從含有戊糖的底物製備乳酸的製作方法

2023-12-10 10:15:47

專利名稱：從含有戊糖的底物製備乳酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及從含有戊糖，特別是含有木糖的底物生產乳酸。
背景技術：
乳酸及其稱為乳酸鹽的鹽，是可購得產品，用於各種領域中，包括醫藥、生物可降解聚合物和食品加工。通常，從葡萄糖、澱粉、液化澱粉或蔗糖商業生產乳酸。目前，這些底物是乳酸生產成本價格的重要組成部分。木質纖維生物質提供了作為乳酸生物生產底物的具有價格吸引力的可替換物，因為其容易獲得，沒有競爭食品價值，且沒有澱粉或蔗糖貴。理論上，微生物能夠將生物質中含有的糖發酵成乳酸。然而，數種障礙幹擾了微生物有效利用這種原料來生產乳酸。木質纖維底物主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。雖然數種微生物可以有效地發酵纖維素中的葡萄糖組分，已經證實轉化生物質的半纖維素部分中含有的戊糖更難。半纖維素中含量最多的戊糖包括D-木糖和L-阿拉伯糖。木糖和阿拉伯糖的發酵仍然是植物來源生物質經濟轉化的主要障礙。
許多異質乳酸和兼性異質乳酸細菌能發酵戊糖。這些生物體發酵這些糖所用的代謝途徑是簡單的戊糖，如D-木糖(醛糖)進入細胞，在那裡其異構成木酮糖(酮糖)，並隨後消耗1個ATP來磷酸化生成木酮糖-5-磷酸鹽，然後通過磷酸酮酶(EC4.1.2.9)裂解成甘油醛-3-磷酸鹽和乙醯-磷酸鹽。該代謝途徑稱為磷酸酮酶途徑(Lengeler，J.W.；G.Drews；H.G.Schlegel，Biology of prokaryotes(原核生物學)，1999，Thieme Verlag，Stuttgart，德國)。磷酸酮酶反應中產生的甘油醛-3-磷酸鹽在Emden-Meyerhof途徑中轉化成丙酮酸並產生2ATP和1NADH2(Lengeler，J.W.；G.Drews；H.G.Schlegel，Biology of prokaryotes(原核生物學)，1999，Thieme Verlag，Stuttgart，德國)。最終丙酮酸通過NADH2還原成乳酸。磷酸酮酶反應中產生的乙醯-磷酸鹽通過乙酸激酶(EC2.7.2.1)轉化成乙酸鹽並產生1ATP。在戊糖發酵過程中，形成和消耗1NADH2；每摩爾戊糖淨產生2個ATP。混合乳酸發酵細菌利用相似途徑來發酵己糖。己糖，如葡萄糖首先磷酸化成葡萄糖-6-磷酸鹽，氧化生成6-磷酸葡萄糖酸鹽，且最終氧化脫羧生成核酮糖-5-磷酸鹽和二氧化碳。核酮糖-5-磷酸鹽的差向異構作用生成木酮糖-5-磷酸鹽，其進入磷酸酮酶途徑。和戊糖發酵相反，混合發酵乳酸細菌的己糖發酵產生過量的還原力(3NADH2)，其用於將乙醯-磷酸鹽還原成乙醇和將丙酮酸還原成乳酸。在該途徑中沒有從乙醯-磷酸鹽生成乙酸，因此己糖發酵產生的ATP是戊糖發酵產生的一半；每發酵一摩爾己糖產生1ATP。上述戊糖發酵的代謝途徑中，磷酸酮酶起著決定性的作用，因為該酶將戊糖的C5骨架分裂成C3部分，後者最終轉化成乳酸和C2部分，C2最終成為乙酸。對於乳酸的生產，可以理解為將其調整為有利於最大乳酸鹽生產，乙酸的發酵是不經濟的。然而，少量報導表明一些乳桿菌屬(Lactobacillus)種，如乳桿菌種MONT4幾乎專門發酵特定的戊糖而生成乳酸(BarreP.，Identification of thermobacteria and homofermentative，thermophilic pentose utilizing Lactobacillus from hightemperature fermenting grape must(來自高溫發酵葡萄汁的熱細菌和同型發酵、利用戊糖的嗜熱乳桿菌的鑑定)，J.Appl.Bacteriol.1978，44，125-129)。乳桿菌種MONT4中，戊糖不通過涉及磷酸酮酶的途徑異化，而是通過涉及轉醛醇酶(EC 2.2.1.2)和轉酮醇酶(EC 2.2.1.1)的代謝途徑(US 5,798,237)。該途徑稱為轉醛醇酶/轉酮醇途徑。
然而，該途徑要由戊糖得到較高的乳酸鹽產量需由生物體的價值而獲得。雖然磷酸酮酶途徑的ATP產量是每摩爾戊糖2個，而轉醛醇酶/轉酮醇酶途徑是每3摩爾戊糖5ATP。這較低的ATP產量是為什麼戊糖發酵純乳酸模式的乳酸細菌相對少的原因之一。從工業觀點看，在此相關的是乳桿菌種MONT4不能發酵木糖。目前，用來自戊糖乳細菌(Lactobacillus pentosus)的木糖異構酶和木酮糖激酶基因遺傳改造乳桿菌種MONT4來給予該生物體發酵木糖的能力。這描述於US5,798,237。
儘管微生物，如乳桿菌種是乳酸的生產者，特定的特性使這些生物體較不適於乳酸的工業化生產乳桿菌種需要發酵培養基中有相當量的有機氮，以及生長促進物質，這使得培養基變得更貴，且當使用簡單發酵培養基時純化乳酸更難。此外，許多乳桿菌種，包括乳桿菌種MONT4，產生的乳酸光學異構純度低(參見Barre P.，Identificationof thermobacteria and homofermentative，thermophilic pentoseutilizing Lactobacillus from high temperature fermenting grapemust(來自高溫發酵葡萄汁的熱細菌和同型發酵、利用戊糖的嗜熱乳桿菌的鑑定)，J.Appl.Bacteriol.1978，44，125-129)。本發明目的之一是提供無這些缺陷的方法。
現在我們發現一些天然的中度嗜熱芽孢桿菌屬(Bacillus)菌種能夠厭氧地發酵戊糖，尤其是木糖，主要生成對映體純的乳酸和/或乳酸鹽。所述戊糖的轉化實際上只產生C3化合物，即，所述轉化通過同型發酵途徑進行，該C3化合物可以轉化成乳酸和/或乳酸鹽。中度嗜熱芽孢桿菌種是能夠在30-65℃生長的細菌菌株。進一步的價值是所述發酵是厭氧進行的。在厭氧發酵的情況中，可以容易地以工業規模進行該過程，因為不需要氧供給，例如通過大規模的攪拌設備。在此的實例是凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)和史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)及其遺傳修飾的乳酸生產種。這些類型的微生物的營養需求比乳桿菌低。這些類型的微生物另外的優勢是較高的生長溫度(乳桿菌種生長溫度至多為50℃)使其更容易避免工業規模發酵系統的侵染。因此，本發明涉及製備乳酸的方法，其中通過厭氧發酵的中度嗜熱芽孢桿菌種純乳酸發酵含有戊糖的底物。
根據發酵生成乳酸和/或乳酸鹽的底物的成本和供給來選擇底物。通常低價供給的戊糖來自半纖維素。通過用蒸汽和/或酸或鹼處理從半纖維素原料中釋放出木糖、阿拉伯糖和其它戊糖。該處理過程中也分離出較小量的其它糖，如葡萄糖，也通過中度嗜熱芽孢桿菌發酵生成乳酸和/或乳酸鹽。
木質纖維底物包括纖維素、半纖維素和木質素。通過蒸汽和/或弱酸或鹼處理可以使這些類型的底物可水解。當底物包括纖維素原料時，纖維素可以同時或分開水解成糖，並發酵成乳酸。通常由於半纖維素比纖維素更易於水解成糖，優選首先預水解半纖維素原料，分離出可溶性戊糖，然後水解纖維素。水解可以是酶促進行的(纖維素酶用於纖維素，而半纖維素酶用於半纖維素)或通過酸處理化學進行。使用中度嗜熱芽孢桿菌可以將戊糖和己糖兩者同時或分別發酵成乳酸和/或乳酸鹽。如果期望這樣，可以通過不同的微生物將己糖發酵成乳酸和/或乳酸鹽，即在混合培養物中使用如酵母、真菌或其它已知乳酸生產生細菌，如乳桿菌種和不同於戊糖發酵所用菌的芽孢桿菌種。
形成乳酸和/或乳酸鹽的發酵條件本身是已知的，描述於WO01/27064，WO99/19290，和WO98/15517中。因此，溫度為0至80℃，而pH(隨著乳酸形成而降低)為3至8。通常pH低於5是理想的，隨著乳酸部分形成，然後以其游離酸形式替代鹽形式而存在。而且，在低pH時受到其它微生物汙染的危險較小。許多已知類型設備中的任一種都可以用於根據本發明的發酵中。
可以以生物純培養物使用根據本發明的微生物或於混合培養物中與其它乳酸生產微生物一起使用。通常生物純培養物更易於優化，但是混合培養物能夠利用另外的底物。也可以將酶加入發酵容器中來幫助底物降解或提高乳酸生產。例如，可以加入纖維素酶將纖維素降解成葡萄糖，同時通過微生物發酵葡萄糖生成乳酸。同樣，可以加入半纖維素酶來降解半纖維素。如上所述，還可以在發酵前進行所述的水解(任選地通過酶)。
含有中度嗜熱芽孢桿菌的發酵培養液培養物對其它微生物汙染是相對抗性的。儘管如此，優選消除加入中度嗜熱桿菌的底物中先前存在的有害微生物或使其喪失能力。這可以通過常規技術如過濾、巴氏殺菌和滅菌來完成。
用於根據本發明方法中的中度嗜熱桿菌在所謂化學限定的培養基中和含有不確定化合物，如酵母提取物、蛋白腖、胰蛋白腖、其它肉提取物和複合氮源的培養基中都能生長。優選使用化學限定的培養基，因為其生成較少雜質的乳酸和/或乳酸鹽。
發酵後，通過從水溶液中分離乳酸和/或乳酸鹽的許多已知常規技術中的任一種從發酵培養液中分離出乳酸和/或乳酸鹽。可以在分離前除去底物或微生物(生物質)顆粒來提高分離效率。可以通過離心、過濾、絮凝、浮選或膜濾來進行所述的分離。例如可以從WO01/38283獲知，其中描述了通過發酵製備乳酸的連續方法。而該說明書中公開的方法涉及批量生產，全部或部分過程可以連續進行。為了在發酵罐中保留微生物，可以從發酵流體中分離固體顆粒。或者，可以固定化微生物將其保留在發酵罐中或提供更容易的分離。
從發酵培養液中分離乳酸和/或乳酸鹽後，可以將產品接受一個或多個純化步驟，如提取、蒸餾、結晶、過濾、用活性炭等等處理。任選地在處理後，可以將各種殘餘物流循環至發酵容器或之前進行的任何純化步驟中。
通過以下非限制性實施例進一步說明本發明。
實施例1通過中度嗜熱芽孢桿菌從戊糖生成乳酸材料和方法培養基用於史氏芽孢桿菌DSM 459和460(從德國培養物保藏中心獲得DSM 菌株)生長的酵母提取物培養基每升含有3.5g DAS(聯胺硫酸鹽)，2g DAP(聯胺磷酸鹽)，10g酵母提取物並用10g BIS-TRIS(二[2-羥甲基]亞氨基三[羥甲基]甲烷)緩衝。在使用前將培養基高壓滅菌。以終濃度為3％的D-核糖、D-木糖、D-阿拉伯糖或葡萄糖用作碳源。將碳源過濾滅菌並分開加入。用HCl調培養基pH至6.6-6.7。所述用於史氏芽孢桿菌的酵母提取物培養基可以用於凝結芽孢桿菌DSM2314的生長，然而含有1g/l而非10g/l的酵母提取物。
用於史氏芽孢桿菌DSM2319和凝結芽孢桿菌DSM2314生長的最小培養基每升含有2gDAP，3.5gDAS，10gBIS-TRIS，0.5gKCl和15mgMgCl2。用HCl將培養基的pH調節至6.8。在使用前將培養基高壓滅菌。終濃度為3％的D-核糖、D-木糖、D-阿拉伯糖或葡萄糖用作碳源。將碳源、生長因子和微量元素過濾滅菌並分開加入。終濃度為0.024mg/L生物素，0.012mg/L硫胺素，0.02g/L蛋氨酸，0.05g/L酵母提取物，100μl微量元素，1g/1CaCl2。每100ml微量元素含有0.36gFeCl3，0.3g MnCl2，0.24g CoCl2，0.12g ZnCl2。
乳酸生產的生長條件將來自-80℃甘油儲液的所有細菌在使用葡萄糖(5％w/w)作為碳源的含有10g/l脫乙醯吉蘭糖膠(gelrite)(吉蘭糖膠，Sigma)的酵母提取物培養基上平板培養。平板在厭氧罐中46℃培養24-48小時。此後，將厭氧培養物接種於無菌10ml管中葡萄糖作為碳源(3％w/w)的酵母提取物培養基上。培養物在54℃培養24小時。此後將2％培養物轉移至含有以葡萄糖、木糖、核糖或阿拉伯糖作為碳源的最小培養基的管中。在54℃將管孵育48小時。第二次轉移(2％)至新鮮培養基並在54℃培養48小時後，取樣檢測生物量、pH和有機酸產量。為了測定生物質產量，在分光光度計610nm處相對於軟化水測量光密度。作為(乳)酸產量的指標，測量細胞培養液的pH。此後通過離心(10分鐘，8000rmp)收集細胞，上清液通過0.45μm濾器過濾並保存於4℃用於進一步分析。
有機酸、乙醇和糖的分析使用衍生和GLC測量有機酸(乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸)和乙醇。
通過GLC測量乳酸的光學純度。將D-和L-乳酸鹽甲基化成甲基乳酸鹽並通過手性柱上的頂空分析來測量。
用包括Carbopac PA-1柱和PAD(脈衝安培檢測型ED40)檢測儀的Dionex型DX500來分析戊糖，使用1.0ml/分鐘的流量。
結果史氏芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌在含有3％(w/w)阿拉伯糖、核糖或木糖的酵母提取物和最小培養基上54℃厭氧生長(表1，表2)。所有菌株進行戊糖純乳酸發酵，主要生產L-乳酸。沒有發現可檢測含量的乙酸。產生的L-乳酸的光學純度為96.7-99.7％。所有情況中其它有機酸(甲酸、琥珀酸)和乙醇都低於可檢測含量0.05％w/w。殘餘糖的分析顯示了木糖、核糖和阿拉伯糖濃度根據所用碳源的降低(數據未顯示)。
表1嗜熱芽孢桿菌轉移兩次後在酵母提取物培養基上54℃從戊糖獲得的酸產量
1.可檢出含量為0.05％。
2.未檢測到。
表2嗜熱芽孢桿菌轉移兩次後在最小培養基上54℃從戊糖獲得的酸產量。葡萄糖用作對照。
1.可檢出含量為0.05％。
2.未檢測到。
實施例2凝結芽孢桿菌DSM 2314的木糖純乳酸發酵材料和方法菌株、培養基和發酵條件所用微生物為凝結芽孢桿菌DSM2314。菌株保存於-80℃甘油儲液中。生物反應器(3L Applikon)含有1.51具有以下組成的培養基2g/l DAP，3.5g/l DAS，10g/l BIS-TRIS和0.5g/l KCl。
將含有培養基的生物反應器在121℃(1.2巴)高壓滅菌20-30分鐘。將維生素和微量元素溶液過濾滅菌並在滅菌後分別加入生物反應器中。生長因子的終濃度為20mg/l DL-蛋氨酸，24mg/l生物素，12mg/l硫胺素，15mg/l MgCl2·2H2O，0.1g/l CaCl2和1.5ml微量元素。微量元素每100ml含有0.36g FeCl3，0.3g MnCl2，0.24g CoCl2，和0.12gZnCl2。在滅菌後將D-木糖分開加入至50g/l的終濃度。用濃HCl溶液將培養基的pH調節至6.5。在發酵過程中，且由於發酵50小時後達到低生物量濃度，將酵母提取物加入至10g/l的終濃度。
接種物(～110ml)在含有1％D-木糖的發酵培養基中50℃生長過夜。在木糖培養基中兩次轉移後使用該接種物。
用自動添加20％(w/v)KOH溶液來維持pH。在54℃，pH6.4和250-300rmp攪拌速度下進行發酵。用水浴Lauda E100進行溫度的控制，而通過ADI 1020生物處理器進行pH讀數/對照數據。通過在線數據採集FM V5.0處理所有的數據(pH和鹼消耗)。
在接種之前和之後取樣。在發酵過程中定時取樣5-30ml用於0D測定、細胞乾重(CDW)測定和L(+)和D(-)乳酸、木糖和可能副產品(乙酸鹽)的分析。將樣品離心(4-6℃，6000-12000rmp 5-10分鐘)並於-21℃回收/保存上清直至進一步分析。
生物質產量的測定通過原始稱重的0.45μm微孔濾器獲得乾物質。過濾15至20ml樣品，用10ml軟化水洗滌並在105℃乾燥1-2天。濾器終重量可以測量g/l的幹細胞(CDM)。
糖、有機酸和乙醇的分析使用Ferric-orcinol方法通過比色試驗測定樣品的殘餘木糖濃度，方法描述於Chaplin，M.F.，Kennedy，J.F.(1987).Carbohydrateanalysisa practical approach.IRL Press Limited(ISBN0-947946-68-3)。
(1)用包括Carbopac PA-1柱和PAD(脈衝測電流檢測型ED40)的檢測儀Dionex型DX500來分析顯示於表3的木糖濃度，使用1.0ml/分鐘的流量。
通過酶方法進行樣品的L(+)乳酸鹽分析，酶方法是使用葡萄糖氧化酶定量葡萄糖的Boehringer’s GOD-PAP方法的修改方案。L(+)乳酸氧化酶將L(+)乳酸轉化成丙酮酸鹽和過氧化氫。過氧化氫在過氧化物酶存在下與4-氨基非那宗和苯酚反應生成水溶性的紅色產品，可以在分光光度計540nm下測量。
顯示於表3的有機酸(乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸)和乙醇使用衍生和GLC測量。通過GLC測定乳酸的光學純度。將D-和L-乳酸鹽甲基化至甲基乳酸鹽並通過手性柱上的頂空分析來測定。
結果菌株凝結芽孢桿菌DSM2314在3升發酵罐中於54℃生長於50g/l木糖的最小培養基中(

圖1)。發酵過程中，由於發酵50小時後達到低生物量濃度，將酵母提取物加入至終濃度10g/l。約105小時後耗盡了培養基中的木糖，並主要轉化成乳酸(35g/l)和僅有低濃度的乙酸(1g/l)(表3)。產生的乳酸光學純度為99％。其它有機酸的產量都低於可檢測含量。
結果表明了凝結芽孢桿菌對戊糖進行純乳酸發酵的能力。非最優木糖發酵中凝結芽孢桿菌的最大乳酸產率為1.7g/l/h，如通過在線數據採集軟體所觀察的。
表3凝結芽孢桿菌DSM 2314從50g/l木糖獲得的有機酸產量
可檢測含量為0.5g/l。
權利要求
1.生產乳酸和/或乳酸鹽的方法，其中通過厭氧發酵的中度嗜熱芽孢桿菌純乳酸發酵含有戊糖的底物。
2.根據權利要求1的方法，其中含有戊糖的底物包含木糖。
3.根據權利要求1或2的方法，其中中度嗜熱芽孢桿菌選自凝結芽孢桿菌和/或史氏芽孢桿菌。
4.根據在前任一權利要求的方法，其中含有戊糖的底物包含阿拉伯糖。
5.根據在前任一權利要求的方法，其中底物包含葡萄糖。
6.根據在前任一權利要求的方法，其中通過中度嗜熱桿菌和另一乳酸生產微生物的混合物進行發酵。
7.根據在前任一權利要求的方法，其中從發酵培養液中分離出生成的乳酸和/或乳酸鹽。
8.根據在前任一權利要求的方法，其中中度嗜熱桿菌生長於化學成分確定的培養基中。
9.根據權利要求8的方法，其中在從中分離乳酸和/或乳酸鹽之前，從發酵培養液中除去生物質。
10.根據權利要求8-9任一項的方法，其中將生成的乳酸和/或乳酸鹽從發酵培養液中分離出來後接受一個或多個純化步驟。
全文摘要
本發明涉及從含有戊糖，尤其是含有木糖的底物生產乳酸和/或乳酸鹽的方法。通常，乳酸是從葡萄糖、澱粉、液化澱粉或蔗糖商業生產的。目前，這些底物是乳酸生長成本價格的重要組成部分。木質素生物質提供了具有價格吸引力的替代物用作乳酸生物生產的底物，因為其容易獲得，沒有競爭食品價值，且沒有澱粉或蔗糖貴。我們已經發現中度嗜熱桿菌種能夠將戊糖，尤其是木糖發酵成對映體純的乳酸和/或乳酸鹽。所述的戊糖轉化實際上只生成C
文檔編號C12R1/07GK1735692SQ200480002160
公開日2006年2月15日 申請日期2004年1月12日 優先權日2003年1月13日
發明者R·奧託 申請人:普拉克生化公司