖8中可以看出，與僅處理各肽的情況相比較，可以確認到在處理本發明的肽複合體的情況下β-聯蛋白的表達更加有所增加。綜合試驗例I及試驗例2的實驗結果，可 以知道本發明的肽發揮非常優秀的促進生發及抑制脫髮的作用，在抗老化方面也發揮作用。試驗例3:基於合成肽的纖連蛋白表達量增加纖連蛋白是在合成例I中所合成的肽的WNT的目標蛋白質，為了觀察是否使纖連蛋白的表達量增加的結果，將纖維芽細胞放入6孔組織培養用平板，每孔放入4Χ IO3個細胞，在37°C、5%的CO2條件下培養24小時。24小時後，以完全除去血清的相同的培養液替換培養基後，在用於確定標準的10%的DMSO中，以I μ g/ml的濃度處理溶解成滅菌狀態的供試料、合成肽及肽複合體後，按上述條件，進行3小時、10小時、24小時或者48小時的培養。培養72小時後，回收培養溶液，利用纖連蛋白ELISA kit (酶聯免疫檢測試劑盒-enzymelinked immunosorbent assay kit)(安迪生物科技有限公司，美國)來測量培養液中纖連蛋白的表達量。如圖9a所示，可以確定纖連蛋白的表達量隨著肽的處理時間而增加。並且，處理DKK-I蛋白質來按上述培養條件培養後觀察纖連蛋白的表達量時，如圖9b所示，能夠看出被DKK-I抑制的纖連蛋白表達在同時處理肽和DKK-I時纖連蛋白的表達量重新恢復並且增加。圖9a是在纖維芽細胞按時間類別處理本發明的肽來測量纖連蛋白的表達的結果，隨著本發明的肽的處理時間纖連蛋白的表達增加。圖9b表示本發明的肽恢復在纖維芽細胞中被WNT抑制劑及脫髮基因(DKK-I)所誘導的纖連蛋白的減少的效果的結果。在與圖9a相同的培養條件下被DKK-I所減少的纖連蛋白的表達量藉助本發明的肽處理而恢復。由圖10可以確認，與對照組相比較，對各肽進行72小時處理時，纖連蛋白的表達量增加；將各肽處理成複合體時，能夠觀察到最多的纖連蛋白的表達量。這種結果意味著，即使存在作為DKK-I的WNT抑制劑及脫髮基因，藉助本發明的肽啟動WNT-β -聯蛋白信號路徑，從而貢獻於促進生發、抑制脫髮以及抗老化。試驗例4:製備的肽的列穩定性將根據合成例I所製備的肽和在英國國家生物製品檢定所(英國)購買的標準品生長因子(WNTlO)製備成O. lmg/ml濃度的磷酸緩衝液。將準備好的溶液按Iml放入玻璃瓶後在37°C中定置。將定置在37°C中的溶液在第0、5、10、20、30、40以及70日取樣，並按日期進行離心分離，除去變性的肽或蛋白質，並取上層液，利用HPLC(高效液相色譜法)來進行定量(圖11)。試驗例5:處理所製備的肽的小老鼠的毛髮生長效果將通過合成例I而製備的肽進行納米微脂囊化，並在後背皮膚去毛的C57BL/6小老鼠上按每天兩次，塗敷15日。給對照組按每天兩次塗敷磷酸緩衝溶液。在塗敷到第9日時，能夠確認到小老鼠的後背皮膚長出黑色，在塗敷到第15日時，能夠確認到相比對照組長出更多量的毛(圖12)。試驗例6:觀察通過毛髮卵泡培養的在所製備的肽複合體的毛髮卵泡中的蛋白質
表達量用手術用刀切開balb/C小老鼠的毛髮卵泡，用乙醇清洗後額外用PBS和DMEM培養溶液進行清洗。在如此結束清洗的毛髮卵泡以5 μ g/ml的濃度處理在DMEM培養溶液製備的各肽複合體後，在37°C、5%的CO2條件下培養5天 。5天後將培養結束的毛髮卵泡製備成石臘塊，通過伊紅染色法(H&E,hematoxylin-eosin staining)對與對照組處理肽複合體的組織、DKK-1、與DKK-I處理肽複合體的組織分別進行比較(圖13a-13d)。圖13a表示藉助本發明的肽複合體，抑制DKK-I-衍生的毛髮卵泡細胞的退化的結果。如果在對照組處理DKK-1，則毛髮卵泡退化，相反，在同時處理DKK-I和本發明的肽複合體處，可以確認到毛髮卵泡沒有退化，反而生成。圖13b表示藉助本發明的肽複合體能夠恢復DKK-I-衍生的聯蛋白的表達抑制的結果。如果對對照組處理DKK-UU 聯蛋白的表達被抑制，此時可以確認到，如果同時處理DKK-I和本發明的肽複合體，則聯蛋白的表達不會被抑制，反而會急劇增加。由圖13c可以確認，對對照組處理DKK-I後，在毛髮卵泡中WNT的表達受到抑制。但是，在同時處理DKK-I和本發明的肽複合體的毛髮卵泡中WNT的表達有所增加。這意味著本發明的肽複合體與在毛髮周圍的細胞生長一起促進毛髮卵泡的生成。由圖13d可以確認，對對照組處理DKK-I後在毛髮卵泡中ki-67的表達受到抑制。但是，在同時處理DKK-I和本發明的肽複合體的毛髮卵泡中ki-67的表達有所增加。這種結果意味著，在毛髮卵泡的部分中細胞不會藉助DKK-I而成長，反而細胞會死掉並引發毛髮卵泡的退化，這能夠藉助本發明的肽複合體的處理而克服。並且，顯示本發明的肽複合體能夠促進毛髮卵泡的增殖及生成。實施例I:製備納米化肽分別正確地稱量50mg在上述合成例中得到的肽後，用500ml蒸餾水充分攪拌並進行溶解。將配合體溶液與5g卵磷脂、O. 3ml油酸鈉(sodium oleate)、50ml乙醇,還有若干的乳相一起混合後，用蒸餾水對準成總量為IL後，用微流化器利用高壓來進行乳化，製備大小為IOOnm左右的納米微脂囊。所製備的納米微脂囊以最終濃度為約50ppm單獨或者複合地使用為化妝品原料。劑型例I:柔軟化妝水按照一般的化妝水製備方法製備包含在上述實施例中製備的肽納米微脂囊，且由下述組成所構成的柔軟化妝水。(表2)
權利要求
1.ー種肽，其特徵在於，具有序列目錄第一序列的胺基酸序列。
2.根據權利要求I所述的肽，其特徵在於，上述肽來源於人類WNT10。
3.根據權利要求I所述的肽，其特徵在於，上述肽具有角質細胞及纖維芽細胞的成長促進能力。
4.根據權利要求I所述的肽，其特徵在於，上述肽促進纖連蛋白的表達。
5.根據權利要求I所述的肽，其特徵在於，上述肽將β_聯蛋白傳遞至核內。
6.一種脫髮治療或改善用組合物，其特徵在幹，作為有效成分包含上述權利要求I至5中的任ー項的肽。
7.根據權利要求6所述的組合物，其特徵在幹，上述組合物追加包含具有序列目錄第2序列的胺基酸序列的肽、具有序列目錄第3序列的胺基酸序列的肽或者上述所有肽。
8.根據權利要求6所述的組合物，其特徵在於，上述脫髮治療或者改善用於促進生發或者生成毛髮。
9.ー種皮膚狀況改善用組合物，其特徵在於，作為有效成分包含上述權利要求I至5中的任ー項的肽。
10.根據權利要求9所述的組合物，其特徵在於，上述組合物追加包含具有序列目錄第2序列的胺基酸序列的肽、具有序列目錄第3序列的胺基酸序列的肽或者上述所有肽。
11.根據權利要求9所述的組合物，其特徵在於，上述改善皮膚狀況的組合物用於改善皺紋、改善皮膚彈力、防止皮膚老化、改善皮膚保溼、消除疤痕或者皮膚再生。
12.—種WNTlO信號傳遞-關聯疾病改善或者治療用組合物，其特徵在於，作為有效成分包含上述權利要求I至5中的任ー項的肽。
13.根據權利要求12所述的組合物，其特徵在於，上述組合物追加包含具有序列目錄第2序列的胺基酸序列的肽、具有序列目錄第3序列的胺基酸序列的肽或者上述所有肽。
14.根據權利要求12所述的組合物，其特徵在幹，上述WNTlO信號傳遞-關聯疾病是骨疾病或者腫瘤疾病。
15.根據權利要求14所述的組合物，其特徵在於，上述骨疾病選自包含骨疾病、骨折、老年性骨損傷、軟骨營養障礙、高鈣血症、骨質增生症、骨脆症、骨軟化症、骨髄炎、骨質疏鬆症、變形性骨炎、骨關節炎及佝僂病的組中。
16.ー種DKK-I蛋白質-衍生疾病治療用組合物，其特徵在於，作為有效成分包含上述權利要求I至5中的任ー項的肽。
17.根據權利要求16所述的組合物，其特徵在於，上述組合物追加包含具有序列目錄第2序列的胺基酸序列的肽、具有序列目錄第3序列的胺基酸序列的肽或者上述所有肽。
18.根據權利要求16所述的組合物，其特徵在於，上述DKK-I蛋白質-衍生疾病是糖尿病或者肌肉復原及再生。
19.根據權利要求18所述的組合物，其特徵在於，上述糖尿病與耐胰島素性及低胰島素血症的治療有關聯。
全文摘要
本發明涉及一種WNT10-來源肽及一種包含該肽的改善脫髮及改善皮膚的組合物以及Wnt-10信號傳遞-關聯疾病及DKK-1蛋白質-衍生疾病治療用組合物。本發明的WNT10-來源肽起到與天然的WNT10蛋白質相同或者類似的作用，與天然的WNT10蛋白質相比，具有非常優秀的穩定性，而且皮膚滲透度也非常優秀。因此，包含本發明的肽的組合物不僅對改善脫髮(例如，促進生發或者生成毛髮)具有非常優秀的功效，而且還能夠對治療WNT10信號傳遞-關聯疾病及DKK-1蛋白質-衍生疾病發揮卓越的功效。並且，本發明的肽的優秀的活性及穩定性能夠非常有利地應用在醫藥、醫藥外用品及化妝品上。
文檔編號A61Q9/04GK102712685SQ200980161923
公開日2012年10月3日 申請日期2009年11月24日 優先權日2009年9月1日
發明者宋尚洙, 曹囧美, 鄭鎔池, 金銀美 申請人:凱爾格恩有限公司