檢測單個細胞中的核酸和鑑定異質大細胞群中罕見細胞的方法

2023-06-04 21:45:56 2

專利名稱：檢測單個細胞中的核酸和鑑定異質大細胞群中罕見細胞的方法
技術領域：
本發明總體涉及核酸化學和生物化學試驗。更具體說，本發明涉及原位檢 測單個細胞中核酸分析物的方法。本發明還涉及檢測和鑑定單個細胞，特別是 罕見細胞。
背景技術：
大量證據證明癌細胞可脫離原發腫瘤部位經循環進入淋巴結、骨髓、外周 血液或其它體液。已證明這種循環性腫瘤細胞(CTC)可反映原發腫瘤的生物 學特性，包括腫瘤轉移和復發能力。因此檢測到CTC極可能表明疾病復發、腫 瘤細胞播散和遠處轉移。所有這些都是鑑定高危癌症病人疾病狀態的重要臨床 信息因素(如Vogel等，2002; Gilbey等,2004; Molnar等,2003; Vlems等,2003; Ma 等,2003)。
臨床上可用CTC檢測結果作為預後指標的驗證，但進展不如預計的那樣 快，主要是由於缺乏合適的檢測技術。檢測外周血或其它體液中CTC的一個關 鍵性難題是循環中存在的CTC濃度極低，估計其範圍是106— 107個正常白細 胞中只有一個腫瘤細胞。因此，此種應用性檢測技術必須具有優越的靈敏度和 特異性，假陰性和假陽性率應限制在可接受水平。
現有的一種方法採用免疫磁珠分離技術來檢測CTC完整細胞 (US6,365，362; US6，645，731)。採用此技術時，將癌症病人的血樣與包被了抗上
15皮細胞表面抗原如EpCAM的抗體磁珠一起培育(Cristofanilli等，2004)，然 後用電磁分離器分離磁珠標記的細胞。下遊分析時進一步加工免疫磁珠富集的 細胞組分來鑑定CTC。採用此技術，在一項前瞻性研究中顯示，轉移性乳腺癌 病人治療後的CTC數可獨立預測疾病無發展的存活率和總體存活率 (Cristofanilli等，2004)。雖然據報導此技術靈敏度高，但其應用受限於能否 得到針對特定類型CTC的高靈敏度高特異性檢測抗體。抗體非特異性結合其它 細胞組分可能導致低信噪比而損傷CTC的檢測。結合CTC的抗體也能低水平 結合其它類型細胞上的抗原，導致高水平的假陽性。
檢測CTC的另一種現有方法是檢測血液中腫瘤細胞特異性表達的信使 RNA。已採用實時逆轉錄聚合酶鏈反應(QPCR)將檢測到的CTC結果與病人 的預後相關聯。已用實時RT-PCR檢測結腸直腸癌病人外周血中的CEA mRNA (Ito等，2002)。術後血CEAm RNA陽性的病人無疾病存活率顯著低於CEAm RNA陰性病例。這些結果提示在結腸直腸癌病人中如果腫瘤細胞進入血流將導 致病人不良結局。另一報導顯示臨床上可利用多種mRNA標記對高危AJCC期 IIBC和IIIAB黑素瘤病人的CTC作QPCR分子檢測(Mocellin等，2004)。 檢測腫瘤特異性mRNA表達的優點是，可利用任何腫瘤特異性基因作為診斷/ 預後標誌。然而QPCR方法需要進行分離和逆轉錄血樣品中的mRNA，然後進 行PCR反應，步驟費力。用此技術時由於樣品汙染染色體DNA，或所選標誌 在正常血細胞中也有低水平表達而常出現假陽性(Fava等，2001)。此外，此 技術的檢測靈敏度最高上限是每毫升血最多含約一個腫瘤細胞，因此此技術不 能提供精確的CTC計數。
非常需要檢測和定量血液和其它體液中單個細胞水平的腫瘤細胞特異性 mRNA表達。能檢測細胞懸液中單個細胞多種特異性mRNA表達的技術，應能 靈敏和特異性檢測和計數血液和其它體液中的CTC。此外，這種技術應能收集 CTC細胞供下遊細胞學和分子學分析。但目前已有技術不能滿足這些需求。
原位雜交(ISH)技術是一種已建立的定位和形態學檢測保存的組織切片 或細胞製備物中特異性mRNA序列的方法(Hicks等，2004)。最常用的標本 是冰凍切片、石蠟包埋切片或經細胞離心沉澱在載玻片上用甲醇固定的懸浮細 胞。進行檢測時採用與細胞和組織中特定核酸序列互補而能與其雜交的核酸探 針。此技術的靈敏度即檢測的域值水平範圍是每個細胞10-20個拷貝的mRNA。
然而，ISH技術面臨許多技術問題限制了其廣泛應用。首先，固定在固體表面的細胞顯示雜交動力學性能差。其次，在靶mRNA的探針的選擇、標記和 檢測中，在每個組織切片的固定和滲透以及雜交和洗滌中， 一般都需要進行試 驗優化。此外，需要對探針的特異性、組織mRNA的性能和實驗方法的雜交效 率進行各種實驗加以控制。除技術問題外，就檢測靈敏度和重複性而言，目前 的ISH技術性能標準較差。假陽性率仍高，除非利用形態學手工再檢查相關細 胞，但該過程費時費力。目前的ISH技術也不能定量測定細胞的mRNA表達水 平，或同時測定多種靶mRNA的表達，而這種測定結果可提供臨床上有價值的 信息，如提高的檢測靈敏度和特異性以及鑑定原發腫瘤的類型、來源和階段。
常用於進行細胞內原位雜交的探針有四種類型寡核苷酸探針(通常長20 一40個鹼基)、單鏈DNA探針(長200 — 500個鹼基)、雙鏈DNA探針或RNA 探針(長200 — 5000個鹼基)。RNA探針是目前原位雜交應用最廣泛的探針， 因為它們具有以下優點RNA-RNA雜交體對溫度非常穩定並且能抵抗RNA酶 的消化。但RNA探針直接標記方法遇到許多困難。首先，必須分別製備檢測 各感興趣mRNA的標記探針。其次，技術上難以同時原位檢測多種感興趣 mRNA的表達。因此，目前據報導對多種mRNA只能用不同的標記方法依次檢 測(Schrock等，1996; Kosman等，2004)。另外，用直接標記方法，不能很 好地控制與細胞中非特異性序列可能的交叉雜交。分支DNA (bDNA)原位雜 交是檢測單個細胞中mRNA的間接標記方法(Player等，2001)。此法採用的 一系列寡核苷酸探針中的部分(序列)能與感興趣的特異性mRNA雜交，另一 部分能與bDNA雜交而放大信號和檢測。bDNA ISH的優點是試驗中可利用非 標記的寡核苷酸探針來檢測各種感興趣的mRNA並且放大信號和檢測的是通 用成分。然而理論上，需要對bDNAISH中所用的基因特異性探針進行篩選， 應不能與細胞中其它mRNA序列發生非特異性雜交相互反應。當bDNAISH中 採用多種探針檢測低豐度mRNA時，寡核苷酸探針的非特異性雜交可能產生嚴 重問題。類似地，雖然需要採用bDNAISH來檢測或定量多種mRNA，但寡核 苷酸探針的這種非特異性雜交也是一個潛在的需要解決的問題。
本發明克服了上述困難，本發明提供了檢測和鑑定單個細胞中核酸的方 法。通過閱讀以下內容將獲得對本發明的完全了解。
發明概述
本發明提供檢測單個細胞中靶核酸，包括檢測單個細胞中多種靶(核酸)的方法。描述了通過檢測核酸來檢測異質大細胞群中單個細胞，特別是罕見細 胞的方法。也描述了相關的組合物、系統和試劑盒。
第一種通用類型的實施方式包括檢測單個細胞中兩種或多種耙核酸的方 法。此方法中，提供含有細胞的樣品。所述細胞含有或被懷疑含有第一耙核酸 和第二靶核酸。第一標記探針含有第一標記，第二標記探針含有第二標記，其 中提供的第一標記發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別。還提 供至少第一捕獲探針和至少第二捕獲探針。
第一捕獲探針與細胞中的第一靶核酸雜交(當細胞中存在第一耙核酸時)， 第二捕獲探針與細胞中的第二靶核酸雜交(當細胞中存在第二靶核酸時)。第 一標記探針被第一捕獲探針捕獲，第二標記探針被第二捕獲探針捕獲，從而第 一標記探針被第一靶核酸捕獲，第二標記探針被第二靶核酸捕獲。然後檢測第 一標記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號。由於第一和第二標記通過 捕獲探針與它們各自的靶核酸結合，細胞中存在此種標記可表明細胞中存在相 應的靶核酸。此方法任選可定量測定。因此可測定第一信號的強度和第二信號 的強度。可將第一信號的強度與細胞中第一靶核酸的含量相關聯，同時將第二 信號的強度與細胞中第二靶核酸的含量相關聯。
一方面，所述標記探針能直接結合所述捕獲探針。例如，在一類實施方式 中，提供一種第一捕獲探針和一種第二捕獲探針。第一標記探針可與第一捕獲 探針雜交，第二標記探針可與第二捕獲探針雜交。在一相關類型實施方式中， 提供兩種或多種第一捕獲探針和兩種或多種第二捕獲探針，以及多個第一標記 探針(如二個或多個相同的第一標記探針)和多個第二標記探針(如二個或多 個相同的第二標記探針)。使兩種或多種第一捕獲探針與第一靶核酸雜交，使 兩種或多種第二捕獲探針與第二靶核酸雜交。使一種第一標記探針與各個第一 捕獲探針雜交，使一種第二標記探針與各個第二捕獲探針雜交。
另一方面，標記探針間接通過例如輔放大核酸(preamplifer)和/或放大核 酸(amplifier)被捕獲探針所捕獲。在採用放大核酸的一類實施方式中，提供一種 第一捕獲探針， 一種第二捕獲探針，多個第一標記探針和多個第二標記探針。 使第一放大核酸與第一捕獲探針雜交並與多種第一標記探針雜交，使第二放大 核酸與第二捕獲探針雜交並與多種第二標記探針雜交。在另一類型實施方式 中，提供兩種或多種第一捕獲探針，兩種或多種第二捕獲探針，多個第一標記 探針和多個第二標記探針。使兩種或多種第一捕獲探針與第一靶核酸雜交，使兩種或多種第二捕獲探針與第二靶核酸雜交。使第一放大核酸與各個第一捕獲 探針雜交，多個第一標記探針與第一放大核酸雜交。使第二放大核酸與各個第 二捕獲探針雜交，和多個第二標記探針與第二放大核酸雜交。
在採用輔放大核酸的一類實施方式中，提供一種第一捕獲探針， 一種第二 捕獲探針，多個第一標記探針和多個第二標記探針。使第一輔放大核酸與第一 捕獲探針雜交，使多個第一放大核酸與第一輔放大核酸雜交，和使多個第一標 記探針與第一放大核酸雜交。使第二輔放大核酸與第二捕獲探針雜交，使多個 第二標記探針與第二放大核酸雜交。在另一類型實施方式中，提供兩種或多種 第一捕獲探針，兩種或多種第二捕獲探針，多個第一標記探針和多個第二標記 探針。使兩種或多種第一捕獲探針與第一靶核酸雜交，使兩種或多種第二捕獲 探針與第二靶核酸雜交。使第一輔放大核酸與各個第一捕獲探針雜交，多個第 一標記探針與第一放大核酸雜交。使第二輔放大核酸與各個第二捕獲探針雜 交，多個第二放大核酸與各個第二輔放大核酸雜交，多個第二標記探針與第二 放大核酸雜交。
在採用兩種或多種第一捕獲探針和/或兩種或多種第二捕獲探針的實施方 式中，捕獲探針優先與它們各自靶核酸中非重疊性多核苷酸序列雜交。
在一類實施方式中，提供多個第一標記探針和多個第二標記探針。通過滾
動循環擴增與第一捕獲探針雜交的第一環形多核苷酸產生擴增的第一多核苷
酸。該第一環形多核苷酸至少包含一個拷貝的與第一標記探針中某多核苷酸序
列相同的多核苷酸序列，因此擴增的第一多核苷酸含有多個拷貝的與第一標記
探針中該多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。然後使多個第一標記探針與該擴
增的第一多核苷酸雜交。類似地，通過滾動循環擴增與第二捕獲探針雜交的第
二環形多核苷酸產生擴增的第二多核苷酸。該第二環形多核苷酸至少包含一個 拷貝的與第二標記探針中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，因此擴增的第
二多核苷酸含有多個拷貝的與第二標記探針中該多核苷酸序列互補的多核苷
酸序列。然後使該多種第二標記探針與擴增的第二多核苷酸雜交。所述擴增的
多核苷酸保持與捕獲探針的結合，從而使標記探針被捕獲到靶核酸。
該方法適用於多重核酸檢測，包括同時檢測多於兩種的靶核酸。因此，所
述細胞任選含有或被懷疑含有第三靶核酸，所述方法任選包括提供含有第三
標記的第三標記探針，其中，所述第三標記產生的第三信號可與第一和第二信
號相區別；提供至少第三捕獲探針；在細胞中第三捕獲探針與第三靶核酸(細
19胞中存在的話)雜交；第三標記探針被第三捕獲探針捕獲；以及檢測第三標記 產生的第三信號。類似地，如需要可同時檢測第四、第五、第六等耙核酸。宜 同時進行所有靶核酸的各個雜交或捕獲步驟。
靶核酸基本上指細胞中要檢測的任何核酸。例如，耙核酸可以是DNA、染
色體DNA、 RNA、 mRNA、 microRNA、核糖體RNA等。耙核酸可以是細胞的 內源性核酸。另一例子，靶核酸可以是病原體感染細胞而導入細胞或在細胞中 表達的核酸，如病毒或細菌的基因組RNA或DNA、質粒、病毒或細菌的mRNA 等。
所述第一和第二 (和/或任選第三、第四等)耙核酸(序列)可以是一個核 酸分子的一部分，或它們可以是分離的分子。在一類實施方式中，第一靶核酸 是第一種mRNA，第二靶核酸是第二種mRNA。在另一類實施方式中，第一靶 核酸包含某mRNA的第一區域，第二靶核酸包含該同一 mRNA的第二區域。 在另一類實施方式中，第一靶核酸包含第一染色體DNA的多核苷酸序列，第 二靶核酸包含第二染色體DNA的多核苷酸序列。所述第一和第二染色體DNA 的多核苷酸序列任選位於同一染色體中，如同一基因中，或不同染色體中。
一方面，標準化靶核酸產生的信號。在一類實施方式中，第二靶核酸包括 參比核酸，此方法包括按第二信號標準化第一信號。所述標記(第一、第二、 第三等)基本上可以是任何方便的能提供可檢測信號的直接或間接標記。 一方 面，第一標記是第一螢光標記，第二標記是第二螢光標記。
基本上可用上述方法檢測任何類型樣品細胞中存在的靶核酸。例如，樣品 可來源於體液如血液。可利用檢測細胞中靶核酸的方法來鑑定細胞。例如，可
根據何種核酸及其所含水平來鑑定某細胞是否為所需類型。因此，在一類實施 方式中，所述方法包括根據某細胞中檢測到的第一和第二信號(任選第三、第 四信號等)來鑑定該細胞是否為所需靶細胞。作為幾個例子，細胞可以是循環 性腫瘤細胞、病毒感染的細胞、母血中的胚胎細胞、生物樣品中的細菌細胞或 其它微生物細胞、前體內皮細胞、或血中心肌細胞。
與捕獲探針雜交前通常要固定和滲透處理所述細胞，以保留細胞中的靶核酸 和使捕獲探針、標記探針等能進入細胞。任選洗滌細胞以除去沒有被靶核酸之一捕 獲的物質。各種步驟後進行細胞洗滌，例如捕獲探針與靶核酸雜交後洗滌以去除未 結合的捕獲探針，輔放大核酸、放大核酸和/或標記探針與捕獲探針雜交後，等等。 對於雙鏈靶核酸宜加熱變性後才能使相應的捕獲探針與靶核酸雜交。
20此法的所有或大多數步驟中優選釆用細胞懸浮液。因此在一類實施方式 中，雜交、捕獲和/或檢測步驟的樣品採用含有細胞的懸浮液。在其它實施方式 中，雜交、捕獲和/或檢測步驟的樣品可採用細胞懸浮液和被固定在基材上的細 胞。例如，雜交、捕獲和任選的洗滌步驟釆用細胞懸浮液，而檢測步驟細胞固 定在基材上。在細胞為懸浮液的方式中，可用流式細胞術方便地檢測第一和第 二信號(任選包括第三信號等)。通常可在一次操作中檢測各標記發出的信號。
一種通用類型實施方式提供檢測單個細胞中一種或多種耙核酸相對水平 的方法。此方法中提供含細胞的樣品。所述細胞含有或被懷疑含有第一耙核酸 和第二參比核酸。還提供了含第一標記的第一標記探針，含第二標記的第二標 記探針，其中提供的第一標記發出的信號可與第二標記發出的第二信號相區 別。在細胞中，第一標記探針被第一靶核酸(當細胞中存在的話)捕獲，第二 標記探針被第二參比核酸捕獲。檢測單個細胞中第一標記發出的第一信號，第 二標記發出的第二信號，並測定各信號的強度。將第一信號的強度按第二 (參 比)信號的強度標準化。從而可檢測出細胞中第一靶核酸與第二參比核酸的相 對水平，因為第一和第二標記與它們各自的核酸相關聯。這些方法任選可定量 測定，而得以衡量細胞中第一靶核酸含量相對於第二參比核酸的水平。可將細 胞中按第二信號標準化的第一信號強度與第一靶核酸的含量相關聯。
標記探針可直接結合核酸D例如，第一標記探針可與第一靶核酸雜交，和 /或第二標記探針可與第二參比核酸雜交。或者，標記探針可間接，例如通過捕 獲探針與核酸結合。在一類實施方式中，提供至少一種第一捕獲探針和至少一 種第二捕獲探針。在細胞中，第一捕獲探針與第一靶核酸雜交，第二捕獲探針 與第二參比核酸雜交。第一標記探針被第一捕獲探針捕獲，第二標記探針被第 二捕獲探針捕獲，從而使第一標記探針被第一靶核酸捕獲，第二標記探針被第 二參比核酸捕獲。關於標記和捕獲探針的結構和用數，任選採用輔放大核酸和 /或放大核酸、環形多核苷酸的滾動循環擴增等，以上方法所述的特徵也可應用 於這些實施方式。
上述方法也可用於核酸多重檢測，包括同時檢測兩種或多種靶核酸。因此，
所述細胞任選含有或被懷疑含有第三靶核酸，所述方法任選包括提供含有第
三標記的第三標記探針，其中第三標記發出的第三信號可與第一和第二信號相
區別；在細胞中使第三標記探針被第三靶核酸(當細胞中存在時)捕獲；檢測
第三標記發出的第三信號，該檢測包括測定第三信號的強度；按第二信號強度標準化第三信號強度。如需要，類似地同時檢測細胞中的第四、第五、第六信 號等。
可採用檢測細胞靶核酸相對水平的方法來鑑定細胞。例如，可根據細胞所 含核酸和其水平鑑定細胞是否為所需類型。因此，在一類實施方式中，所述方 法包括根據標準化的第一信號(和任選的標準化第三、第四等信號)鑑定細胞 是否為所需靶細胞。
上述方法提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事項；例 如，靶核酸與參比核酸的類型、細胞類型、樣品來源、細胞的固定和滲透處理、 細胞洗漆、雙鏈靶核酸與參比核酸的變性、標記的類型、採用任選的封閉探針、 信號的檢測、流式細胞術或顯微鏡檢測(及強度測定)、細胞以懸浮液存在或固 定在基材上等等。
另一類通用實施方式提供對單個細胞基因表達進行比較分析的方法。該方 法中，先提供含有一種或多種特定類型細胞的第一混合細胞群。檢測第一群特 定類型細胞中的一種或多種靶核酸相對於參比核酸表達的表達水平，以提供第 一表達模式。提供含有一種或多種特定類型細胞的第二混合細胞群，檢測第二 群特定類型細胞中的一種或多種靶核酸相對於參比核酸表達的表達水平，提供 第二表達模式。然後比較該第一與第二表達模式。
上述方法提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事項；例 如，靶核酸與參比核酸的類型、細胞類型、樣品來源、細胞的固定和滲透處理、 細胞洗滌、雙鏈靶核酸與參比核酸的變性、標記的類型、採用任選的封閉探針、 信號的檢測、流式細胞術或顯微鏡檢測(及強度測定)、細胞以懸浮液存在或固 定在基材上等等。
一方面，本發明提供有利於高密度標記物與細胞中靶核酸結合的方法。一 類通用的實施方式提供檢測單個細胞中兩種或多種靶核酸的方法。此方法中提 供含細胞的樣品。所述細胞含有或被懷疑含有第一靶核酸和第二靶核酸。在細 胞中，第一標記被第一靶核酸捕獲(當細胞中存在時)，第二標記被第二靶核 酸捕獲(當細胞中存在時)。第一標記發出的第一信號可與第二標記發出的第 二信號相區別。因此，第一靶核酸中跨越第一靶核酸至少20個毗連核苷酸區 域的每個核苷酸平均至少捕獲一個拷貝的第一標記，第二靶核酸中跨越第二靶
核酸至少20個毗連核苷酸區域的每個核苷酸平均至少捕獲一個拷貝的第二標
記。檢測第一標記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號。在一類實施方式中，第一靶核酸中跨越第一靶核酸至少20個毗連核苷酸
區域的每個核苷酸平均至少捕獲4、 8或12個拷貝的第一標記，第二耙核酸中 跨越第二靶核酸至少20個毗連核苷酸區域的每個核苷酸平均至少捕獲4、 8或 12個拷貝的第二標記。在一實施方式中，第一靶核酸中跨越第一耙核酸至少 20個毗連核苷酸區域的每個核苷酸平均至少16個拷貝的第一標記，第二耙核 酸中跨越第二靶核酸至少20個毗連核苷酸區域的每個核苷酸平均至少捕獲16 個拷貝的第二標記。
上述方法提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事項；例 如，標記的類型，信號的檢測，細胞的類型、處理和懸浮等。任選第三、第四、 第五、第六等靶核酸捕獲的第三、第四、第五、第六等標記的密度相似。
另一類通用實施方式提供檢測某特定類型單個細胞的方法。此方法中，提 供的包含混合類型細胞的樣品含有至少一個特定類型的細胞。第一標記探針含 有第一標記，第二標記探針含有第二標記，其中提供的第一標記發出的第一信 號可與第二標記發出的第二信號相區別。在細胞中，第一標記被第一靶核酸捕 獲(當細胞中存在第一靶核酸時)，第二標記被第二靶核酸捕獲(當細胞中存 在第二耙核酸時)。檢測第一標記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號， 並與細胞中存在、缺失第一和第二靶核酸，或它們的含量相關聯。根據對細胞 中存在、缺失第一和第二靶核酸，或它們的含量測定，鑑定細胞是否為特定類 型，根據細胞中存在、缺失第一靶核酸或其含量，或根據細胞中存在、缺失第 二靶核酸或其含量(即此特定類型細胞中該靶核酸是冗餘標誌)可將特定類型 細胞與混合物中其它類型的細胞相區別。任選測定細胞中第一信號的強度和第 二信號的強度並與存在的相應核酸含量相關聯。在一類實施方式中，所述細胞 含有第一耙核酸和第二靶核酸，根據對細胞中第一和第二靶核酸二者的存在或 含量檢測來鑑定是否為特定類型，根據細胞中第一靶核酸的存在或含量，或第 二靶核酸的存在或含量，將特定類型細胞與混合物中其它類型的細胞相區別。
標記探針能直接結合靶核酸。例如，第一標記探針能與第一靶核酸雜交， 和/或第二標記探針能與第二耙核酸雜交。可任選通過捕獲探針使靶核酸捕獲標
記探針。在一類實施方式中，提供至少一種第一捕獲探針和至少一種第二捕獲 探針。在細胞中，第一捕獲探針與第一靶核酸雜交，第二捕獲探針與第二靶核 酸雜交。第一捕獲探針捕獲第一標記探針，第二捕獲探針捕獲第二標記探針， 從而使第一靶核酸捕獲第一標記探針，第二靶核酸捕獲第二標記探針。上述方說
法提及的特徵也可應用於這些實施方式，關於標記和捕獲探針的結構和數目， 任選採用輔放大核酸和/或放大核酸、環形多核苷酸的滾動循環擴增等等。
任選檢測細胞中的第三、第四、第五靶核酸等。例如，此方法任選包括 提供含第三標記的第三標記探針，其中第三標記發出的第三信號可與第一和第 二信號相區別，細胞中第三靶核酸捕獲此第三標記探針(當細胞中存在此第三 靶核酸時)，和檢測第三標記發出的第三信號。任選使第三、第四、第五等標 記探針與它們相應的核酸直接雜交，或通過第一和第二標記探針中所述的捕獲 探針間接捕獲它們。
可按第三信號標準化第一和/或第二信號。因此，在某些實施方式中，所述 細胞含有第三靶核酸，該方法包括根據標準化的第一和/或第二信號來鑑定細胞 的特定類型，例如在一些實施方式中，根據第一和/或第二靶核酸的拷貝數而不 是它們單單存在於耙細胞類型而不存在於其它類型細胞中，來區分特定靶細胞
類型與混合物中其它類型的細胞。
作為另一個例子，第三靶核酸可作為靶細胞類型的第三種冗餘標誌，例如 來提高檢測所需細胞類型試驗的特異性。因此在一類實施方式中，所述方法包 括將檢測到的細胞第三信號與細胞中存在、缺失第三靶核酸或其含量相關聯， 根據該細胞中第一靶核酸的存在、缺失或其含量，或第二靶核酸的存在、缺失 或其含量，或第三靶核酸的存在、缺失或其含量，來區分特定靶細胞類型與混 合物中其它類型的細胞。
可應用上述方法檢測和鑑定罕見細胞類型。例如，混合細胞群中特定類型
細胞與其它類型細胞的比率任選低於l:lx104、低於l:lx105、低於l:lx106、低 於l:lx107、低於l:lx108、或甚至低於l:lx109。
上述方法提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事項；例 如，靶核酸的類型、細胞類型、樣品來源、細胞的固定和滲透處理、細胞洗滌、 雙鏈核酸的變性、標記的類型、採用任選的封閉探針、信號的檢測、流式細胞 術或顯微鏡檢測單個細胞發出的信號(和檢測其強度)、細胞以懸浮液存在或 固定在基材上等等。
本發明還提供用於實施所述方法或所述方法產生的組合物。 一類示範性實 施方式提供的組合物包含含有和被懷疑含有第一靶核酸和第二靶核酸的經固 定和滲透處理的細胞，至少一種能與第一靶核酸雜交的第一捕獲探針，至少一 種能與第二靶核酸雜交的第二捕獲探針，含有第一標記的第一標記探針，和含有第二標記的第二標記探針。第一標記發出的第一信號可與第二標記發出的第 二信號相區別。所述細胞任選含有第一和第二捕獲探針及標記探針。第一和第 二捕獲探針任選能與細胞中它們各自的靶核酸雜交。
上述方法中標記探針間接捕獲靶核酸的特徵可應用於這些實施方式，在標 記和捕獲探針的結構和數量，任選採用輔放大核酸和/或放大核酸等方面。
在一類實施方式中，所述組合物包含多個第一標記探針，多個第二標記 探針，與第一捕獲探針雜交的第一環形多核苷酸經滾動循環擴增產生的擴增的 第一多核苷酸，與第二捕獲探針雜交的第二環形多核苷酸經滾動循環擴增產生 的擴增的第二多核苷酸。所述第一環形多核苷酸包含至少一個拷貝的與第一標 記探針中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，而擴增的第一多核苷酸包含多 個拷貝的與第一標記探針中該多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。所述第二環 形多核苷酸包含至少一個拷貝的與第二標記探針中某多核苷酸序列相同的多 核苷酸序列，而擴增的第二多核苷酸包含多個拷貝的與第二標記探針中該多核 苷酸序列互補的多核苷酸序列。所述組合物也可包含產生該擴增的多核苷酸所 必須的試劑，例如外源提供的核酸聚合酶、外源提供的核酸連接酶、和/或外源 提供的三磷酸核苷(如dTNP)。
所述細胞任選包含其它靶核酸，所述組合物(和細胞)可包含檢測這些靶 分子的試劑。例如所述細胞可含有和被懷疑含有第三靶核酸，所述組合物可包 含至少能與第三靶核酸雜交的第三捕獲探針，和含第三標記的第三標記探針。
第三標記發出的第三信號可與第一和第二信號相區別。所述細胞任選包含第 四、第五、第六靶核酸等，所述組合物任選包含第四、第五、第六等標記探針 和捕獲探針。
所述細胞可以是細胞混合物，如複雜的異質混合細胞。在一類實施方式中， 所述細胞是某特定類型，所述組合物包含一種或多種其它類型細胞。這些其它 細胞可以是過量，甚至大大過量存在的細胞。例如，該組合物中特定類型的細
胞與所有其它類型細胞的比率任選低於l:lx104、低於l:lx105、低於l:lx106、 低於l:lx107、低於l:lx108、或甚至低於l:lx109。
上述方法提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事項；例 如，關於耙核酸的類型和細胞來源、各種靶序列在同一分子或不同分子上的位 置、標記的類型、包括任選的封閉探針等等。所述細胞任選用此組合物的懸浮 液。在一類通用實施方式中提供含有細胞的組合物，所述細胞包含第一耙核 酸；第二靶核酸；第一標記，細胞中第一標記的存在指示該細胞中存在第一耙 核酸；第二標記，細胞中第二標記的存在指示該細胞中存在第二耙核酸，其中 第一標記發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別。該細胞中第一 靶核酸中跨越第一靶核酸至少20個毗連核苷酸區域的每個核苷酸平均至少存 在一個拷貝的第一標記，該細胞中第二靶核酸中跨越第二耙核酸至少20個舭 連核苷酸區域的每個核苷酸平均至少存在一個拷貝的第二標記。
在一類實施方式中，第一標記的拷貝與第一靶核酸實質上相關聯，第二標 記的拷貝與第二靶核酸實質上相關聯。例如，第一標記是第一標記探針中的一 部分，第二標記是第二探針中的一部分，而這些標記探針被靶核酸所捕獲。
上述實施方式提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事 項；例如，標記的類型和數目、細胞懸浮液等等。任選第三、第四、第五、第
六等耙核酸存在類似密度的標記。
本發明另一方面提供用於實施所述方法的試劑盒。 一類通用實施方式提供 檢測單個細胞中第一耙核酸和第二耙核酸的試劑盒。在該試劑盒的一個或多個
容器中裝有至少一種用於固定和/或滲透處理細胞的試劑，至少一種能與第一
靶核酸雜交的第一捕獲探針，至少一種能與第二靶核酸雜交的第二捕獲探針， 含有第一標記的第一標記探針和含有第二標記的第二標記探針，其中第一標記
發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別。
上述實施方式提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事 項；例如，靶核酸的數目、標記和捕獲探針的構型和數目、包括輔放大核酸和 /或放大核酸、包括封閉探針、包括擴增試劑、靶核酸的類型、各種靶序列在單 一分子或不同分子上的位置、標記的類型、包括任選的封閉探針等等。
另一類通用實施方式提供的試劑盒，通過檢測第一靶核酸和第二靶核酸來 檢測混合類型細胞中某特定類型的單個細胞。該試劑盒的一個或多個容器中裝 有至少一種用於固定和/或滲透處理細胞的試劑，含有第一標記的第一標記探 針和含有第二標記的第二標記探針，其中第一標記發出的第一信號可與第二標 記發出的第二信號相區別。可通過細胞中第一靶核酸的存在、缺失或含量，或 第二耙核酸的存在、缺失或含量來區分此特定類型細胞與混合物中其它類型的 細胞。
上述實施方式提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事項；例如，靶核酸的數目、包括捕獲探針、標記和/或捕獲探針的構型和數目、 包括輔放大核酸和/或放大核酸、包括封閉探針、包括擴增試劑、耙核酸的類型、 各種靶序列在單一分子或不同分子上的位置、標記的類型、包括任選的封閉探 針等等。
附圖簡要說明


圖1說明一示範性實施方式的QMAGEX技術流程圖。 圖2說明標記探針與靶核酸雜交的直接標記方法。
圖3說明標記探針通過與耙核酸雜交的捕獲探針雜交而間接標記的方法。
圖4說明利用一對獨立的捕獲探針來提高靶核酸捕獲標記探針特異性的間 接標記的捕獲探針設計方法。
圖5說明利用三對或多對獨立的捕獲探針來提高靶核酸捕獲標記探針特異 性的間接標記的捕獲探針設計方法。
圖6說明利用二對獨立捕獲探針直接標記(分圖A)或間接標記(分圖B) 平行檢測多種靶分子的探針設計方法。
圖7說明通過將多種類型信號產生粒子(標記)連接於同一靶分子來減少 罕見細胞鑑定中假陽性率的探針設計方法。分圖A顯示一種靶分子上多種類型 的信號產生粒子(標記)。分圖B顯示大於一種靶分子上多種類型的信號產生 粒子(標記)，各耙分子間維持相對的粒子組信號強度。分圖C顯示一種靶分 子上一組信號產生粒子(標記)，不同靶分子有不同組的獨特信號產生粒子。
圖8分圖A-D說明示範性放大核酸的不同結構。
圖9說明採用滾動循環擴增來擴增信號。分圖A顯示環形核苷酸分子結合 捕獲探針。分圖B顯示滾動循環擴增產生的含許多重複序列的長鏈分子。分圖 C顯示許多信號探針可與此重複序列雜交而實現信號放大。
圖IO說明試驗裝置結構的一種實施方式。
以上示意圖並不按照比例。
定義
除非另有說明，本文所用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域 普通技術人員共同理解的含義相同。以下定義補充了本領域的定義是針對本申 請書的，不歸因於任何相關或無關文件，如任何共同擁有的專利或申請。雖然
27可採用與本文所述類似或相等的方法和材料來實施本發明的檢測，但本文所述
的是優選的材料和方法。因此本文所用的術語目的只是描述具體的實施方式， 而非限制本發明的範圍。
如本說明書和附件權利要求書中所述，單數形式的"一個"、"一種"和 "這種"包括複數，除非文中另有明確闡述。因此，例如稱"一種分子"包括 多個此種分子等等。
術語"約"本文用於指給定數值的變化範圍為其值的±10%、或任選其值 的±5%、或在某些實施方式中所述值的±1%。
術語"多核苷酸"(和等價術語"核酸")包括單體核苷酸的任何物理串，
可對應於一串核苷酸，包括核苷酸的聚合體(如典型的DNA或RNA聚合體)、 肽核酸(PNA)、修飾的寡核苷酸(如含有生物RNA或DNA通常沒有的核苷 酸的寡核苷酸，如2，-0-甲基寡核苷酸)等的聚合體。此種多核苷酸中的核苷 酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸類似物，可以是天然或非天然 產生的，可以是無取代、無修飾的、或是取代的或修飾的。諸核苷酸可通過磷 酸二酯鍵、或硫代磷酸鍵、甲基磷酸鍵、硼代磷酸鍵等連接。多核苷酸還可含 非核苷酸成分，如標記、淬滅、封閉基團等。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈。 "核酸靶"或"靶核酸"是指待檢測的核酸，或任選核酸的一部分。 "多核苷酸序列"或"核苷酸序列"是核苷酸組成的聚合體(寡核苷酸、 DNA、核酸等)，或代表核苷酸聚合體的特徵串，視上下文而定。可測定給定 核酸或互補多核苷酸序列(如互補核酸)中的任何特定多核苷酸序列。
術語"基因"廣泛用於指與生物學功能相關的任何核酸。基因通常包含編 碼序列和/或表達編碼序列所需的調控序列。術語基因可應用於特定基因組序 列，及該基因組序列編碼的cDNA或mRNA。基因還包含不表達的核酸區段，
例如形成其它蛋白的識別序列。不表達的調控序列包括啟動子和增強子，調控 蛋白如轉錄因子與它們結合後可導致毗連的或附近的序列轉錄。
二種多核苷酸例如在相應試驗條件下結合形成穩定的雙鏈體時稱為"雜 交"。核酸雜交是由於各種熟知的特徵性理化作用力所致，如氫鍵、溶劑排斥、 鹼基堆積力等。核酸雜交的全面指南可參見Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with nucleic Acid probes第 2章第1部分，"雜交原理和核酸探針試驗策略的綜述"(Elsevier,new York)以 及A廳bel，同上。
28能與第二多核苷酸"雜交"的第一多核苷酸含有與第二多核苷酸中的第 二多核苷酸序列互補的第一多核苷酸序列。該第一和第二多核苷酸(例如)能 在相關試驗條件下形成穩定的雙鏈體。
在特定條件下(如相關試驗條件下)核酸雙鏈體的"Tm"(解鏈溫度)是 此雙鏈體群中一半鹼基對解離而另一半結合時的溫度。例如可獲得某特定雙鏈 體的溫度變化曲線來計算和/或測定該雙鏈體的Tm(此時Tm是所觀察到的從雙 鏈形式轉變為單鏈形式相應的中點溫度)。
術語"互補"指在相關試驗條件下，多核苷酸與其"互補"序列形成穩定
的雙鏈體。通常彼此互補的二個多核苷酸序列錯配的鹼基應不到約20%,不到 約10%，優選不到約5%，更優選無錯配。
"標記"是有利於分子檢測的部分。本文中常用的標記包括螢光、冷光、
光散射和/或顏色標記。合適的標記包括酶和螢光分子，以及放射性核素、底物、 輔因子、抑制劑、化學發光分子、磁性顆粒等等。說明這些標記用途的專利包
括美國專利3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3，996，345; 4,277,437; 4,275,149; 和4,366,241。許多標記可從市場上購買到用於本發明。
術語"標記探針"指能直接或間接結合靶分子而使該靶分子能通過讀數儀 檢測的任何物質。標記探針(或"LP")通常是含有至少一種能直接或間接提 供可檢測信號的標記物的單鏈多核苷酸。標記可共價連接於該多核苷酸，或可 構建能結合標記物的多核苷酸(如生物素化多核苷酸可結合鏈黴親和素相連的 標記)。例如，可使標記探針與靶核酸直接雜交，或可與靶核酸雜交的核酸再 雜交，或與靶核酸雜交的一種或多種其它核酸雜交。因此，標記探針可含有與 耙核酸中某多核苷酸序列互補的多核苷酸序列，或可含有至少一種與捕獲探 針、放大核酸等中某多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
"捕獲探針"是能與靶核酸雜交和使靶核酸捕獲標記探針的多核苷酸。捕 獲探針可與標記探針直接雜交，或可與標記探針雜交的一種或多種核酸雜交；
例如，捕獲探針可與放大核酸或輔放大核酸雜交。捕獲探針可包含.*與靶核酸 中某多核苷酸序列互補的第一多核苷酸序列，和與標記探針、放大核酸、輔放 大核酸等中某多核苷酸序列互補的第二多核苷酸序列。優選捕獲探針為單鏈。 "放大核酸(amplifier)"通常是能與多種標記探針雜交的多核苷酸。一
般放大核酸能與多個相同的標記探針雜交。放大核酸也能與至少一個捕獲探針 或與已與捕獲探針結合的核酸雜交。例如，放大核酸能與至少一個捕獲探針和多個標記探針雜交，或與一個輔放大核酸和多個標記探針雜交。放大核酸可以是線狀、叉狀、梳狀或分枝狀核酸。如所有的多核苷酸所述的那樣，放大核酸可包含修飾的核苷酸和/或非標準核苷酸之間的連接鍵以及標準的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、和/或磷酸二酯鍵。合適的放大核酸描述可參見例如美國專
利USPN5,635,352; USPN5,124,246; USPN5，710,264T和USPN5,849,481 。
"輔放大核酸(preamplifier)"通常是一種起著一個或多個捕獲探針與放大核酸之間(結合)中介作用的多核苷酸分子。通常輔放大核酸能同時與一個或多個捕獲探針和多個放大核酸雜交。示範性的輔放大核酸可參見例如UAPN5,635,352和USPN5,681,697。
"病原體"是一種能引起其宿主患病的生物試劑，通常是微生物。"微生物"是顯微或亞顯微大小的生物，例子包括但不限於細菌、真菌、酵母菌、原蟲、微型海藻(如單子葉海藻)、病毒(通常包括在此類中，雖然它們不能在宿主細胞外生長和複製)、亞病毒生物、類病毒體和支原體。本文包括各種其它術語或另作特徵說明的定義。
發明詳述
在其它方面內容中，本發明提供可用於同時檢測和任選定量檢測單個細胞中兩種或多種靶核酸的多重試驗方法。本發明的一相關方面提供檢測單個細胞中一種或多種靶核酸與參比核酸相對水平的方法。
總體上講，在本發明的試驗中，標記探針被各靶核酸捕獲。標記探針可通過與靶核酸直接結合而被靶核酸捕獲。然而優選標記探針間接通過與能夠結合靶核酸的捕獲探針、放大核酸和/或輔放大核酸結合而被捕獲。採用任選的放大核酸和輔放大核酸可促進多個拷貝的標記探針被靶核酸捕獲，從而放大靶核酸的信號而不需要酶促反應擴增靶核酸本身。捕獲探針的結合任選為協同性，可
減少捕獲探針與非靶核酸不希望的交叉雜交所產生的背景噪聲(與單一試驗相比，這在多重試驗中更加嚴重問題，因為多重試驗必須釆用更多探針，因而交叉雜交的機率增加)。
本發明的一個方面內容涉及檢測單個細胞，包括檢測異質混合細胞中的罕見細胞。通過檢測單個細胞中特徵性核酸的存在、缺失、拷貝數等來檢測單個細胞。
也提供與該方法相關的組合物、試劑盒和系統。檢測核酸和細胞的方法 核酸的多重檢測
如上所述，本發明一方面提供單個細胞的多重核酸檢測試驗。因此， 一種 通用類型的實施方式包括檢測單個細胞中兩種或多種靶核酸的方法。所述方法
提供含有細胞的樣品。所述細胞含有和被懷疑含有第一靶核酸和第二靶核酸D 還提供含第一標記的第一標記探針，含第二標記的第二標記探針，其中提供的 第一標記發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別。還提供至少第 一捕獲探針和至少第二捕獲探針。
細胞中第一捕獲探針與第一靶核酸雜交(當細胞中存在此第一靶核酸時)， 第二捕獲探針與第二靶核酸雜交(當細胞中存在此第二靶核酸時)。第一標記
探針被第一捕獲探針捕獲，第二標記探針被第二捕獲探針捕獲，從而使第一標 記探針被第一靶核酸捕獲，第二標記探針被第二靶核酸捕獲。然後檢測第一標 記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號。因為第一和第二標記探針通過 捕獲探針與它們各自的靶核酸結合，細胞中存在此類標記就表明該細胞中存在 相對應的耙核酸。所述方法任選為定量測定法。因此可測定第一信號的強度和 第二信號的強度，將第一信號的強度與該細胞中第一靶核酸的含量相關聯，同 時將第二信號的強度與該細胞中第二靶核酸的含量相關聯。
一方面，標記探針可直接結合捕獲探針。例如，在一類實施方式中，提供 一種第一捕獲探針和一種第二捕獲探針，使第一標記探針與第一捕獲探針雜交
而第二標記探針與第二捕獲探針雜交。在相關的一類實施方式中，提供兩種或 多種第一捕獲探針和兩種或多種第二捕獲探針，以及多個第一標記探針(如二
個或多個相同的第一標記探針)，多個第二標記探針(如二個或多個相同的第 二標記探針)。使兩種或多種第一捕獲探針與第一靶核酸雜交，和使兩種或多 種第二捕獲探針與第二靶核酸雜交。單個第一標記探針各自與第一捕獲探針雜 交，單個第二標記探針各自與第二捕獲探針雜交。
另一方面，標記探針例如通過輔放大核酸和/放大核酸被捕獲探針捕獲。採 用放大核酸和輔放大核酸的好處是能提高信號強度，因為它們可促進大量標記 探針與各靶核酸結合。
在採用放大核酸的一類實施方式中，提供一種第一捕獲探針， 一種第二捕 獲探針，多個第一標記探針，和多個第二標記探針。使第一放大核酸與第一捕獲探針和多個第一標記探針雜交，第二放大核酸與第二捕獲探針和多個第二標記探針雜交。在另一類實施方式中，提供二個或多個第一捕獲探針，二個或多個第二捕獲探針，多個第一標記探針，和多個第二標記探針。使二個或多個第一捕獲探針與第一靶核酸雜交，二個或多個第二捕獲探針與第二靶核酸雜交。使第一放大核酸與各個第一捕獲探針雜交，和使多個第一標記探針與第一放大核酸雜交。使第二放大核酸與各個第二捕獲探針雜交，和使多個第二標記探針與第二放大核酸雜交。
在採用輔放大核酸的一類實施方式中，提供一種第一捕獲探針， 一種第二捕獲探針，多個第一標記探針，和多個第二標記探針。使第一輔放大核酸與第一捕獲探針雜交，使多個第一放大核酸與第一輔放大核酸雜交，多個第一標記探針與第一放大核酸雜交。使第二輔放大核酸與第二捕獲探針雜交，使多個第二放大核酸與第二輔放大核酸雜交，多個第二標記探針與第二放大核酸雜交。在另一類實施方式中，提供二個或多個第一捕獲探針，二個或多個第二捕獲探針，多個第一標記探針和多個第二標記探針。.使二個或多個第一捕獲探針與第一靶核酸雜交，二個或多個第二捕獲探針與第二靶核酸雜交。使第一輔放大核酸與各個第一捕獲探針雜交，使多個第一放大核酸與—各個第一輔放大核酸雜交，多個第一標記探針與第一放大核酸雜交。使第二輔放大核酸與各個第二捕獲探針雜交，使多個第二放大核酸與各個第二輔放大核酸雜交，多個第二標記探針與第二放大核酸雜交。任選採用其它輔放大核酸作為與捕獲探針雜交的輔
放大核酸與放大核酸之間的中介物。
在以上類型實施方式中， 一個捕獲探針與一個標記探針、放大核酸或輔放大核酸雜交。在其它類型實施方式中，二個或多個捕獲探針與標記探針、放大核酸或輔放大核酸雜交。參見例如標題為"實施，應用和優點"的以下章節。
在釆用兩種或多種第一捕獲探針和/或兩種或多種第二捕獲探針的實施方式中，捕獲探針優先與它們各自靶核酸中非重疊的多核苷酸序列雜交。捕獲探針可以但不一定覆蓋靶核酸的毗連區域。任選提供封閉探針並與靶核酸雜交，這些封閉探針是能夠與沒有被捕獲探針佔據的靶核酸區域雜交的多核苷酸。對於某給定的靶核酸，其相應的捕獲探針和封閉探針優選與該靶核酸中物理上獨特的非重疊序列互補，這些非重疊序列優選但不一定是毗連序列。在某些實施方式中，捕獲探針和任選的封閉探針彼此毗連可提高雜交強度、消除二級結構和確保信號更加均一和再現在例如以上許多實施方式中，不需要用酶來使捕獲探針捕獲標記探針。然 而在其它實施方式中，可採用酶，特別是擴增捕獲探針與標記探針之間的中介 核酸時，這有利於靶核酸的檢測。例如在一類實施方式中，提供多個第一標記 探針和多個第二標記探針。使滾動循環擴增第一環形多核苷酸產生的擴增的第 一多核苷酸與第一捕獲探針雜交。該第一環形多核苷酸包含至少一個拷貝的與 第一標記探針中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，因此該擴增的第一多核 苷酸含有多個拷貝的與第一標記探針中該多核苷酸序列互補的多核苷酸序列D 然後使多個第一標記探針與該擴增的第一多核苷酸雜交。類似地，使滾動循環 擴增第二環形多核苷酸產生的擴增的第二多核苷酸與第二捕獲探針(優選在產 生第一擴增的多核苷酸同時)雜交。第二環形多核苷酸包含至少一個拷貝的與 第二標記探針中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，因此該擴增的第二多核 苷酸含有多個拷貝的與第二標記探針中該多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。 然後使多個第二標記探針與該擴增的第二多核苷酸雜交。擴增的多核苷酸保持 與捕獲探針的(如共價)結合，因此標記探針被靶核酸捕獲。可提供環形多核 苷酸使其與捕獲探針雜交，或可採用線性多核苷酸通過連接環化後使之與捕獲
探針(如扣鎖探針)結合。滾動循環擴增技術，包括採用扣鎖探針的技術是本
領域熟知的，可參見如Larsson等(2004)"通過靶引導的滾動循環擴增扣鎖 探針原位基因分型各DNA分子(In situ genotyping individual DNA molecules by target-primed rolling-circle amplification of padlock probes)" Nat Methods. 1(3): 227-32， Nilsson等(1994),Science 265:2085-2088和Antson等(2000)"PCR產生 的扣鎖探針可檢測基因組DNA中的單個核苷酸變異(PCR-generated padlock probes detect single nucleotide variation in genomic DNA)" Nuci Acids Res 28(I2):E58。
任選檢測捕獲探針序列是否能與非對應的靶核酸、輔放大核酸、放大核酸、 標記探針和/或任何相關基因組序列發生相互作用。通常在捕獲探針中不要選用 預計會與不需要的核酸發生交叉反應的序列，其檢測可採用例如目視(如目視 觀察互補性)、計算機(如對相關基因組資料庫的BLAST檢索或結合自由能 作計算機比較)和/或實驗(如交叉雜交實驗)。宜同時檢驗標記探針序列以便 最大程度減少不良交叉雜交。
捕獲探針、輔放大核酸和/或標記探針任選包含至少一個非天然核苷酸。例 如，與之雜交的捕獲探針和輔放大核酸(或放大核酸或標記探針)任選在互補
33位置上包含至少一對彼此鹼基配對但不是屬於生物DNA或RNA典型鹼基(即A、 C、 G、 T或U)的Watson-Crick鹼基對的非天然核苷酸。非天然核苷酸的例子包括但不限於Locked Nucleic 的核苷酸(購自 ExiqonA/S〖www.)exigon.com:參見如 SantaLucia jr.(1998)Proc Natl Acad Sci95:1460-1465)和isoG 、 isoC及AEGIS系統(Artificially Expanded GeneticInformation System,購自EraGen Biosciences(www.)eragen.com中所用的其它核苷酸；參見如USPN6，001,983;USPN6,037,120和USPN6， 140,496)。在探針中採用這種非天然鹼基對(如isoG-isoC鹼基對)通過減少交叉雜交而降低背景噪聲和/或簡化探針設計，或者當該非天然鹼基對的結合親和力高於天然鹼基對時可允許釆用較短的探針。
如上所述，用於多重核酸檢測的方法包括同時檢測大於二種的靶核酸。因
此所述細胞任選可含有和被懷疑含有第三靶核酸，所述方法任選包括提供含第三標記的第三標記探針，該第三標記發出的第三信號可與第一和第二信號相區別；提供至少一種第三捕獲探針，在細胞中使第三捕獲探針與第三耙核酸(當細胞存在第三靶核酸時)雜交，使第三標記探針被第三捕獲探針捕獲，並檢測第三標記發出的第三信號。類似地，需要時可同時檢測細胞中的第四、率五、第六等靶核酸。
靶核酸可以基本上是細胞中需要檢測的任何核酸。例如，靶核酸可以是DNA、染色體DNA、 RNA、 mRNA、 microRNA、核糖體RNA等等。耙核酸可以是細胞的內源性核酸。另一個例子，靶核酸可以是病原體如病毒或細菌基因組RNA或DNA、質粒、病毒或細菌mRNA等感染細胞而導入細胞或在細胞中表達的核酸等。
第一和第二 (和/或任選的第三、第四等)靶核酸可以是單一核酸分子的一部分，或者可以是不同的分子。在以下"實施、應用和優點"章節中更詳細討論了此二種方法各自的優點和應用。在一類實施方式中，第一靶核酸是第一niRNA，第二耙核酸是第二mRNA。在另一類型實施方式中，第一耙核酸包含mRNA的第一區域，第二靶核酸包含該同一 mRNA的第二區域；此法可提高mRNA檢測的特異性。在另一類型實施方式中，第一靶核酸包含第一染色體DNA多核苷酸序列，第二耙核酸包含第二染色體DNA多核苷酸序列。該第一和第二染色體DNA多核苷酸序列任選位於同一染色體中，如同一基因中，或者不同的染色體中。
34一方面，標準化靶核酸發出的信號。在一類實施方式中，第二耙核酸包括 參比核酸，所述方法包括按第二信號標準化第一信號。參比核酸是選出作為比 較標準品的核酸。已知參比核酸的選擇取決於所需的應用。例如，對於基因表
達分析，當要測定第一和任選的第三、第四等靶核酸mRNA的表達水平時，參 比核酸可以是管家基因轉錄的mRNA。另一個例子，第一靶核酸可以是疾病狀 態時表達改變的mRNA，如腫瘤細胞表達而正常細胞不表達，或腫瘤細胞表達 高於正常細胞的mRNA，同時第二耙核酸是在疾病狀態時表達不改變的管家基 因或類似基因表達的mRNA。還有一個例子，第一靶核酸可以是在腫瘤細胞中 擴增或缺失的染色體DNA序列，而第二靶核酸是在腫瘤細胞中維持正常拷貝 數的另一染色體DNA序列。本文描述了示範性的參比核酸，本領域熟知許多 這種核酸。
任選將耙細胞測定結果與參比細胞測定結果作比較。檢測參比細胞，例如 根據所需應用選擇作為標準的非腫瘤性未感染細胞或其它健康正常細胞中的 第一和第二耙核酸。可按上述參比核酸標準化發出的信號。作為一個例子，第 一靶核酸可以是Her-2基因，目的是檢測Her-2基因的擴增。可按照在基因組 DNA中拷貝數保持穩定的參比基因標準化此Her-2的信號。可與正常細胞作比 較，將靶細胞(如腫瘤細胞或懷疑為腫瘤細胞)Her-2基因的標準化信號與參 比細胞(如正常細胞)的標準化信號作比較，來確定癌細胞中的拷貝數。
所述標記(第一、第二、第三等)必須是能直接或間接提供可檢測信號的 任何常規標記。 一方面，第一標記是第一螢光標記，第二標記是第二螢光標記。 因此檢測標記發出的信號包括檢測標記發出的螢光信號。已知有多種相互區別 的螢光標記，包括例如，螢光斑點和量子斑點。作為其它例子，所述標記可以 是冷光標記、散射光標記(如膠體金顆粒)或酶(如鹼性磷酸酶或辣根過氧化 物酶)標記。
可用所述方法檢測基本上任何樣品類型的細胞中存在的靶核酸。例如樣品 可得自體液、肌體廢液、血液、骨髓、痰液、尿液、淋巴結、糞便、陰道分 泌液、宮頸乳頭塗片、口腔拭子和其它拭子或塗片、骨髓液、唾液、痰液、射 精液、精液、淋巴液、細胞間液、組織(如組織勻漿液)、活檢組織樣品和/ 或腫瘤組織。樣品和/或細胞可得自人體、動物、植物或培養的細胞中的一種或 多種。本發明方法篩檢的樣品可得自甚至較大體積的物質如體液或肌體廢液，
這些樣品的取得採用的是相對無侵害性的方法。任選在徵得同意後採用標準的實驗室方法獲得這些樣品。
檢測細胞中靶核酸的方法可用於鑑定細胞。例如，根據細胞所含核酸和其水平來鑑定細胞是否為所需類型。因此，在一類實施方式中，所述方法包括根據細胞中的第一和和第二信號(及任選的第三、第四等信號)來鑑定細胞是否為所需的靶細胞。可根據一種或多種靶核酸的存在與否鑑定細胞。類似地，可根據一種或多種靶核酸的相對信號強度或表達水平來鑑定細胞。通常如上所述將信號標準化和/或與參比細胞的信號作比較。
甚至可用所述方法來檢測和鑑定罕見細胞類型。因此樣品所含的細胞可能是所需耙細胞和其它非靶細胞的混合物，其中非耙細胞存在的量超過耙細胞。
例如，樣品中靶細胞與所有其它類型細胞的比率任選低於l:lx104、低於l:lx105、低於l:lx106、低於l:lx107、低於l:lx108、或甚至低於l:lx109。
採用上述方法和適當選擇的靶核酸，根據細胞中核酸成分(是否存在一種或多種核酸、其表達水平和拷貝數)的不同，可檢測和鑑定基本上任何類型的細胞。作為幾個例子，生物學樣品(如血液或其它體液)中的所述細胞可以是循環性腫瘤細胞、病毒感染細胞、母血中的胚胎細胞、細菌細胞或其它微生物細胞、或血液中的內皮細胞、內皮前體細胞、心肌細胞、幹細胞或T細胞。如需要可用本領域已知方法(如裂解紅細胞，分離外周血單個核細胞，通過磁激活細胞分離術(MACS)等進一步富集罕見細胞)先富集罕見細胞然後進行檢測。所述方法任選與其它技術如核DNA的DAPI染色術聯用。證明所述方法可任選同時檢測各種不同的核酸標誌物而用於鑑定細胞。例如，可根據細胞中存在一種靶核酸或其相對表達水平，和不存在另一種靶核酸來鑑定細胞；例如如果存在腫瘤細胞中所見的而血細胞中未見(或表達水平不同)的一種或多種標誌，可鑑定為循環性腫瘤細胞，並且不存在血細胞和非循環性腫瘤細胞中的一種或多種標誌可證實其腫瘤細胞身份。此原理可延伸至任何其它類型的標誌，如單種細胞的蛋白質標誌。
通常細胞需要先固定和滲透處理，然後再與捕獲探針雜交，以保留細胞的靶核酸並允許捕獲探針、標記探針等進入細胞。任選洗滌細胞以除去未被任一靶核酸捕獲的物質。可任意步驟之後洗滌細胞，例如捕獲探針與靶核酸雜交後洗滌細胞以除去未結合的捕獲探針，輔放大核酸、放大核酸和/或標記探針與捕獲探針雜交後洗滌細胞等等。
可同時或依次以基本上任何方便的順序進行各捕獲和雜交步驟。優選同時進行所有靶核酸的給定雜交步驟。例如，可一次將所有的捕獲探針加入細胞使它們與其相應的靶核酸雜交，洗滌細胞，使放大核酸(第一、第二等)與相應 的捕獲探針雜交，洗漆細胞，使標記探針與相應的放大核酸雜交，再洗滌細胞， 然後檢測標記物。另一例子是，捕獲探針與靶核酸雜交，洗滌細胞， 一起加入 放大核酸和標記探針使之雜交，洗滌細胞然後檢測。證明宜通過例如加熱變性 雙鏈靶核酸，再使相應的捕獲探針與靶核酸雜交。
所用方法的所有或大部分步驟中細胞宜為懸浮液，以便於操作。然而，所 述方法也可用於固態組織樣品(如組織切片)和/或固定在基材(如載玻片或其 它表面)上的細胞。因此，在一類實施方式中，樣品是含有細胞的懸浮細胞， 和/或雜交、捕獲和/或檢測步驟均為懸浮細胞。例如雜交、捕獲、任選的洗滌 和檢測步驟中細胞樣品是懸浮細胞。在其它實施方式中，樣品為含有細胞的懸 浮液，而在雜交、捕獲和/或檢測步驟期間細胞固定在基材上。例如，在雜交、 捕獲、任選的洗滌和檢測步驟時為懸浮細胞，而在檢測步驟時為固定在基材上 的細胞。
可任選用本領域熟知的任何一種技術檢測標記發出的信號和它們的強度。 例如，在細胞為懸浮液的實施方式中，可用流式細胞術方便地檢測第一和第二 (任選第三等)信號。在細胞固定在基材上的實施方式中，可用雷射掃描或 顯微鏡如螢光或自動化掃描顯微鏡檢測第一和第二 (任選第三等)信號。如上 所述，檢測是單個細胞水平的檢測。通常可在一次操作(如一次流式細胞術或 一次顯微鏡或掃描觀察時)中檢測各標記發出的信號，而不是在分開的操作中 依次檢測各標記。這種一次檢測操作包括例如，在檢測不同標記時更換濾光片， 但不是檢測第一標記，然後捕獲第二標記後，然後再檢測第二標記。在某些實 施方式中，使第一和第二 (任選第三等)標記同時被它們各自的靶核酸捕獲， 但在分開的檢觀I」步驟或操作中檢湖'J 。
可將本文描述的，如以下標題為"實施、應用和優點"的章節中描述的其 它特徵應用於相關方法。例如以下更詳細描述的方法中，標記探針可包括一種 以上相同或不同的標記。如需要，任選可根據二靶核酸之間預計的拷貝數調節
信號強度；例如，可擴增低水平表達的mRNA的信號強度(如每個標記探針採 用更多標記，和/或利用輔放大核酸、放大核酸使每個拷貝的靶核酸捕獲更多標 記探針)使之高於高表達mRNA的信號強度。
本發明另一方面，通過單個細胞核酸的原位擴增檢測兩種或多種核酸。為 了防止所產生的擴增子漏出細胞，可按照Li等(2006)"檢測和定量罕見序列變體的BEAMing up (BEAMing up for detection and quantification of rare sequence variants)" Nature Methods.3(2):95-7所述製備油包水乳液，將單個細胞 隔離在不同區室中。
按參比核酸標準化，檢測相對水平
如上簡述，檢測到的感興趣核酸信號可按標準的參比核酸信號標準化。一 通用類型實施方式提供檢測單個細胞中一種或多種靶核酸的相對水平的方法。 在所述方法中提供含細胞的樣品。所述細胞含有或被懷疑含有第一耙核酸和第 二參比核酸。也提供含第一標記的第一標記探針，含第二標記的第二標記探針， 第一標記發出的信號可與第二標記發出的信號相區別。在細胞中，第一標記探 針被第一靶核酸捕獲(當細胞中存在此第一靶核酸時)，第二標記探針被第二 參比核酸捕獲。然後檢測單個細胞中第一標記發出的第一信號和第二標記發出 的第二信號，並測定各信號的強度。將第一信號的強度按第二 (參比)信號標 準化。由於第一和第二標記與它們各自的核酸相關聯，從而可測定此細胞中第 一靶核酸相對於第二參比核酸的水平，所述方法任選為定量方法，而允許檢測 細胞中第一靶核酸對第二參比核酸的相對含量。因此可將按第二信號標準化的 第一信號的強度與細胞中存在的第一靶核酸含量相關聯。
標記探針可直接與核酸結合。例如，第一標記探針可與第一靶核酸雜交， 和/或第二標記探針可與第二參比核酸雜交。或者，某些或所有的標記探針可通 過捕獲探針間接結合它們相應的核酸。例如，第一和第二標記探針可直接結合 核酸，或一種直接結合而另一種間接結合，或二者都間接結合。
任選通過捕獲探針使標記探針被核酸捕獲。在一類實施方式中，提供至少 一種第一捕獲探針和至少一種第二捕獲探針。在細胞中，第一捕獲探針與第一 靶核酸雜交，第二捕獲探針與第二參比核酸雜交。第一標記探針被第一捕獲探 針捕獲，第二標記探針被第二捕獲探針捕獲，進而使第一標記探針被第一靶核 酸捕獲，第二標記探針被第二參比核酸捕獲。也可將上述方法描述的特徵應用 於這些實施方式，即關於標記和捕獲探針的構型和數目、任選採用輔放大核酸 和/或放大核酸、滾動循環擴增環形多核苷酸等等。
所述方法可用於核酸的多重檢測，包括同時檢測兩種或多種靶核酸。因此
所述細胞任選含有或被懷疑含有第三靶核酸，所述方法任選包括提供含第三 標記的第三標記探針，其中第三標記發出的第三信號可與第一和第二信號相區別；在細胞中使第三標記探針被第三靶核酸(當細胞中存在時)捕獲；檢測第 三標記發出的第三信號，該檢測包括測定第三信號的強度；和將第三信號的強 度按第二信號強度標準化。或者，可按不同的參比核酸標準化第三信號。如需 要可類似地同時檢測第四、第五、第六核酸等。任選使第三、第四第五等標記 探針與它們相應的核酸直接雜交，或如第一和第二標記探針所述，可通過捕獲 探針使它們間接被捕獲。
所述方法用於基因表達分析、基因檢測、擴增或缺失、或疾病檢測或診斷 只是舉了幾個例子。靶核酸基本上可以是要檢測的細胞中的任何核酸。例如， 靶核酸可以是DNA、染色體DNA、 RNA、 mRNA、 microRNA、核糖體RNA 等等。靶核酸可以是細胞的內源性核酸，或另一例子，靶核酸可以是病原體如 病毒或細菌基因組RNA或DNA、質粒、病毒或mRNA等感染細胞而導入的或 在細胞中表達的核酸。參比核酸類似地可以是DNA、 mRNA、染色體DNA、 mRNA、細胞的內源性RNA等等。
如上所述，可根據所需應用來選擇參比核酸。例如，對於基因表達分析，
當要檢測第一和任選的第三、第四等靶核酸是mRNA的表達水平時，參比核酸
可以是從管家基因轉錄的mRNA。另一例子，第一靶核酸可以是在疾病狀態時
表達發生改變的mRNA，如腫瘤細胞表達而正常細胞不表達，或腫瘤細胞表達
水平高於正常細胞的mRNA，而參比核酸是管家基因表達的或與其類似的在疾
病狀態時表達不改變的基因的mRNA。在一類似例子中，靶核酸可以是病毒或
細菌核酸，而參比核酸是細胞的內源核酸。還有一個例子，第一靶核酸可以是
腫瘤細胞中擴增的或缺失的染色體DNA序列，而參比核酸是該腫瘤細胞中維
持正常拷貝數的另一染色體DNA序列。本文描述了示範性的參比核酸，本領
域熟知有更多的參比核酸。
在一類實施方式中，第一靶核酸是第一 mRNA，第二參比靶核酸是第二
mRNA。在另一類實施方式中，第一靶核酸包含第一染色體DNA多核苷酸序 列，第二參比耙核酸包含第二染色體DNA多核苷酸序列。該第一和第二染色 體DNA多核苷酸序列任選位於同一染色體或不同染色體上。
任選將細胞的標準化(檢測)結果與參比細胞的標準化結果作比較。即也 檢測參比細胞如非腫瘤、非感染的或其它健康的正常細胞中的靶核酸和參比核 酸，選擇用作比較的標準取決於所需的應用。作為一個例子，第一靶核酸可以 是Her-2基因，目的是檢測Her-2基因的擴增。可按照在基因組DNA中拷貝數保持穩定的參比基因標準化此Her-2的信號。可與正常細胞作比較，將耙細胞 (如腫瘤細胞或懷疑為腫瘤細胞)Her-2基因的標準化信號與參比細胞(如正 常細胞)的標準化信號作比較來確定癌細胞中的拷貝數。
如需要，任選根據靶核酸與參比核酸預計的拷貝數調節它們之間的信號強 度。例如，可放大低水平表達的靶mRNA信號(如每個標記探針採用多個標記 和/或採用捕獲探針、輔放大核酸和放大核酸使每個拷貝的靶核酸捕獲更多的標 記探針)使其強度高於高表達的mRNA (例如可以使標記探針直接結合參比核 酸，或利用捕獲探針和放大核酸而不用輔放大核酸來檢測等等)。
可利用檢測細胞中耙核酸相對水平的方法來鑑定細胞。例如，可根據細胞 所含的核酸及其水平來鑑定細胞是否為所需類型。在一類實施方式中，所述方 法包括根據標準化的第一信號(和任選標準化的第三、第四等信號)來鑑定是 否為所需靶細胞。如本文所述，可根據一種或多種靶核酸的存在與否來鑑定細 胞。類似地，可根據一種或多種靶核酸的信號強度或表達水平來鑑定細胞。任 選將其信號與參比細胞的信號作比較。
可採用所述方法來檢測和鑑定甚至罕見的細胞。因此，所述樣品包含的細 胞可能是所需靶細胞與其它非靶細胞的混合物，其中非靶細胞存在的量可能超 過耙細胞。例如，樣品中靶細胞與所有其它細胞的比率任選低於l:lx104、低於 l:lx105、低於l:lx106、低於l:lx107、低於l:lx108、或甚至低於l:lx109。
利用所述方法和適當選擇的靶核酸和參比核酸可檢測和鑑定基本上任何 類型的細胞，根據其核酸組成(根據一種或多種核酸的存在、缺失或拷貝數) 進行區分。作為幾個例子，生物樣品(如血液或其它體液)中的所述細胞可以 是循環性腫瘤細胞、病毒感染細胞、母血中的胚胎細胞、細菌細胞或其它微生 物細胞、或血液中的內皮細胞、內皮前體細胞、或心肌細胞。如需要可用本領 域已知方法(如裂解紅細胞，分離外周血單個核細胞)先富集罕見細胞然後進 行檢測。所述方法任選與其它技術，如核DNA的DAPI染色術聯用。證明所述 方法可任選同時檢測各種不同類型的核酸標誌物來鑑定細胞。例如，可根據細 胞中存在一種耙核酸或其相對表達水平，和不存在另一種靶核酸來鑑定細胞， 例如存在腫瘤細胞中所見的而血細胞中未見(或表達水平不同)的一種或多種 標誌，並且不存在血細胞和非循環性腫瘤細胞中存在的一種或多種標誌，可鑑 定為循環性腫瘤細胞。此原理可延伸至任何其它類型標誌，如單種細胞的蛋白 質標誌上述方法提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事項；例 如，關於樣品的來源、細胞的固定和滲透、細胞洗滌、雙鏈靶核酸與參比核酸 的變性、標記的類型、採用任選的封閉探針、信號的檢測、流式細胞術或顯微 鏡檢測(和強度測定)、細胞以懸浮液存在或固定在基材上等等。還有，可將 本文所述，如題為"實施、應用和優點"章節中所述的其它特徵應用於相關方 法中。
本發明方法可用於分析單個細胞中的基因表達。目前基因表達分析的是異 質細胞群如血液或腫瘤標本。血液含有各種亞型的白細胞，當測到全血或從血
中分離的RNA基因表達變化時，不確切知道是哪種亞型血細胞的基因表達發 生變化。例如，在疾病中或藥物治療時可能只有某一種亞型血細胞的基因表達 受到影響。因此需要能夠測定單個細胞中基因表達，從而檢測單個細胞中基因 表達的變化的技術。類似地，腫瘤標本包含的異質細胞群包括腫瘤細胞、正常 細胞、基質細胞、免疫細胞等。目前的技術通過總RNA或細胞裂解液測定的 是這些細胞的總體表達。然而，此種總體表達不能代表腫瘤靶細胞的表達。因 此再次表明需要觀察單個細胞的表達變化，從而可專門檢査腫瘤靶細胞，觀察 腫瘤靶細胞的基因表達如何變化以及它們對藥物治療如何反應。
一方面，本發明提供分析單個細胞中基因表達的方法。可通過檢測靶基因 的表達和如上所述按管家基因的表達標準化來執行單細胞基因表達的分析。作 為一些例子，可將疾病時標準化的表達與正常時的作比較，或可將藥物治療時
的表達與正常時的作比較。單細胞中的表達變化具有生物學顯著性時，表明疾 病發展、治療有效和/或有毒性、腫瘤的階段和類型等等。
因此， 一類通用實施方式提供比較單個細胞基因表達的分析方法。此方法 中，提供的第一混合細胞群包含一種或多種特定類型的細胞。提供的第二混合 細胞群也包含一種或多種特定類型的細胞。檢測第一群特定類型細胞中一種或 多種耙核酸與參比核酸的相對表達水平以提供第一表達模式。檢測第二群特定 類型細胞中一種或多種靶核酸與參比核酸的相對表達水平以提供第二表達模 式。比較該第一與第二表達模式。
在一類實施方式中，所述一種或多種靶核酸是一種或多種mRNA，如二種 或更多種，三種或更多種，四種或更多種等mRNA。可檢測各mRNA與作為參 比核酸的管家基因mRNA的相對表達水平。
該第一和/或第二混合細胞群除特定類型細胞外包含至少一種其它類型細胞，更具體說，包含至少二種或更多種其它類型細胞，和任選的幾種到多種其 它類型細胞(如全血、腫瘤或其它複雜生物樣品中的細胞)。特定類型細胞與
所有其它類型細胞的比率任選低於l:lx104、低於l:lx05、低於l:lx06、低於 l:lx107、低於l:lx108、或甚至低於l:lx109。
如將證明的那樣，二個細胞群之間基因表達模式的變化可提示疾病狀態、 藥物反應、治療效果等。因此例如，第一混合細胞群可以是已診斷或待診斷患 某具體疾病病人的，而第二混合細胞群是健康個體的細胞群。類似地，例如所 述第一和第二混合細胞群可得自同一位個體但採自不同時間，以隨訪疾病的發
展或評估對藥物治療的反應。因此，該第一混合細胞群可得自藥物或其它化合 物開始治療前的個體(如人)，而第二群得自開始治療後某特定時間的該個體。 另一個例子，第一混合群得自治療個體，而第二混合群得自未治療的個體。
上述方法提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事項；例 如，耙和參比核酸的類型、樣品的來源、細胞的固定和滲透處理、細胞洗滌、 雙鏈靶和參比核酸的變性、標記的類型、標記探針、捕獲探針、輔放大核酸和 /或放大核酸的使用和構型、採用任選的封閉探針、信號的檢測、流式細胞術或 顯微鏡檢測(和其強度檢測)、細胞以懸浮液存在或固定在基材上等等。本文 描述的是示範性靶核酸和參比核酸。
另一方面，可採用所述方法來比較第一群(如腫瘤細胞)單個細胞中的拷 貝數與第二群(如用作參比的正常細胞)單個細胞中的拷貝數。所述靶核酸可 以是轉錄物或基因組DNA，例如，將Her-2基因的擴增或缺失程度與腫瘤發展 相關聯。另一方面，可將所述方法用於甚至一種細胞群(包括例如同類型但處 在細胞周期不同階段)的單個細胞基因表達分析。
標記密度
與現有技術相比，本發明的方法允許更多的標記被靶核酸中的小區域所捕 獲。例如，標準的FISH技術通常採用得自覆蓋20kb或更長(區域)的探針， 該探針一般含有化學方法偶聯的螢光團，密度為探針每7個核苷酸約一個螢光 分子。當採用分子信標檢測時， 一對標記被靶核酸中該信標覆蓋的通常約40 個核苷酸的區域所捕獲。目前的示範性技術的其它討論可參見如美國專利申請 公布號2004/0091880和2005/0181463、 USPN6,645,731及國際專利申請公布號 WO95/09245和03/019141。比較而言，本文所述方法在一個捕獲探針所覆蓋的耙核酸區域(如20-25
個核苷酸或更多)中不難捕獲數百個(如400個或更多)標記。理論上對於任何
給定構型的捕獲探針、放大核酸等，不難計算出一個捕獲探針可達到的放大程 度；例如，理論上一個捕獲探針可達到的放大程度以及由此該捕獲探針每個核 苷酸長度的標記數等於與該捕獲探針結合的輔放大核酸數乘以結合各輔放大 核酸的放大核酸數，再乘以結合各輔放大核酸的標記探針數，再乘以每個標記 探針中的標記數。
因此在一方面，本發明提供促進高密度標記與細胞中靶核酸結合的方法。 一類通用實施方式提供檢測單個細胞中兩種或多種耙核酸的方法。在此方法 中，提供含細胞的樣品。所述細胞含有或被懷疑含有第一靶核酸和第二耙核酸。 所述細胞中，第一標記被第一靶核酸(當細胞中存在時)捕獲，第二標記被第 二革巴核酸(當細胞中存在時)捕獲。第一標記發出的第一信號可與第二標記發 出的第二信號相區別。如上所述標記被高密度捕獲。因此，第一靶核酸的橫跨
至少20個毗連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至少捕獲一個拷貝的第一標記， 第二靶核酸的橫跨至少20個毗連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至少捕獲一 個拷貝的第二標記。檢測第一標記發出的第一信號和第二標記發出的第二信 號。
在一類實施方式中，第一靶核酸的橫跨至少20個毗連核苷酸的區域中每 個核苷酸平均至少捕獲4、 8或12個拷貝的第一標記，第二靶核酸的橫跨至少 20個毗連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至少捕獲4、 8或12個拷貝的第二標 記。在一實施方式中，第一靶核酸的橫跨至少20個毗連核苷酸的區域中每個 核苷酸平均至少捕獲16個拷貝的第一標記，第二靶核酸的橫跨至少20個毗連 核苷酸的區域中每個核苷酸平均至少捕獲16個拷貝的第二標記。
上述方法提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事項；例 如，關於標記的類型，信號的檢測，細胞的類型、處理和懸浮等。第一和第二 靶核酸的所述區域任選橫跨至少25、 50、 100、 200個或更多毗連核苷酸和/或 最多2000、 1000、 500、 200、 100、 50個或更少核苷酸。對於第三、第四、第 五、第六等靶核酸任選存在相同密度的第三、第四、第五、第六等標記。
如上所述，可通過檢測細胞的組成核酸來檢測和鑑定細胞。對於某些應用:宜檢測大的異質混合細胞中的罕見細胞、檢測多種冗餘的核酸標誌來檢測罕見 細胞。以下假設的實施例說明了檢測冗餘標誌的一種益處。
假設在血樣品中檢測到循環性腫瘤細胞(CTC) ， CTC的濃度是1(^個正 常白細胞中一個腫瘤細胞。如CTC的一種標誌核酸(例如，此核酸的存在或拷 貝數是獨特的、足夠與細胞群中的其它細胞相區別)具有的檢測特異性為103 中一個，當計數106個細胞時將有1000個細胞被錯誤鑑定為CTC。(此假陽性 可能來自相關探針或類似因子非特異性結合所產生的隨機背景信號)。如果包 括自身檢測特異性也為103中一個的另一種獨立標誌，只有在這二種標誌均陽 性時細胞才鑑定為CTC，此種聯合檢測的特異性理論上將顯著提高到 10、103=106中一個。在這種推測下，此特異性對正常血白細胞的CTC直接檢 測已足夠。類似地，如果採用三種獨立的冗餘標誌檢測CTC，檢測特異性可增 加至109中一個。因此採用兩種或多種冗餘標誌可減少假陽性數而有利於檢測 複雜樣品中的罕見細胞。
因此， 一通用實施方式提供檢測特定類型單個細胞的方法。此方法中提供 的樣品包含含有至少一種特定類型細胞的細胞混合物。提供的第一標記探針含 第一標記，第二標記探針含第二標記，其中第一標記發出的信號可與第二標記 發出的信號相區別。在細胞中，第一標記探針被第一靶核酸(當細胞中存在第 一耙核酸時)捕獲，第二標記探針被第二靶核酸(當細胞中存在第二靶核酸時) 捕獲。檢測第一標記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號，並將其與細 胞中相應的第一和第二耙核酸存在與否或含量相關聯。根據細胞中第一和第二 耙核酸存在與否或含量(如非零含量)的檢測鑑定該細胞是否為特定類型細胞， 根據細胞中第一耙核酸的存在與否或含量，或者第二靶核酸存在與否或含量 (即該特定類型細胞冗餘標誌的靶核酸)，區別混合群中的特定類型細胞與其 它類型細胞。任選測定第一信號強度和第二信號強度，並將其與細胞中存在的 相應核酸含量相關聯。
各耙核酸可作為特定類型細胞的標誌，通過其在細胞中的存在、含量(拷 貝數，如基因拷貝數或轉錄物表達水平)、或細胞缺失此標誌(標誌陰性)， 來區分該特定類型細胞與其它類型細胞。 一組靶核酸可包括不同類型的這種標 志；即一種靶核酸可作為陽性標誌，通過其在細胞中的存在或非零含量鑑別該 細胞，而另一種作為陰性標誌，通過其在細胞中的缺失鑑別該細胞。例如在一 類實施方式中，所述細胞包含第一靶核酸和第二靶核酸，根據細胞中檢測到的第一和第二靶核酸二者的存在或含量，鑑定該細胞是否為特定類型，根據細胞 中第一靶核酸的存在或含量，或者第二靶核酸存在或含量，區別混合群中的特 定類型細胞與其它類型細胞。
標記探針可直接與靶核酸結合。例如，第一標記探針可與第一靶核酸雜交， 第二標記探針可與第二靶核酸雜交。或者，某些或所有的標記探針可間接通過 例如捕獲探針與它們相應的靶核酸結合。例如，第一和第二標記探針可直接結 合靶核酸，或者一個直接結合而另一個間接結合，或二者均間接結合。
標記探針可任選通過捕獲探針捕獲耙核酸。在一類實施方式中，提供至少 一種第一捕獲探針和至少一種第二捕獲探針。在細胞中第一捕獲探針與第一耙 核酸雜交，第二捕獲探針與第二靶核酸雜交。第一標記探針被第一捕獲探針捕 獲，第二標記探針被第二捕獲探針捕獲，從而使第一標記探針被第一靶核酸捕 獲，和第二標記探針被第二靶核酸捕獲。以上方法所述的特徵也可應用於這些 實施方式，包括標記和捕獲探針的構型和數目、任選採用輔放大核酸和/或放大 核酸、環形多核苷酸的滾動循環擴增等等。
任選檢測細胞中的第三、第四、第五等靶核酸。例如，該方法任選包括 提供含第三標記的第三標記探針，其中第三標記發出的第三信號可與第一和第 二信號相區別，在細胞中第三標記探針被第三靶核酸(當細胞中存在時)捕獲， 檢測第三標記發出的第三信號。任選使第三、第四、第五等標記探針與它們相 應的核酸直接雜交，或如第一和第二標記探針所述那樣通過捕獲探針間接捕 獲。
在各種方法中可任意釆用其它標誌。例如，所述細胞可能含有第三靶核酸， 可將第一和/或第二信號按第三信號標準化。所述方法包括根據標準化的第一和 /或第二信號鑑定細胞是否為特定類型；在這種實施方式中，可根據第一和/或 第二耙核酸的拷貝數，而不只是根據它們存在於靶細胞類型中但不存在其它類 型細胞中，來鑑別靶細胞類型與混合物中其它類型細胞。例子包括根據不同基
因表達模式檢測細胞，根據一種或多種特定mRNA的過度表達檢測CTC或其 它腫瘤細胞，和根據一種或多種特定染色體區域的擴增或確實來檢測CTC或其 它腫瘤細胞。
作為另一例子，可利用第三靶核酸作為靶細胞類型的第三冗餘標誌，來提 高對所需細胞類型的檢測特異性。因此在一類實施方式中，所述方法包括將細 胞測到的第三信號與細胞中第三靶核酸的存在、缺失或含量相關聯，和根據細胞中第一、第二和第三靶核酸的存在、缺失或含量來鑑定細胞是否為特定類型， 根據細胞中第一靶核酸的存在、缺失或含量，第二靶核酸的存在、缺失或含量， 或第三靶核酸的存在、缺失或含量，來鑑別特定類型細胞與混合物中其它類型 的細胞。
還有另一例子可利用其它標誌幫助鑑定細胞類型。例如，第一和第三的存 在、缺失或含量可能足以鑑定細胞類型，如同第二和第四標記的存在、缺失或 其含量足以鑑定細胞類型；可檢測所有四種標誌以提供二套冗餘標誌，從而提 高了檢測的特異性。作為另一例子，可利用一種或多種其它標誌對不需要的細 胞類型作陰性選擇；例如，可通過血細胞和非循環性腫瘤細胞中不存在的一種 或多種標誌進一步驗證某細胞的身份是否為CTC。
檢測其它耙核酸還可提供進一步的信息用於診斷、結局預測等，而不論此 耙核酸是否作為特定類型細胞的標誌。例如，其它靶核酸可以是包括增殖能力、 凋亡、或其它轉移性、遺傳性、或後成性變化的標誌。
任選將其它靶核酸的信號按上述參比核酸標準化。如需要，任選依據它們 預計的拷貝數調節靶核酸之間的信號強度。如上所述任選將細胞中的靶核酸信 號與參比細胞的信號作比較。
靶核酸基本上可以是細胞中需要檢測的任何核酸。例如，靶核酸可以是 DNA、染色體DNA、 RNA、 mRNA、 microRNA、核糖體RNA等等。靶核酸可 以是細胞的內源性核酸，作為另一例子，靶核酸可以是病原體如病毒或細菌基 因組RNA或DNA、質粒、病毒或mRNA等感染細胞而導入的或在細胞中表達
的核酸。
第一和第二 (和/或任選的第三、第四等)靶核酸可以是一種核酸分子的組 成部分，或它們可以是分開的分子。例如在以下題為"實施、應用和優點"章 節中更詳細討論了此二種方法的各種優點和應用。在一類實施方式中，第一靶 核酸是第一mRNA，第二靶核酸是第二mRNA。在另一類實施方式中，第一靶 核酸包含某mRNA的第一區域，第二靶核酸包含該同一 mRNA的第二區域。 另一類實施方式中，第一靶核酸包含第一染色體DNA多核苷酸序列，第二靶 核酸包含第二染色體DNA多核苷酸序列。該第一和第二染色體DNA多核苷酸 序列任選位於同一染色體如同一基因中，或位於不同染色體上。
甚至可用所述方法來檢測和鑑定罕見類型的細胞。例如，混合群中特定類 型的細胞與所有其它類型細胞的比率任選低於l:lx104、低於l:lx105、低於l:x106、低於l:lx107、低於l:lx108、或甚至低於l:lx109。
利用上述方法，根據合適的標誌進行區分，可檢測和鑑定基本上任何類型 的細胞。作為幾個例子，所述細胞可以是循環性腫瘤細胞、病毒感染細胞、母 血中的胚胎細胞、生物學樣品(如血液或其它體液)中的細菌細胞或其它微生 物細胞、血液中的內皮細胞、內皮前體細胞、或心肌細胞、幹細胞或T細胞。 如需要可用本領域已知方法(如裂解紅細胞、分離外周血單個核細胞等)先富 集罕見細胞然後進行檢測。
上述方法提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事項；例 如，樣品來源、細胞的固定和滲透處理、細胞洗滌、雙鏈核酸的變性、標記的 類型、採用任選的封閉探針、信號的檢測、流式細胞術或顯微鏡檢測單個細胞 發出的信號(和檢測其強度)、細胞以懸浮液存在或固定在基材上等等。還有 本文例如在題為"實施、應用和優點"章節中所述的其它特徵可應用於相關方 法中。
另一方面，如上所述檢測特定類型的單個細胞，但該類型細胞的第一和第 二耙核酸不一定是冗餘標誌。這類靶核酸基本上可以是任何需要的核酸，包括 例如，該類型細胞的冗餘和/或非冗餘標誌。
組合物和試劑盒
本發明還提供用於實施的或所述方法產生的組合物。 一類示範性實施方式 提供的組合物包含固定和經滲透處理的細胞，該細胞含有或被懷疑含有第一靶 核酸和第二耙核酸、至少一種能與第一耙核酸雜交的第一捕獲探針和至少一種
能與第二靶核酸雜交的第二捕獲探針、含第一標記的第一標記探針和含第二標 記的第二標記探針。第一標記發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相 區別。所述細胞任選包含第一和第二捕獲探針和標記探針。該第一和第二捕獲 探針任選能與細胞中它們各自的靶核酸雜交。
直接使標記探針被靶核酸捕獲的以上方法所述特徵也可應用於這些實施 方式。例如，標記探針可與捕獲探針雜交。在一類實施方式中，所述組合物包 含一種第一捕獲探針和一種第二捕獲探針，其中第一標記探針能與第一捕獲探 針雜交，第二標記探針能與第二捕獲探針雜交。在另一類實施方式中，所述組 合物包含二種或更多種第一捕獲探針和二種或更多種第二捕獲探針、多個第一 標記探針和多個第二標記探針。單個第一標記探針能與各自的第一捕獲探針雜交，單個第二標記探針能與各自的第二捕獲探針雜交。
另一方面，可利用放大核酸來提高各靶核酸捕獲的標記探針數。例如，在 一類實施方式中，所述組合物包含一種第一捕獲探針、 一種第二捕獲探針、多 個第一標記探針、多個第二標記探針、第一放大核酸和第二放大核酸。該第一 放大核酸能與第一捕獲探針雜交和與多個第一標記探針雜交，該第二放大核酸 能與第二捕獲探針雜交和與多個第二標記探針雜交。在另一類實施方式中，所 述組合物包含二種或更多種第一捕獲探針、二種或更多種第二捕獲探針、多個 第一標記探針、多個第二標記探針、第一放大核酸和第二放大核酸。該第一放 大核酸能與一個第一捕獲探針和多個第一標記探針雜交，該第二放大核酸能與 一個第二捕獲探針和多個第二標記探針雜交。
另一方面，可採用輔放大核酸使標記探針被靶核酸捕獲。在一類實施方式 中，所述組合物包含一種第一捕獲探針、 一種第二捕獲探針、多個第一標記探 針、多個第二標記探針、多個第一放大核酸、多個第二放大核酸、第一輔放大 核酸和第二輔放大核酸。該第一輔放大核酸能與第一捕獲探針雜交和與多個第 一放大核酸雜交，該第二輔放大核酸能與第二捕獲探針雜交和與多個第二放大 核酸雜交。而第一放大核酸能與第一輔放大核酸和多個第一標記探針雜交，第 二放大核酸能與第二輔放大核酸和多個第二標記探針雜交。在一類相關實施方 式中，所述組合物包含二種或更多種第一捕獲探針、二種或更多種第二捕獲探 針、多個第一標記探針、多個第二標記探針、多個第一放大核酸、多個第二放 大核酸、多個第一輔放大核酸和多個第二輔放大核酸。該第一輔放大核酸能與 一個第一捕獲探針和多個第一放大核酸雜交，該第二輔放大核酸能與一個第二 捕獲探針和多個第二放大核酸雜交，第一放大核酸能與第一輔放大核酸和多個 第一標記探針雜交，第二放大核酸能與第二輔放大核酸和多個第二標記探針雜 交。任選可採用其它輔放大核酸作為(與捕獲探針雜交的)輔放大核酸與放大 核酸之間的中介物。
在上述類型的實施方式中， 一個捕獲探針與各個標記探針、放大核酸或輔 放大核酸雜交。在另一類相關實施方式中，二個或多個捕獲探針與標記探針、 放大核酸或輔放大核酸雜交。
在一類實施方式中，所述組合物包含多個第一標記探針、多個第二標記探
針、與第一捕獲探針雜交的第一環形多核苷酸滾動循環擴增產生的擴增的第一
多核苷酸，與第二捕獲探針雜交的第二環形多核苷酸滾動循環擴增產生的擴增的第二多核苷酸。該第一環形多核苷酸包含至少一個拷貝的與第一標記探針中 某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，該擴增的第一多核苷酸包含多個拷貝的 與第一標記探針中該多核苷酸序列互補的多核苷酸序列(和因此能與多個標記 探針雜交)。該第二環形多核苷酸包含至少一個拷貝的與第二標記探針中某多 核苷酸序列相同的多核苷酸序列，該擴增的第二多核苷酸包含多個拷貝的與第 二標記探針中該多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。所述組合物還包含產生所 述擴增的多核苷酸必須的試劑，如外源提供的核酸聚合酶、外源提供的核酸連 接酶、和/或外源提供的核苷酸三磷酸(如dNTP)。
所述細胞任選包含其它靶核酸，所述組合物(和細胞)可包含檢測這些耙 核酸的試劑。例如，所述細胞可含有或被懷疑含有第三耙核酸，所述組合物可 包含至少能與第三靶核酸雜交的第三捕獲探針和含第三標記的第三標記探針。 第三標記發出的第三信號可與第一和第二信號相區別。所述細胞任選包含第 四、第五、第六等靶核酸，所述組合物任選包含第四、第五、第六等標記探針 和捕獲探針。
上述方法提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事項，例 如，靶核酸的類型、各種靶(序列)處在一種分子或不同分子中的位置、標記 的類型、包括任選的封閉探針等等。例如，值得注意的是第二靶核酸任選包括 參比核酸。在其它實施方式中，第一和第二靶核酸用作特定類型細胞的標誌， 如冗餘標誌。
所述細胞基本上可以是任何來源任何類型的細胞，具體可根據其核酸組成 (存在、缺失一種或多種核酸或其拷貝數)區分細胞。作為幾個例子，生物學 樣品(如血液或其它體液)中的細胞可以是循環性腫瘤細胞、病毒感染細胞、 母血中的胚胎細胞、細菌細胞或其它微生物細胞、或血液中的內皮細胞、內皮 前體細胞、心肌細胞。例如，所述樣品可得自體液、血液、骨髓、痰液、尿 液、淋巴結、糞便、宮頸乳頭塗片、口腔拭子和其它拭子或塗片、骨髓液、唾 液、痰液、精液、淋巴液、細胞間液、組織(如組織勻漿液)、活檢組織樣品 和/或腫瘤組織。所述細胞可得自人體、動物、植物或培養的細胞之一種或多種。
所述細胞可以是混合細胞，例如，複雜的異質細胞混合物。在一類實施方 式中，所述細胞是特定類型，所述組合物包含一種或多種類型細胞。這些其它 細胞可過量，甚至大大過量存在。例如該組合物中特定類型細胞與所有其它類
型細胞的比率任選低於l:lx104、低於l:lx105、低於l:lx106、低於l:lx107、低於l:lx108、或甚至低於l:lx109。
細胞任選地固定在基材上，以組織切片存在等。然而優選細胞懸浮在該組 合物中。該組合物可裝在流式細胞計數儀或類似儀器中。本文中如在題為"實 施、應用和優點"章節中所述的其它特徵可應用於任選的相關組合物。
本發明另一方面提供含有大量與各靶核酸相關標記的組合物。 一類通用實 施方式提供含細胞的組合物，所述細胞包含第一耙核酸和第二靶核酸；細胞中 存在第一標記表明細胞中存在第一耙核酸，細胞中存在第二標記表明細胞中存 在第二靶核酸，其中第一標記發出的信號可與第二標記發出的信號相區別。細 胞中第一靶核酸的橫跨至少20個毗連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至少捕 獲1個拷貝的第一標記，第二靶核酸的橫跨至少20個毗連核苷酸的區域中每 個核苷酸平均至少捕獲1個拷貝的第二標記。
在一類實施方式中，第一標記的拷貝與第一靶核酸在實質相關，第二標記 的拷貝與第二靶核酸在實質相關。例如，第一標記是第一標記探針的組成部分，
第二標記是第二標記探針的組成部分，所述標記探針被靶核酸捕獲。
在一類實施方式中，細胞中第一靶核酸的橫跨至少20個毗連核苷酸的區 域中每個核苷酸平均至少捕獲4、 8或12個拷貝的第一標記，第二靶核酸的橫 跨至少20個毗連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至少捕獲4、 8或12個拷貝 的第二標記。在一實施方式中，第一靶核酸的橫跨至少20個毗連核苷酸的區 域中每個核苷酸平均至少捕獲16個拷貝的第一標記，第二靶核酸的橫跨至少 20個毗連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至少捕獲16個拷貝的第二標記。
上述實施方式所涉及的基本上所有特徵也適用於這些實施方式及相關事 項，例如關於標記的類型、細胞的懸浮等。第一和第二靶核酸的所述區域通常 是檢測各個靶核酸所用的探針、引物或類似多核苷酸所覆蓋的區域。第一和第 二靶核酸的所述區域任選橫跨至少25、 50、 100、 200個或更多個毗連核苷酸 和/或最多2000、 1000、 500、 200、 100、 50個或更少核苷酸。任選第三、第四、 第五、第六等靶核酸捕獲同樣密度的標記。在原位多重複合物檢測靶核酸的實 施方式中，所述組合物任選包含PCR引物、熱穩定的聚合酶等。
本發明另一方面是用於實施所述方法的試劑盒。 一通用實施方式提供檢測 單個細胞中第一靶核酸和第二靶核酸的試劑盒。該試劑盒的一個或多個容器中 裝有至少一種固定和/或滲透處理細胞的試劑，至少一種能與第一靶核酸雜交的 第一捕獲探針、至少一種能與第二靶核酸雜交的第二捕獲探針、含第一標記的第一標記探針和含第二標記的第二標記探針，其中第一標記發出的第一信號可 與第二標記發出的第二信號相區別。
上述實施方式提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事 項，例如，關於靶核酸的數目、標記和捕獲探針的構型和數目、包括輔放大核 酸和/或放大核酸、包括封閉探針、包括擴增試劑、耙核酸的類型、各種耙(序 列)在一種分子或不同分子上的位置、標記的類型、包括任選的封閉探針等等。 該試劑盒任選可裝有檢測細胞中靶核酸和/或鑑定細胞是否是特定類型的說明 書， 一種或多種緩衝液(如稀釋液、雜交緩衝液、和/或洗滌緩衝液)、含有一 種或多種靶核酸的參比細胞等等。
另一通用實施方式提供通過檢測第一靶核酸和第二靶核酸來檢測混合類 型細胞群中特定類型單個細胞的試劑盒。該試劑盒的一個或多個容器中裝有至 少一種固定和/或滲透處理細胞的試劑，含第一標記的第一標記探針(為檢測第 一靶核酸)和含第二標記的第二標記探針(為檢測第二靶核酸)，其中第一標 記發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別。通過細胞中第一靶核 酸的存在、缺失或含量，或通過細胞中第二靶核酸的存在、缺失或含量，可鑑 別特定類型細胞與混合物中其它類型的細胞(即該二種靶核酸是該特定類型細 胞的冗餘標誌)。
上述實施方式提及的基本上所有特徵都可應用於這些實施方式及相關事 項，例如，關於靶核酸的數目、包括捕獲探針、標記和/或捕獲探針的構型和數 目、包括輔放大核酸和/或放大核酸、包括封閉探針、包括擴增試劑、靶核酸的 類型、各種靶(序列)在一種分子或不同分子上的位置、標記的類型、包括任 選的封閉探針等等。該試劑盒任選還裝有鑑定細胞是否是特定類型的說明書， 一種或多種緩衝液(如稀釋液、雜交緩衝液、和/或洗漆緩衝液)、含有一種或 多種靶核酸的參比細胞等等。
實施、應用和優點
下面更詳細描述本發明的各方面內容。也描述示範性的實施方式和應用。
本文公開的新技術(方法、組合物、系統和試劑盒)、QMAGEX(Quantitative Multiplex Analysis of Gene Expression in Singal Cell,多重定量分析單個細胞中 的基因表達)能檢測和定量單個細胞中的多種核酸。該技術與目前的ISH技術在 幾個方面有顯著不同，雖然二者均可檢測單個細胞中的mRNA表達。首先，在本發明試驗的所有或至少大部分試驗步驟中細胞宜保持懸浮狀態，這大大改進 了試驗的雜交動力學，導致更好的重現性和縮短試驗時間。其次，此技術能同
時和定量分析細胞中多種mRNA轉錄物的表達。這點很需要，因為例如，多種 腫瘤標誌的檢測可大大提高CTC鑑定的準確性(Mocellin等，2004)和大大減 少假陽性率。定量分析基因表達水平不僅有助於區分CTC與其它類型細胞，而 且能幫助區分原代腫瘤的類型和來源以及腫瘤發展的階段。第三，此技術採用 流式細胞計數儀作為檢測基礎，與顯微鏡檢測儀器相比具有更高的處理量。此 外，流式細胞計數儀能選揀細胞如腫瘤細胞作進一步研究。檢測和定量mRNA 的表達之後，分離CTC或其它細胞對進一步確認身份或進一步作細胞學和分子 學分析是有益的。第四，本發明技術大大提高了檢測靈敏度和重現性，能進行 單拷貝基因檢測和定量。此外，本發明技術採用標準的通用標記探針和檢測技 術(如相同的輔放大核酸、放大核酸和標記探針可用於檢測多種不同的耙核酸， 對於各種新的靶核酸組只需要合成一組新的捕獲探針即可)，並任選採用標準 程序進行細胞固定與滲透處理，雜交與洗滌。還有，此技術可包括用於控制檢 測特異性和有效性的固有內標。
本發明技術不僅可用於檢測和計數血液樣品或其它體液中的罕見細胞，而 且可用於任何類型罕見細胞的鑑定和計數。應用包括但不限於檢測白血病和 淋巴瘤的最小殘留病灶；化療後(腫瘤)的復發監測(Hess等)；檢測體液中 的其它前癌細胞如檢測含HPV的宮頸細胞；檢測感染細胞中的病毒或細菌核 酸；檢測母血中的胚胎細胞；檢測腫瘤生長早期的微小腫瘤病灶；或檢測手術 後周邊殘留的腫瘤細胞。在所有這些例子中，腫瘤細胞的特異性基因表達可能 埋藏在大量異質細胞群的背景中。因此，需要從大細胞群分離mRNA的微陣列 或RT-PCR表達分析將難以精確和可靠地檢測這些罕見細胞的存在，而釆用本 發明技術則不難。
還應注意到，雖然本文說明的主要應用是單個細胞檢測和定量多種mRNA 轉錄物，但此技術可同樣應用於檢測其它罕見細胞，包括其染色體DNA或細 胞核酸成分的變化。例子包括但不限於檢測Her-2/neu基因的擴增、檢測Rb 基因的缺失、檢測體細胞突變、檢測例如慢性髓性白血病(BCR-ABL)中的染 色體轉位、或檢測宮頸癌細胞染色體DNA中的HPV插入。
最後，此技術中探針設計、多重複合和擴增方面的內容可應用於定量分析 多重基因表達和測定固體組織切片(例如福馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的
52組織樣品)中單個細胞水平的染色體DNA的變化。
QMAGEX技術包括試驗和任選的實施該試驗的相關自動化裝置。圖1說 明QMAGEX試驗工作流程的主要步驟，採用放大核酸的一示範性實施方式包 括
固定和滲透處理:樣品細胞以懸浮液固定和滲透處理(經滲透處理的細 胞)。固定步驟可使細胞結構的核酸(如mRNA或染色體DNA)固定並使其 交聯。然後，經滲透處理的細胞膜使靶核酸特異性探針和信號產生粒子如螢光 標記核酸探針能進入細胞與耙核酸結合。
變性:如果要檢測的耙核酸是雙鏈染色體DNA，可加入變性步驟將雙鏈耙 核酸轉變為單鏈DNA，準備好與靶特異性探針結合。
捕獲探針雜交:使精心選擇的耙特異性捕獲探針或探針組與靶核酸雜交。 捕獲探針的作用是特異性連接靶分子與信號產生粒子。此技術使細胞中的多種 耙基因能夠同時和高度特異性地被不同的探針所識別。
信號放大:可通過大的支架分子(放大核酸)與捕獲探針或探針組的結合
來放大耙分子的信號。各支架分子含有多個接受標記探針和信號產生粒子的位 點。在多重試驗中，釆用多種獨特的放大核酸。
標記:此步驟中使結合於信號產生粒子的標記探針與放大核酸雜交。在多 重試驗中，採用多種不同的標記探針。
洗滌:通過洗滌步驟除去未結合的或非特異性結合的過量探針或信號產生 粒子，此步驟降低了背景噪聲和提高了信噪比。在捕獲探針雜交或信號擴增步 驟中加入額外的洗滌步驟可進一步提高試驗性能。
檢測:採用螢光激活細胞分揀(FACS)儀或流式細胞計數儀檢測標記的 懸浮細胞，或用顯微鏡或掃描儀檢測固定在固體表面的細胞。
在以下章節中將詳細描述QMAGEX技術的主要組成。以下描述中，術語 標記探針指能直接或間接結合靶分子而使該靶分子能夠通過讀出儀檢測的物 質。標記探針一般包含能直接或間接結合靶分子的和結合一個或多個"信號產 生粒子"(即標記物，能產生可被讀出儀識別的信號)的核酸或修飾的核酸分 子。在間接模式中，標記探針或通過結合捕獲探針與靶分子直接結合，或通過 結合放大核酸進而與捕獲探針相連。示範性的信號產生粒子(標記物)包括但
不限於螢光分子、納米顆粒、放射性同位素、化學發光分子(如地高辛、二
硝基苯)，螢光分子包括但不限於螢光素(FITC) 、 cy3、 cy5、 alexa染料、藻紅素等等。納米顆粒包括但不限於螢光量子斑點、螢光散射顆粒等。術語捕 獲探針指能直接或間接連接靶核酸與特定類型標記探針的核酸或修飾的核酸。 術語"捕獲探針組"指能直接或間接連接靶核酸與特定類型標記探針的多個核 酸或修飾的核酸，以提高試驗的靈敏度。術語放大核酸指能結合一個或多個捕 獲探針，或一側結合輔放大核酸另一側結合多個標記探針的大支架分子。 固定
此步驟中，核酸在細胞結構中通過交聯而固定在細胞內。已有採用固定試 劑固定懸浮細胞和封閉內源性RNA酶活性的各種熟知方法，這些方法適合用 於本發明。固定試劑包括福馬林(甲醛)、低聚甲醛、戊二醛、乙醇、甲
醇等。一種常用的組織切片固定溶液是含0.25%戊二醛和4%低聚甲醛的磷酸緩 衝液。另一種常用的組織切片固定液含50%乙醇、10%福馬林(含37%甲醛) 和5%乙酸。任選採用本領域熟知的技術，測試不同濃度的固定試劑的不同組 合以尋找固定懸浮細胞的最優組合。也要優化固定處理的時間。固定溶液可含 有一些不同的RNA酶抑制劑，如RNAlater (Ambion)、擰檬或LiCI等。 滲透處理
固定將導致靶核酸與細胞中的蛋白質或其它細胞成分交聯，而阻礙或阻止 了捕獲探針滲入細胞和屏蔽了要雜交的靶分子。本發明的試驗通常包括使細胞 中核酸能夠雜交的後續滲入處理步驟。 一種技術包括加熱持續不同時間來破壞 交聯。證明此法可提高細胞中mRNA的雜交可及性。也可利用洗滌劑(如Triton X-100或SDS)和蛋白酶K來提高固定細胞的可滲透性。洗滌劑處理常採用 Triton X-100或SDS通過抽提脂質使膜可滲透。蛋白酶K是在廣泛pH範圍都 具有活性和不易被滅活的一種非特異性蛋白酶。用其來消化圍繞靶mRNA的蛋 白質。另外，可如本領域熟知的那樣，經實驗確定優化的濃度和處理時間，然 後進行細胞洗滌步驟除去滲透處理步驟產生的溶解物質。
任選在固定和滲透處理前，收集懸浮細胞，處理滅活RNA酶和/或減少自 身螢光。已證明DEPS處理(如Braissant和Wahli(1988)"在原位雜交方案中 用非放射性標記探針擴增以檢測組織切片的富含和罕見的mRNA(A simplified in situ hybridization protocol using non- radioactively labeled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections)" Biochemica 1: 10-16)禾卩RNAlater (Ambion， Inc)能有效穩定和保護細胞RNA。也已證明硼氫化鈉和高熱能保 存RNA的完整性和減少自身螢光，有利於低水平表達基因的檢測(Capodieci
54等，2005"組織內單個細胞中的基因表達概況(Gene expression profiling in single cells whhin tissue) "Nat Methods 2(9):663-5)。任選釆用減少細胞自身螢光的其 它方法，如採用臺盼蘭(Mosiman等，1997 "減少流式細胞術中的細胞自身熒 光原位方法(Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in situ method)" Cytometry 30 (3) : 151-6)或單標記的猝滅劑寡核苷酸探針(Nolan 等，2003 "—種減少螢光背景的簡單方法及其在直接檢測特異性mRNA中的應 用(A simple quenching method for fluorescence background reduction and its application to the direct, quantitative detection of specific mRNA)" Anal Chem， 2003 75 (22) : 6236-43)。 捕獲探針雜交
此試驗步驟中，捕獲探針或捕獲探針組與預計的靶分子通過雜交而結合。 靶分子成功雜交的一個指標是特異性，即捕獲探針或捕獲探針組基本上只應使 標記探針連接於感興趣的特定靶分子，而不是任何其它分子。探針的選擇和設 計在實現特異性雜交中至關重要。
探針的選擇和設計
本發明試驗採用"直接標記"和"間接標記"二類探針設計方法使細胞中 的靶核酸與信號產生粒子相連。在直接標記方法中，靶分子直接雜交或捕獲一 個或多個標記探針(LP)。所述LP含有圖2所示的信號產生粒子(SGP)。 需要採用不同的LP在靶分子不同部位結合更多的SGP。為確保雜交的特異性， 宜嚴格選擇標記探針以確保它不會與非特異性核酸序列雜交。
在間接標記方法中，採用額外的捕獲探針(CP)。 一個例子見圖3。耙分子 通過捕獲探針捕獲標記探針。各捕獲探針中至少一個區段T與靶分子上的某區 段互補，另一區段L與標記探針上的某區段互補。此T和L區段通過區段C 相連。為在同一靶分子上不同位置結合更多的SGP，需要不同的捕獲探針，但 標記探針可保持相同。精心選擇L序列以確保它基本上不會與細胞中核酸的任 何序列發生交叉雜交。在另一實施方式中，捕獲探針和標記探針的L部分含有 不會與細胞中天然核苷酸雜交的修飾或非天然核苷酸。在另一實施方式中，此 L部分和標記探針(或其一部分)甚至不是核酸序列。例如，L可以是能識別 信號產生探針的親和結合力弱的抗體，此時要包括抗原；L可共價偶聯於含捕 獲探針T區段的寡核苷酸。對於二個毗鄰的捕獲探針，其T區段任選與耙分子
55雜交，同時二個低結合親和力抗體與標記探針上的抗原結合，產生抗原的強親 和力結合。捕獲和標記探針對感興趣靶基因是特異性的。多個捕獲探針(探針組) 可結合同一感興趣靶基因，從而以較高的檢測靈敏度結合更多信號產生粒子。 此時，同一靶基因的探針組具有相同的標記探針。
雖然本發明技術中可釆用上述二種方法，但優選間接法，因為它能使標記 探針獨立於靶基因，進一步描述表明其特異性和靈敏度更好。
在圖4顯示的間接捕獲實施方式中，二個毗鄰的捕獲探針組成耙向感興趣 基因的探針。設計的T,和T2與耙核酸上二個獨特和毗鄰區段互補。相同或不
同的L,和L2與標記探針上二個毗鄰區段互補。設計其結合區段T、 L或二者， 使標記探針與靶基因之間的連接不穩定，當只有一個捕獲探針原位雜交時在雜 交溫度下易於鬆脫。這種設計應具有預計的特異性，因為只有當二個獨立的捕 獲探針共同識別該靶基因和結合毗鄰序列或在非常靠近靶基因時，產生信號的 標記探針才能結合感興趣的靶基因。在其它實施方式中，二個捕獲探針T區段 的解鏈溫度Tm顯著高於雜交溫度，而L區段的Tm低於雜交溫度。結果，如果 只存在一種捕獲探針，雜交期間T區段與靶分子的結合牢固而穩定，但L區段 與標記探針的結合弱而不穩定。然而，如果存在二種捕獲探針，雜交期間L, 和L2的組合在雜交期間保持標記探針牢固和穩定結合。在另一實施方式中，T 區段的Tm低於雜交溫度而L區段的Tm大大高於雜交溫度。以同樣的方式，只 有當二種捕獲探針以協同方式與靶分子雜交時，標記探針與靶分子之間的連接 經受雜交過程。
在另一實施方式中，細胞中需要釆用三種或更多種靶核酸特異性、毗鄰的 捕獲探針來穩定捕獲一種標記探針(圖5)。如上所述探針的基礎設計相同， 但捕獲一個產生信號的探針的特異性甚至比採用二種毗鄰探針時更高，因為現 在需要有三個獨立探針結合於同一個感興趣靶分子中的毗鄰部位來產生信號。
多重複合(檢測)
如圖6所示，為進行一種以上靶基因的多重檢測，各靶基因必須與不同的 捕獲和標記探針特異性結合。此外，產生信號的粒子(標記)結合標記探針後 應為各靶基因提供獨特的不同信號，可用檢測儀器讀取。在直接標記方法中(如 圖6分圖A)，可能更難找到具有最低交叉雜交的合適探針，因為各標記探針 必須能牢固結合靶基因又必須與系統中任何其它核酸分子不發生交叉雜交。使本發明方法提供最佳結果，明智地是設計的標記探針靶結合部分基本上不會 與非特異性序列交叉雜交。在間接標記方法中(圖6分圖B)，由於獨特的多 種捕獲探針設計，即使有一個捕獲探針結合非特異性靶分子，也不會導致標記 探針非特異性結合該靶分子，因而試驗的特異性得到大大提高。因此圖4和圖 5說明的捕獲探針設計在某些多重複合試驗應用中通常是優選的。在一類實施 方式中，結合於不同靶基因的信號產生粒子是具有獨特發射光譜的不同螢光分 子。
能夠同時檢測多於一個參數的本發明技術可用於檢測大異質細胞群中的
罕見細胞。如上所述，CTC的濃度範圍估計是每106— 107個正常血細胞一個腫 瘤細胞。另一方面，現有的FACS免疫試驗中，細胞的隨機染料凝聚可導致每 一萬個細胞中有一個假陽性細胞計數。 因此由於此種不可接受的 高假陽性率，這種試驗不能用於CTC檢測。採用本發明技術可精細地解決此問 題。在一具體實施方式
中，利用大於一種的腫瘤基因表達作為多重檢測的耙點。 只有表達所有這些靶基因的細胞才計數為腫瘤細胞。以此方式，可顯著降低 CTC檢測的假陽性率。例如，由於細胞的染料聚集具有隨機性，如果用單色檢 測的假陽性率為104，那麼二色和三色檢測的假陽性率可分別低至10-8或10-u。 在耙基因相對表達水平己知的情況下，可用本文所述的多重檢測方法測定這些 相對水平並利用此信息進一步降低假陽性率。
在另一實施方式中，如圖7分圖A說明，使大於一個的信號產生粒子與同 一耙核酸相連。這些粒子可在檢測儀器中產生獨特信號。通過設計結合耙基因 的各類型粒子的數目，預先確定這些信號的相對強度。在探針設計中可通過如 以下章節中所述的改變探針組的數目或採用不同的信號放大方法，來控制耙分 子上的信號產生粒子的數目。只有當檢測儀器檢測到這些粒子的相對信號強度 等於該預定值時才鑑定為罕見細胞。此實施方式可用於沒有充分適合的標誌或 它們在特定類型罕見細胞中的表達水平未知時的情況。在還有一實施方式中， 如圖7分圖B所示，同一組信號產生粒子結合多於一種的靶分子。對所有選擇 的靶分子可控制粒子組發出的相對信號強度使其相同。當所鑑定的罕見細胞存 在任何一種靶分子的情況下可採用此實施方式。在還有另一實施方式中，如圖 7分圖C所示，各靶分子含有與其結合的一組信號產生粒子，但此粒子組在耙 分子與耙分子之間不相同而可區別。
多種感興趣靶核酸的檢測可用於定量測定一種靶分子。由於樣品和實驗條件不同，細胞中特定靶分子的豐度通常不能通過檢測與靶分子結合的信號水平 來精確測定。然而，可將感興趣基因的信號按參比/管家基因的信號標準化來精 確測定。參比/管家基因的定義為細胞中通常總是存在和表達的基因。參比/管 家基因的表達一般是組成性表達，在不同生物條件下不易變化。通常認為18S、
28S、 GAPD、 ACTS、 PPIB等可作為參比或管家基因，它們已用於標準化不同 樣品和/或在不同試驗條件下產生的基因表達數據。
在另一實施方式中，可設計不與任何捕獲探針或靶分子特異性結合的特殊 標記探針組。可利用與此標記探針相關的信號來確定單個細胞中雜交信號的背 景。如此可先減去背景雜交信號，然後按減去背景的參比/管家基因雜交信號標 準化，來定量測定特定靶分子的豐度。
在還有一實施方式中，可同時檢測細胞中兩種或多種感興趣的染色體DNA 序列。檢測細胞中多種DNA序列時，這些DNA序列的標記探針相互不同，它 們之間不會發生交叉雜交，在採用協同間接捕獲的實施方式中，由於設計方案， 即使有一個探針結合了非特異性DNA序列，也不會導致產生信號的探針被該 非特異性DNA序列捕獲。
在還有一實施方式中，對感興趣的多種染色體DNA序列的檢測能夠定量 分析單個細胞中的基因擴增、基因缺失或基因轉座。這可通過將感興趣基因的 信號按參比基因的信號標準化而實現。將感興趣特定細胞中感興趣基因與參比 基因的信號比與參比細胞中的信號比作比較。參比基因定義為能在基因組DNA 中穩定保持其拷貝數的基因。參比細胞定義為含有正常拷貝數感興趣基因與參 比基因的細胞。如果感興趣細胞中的信號比高於參比細胞，即測到基因擴增。 如果感興趣細胞中的信號比低於參比細胞，即測到基因缺失。
信號擴增和標記
圖2和圖6分圖A所述的直接標記法的靈敏度有限，因為每個標記探針只 結合了較少數目的信號產生粒子(標記)。 一種提高靈敏度的方法是採用體外 轉錄的摻入了信號產生粒子但特異性不受影響的RNA。
"間接標記"方法不僅能如上所述改進特異性還能用於提高檢測的靈敏 度。此方法中，標記探針與放大核酸分子雜交或連接，因而提供了標記探針更 多的結合位點。放大核酸的結構和結合方法可有許多形式。圖8分圖A-D顯示 了一些擴增方案作為示範性例子。分圖A中，多個單標記的標記探針結合於放 大核酸。分圖B中，多個多標記的標記探針結合於放大核酸。分圖C中，多個單標記的標記探針結合於放大核酸，並且多個拷貝的放大核酸結合於輔放大核
酸。在一具體實施方式
中，放大核酸是一種分支或多分支的DNA分子(分圖D)。
宜精心選擇標記探針的序列使其基本上不會與細胞中任何內源核酸發生交叉 雜交。事實上，標記探針不一定是天然聚苷核酸分子。例如可化學修飾該分子， 使之含有非天然核苷酸，從而確保該標記探針只與放大核酸雜交而不與細胞中 天然產生的核酸分子雜交。在多重試驗中，設計獨特的放大核酸和標記探針用 於不同的靶分子。
在一實施方式中，如圖9所示說明，環形聚苷核酸分子被捕獲探針組捕獲。 該環形聚苷核酸中， 一條序列或同一序列上大於一個重複區與標記探針結合 (圖9分圖A)。在該試驗的信號擴增步驟中，進行滾動循環(Larsson等，2004)。 此擴增產生了結合於捕獲探針的長鏈聚苷核酸分子(圖9分圖B)。沿此鏈有 多個重複序列，標記探針可通過雜交與之結合(圖9分圖C)。在多重試驗中， 設計和採用獨特的捕獲探針、滾動循環和標記探針。
在一實施方式中，可用PCR擴增產生標記信號探針的一部分。在另一實施 方式中，可用PCR同時擴增多種產生標記信號探針的各部分。
雖然已用特異性捕獲方法(用捕獲探針間接標記)說明了圖8和圖9的標 記和放大方案，但重要的是應注意，可聯用先前章節中描述的其它探針捕獲方 法、直接或間接方法，和這些章節中描述的標記和放大方案。上述捕獲探針、 標記方法和放大核酸構型互相獨立，可在具體試驗設計中以任何聯合方式應 用。
雜交條件
雜交溶液的組成可能影響雜交過程的效率。雜交通常依賴於寡核苷酸在其 解鏈點(Tm)以下溫度能否與互補mRNA鏈退火。Tm值是存在的寡核苷酸雙 鏈體有一半是單鏈形式時的溫度。影響寡核苷酸探針與靶核酸雜交的因素包 括.-溫度、pH、單價陽離子濃度、有機溶劑的存在等。典型的雜交溶液可包含 某些或所有的以下試劑如硫酸葡聚糖、甲醯胺、DTT (二硫蘇糖醇)、SSC (NaCl加檸檬酸鈉)、EDTA等。也可加入其它組分來減少寡苷核酸探針非特 異結合的機會，包括例如，單鏈DNA、作為運載體RNA的tRNA、聚A、Denhardt 溶液等。示範性的雜交條件可在專業文獻中找到和/或如本領域所知憑經驗確 定。參見公開的美國專利申請2002/0172950 、 Player等(2001) J.Histochem.Cytochem.49:603-611禾QKenny 等 (2002) J HistochemCytochem.50:1219-1227，它們還描述了固定、滲透處理和洗漆。
任選進行額外的預雜交以降低背景染色。預雜交包括用含有雜交溶液除探
針外的所有組分的溶液培育固定的組織或細胞。 洗滌
標記步驟後，宜洗滌細胞除去未結合的探針或鬆弛結合於不完美匹配序列 的探針。開始時通常用低嚴謹洗滌緩衝液，如2XSSC+lMm(lXSSC是0.15M NaCl， 0.015M檸檬酸鈉)洗漆，然後用較高嚴謹性洗滌緩衝液如0.2 X SSC+lmM EDTA或0.1 X SSC+lmM EDTA洗滌。
洗滌對降低該試驗的背景噪聲、提高定量測定時的信噪比至關重要。已建 立的洗滌方法可參見如Bauman和bentvalzen(1988)"原位雜交螢光流式細胞術 檢測懸浮細胞中的核糖體RNA(Flow cytometric detection of ribosomal RNA in suspended cells by fluorescent in situ hybridization)" Cytometry9(6):517-24， 及 Yu等(1992)"流式細胞術靈敏檢測單個細胞中的RNA(Sensitive detection of RNAs in single cells by flow cytometry)" Nucleic Acids Res.20(1 ):83-8。
進行合適輪次的循環洗滌，即一輪或多輪洗滌。每輪通常包括以下步驟 混合細胞與合適的緩衝液、洗脫與細胞非特異性結合的物質、將緩衝液與廢物 一起除去。每個步驟的更詳細說明見下文。
混合細胞與洗滌緩衝液:在某些試驗中，將細胞固定在基材表面然後洗滌。 此種例子中，將洗滌緩衝液與基材表面混合在一起。在許多其它實施方式中， 自由漂浮洗滌細胞。將洗滌緩衝液加入細胞沉澱中或懸浮細胞液中。
洗脫與細胞非特異性結合的物質:在細胞經滲透處理和探針雜交後，可採 用許多技術來降低非特異性結合以促進非特異性結合的探針脫離細胞溶入洗 滌緩衝液中。這些方法包括提高溫度恰好至略低於特異性結合探針的解鏈溫 度，和採用磁力或機械攪拌棒攪拌，或用聲波或超聲波攪拌。也可用搖動或旋 渦運動振搖容器攪拌混合液。
緩衝液與廢物一起除去:可採用任何方便的方法分離或除去洗滌緩衝液和 樣品中除靶細胞以外的廢物。例如，通過離心將漂浮細胞或結合細胞的基材與 緩衝液和廢物分開。離心後細胞或基材形成位於容器底部的沉澱。倒掉上部的 緩衝液和廢物。
作為另一實施例，任選將此混合液移入底部用多孔膜製作(或構成)的容
器中。所選的膜孔徑小於靶細胞或結合細胞基材的大小，但足夠大到能允許碎
60片和其它廢物通過。為了除去廢物，任選調節氣壓或液壓使容器內壓高於外壓，驅使緩衝液和廢物流出容器同時依靠膜將靶細胞保留在容器內。也可例如通過壓力、重力或離心力使緩衝液和廢物濾過膜而除去。
還有另一實施例，通過細胞固定或利用表面蛋白的親和結合使細胞固定在大的基材如載玻片或容器底部的表面。利用真空倒掉上部或倒置容器，直接除去緩衝液和廢物。還有另一實施例，任選通過化學固定或表面蛋白親和結合將細胞固定在磁珠上。然後通過安置在容器上的磁場吸力將磁珠固定在容器中。然後直接倒去緩衝液和廢物而不會丟失細胞，上述實施例已描述了相同的方法。還有一實施例，用電學方法將細胞中的非特異性結合探針誘導移出細胞外同時保留特異性結合的探針。
如上所述，進行上述三步驟完成一輪洗滌，進行一輪或多輪洗滌完成洗滌。在不同的洗滌輪次中可採用不同的洗滌緩衝液、洗脫或廢物去除技術。
檢測
本發明技術中，在洗滌除去非特異性結合探針和其它廢物後，可鑑定出大異質細胞群中與細胞中靶核酸特異性雜交的含有信號產生粒子(標記)的靶細胞。可採用基本上任何方便的檢測和鑑定方法。
在一實施方式中，如上所述在標記和洗滌步驟後將懸浮細胞固定在固體基材上。用顯微鏡儀器檢測。具體說，當探針產生的信號是化學發光時，可用帶
CCD照相機的攝像顯微鏡或掃描顯微鏡將光信號轉變為數字信息。當探針攜帶的標記可發射螢光信號時，可用螢光成像或掃描顯微鏡檢測。此外，由於靶細胞通常是大細胞群中的罕見細胞，可採用自動尋找算法來自動鑑定和計數群體中的靶細胞數。可用任何一種技術將懸浮細胞固定在固體表面。在一實施方式中，採用具有大的平底表面的容器裝懸浮細胞液。離心該容器迫使細胞沉降到
底部。與細胞溶液濃度相比，如果容器底表面足夠大，細胞不會在底表面重疊。大多數情況下，即使細胞重疊，它們也不會是靶細胞，因為在大細胞群中它們很罕見。在另一實施方式中，將懸浮細胞離心沉降在平表面上。除去液體後，依靠表面張力將細胞固定在表面上。
在本發明的優選實施方式中，細胞漂浮(懸浮液)或固定在漂浮的基材如珠上，故可在溶液中有效進行檢測之前的步驟，如雜交和洗滌。檢測大漂浮細胞群中罕見細胞有幾種方法。優選的方法是採用流式細胞術為基礎的檢測系統，其中漂浮細胞或基材成線流一個接一個地通過激發光和檢測光前面。通過與細胞中靶核酸特異性結合的探針發出的光信號鑑定耙細胞。光信號可以是例如特定波長的發射光或螢光。優點
總之，本發明QMAGEX技術具有許多能檢測單個細胞中的多種核酸和檢測靶細胞的獨特組分。這些組分包括
利用細胞內固定的核酸作為鑑定CTC (或其它細胞類型)的標誌。與蛋白標誌相比，核酸更穩定並可廣泛獲得，檢測時可提供更佳的信噪比。此外，此檢測技術容易應用於各種腫瘤，或其它細胞鑑定或分類方面的應用。另一優點是，可定量測定單個細胞而不是混合細胞群的核酸分子水平。此特徵確保了作為研究生物系統中關鍵功能單元的細胞的保存。在涉及混合細胞群的許多應用中，此特點在提取真實有用的試驗信息上非常有用(如根據檢測細胞中一組核酸標誌的存在或表達水平來鑑定CTC;細胞中其它核酸的存在或拷貝數可提供用於診斷、預測結局等的額外信息)。
在最終檢測前的所有試驗步驟中任選保持細胞懸浮或保持為可重懸浮的細胞沉澱。此特點顯著改進了試驗的動力學、簡化了程序、提高了重現性和保持細胞處在最佳相關功能狀態。另一方面，本發明的一些重要方面內容，包括探針的選擇和設計、多重複合、擴增和標記，可直接用於原位雜交技術來檢測和計數組織樣品中的罕見細胞。
任選採用獨特的間接捕獲探針設計方法來獲得罕見靶點的雜交特異性，使檢測時信噪比更佳。
所述試驗能同時檢測多種靶基因或同一基因的多種參數。此特點在一些方法中有助於檢測罕見細胞如CTC。首先，可降低假陽性率，這在癌症診斷中是必需的。其次，可提供與檢測腫瘤相關的更多臨床重要信息，包括原發癌症的
發展階段和/或原始類型和來源。
本發明技術結合信號放大過程，從而提高了檢測靈敏度，並能以高置信度檢測大量正常細胞中的罕見細胞。
可在FACS或流式細胞計數儀或顯微鏡平臺上進行檢測。前者可完全自動化，提供快速檢測和選揀出所鑑定的細胞供進一步研究而具有額外的好處。後者顯微鏡平臺的優點是更容易獲得並且能通過形態學最終手動操作進行鑑定。
系統
一方面，本發明提供進行這類新型試驗用的系統和裝置。所述裝置或系統包括一種或多個(優選所有)至少以下的步驟。
液體處理:所述任選包括加入試劑的子系統，如果試驗需要倒掉樣品容器中的液體(如去除或固定、丟棄或重新使用容器如樣品試管、多孔板等)。所述子系統可以是基於移液器類型的液體轉移系統，採用裝有一次性槍頭的各個泵處理不同的液體。作為替代實施例，各試劑可具有自己專用的流體通道。
混合和攪拌:所述裝置任選包括混合樣品液中不同試劑和促進非特異性結
合物質從細胞脫去的儀器。該儀器可具有誘導樣品容器保持件渦旋或搖動的機構，或可向容器施加聲波或超聲波。或者，可將磁力攪拌子放入樣品容器中，用安置在容器保持件中的元件所產生旋轉磁場驅動攪拌。
溫度控制:通過在樣品容器室中安置加熱器和溫度探頭，將樣品的溫度控制在高於室溫水平。可用控溫儀將溫度水平控制在高於或低於室溫。溫度控制是重要的，例如在試驗中對於雜交和洗滌步驟的性能至關重要。
分離細胞與廢液:所述裝置任選包括可除去樣品混合物中的廢液同時保留細胞供進一步分析的儀器。此儀器可包括底部為多孔膜的樣品容器。膜的孔徑小於細胞但大於混合液中的廢物。膜下面的空間密封並連接真空泵。作為另一實施例，也可密封膜上面的空間並連接正壓源。在一不同的實施方式中，所述儀器包括離心機。將具有底部膜的容器裝入離心機，離心迫使廢液濾過膜而排出。此儀器的另一種結構中，樣品容器底部為固體。細胞經離心後沉積在底部，用上述液體處理子系統從頂部倒去廢液。
此儀器也可執行製備用於最終讀數的樣品的任務。在用顯微鏡讀數的實施方式中，細胞通常沉積和粘附在平表面上。如果容器為平底，儀器中的離心機可執行此工作。另一方法是，平板在其平面內旋轉，此系統可利用液體處理儀將含細胞的液滴滴在旋轉平板的中心。使細胞在平板表面均勻分布。
檢測:可將本發明的檢測組件與系統的其餘部分集成安裝在一起，或者可與上述子系統的其餘部件分開安裝。在讀數儀是顯微鏡的實施方式中，可以是攝像或掃描顯微鏡。在另一實施方式中，該儀器可以是對不同探頭具有多種波長激發光和讀數波長的螢光成像或掃描顯微鏡。在一優選實施方式中，讀數儀是流式細胞計數儀。優選細胞計數儀，因為它可以多種波長光直接讀取液體中的漂浮細胞數從而大大提高了試驗效率。
所有上述組件可集成安裝在一個儀器中。或者，這些組件可分別裝在作為一個系統一起工作進行試驗的多個儀器中。圖10說明此類結構儀器的一種具體示範性實施方式。在此特定結構中，樣品裝在底部為膜的容器(樣品試管)中。利用泵通過多進口閥門從試管頂部加入試劑。抽真空從底部除去廢液。放樣品容器的保持件固定在攪動平臺上，用溫度監控儀控制樣品周圍空間(溫度控制區)。液體處理組件將試劑(固定和滲透試劑、雜交緩衝液、探針組和洗滌緩衝液)加到樣品試管中，將廢液移入廢液容器，並將細胞送入流式細胞儀進行檢測。
一類實施方式提供的系統包括接受樣品容器的保持件；能維持樣品容器在所選溫度(例如，使用者為該系統選擇的溫度或當前溫度，對於試驗過程中的不同步驟任選不同的溫度)的溫度控制儀；與樣品容器流體相連並被構造成可在樣品容器中加入液體和/或去除液體的液體處理組件；能混合(攪拌或混合)樣品諸組分的攪拌組件；以及能檢測單細胞中一種或多種信號的檢測儀，其中所述檢測儀任選與樣品容器流體相連。多個液體貯器(例如用於貯存固定或滲透處理試劑、洗滌緩衝液、探針組和/或廢液)之一任選與樣品容器流體相連。
本發明的系統任選包括計算機。此計算機裝有用於接受用戶指令的適當軟體，以用戶輸入一組參數欄位形式如GUI，或預先設置程序的指令形式，例如為各種不同特定操作預先設置的程序指令。軟體任選地將這些指定轉換為適當的語言，控制該系統諸組件的運行(如控制液體處理組件和/或雷射儀)。此計算機也可接受系統其它組件如檢測儀傳來的數據並能解釋這些數據，將其以人類可閱讀形式提供給用戶，或利用這些數據按照用戶的編程進行下一步操作。
靶核酸
如上所述，耙核酸基本上可以是細胞中所要檢測的任何核酸。顯然靶核酸的選擇取決於所需的應用，如表達的分析、疾病診斷、分期或預後、靶基因的鑑定或驗證、通路分析、藥物篩選、藥效研究、或許多其它應用。本領域己報導了大量合適的靶基因，更多的可用標準技術鑑定。
作為一個例子，對於CTC檢測已知有各種合適的靶核酸。例如，檢測CTC的多組標誌可包括一種或多種以下標誌表皮細胞特異性標誌(如CK19、Mucl、EpCAM)、用作陰性選擇的血細胞特異性標誌(如CD45)、腫瘤來源特異性標誌(如前列腺癌的PSA、 PSMA、 HPN和乳腺癌的mam、 mamB、 her-2)、增殖能力特異性標誌(如Ki-67、CEA、CA15-3)、凋亡標誌(如BCL-2、BCL-XL)和其它轉移、遺傳和後成論變化標誌。作為另一實施例，靶基因可包括HOXB13和IL17BRmRNA，已證明原發腫瘤中它們的比率可預示用三苯氧胺治療的乳腺癌病人的臨床結局(MA等，(2004) "二種基因表達的比率可預示用三苯擬胺治療的癌病人臨床結局(A two-gene expression ratio predicts clinical outcomein breast cancer patients treated with tamoxifen)" ， Cancer Cell 5 (6) : 607-16和Goetz等，2006 "Homeobox13與白介素-17B受體二種基因表達的比率可預測接受輔佐劑三苯氧胺治療婦女的復發和存活(A Two- Gene Expression Ratioof Homeobox 13 and Interleukin-17B Receptor for Prediction of Recurrence andSurvival in Women Receiving Adjuvant Tamoxifen)" Cin Cancer Res 12:2080-2087)。也參見例如Gewanter，RM， AEKatz等，(2003) "PSA的RT-PCR檢測可作為放療治療臨床局部前列腺癌病人的預後因子(RT-PCR for PSA as aprognostic factor for patients with clinically localized prostate cancer treated withradiotherapy)" Urology61 (5) : 9676-71; Giatromanolaki等，2004 "評估乳腺癌病人的高度外周血管生成和彌散可預測對輔佐化療的抗性和早期復發(Assessment of highly angiogenic and disseminated in the peripheral blood diseasein breast cancer patients predicts for resistance to adjuvant chemotherapy and earlyrelapse)" Int J Cancer 108(4):620匿7; Halabi等，(2003)"轉移性前列腺癌前列腺特異抗原的逆轉錄酶鏈反應的預後意義CALGB9583內的嵌套式研究(Prognostic significance of reverse transcriptase polymerase chain reaction forprostate-specific antigen in metastatic prostate cancer: a nested study withinCALGB 9583)" J Clin Oncol 21(3):490-5; Hardingham等，(2000)"結直腸癌病人和良性大腸病病人血源表皮細胞的分子檢觀lJ(Molecular detection ofblood-borne epithelial cells in colorectal cancer patients and in patients with benignbowel disease)" Int J Cancer 89(1):8-13; Hayer等，(2002)"監測晚期乳腺癌病人循環血表皮細胞的HER-2表達(Monitoring expression of HER-2 oncirculating epithelial cells in patients with advanced breast cancer)" Int J Oncol21(5):llll-7; Jotsuka,等(2004)"用RT-PCR for CEA mRNA檢測到循環性腫瘤細胞持續存在的證據可預測早期復發淋巴結轉移陰性乳腺癌的前瞻性研究(Persistent evidence of circulating tumor cells detected by means of RT-PCR forCEA mRNA predicts early relapse: a prospective study in node-negative breastcancer )" Surgery 135(4):419-26; Allen-Mersh T等.(2003) " RT-PCR檢測原發腫瘤切除後24小時循環中的癌細胞可預測結直腸癌復發(Colorectal cancerrecurrence is predicted by RT-PCR detection of circulating cancer cells at 24 hoursafter primary excision )" ASCO會議，芝加哥，2003年5月；Shariat等(2003)"前列腺特異性抗原的術後早期外周血逆轉錄PCR試驗結果與放療前列腺切除術後病人的前列腺癌發展相關聯(Early postoperative peripheral bloodtranscription PCR assay for prostate-specific antigen is associated with prostatecancer progression in patients undergoing radical prostatectomy )" Cancer Res63(18):5874-8; Sm池等.(2000)"對轉移性乳腺癌病人全身治療的循環性腫瘤細胞應答定量聚合酶鏈反應和免疫細胞化學技術的比較(Response ofcirculating tumor cells to systemic therapy in patients with metastatic breast cancer:comparison of quantitative polymerase chain reaction and immunocytochemicaltechniques )" J CHn Oncol 18(7): 1432-9; Stathopoulou等.(2002)"乳腺癌手術病人細胞角蛋白-19-陽性細胞的分子學檢測它們的預後意義評價(Moleculardetection of cytokeratin-19-positive cells in the peripheral blood of patients withoperable breast cancer: evaluation of their prognostic significance )" J Clin Oncol20(16):3404 12;和Xenidis等.(2003)"乳腺癌手術病人輔佐化療完成後的外周血循環角蛋白-19 mRNA-陽性細胞(Peripheral blood circulating cytokeratin-19mRNA-positive cells after the completion of adjuvant chemotherapy in patientswith operable breast cancer )" Ann Oncol 14(6): 849-55。
本文方法中要檢測的一類優選靶核酸是涉及癌症的靶核酸。可用本發明方法檢測任何與癌症相關的核酸，如編碼過度表達或突變的多肽生長因子(如sis)、過度表達或突變的生長因子受體(如erb-Bl)、過度表達或突變的信號轉導蛋白如G-蛋白(如Ras)、或非受體酪氨酸激酶(如abl)、或過度表達或突變的調節蛋白(如myc、 myb、 jun、 fos等)等等的核酸。 一般而言，癌症常常可牽連到信號轉導分子和相應的原癌基因產物如編碼Mos、 Rsa、 Raf和Met的核酸；以及轉錄活化與抑制蛋白，如p53、 Tat、 Fos、 Myc、 Jun、 Myb、Rel和/或其核受體。特別相關的P53俗稱細胞的"分子警察"，所有己知癌症中約50。/。可在p53中找到一個或多個遺傳病損。
一類與癌症相關的基因作為討論的例子，已詳細報導了許多激素的核受體，發現這些受體的作用機制改變而賦予了致癌活性。例如，在Yen (2001)"甲狀腺激素作用的生理和分子基礎(Physiological and Molecular Basis of ThyroidHormone Action)" Physiological Reviews 81(3): 1097-1142和其引用的參考文獻中回顧了甲狀腺激素作用的生理和分子基礎。已知且特徵鑑定充分的核受體包括糖皮質激素受體(GR)、雄激素受體(AR)、鹽皮質激素受體(MR)、孕激素受體(PR)、雌激素受體(ER)、甲狀腺激素受體(TR)、維生素D受體(VDR)、視黃醇受體(RAR和RXR)及結合類花生酸的過氧化物酶體增殖劑活化受體(PPAR)。所謂的"孤兒核受體"也是核受體超家族的一部分，它們在結構上與典型的核受體如類固醇和甲狀腺受體同源。可用本發明方法檢測編碼這些受體中任一種或其致癌形式的核酸。目前可得到的所有治療藥物中約40%是核受體和/或其致癌形式的激動劑或拮抗劑，強調了這些受體(和編碼它們的核酸)作為用本發明方法分析靶點的相對重要性。
一類示範性耙核酸是用於診斷糞便樣品結腸癌的靶核酸。結腸癌是常見病，可散發或遺傳。對各種形式的結腸癌分子學基礎己有某種詳細了解。 一般而言，種系突變是遺傳性結腸癌症候群的基礎，而體細胞突變的累積是散發性結腸癌的基礎。在德系猶太人中，早已認為多態性突變可能引起家族性結腸癌。結腸癌病因學已報導至少有三類不同基因原癌基因、抑制基因和錯配修復基因發生了突變。 一個例子是編碼DCC (與纖連蛋白同源的細胞粘附分子，結腸癌中缺失)的核酸。其它形式的結腸癌是常染色體顯性基因hMSH2含有病損。家族性腺瘤息肉病是另一類型的結腸癌，其染色體成員5的MCC基因座中含有病損。關於結腸癌的其它細節可見Calvert等.(2002)"結腸直腸癌的遺傳學(The Genetics of Colorectal Cancer )" Annals of Internal Medicine 137 (7):603-612及其引用的參考文獻。關於可利用糞便檢測各種結腸癌和結腸癌標誌可見例如Boland(2002)"結直腸癌篩檢的進展結直腸癌糞便DNA檢測的分子基礎供臨床醫師引用(Advances in Colorectal Cancer Screening: MolecularBasis for Stool-Based DNA Tests for Colorectal Cancer: A Primer for Clinicans )"Reviews in Gastroenterological Disorders第2巻,增刊l及其中引用的參考文獻。關於其它癌症，可利用其它與癌症相關的各種基因，如Ras和p53的突變作為癌症診斷的指標。
宮頸癌是要檢測的另一種示範性目標，如檢測獲自陰道分泌物樣品中這類癌症的核酸進行診斷。乳頭瘤病毒(如人乳頭瘤病毒)和二種原癌基因E6和E7可引起宮頸癌。E6可結合而除去p53， E7可結合而除去PRB。丟失p53和沒有PRB調節導致E2F/DP生長因子的作用失控是引起宮頸癌的一種機制。
可用本發明方法檢測的另一示範性目標是檢測眼淚樣品中的視網膜母細胞瘤細胞。視網膜母細胞瘤是一種眼睛腫瘤，因PRB基因失活所致。已發現含有突變PRB基因的病人可遺傳傳播此癌(當然體細胞突變也可引起非遺傳形式
的癌症)。
可用本發明方法檢測I型神經纖維瘤。此瘤中的NF1基因失活，從而激活 ras原癌基因的GTP酶活性。如果NF1丟失，ras過度活化將引起神經腫瘤。 可用本發明方法檢測中樞神經系統(CSF)中或組織樣品中的I型神經纖維瘤。
許多其它類型的癌症是已知的並且可用本發明方法檢測相關基因病損而 確診。通過檢測相應病損來確診的癌症包括淋巴癌、血癌、胃癌、腸癌、結 腸癌、睪丸癌、胰腺癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、皮膚癌、和基本上所有已
知存在基因病損的其它癌症。此方面內容的綜述可參見"人癌症的分子基礎OM Molecular Basis of Human Cancer)" Coleman禾口 Tsongalis編，Humana Press; ISBN: 0896036340;第1版(2001年8月)。
類似地，可用本發明方法檢測病原和傳染微生物的核酸，如傳染性真菌， 如麴黴菌或念珠菌屬；細菌，特別是作為病原細菌模型的大腸桿菌(其某些菌 株為致病性)，以及醫學上重要的細菌屬，如葡萄球菌(如金黃葡萄球菌)或 鏈球菌(如肺炎鏈球菌)；原蟲，如孢子蟲(如瘧原蟲)、根足蟲(如阿米巴 原蟲)和鞭毛蟲(錐蟲、利什曼蟲、滴蟲、賈第鞭毛蟲等)；病毒，如(+ ) RNA病毒(例子包括痘病毒如牛痘病毒、細小病毒如髓灰病毒、披膜病毒如風 診病毒、黃病毒如C肝病毒、和冠狀病毒)；(一)RNA病毒(如彈狀病毒如 VSV;副粘病毒如RSV;正粘病毒如流感病毒；本雅病毒和沙粒病毒)、雙鏈 DNA病毒(如呼腸狐病毒)、RNA-〉DNA病毒即逆轉錄病毒如HIV和HTLV， 以及某些DNA->RNA病毒如B肝病毒。
如上所述，可用本發明方法檢測染色體水平的基因擴增和缺失，如可檢測 基因表達水平的改變或異常。可用本發明方法檢測的一類優選靶基因包括原癌 基因和腫瘤抑制基因，檢測其擴增或缺失。示範性的靶基因包括但不限於整 合素(如缺失)、受體酪氨酸激酶(RTK，如其擴增、點突變、轉位或表達增 加)、NFl (如缺失或點突變)、Akt (如其擴增、點突變、或表達增加)、PTEN (如缺失、點突變)、MDM2 (如擴增)、SOX (如擴增)、RAR (如擴增)、 CDK2 (如擴增、或表達增加)、細胞周期蛋白D (如擴增或轉位)、細胞周 期蛋白E(如擴增)、Aurora A (如擴增或表達增加)、p53 (如缺失或點突變)、 NBS1 (如缺失或點突變)、Gli (如擴增或轉位)、Myc (如擴增或點突變)、 HPV-E7(如病毒感染)和HPV-E6 (如病毒感染)的基因。
68在採用靶核酸作為參比核酸的實施方式中，本領域類似報導了合適的參比 核酸或者可以確定。例如，本領域已知在不同腫瘤細胞中維持穩定拷貝數的各
種基因。其轉錄物可作為基因表達分析參比品的管家基因包括例如18SrRNA、 28SrRNA、 GAPD、 ACTB和PPIB基因。可採納本領域已有描述的其它類似核 酸用於實施本發明。 標記
可採納本領域熟知各種各樣的標記用於實施本發明。例如，已報導的冷光 標記、散射光標記(如膠體金顆粒)。參見例如Csaki等.(2002)"金納米顆粒 用作DNA診斷的新型標記(Gold nanoparticles as novel label for DNA diagnostics )" Expert Rev Mol Diagn 2:187-93。
作為另一實施例，本領域熟知許多螢光標記，包括但不限於疏水性螢光
團(如藻紅素、羅丹明、Alexa Fluor488和螢光黃)和螢光量子斑點。各種不 同波長發射螢光的描述(包括可促進同時發射和檢測多種標記螢光的串聯螢光 團偶聯物)可參見例如"手冊螢光探針和標記技術指南(The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)", 10版或Invitrogen(英 傑公司)的(2006)Web版(可從全球資訊網站probes.invitrogen.eom/handbook下載)。 對於採用螢光量子斑點作為生物分子標記可參見例如Dubertret等.(2002) Science 298:1759; Nature Biotechnology (2003) 21:41-46; 禾卩 Nature Biotechnology (2003) 21:47-51
可用本領域己建立的技術在合成過程中或合成後反應中將標記摻入分子 如多核苷酸中。例如，裝有帶各種螢光團的螢光標記多核苷酸試劑盒可購自 Molecular Probes公司((www.)molecularprobes.com)，也可商品購得核酸合成中 使用的螢光亞磷醯胺。類似地，基本上可用本領域已知的方法檢測標記物發出 的信號(吸收和/或標記物發射的螢光。同樣熟知和可購買到檢測標記的儀器， 如掃描儀、顯微鏡、流式細胞計數儀等。例如，流式細胞計數儀可購自 Becton-Dickinson((www.)bd.com)禾口 BeckmanCoulter((www.)beckman.com)。
分子生物學技術
實施本發明時任選採用分子生物學、微生物學和重組DNA技術中的許多 常規技術。這些技術是熟知的，在例如以下文獻中有解釋Berger和Kimmel, 分子克隆技術指南，酶學方法第152巻Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook等.，"分子克隆-實驗室手冊"(第3版)，l-3巻，Cold Spring Harbor
69Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000禾n "分子生物學當前方法"
(Current Protocols in Molecular Biology ) F.M. Ausubel 等編 ， Current Protocols,格林出版聯合公司(Greene Publishing Associates Inc.)和強生威利父 子公司(John Wiley & Sons Inc.)聯合出版(2006年增補本)。其它有用的參考文 獻例如有"細胞的分離和培養(如核酸亞序列的分離)"包括Freshney(1994) 的"動物細胞的培養，基本技術手冊"(Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique)第3版，Wiley-Liss, New York及其中引用的參考文獻；Payne 等.(歷)"在液體系統中培養植物細胞和組織"(Plant Celland Tissue Culture in Liquid Systems)強生威利父子公司，紐約，NY; Gamborg禾Q Phillips編(1995) "植物細胞、組織和器官的培養基本方法"(Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods) Springer實驗室手冊，Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks編"微生物培養基手冊"(The Handbook of Microbiological Media) (1993) CRC Press, Boca Raton, FL。 製備多核苷酸
以上參考文獻中描述了製備核酸的方法(如細胞體外擴增、純化或化學合 成)、操縱核酸的方法(如限制性酶消化、連接等)以及用於操縱和製備核酸 的各種載體、細胞系等。此外在USPN 5,635,352、 USPN 5,124,246、 USPN 5,710,264和USPN 5,849,481及以上提及的其它參考文獻中描述了製備分支多 核苷酸的方法(如擴增多聚體)。
此外，可從各種商品來源，如中部認證試劑公司(MidlandCertifiedReagent Company) ((www.) mcrc.com)、 美國基因公司(Great American Gene Company)((www.) genco.com)、 表達基因公司(ExpressGen Inc.) ((www.) expressgen.com)、前進公司(Qiagen) (oligos.qiagen.com)禾口許多其它公司定製或 按標準定製基本上任何多核苷酸(包括例如標記的或生物素化的多核苷酸)。
可任選在合成時或合成後將標記物、生物素或其它標記分子摻入多核苷酸 中。例如，可在化學合成多核苷酸時摻入生物素化亞磷醯胺。或者，可用本領 域已知的技術生物素化任何核酸。合適的試劑可從例如穿孔生物技術公司 (Pierce Biotechnology)((www.) piercenet.com)購得。類似地，可用螢光標記任何 核酸，例如採用從分子探針公司(Molecular Probes,Inc.)((www.) molecularprobes.com)或穿孔生物技術公司((www.) piercenet.com)購得的商品 化試劑盒，或在化學合成多核苷酸時摻入螢光標記的亞磷醯胺。參考文獻
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應理解本文描述的實施例和實施方式目的只是為了說明，本領域技術人員 可對其提出各種修改和變化，但這些都包括在本申請書的思路和範圍內以及所 附權利要求書的範圍內。
雖然以上已描述了本發明的某些細節，其目的是闡述和使人理解，但本領 域技術人員通過閱讀此公開內容會明白，可對其形式和細節作出各種修改，但 這不脫離本發明的真正範圍。例如，可採用上述所有技術和裝置的各種組合。 本申請書中引用的所有出版物、專利、專利申請和/或其它文件出於所有目的納 入本文作參考，其程度如同各出版物、專利、專利申請和/或其它文件出於所有 目的個別單獨納入作參考那樣。
7權利要求
1.一種檢測單個細胞中兩種或多種靶核酸的方法，該方法包括提供包含細胞的樣品，所述細胞含有或被懷疑含有第一靶核酸和第二靶核酸；提供含第一標記的第一標記探針和提供含第二標記的第二標記探針，其中第一標記發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別；提供至少第一捕獲探針和至少第二捕獲探針；在細胞中，第一捕獲探針與細胞中存在的第一靶核酸雜交，第二捕獲探針與細胞中存在的第二靶核酸雜交；第一標記探針被第一捕獲探針捕獲，第二標記探針被第二捕獲探針捕獲，從而第一標記探針被第一靶核酸捕獲，第二標記探針被第二靶核酸捕獲；和檢測第一標記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號。
2. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述提供至少第一捕獲探針和 至少第二捕獲探針包括提供一種第一捕獲探針和一種第二捕獲探針；所述第一 標記探針被第一捕獲探針捕獲包括第一標記探針與第一捕獲探針雜交；所述第 二標記探針被第二捕獲探針捕獲包括第二標記探針與第二捕獲探針雜交。
3. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述提供至少第一捕獲探針包 括提供兩種或多種第一捕獲探針；所述提供至少第二捕獲探針包括提供兩種或 多種第二捕獲探針；所述提供第一標記探針和第二標記探針包括提供多個第一 標記探針和多個第二標記探針；所述使第一捕獲探針與第一靶核酸雜交和使第 二捕獲探針與第二靶核酸雜交包括使二個或多個第一捕獲探針與第一靶核酸 雜交和使二個或多個第二捕獲探針與第二靶核酸雜交；所述第一標記探針被第 一捕獲探針捕獲和第二標記探針被第二捕獲探針捕獲包括一個第一標記探針 與第一捕獲探針之一雜交和一個第二標記探針與第二捕獲探針之一雜交。
4. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述提供至少第一捕獲探針和 至少第二捕獲探針包括提供一種第一捕獲探針和一種第二捕獲探針；所述提供 第一標記探針和第二標記探針包括提供多個第一標記探針和多個第二標記探 針；所述第一標記探針被第一捕獲探針捕獲包括使第一放大核酸與第一捕獲探 針和多個第一標記探針雜交；和所述第二標記探針被第二捕獲探針捕獲包括使第二放大核酸與第二捕獲探針和多個第二標記探針雜交。
5. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述提供至少第一捕獲探針包 括提供兩種或多種第一捕獲探針；所述提供至少第二捕獲探針包括提供兩種或多種第二捕獲探針；所述提供第一標記探針和第二標記探針包括提供多個第一標記探針和多個第二標記探針；所述使第一捕獲探針與第一靶核酸雜交和使第 二捕獲探針與第二靶核酸雜交包括使二個或多個第一捕獲探針與第一耙核酸 雜交和使二個或多個第捕獲探針與第二靶核酸雜交；所述第一標記探針被第一 捕獲探針捕獲包括第一放大核酸與第一捕獲探針之一雜交和多個第一標記探 針與第一放大核酸雜交；和所述第二標記探針被第二捕獲探針捕獲包括第二放 大核酸與第二捕獲探針之一雜交和多個第二標記探針與第二放大核酸雜交。
6. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述提供至少第一捕獲探針和 至少第二捕獲探針包括提供一種第一捕獲探針和一種第二捕獲探針；所述提供 第一標記探針和第二標記探針包括提供多個第一標記探針和多個第二標記探 針；所述第一標記探針被第一捕獲探針捕獲包括使第一輔放大核酸與第一捕獲 探針雜交、多個第一放大核酸與第一輔放大核酸雜交和多個第一標記探針與第 一放大核酸雜交；和所述第二標記探針被第二捕獲探針捕獲包括使第二輔放大 核酸與第二捕獲探針雜交、多個第二放大核酸與第二輔放大核酸雜交和多個第 二標記探針與第二放大核酸雜交。
7. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述提供至少第一捕獲探針包 括提供兩種或多種第一捕獲探針；所述提供至少第二捕獲探針包括提供兩種或 多種第二捕獲探針；所述提供第一標記探針和第二標記探針包括提供多個第一 標記探針和多個第二標記探針；所述使第一捕獲探針與第一靶核酸雜交和使第 二捕獲探針與第二靶核酸雜交包括使二個或多個第一捕獲探針與第一靶核酸 雜交和使二個或多個第二捕獲探針與第二靶核酸雜交；所述第一標記探針被第 一捕獲探針捕獲包括使第一輔放大核酸與第一捕獲探針之一雜交、多個第一放 大核酸與第一輔放大核酸之一雜交和多個第一標記探針與第一放大核酸雜交； 和所述第二標記探針被第二捕獲探針捕獲包括使第二輔放大核酸與第二捕獲探針之一雜交、多個第二放大核酸與第二輔放大核酸之一雜交和多個第二標記 探針與第二放大核酸雜交。
8. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述提供至少第一捕獲探針包 括提供兩種或多種第一捕獲探針、使第一捕獲探針與第一靶核酸中的非重疊多核苷酸序列雜交；和所述提供至少第二捕獲探針包括提供兩種或多種第二捕獲 探針、使第二捕獲探針與第二靶核酸中的非重疊多核苷酸序列雜交。
9. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述提供第一標記探針和第二 標記探針包括提供多個第一標記探針和多個第二標記探針；所述第一標記探針被第一捕獲探針捕獲包括a) 滾動循環擴增與第一捕獲探針雜交的第一環形多核苷酸產生擴增的第一多核苷酸，此第一環形多核苷酸包含至少一個拷貝的與第一標記探針中某多核 苷酸序列相同的多核苷酸序列，因此擴增的第一多核苷酸含有多個拷貝的與第 一標記探針中該多核苷酸序列互補的多核苷酸序列，和b) 使多個第一標記探針與該擴增的第一多核苷酸雜交；和 所述第二標記探針被第二捕獲探針捕獲包括a) 滾動循環擴增與第二捕獲探針雜交的第二環形多核苷酸產生擴增的第二 多核苷酸，此第二環形多核苷酸包含至少一個拷貝的與第二標記探針中某多核 苷酸序列相同的多核苷酸序列，因此擴增的第二多核苷酸含有多個拷貝的與第 二標記探針中該多核苷酸序列互補的多核苷酸序列，和b) 使多個第二標記探針與該擴增的第二多核苷酸雜交。
10. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述細胞含有或被懷疑含有 第三靶核酸；所述方法包括提供含第三標記的第三標記探針，其中第三標記 發出的第三信號可與第一和第二信號相區別；提供至少第三捕獲探針，在細胞 中，第三捕獲探針與細胞中存在的第三靶核酸雜交，第三標記探針被第三捕獲 探針捕獲，和檢測第三標記發出的第三信號。
11. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，對所有靶核酸同時進行各個 雜交或捕獲步驟。
12. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸和第二靶核 酸獨立選自DNA、 RNA、染色體DNA、 mRNA、細胞的內源核酸、通過用病 原體感染細胞而導入細胞或在細胞中表達的核酸。
13. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸是第一 mRNA，所述第二靶核酸是第二 mRNA。
14. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸包含第一染 色體DNA多核苷酸序列，所述第二靶核酸包含第二染色體DNA多核苷酸序列。
15. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸包含某mRNA的第一區域，所述第二靶核酸包含該同一mRNA的第二區域。
16. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述第二耙核酸包括參比核 酸；所述方法包括按第二信號標準化第一信號。
17. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述第一標記是第一螢光標 記，第二標記是第二螢光標記。
18. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述檢測第一信號和第二信 號包括檢測第一信號的強度和第二信號的強度；所述方法包括將第一信號和第 二信號的強度與細胞中存在的相應靶核酸含量相關聯。
19. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述細胞是循環性腫瘤細胞。
20. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述含細胞的樣品來自體液 或血液。
21. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法包括根據細胞中第 一和第二信號的檢測鑑定細胞是否為所需靶細胞。
22. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述提供含細胞的樣品包括 固定和滲透處理細胞。
23. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述方法包括洗滌細胞以除 去未被耙核酸之一捕獲的物質。
24. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸和/或第二靶 核酸包括雙鏈DNA分子，所述方法包括使該雙鏈DNA變性然後再使第一和第 二捕獲探針與第一和第二靶核酸雜交。
25. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述細胞在含細胞樣品中是 懸浮細胞，和/或所述細胞在雜交、捕獲和/或檢測步驟期間為懸浮細胞。
26. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述檢測第一標記發出的第 一信號和第二標記發出的第二信號包括在一次操作中檢測第一標記發出的第 一信號和第二標記發出的第二信號。
27. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述檢測第一和第二信號包 括進行流式細胞檢測。
28. —種檢測單個細胞中一種或多種靶核酸相對水平的方法，該方法包括 提供包含細胞的樣品，所述細胞含有或被懷疑含有第一靶核酸並且所述細胞含有第二參比核酸；提供含第一標記的第一標記探針和提供含第二標記的第二標記探針，其中第一標記發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別；在細胞中，第一標記探針被細胞中存在的第一靶核酸捕獲，第二標記探針 被第二參比核酸捕獲；檢測此單個細胞中第一標記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號， 所述檢測第一信號和第二信號包括測定第一信號的強度和第二信號的強度；和 按第二信號的強度標準化第一信號的強度。
29. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述第一標記探針被第一耙 核酸捕獲包括第一標記探針與第一靶核酸雜交。
30. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述第二標記探針被第二參比核酸捕獲包括第一標記探針與第二參比核酸雜交。
31. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述第一標記探針被第一靶核酸和第二標記探針被第二參比核酸捕獲包括 提供至少第一捕獲探針和至少第二捕獲探針；在細胞中，使第一捕獲探針與第一靶核酸雜交，使第二捕獲探針與第二參 比核酸雜交；和第一標記探針被第一捕獲探針捕獲，第二標記探針被第二捕獲探針捕獲， 從而第一標記探針被第一靶核酸捕獲，第二標記探針第二靶核酸被捕獲。
32. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述細胞含有或被懷疑含有 第三靶核酸；所述方法包括提供含第三標記的第三標記探針，其中第三標記發出的第三信號可與第一 和第二信號相區別；在細胞中，第三標記探針被細胞中存在的第三靶核酸捕獲；檢測第三標記發出的第三信號，所述檢測包括測定第三信號的強度，和 按第二信號的強度標準化第三信號的強度。
33. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸和第二參比 核酸獨立選自DNA、 RNA、染色體DNA、 mRNA、細胞的內源核酸、通過用 病原體感染細胞而導入細胞或在細胞中表達的核酸。
34. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸是第一 mRNA,所述第二靶核酸是第二 mRNA。
35. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸包含第一染 色體DNA多核苷酸序列，所述第二參比核酸包含第二染色體DNA多核苷酸序列。
36. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述第一標記是第一螢光標記，和第二標記是第二螢光標記。
37. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述方法包括將按第二信號 強度標準化的第一信號強度與細胞中第一靶核酸的含量相關聯。
38. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述細胞是循環性腫瘤細胞。
39. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述含細胞樣品來自體液或 血液o
40. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述方法包括根據標準化的 第一信號鑑定所述細胞是否為所需靶細胞。
41. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，提供含細胞的樣品包括固定 和滲透處理細胞。
42. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述方法包括洗滌細胞以除 去未被耙核酸之一或參比核酸捕獲的物質。
43. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸和/或第二 參比核酸包括雙鏈DNA分子，所述方法包括使該雙鏈DNA變性然後再使第一 和第二標記探針被第一和第二核酸捕獲。
44. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述細胞在含細胞樣品中是懸浮細胞，禾n/或所述細胞在捕獲和/或檢測步驟期間為懸浮細胞。
45. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述檢測單個細胞中第一標 記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號包括在一次操作中檢測第一標 記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號。
46. 如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述檢測第一和第二信號包 括進行流式細胞檢測。
47. —種檢測特定類型單個細胞的方法，該方法包括提供包含多種類型細胞混合物的樣品，該混合物含有特定類型的至少一個 細胞；提供含第一標記的第一標記探針和提供含第二標記的第二標記探針，其中 第一標記發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別；在細胞中，第一標記探針被細胞中存在的第一靶核酸捕獲，第二標記探針 被細胞中存在的第二靶核酸捕獲；檢測第一標記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號； 將細胞中檢測到的第一信號和第二信號與細胞中第一和第二耙核酸的存在、缺失或含量相關聯；和根據細胞中第一和第二靶核酸的存在、缺失或含量的檢測鑑定該細胞是否為特定類型；所述特定類型細胞可根據細胞中第一耙核酸的存在、缺失或含量，或第二 靶核酸的存在、缺失或含量與混合物中其它類型的細胞相區別。
48. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述細胞包含第一耙核酸和 第二靶核酸，所述方法包括根據細胞中第一和第二靶核酸的存在或含量的檢 測鑑定該細胞是否為特定類型；所述特定類型細胞可根據細胞中第一耙核酸的 存在或含量，或第二靶核酸的存在或含量與混合物中其它類型的細胞相區別。
49. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述第一標記探針被第一靶 核酸捕獲包括第一標記探針與第一靶核酸雜交。
50. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述第二標記探針被第二靶 核酸捕獲包括第二標記探針與第二靶核酸雜交。
51. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述第一標記探針被第一靶 核酸捕獲和第二標記探針被第二靶核酸捕獲包括提供至少第一捕獲探針和至少第二捕獲探針；在細胞中，使第一捕獲探針與第一靶核酸雜交，和使第二捕獲探針與第二 靶核酸雜交；和第一標記探針被第一捕獲探針捕獲，第二標記探針被第二捕獲探針捕獲， 從而第一標記探針被第一靶核酸捕獲，第二標記探針第二靶核酸被捕獲。
52. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述方法包括提供含第三標記的第三標記探針，其中第三標記發出的第三信號可與第一和第二信號相區 別；在細胞中，第三標記探針被細胞中存在的第三靶核酸捕獲；和檢測第三標 記發出的第三信號。
53. 如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述細胞包含第三靶核酸， 所述方法包括按第三信號標準化第一和/或第二信號。
54. 如權利要求53所述的方法，其特徵在於，所述方法包括根據標準化的 第一和/或第二信號鑑定細胞是否為特定類型。
55. 如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述方法包括將檢測到的細胞第三信號與細胞中第三靶核酸的存在、缺失或含量相關聯；所述根據細胞中 第一和第二靶核酸的存在、缺失或含量的檢測鑑定該細胞是否為特定類型包括 根據細胞中第一、第二和第三靶核酸的存在、缺失或含量的檢測鑑定該細胞是 否為特定類型；所述特定類型細胞可根據細胞中第一靶核酸的存在、缺失或含 量，第二靶核酸的存在、缺失或含量、或第三靶核酸的存在、缺失或含量與混 合物中其它類型的細胞相區別。
56. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸和第二耙核 酸獨立選自DNA、 RNA、染色體DNA、 mRNA、細胞的內源核酸、通過用病 原體感染細胞而導入細胞或在細胞中表達的核酸。
57. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸是第一 mRNA，所述第二靶核酸是第二mRNA。
58. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸包含某 mRNA的第一區域，所述第二靶核酸包含該同一 mRNA的第二區域。
59. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述第一靶核酸包含第一染 色體DNA多核苷酸序列，所述第二靶核酸包含第二染色體DNA多核苷酸序列。
60. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述第一標記是第一螢光標 記，第二標記是第二螢光標記。
61. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述檢測第一信號和第二信 號包括檢測第一信號的強度和第二信號的強度；所述方法包括將第一和第二信 號的強度與細胞中存在的相應靶核酸含量相關聯。
62. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述細胞是循環性腫瘤細胞。
63. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述含細胞樣品來自體液或 血液。
64. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述特定類型細胞與混合物 中所有其它類型細胞的比率低於l:lx104、低於l:lx105、低於l:lx106、低於 l:lx107、或低於l:lx108。
65. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，提供包含各種類型細胞混合 物的樣品包括固定和滲透處理組成該混合類型細胞的細胞。
66. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述方法包括洗滌細胞以除 去未被靶核酸之一捕獲的物質。
67. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述細胞在樣品中是懸浮細胞，和/或所述細胞在捕獲和/或檢測步驟期間為懸浮細胞。
68. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述檢測第一標記發出的第 一信號和第二標記發出的第二信號包括在一次操作中檢測第一標記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號。
69. 如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述檢測第一和第二信號包 括進行流式細胞檢測。
70. —種組合物，其包含固定和經滲透處理的細胞，所述細胞含有或被懷疑含有第一耙核酸和第二 靶核酸；能與第一靶核酸雜交的至少第一捕獲探針 能與第二靶核酸雜交的至少第二捕獲探針，含第一標記的第一標記探針和含第二標記的第二標記探針，其中第一標記 發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別。
71. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包含一種第一 捕獲探針和一種第二捕獲探針；第一標記探針能與第一捕獲探針雜交，第二標 記探針能與第二捕獲探針雜交。
72. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包含兩種或多 種第一捕獲探針、兩種或多種第二捕獲探針、多個第一標記探針和多個第二標 記探針；其中一種第一標記探針能與第一捕獲探針之一雜交且一種第二標記探 針能與第二捕獲探針之一雜交。
73. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包含 一種第 一捕獲探針、 一種第二捕獲探針、多個第一標記探針、多個第二標記探針、第 一放大核酸和第二放大核酸；其中第一放大核酸能與第一捕獲探針和多個第一 標記探針雜交；第二放大核酸能與第二捕獲探針和多個第二標記探針雜交。
74. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包含兩種或 多種第一捕獲探針、兩種或多種第二捕獲探針、多個第一標記探針、多個第二 標記探針、第一放大核酸和第二放大核酸；其中第一放大核酸能與第一捕獲探 針之一和多個第一標記探針雜交；第二放大核酸能與第二捕獲探針之一和多個 第二標記探針雜交。
75. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包含 一種第 一捕獲探針、 一種第二捕獲探針、多個第一標記探針、多個第二標記探針、多個第一放大核酸、多個第二放大核酸、第一輔放大核酸和第二輔放大核酸；其 中所述第一輔放大核酸能與第一捕獲探針和多個第一放大核酸雜交；所述第二 輔放大核酸能與第二捕獲探針和多個第二放大核酸雜交；所述第一放大核酸能 與第一輔放大核酸和多個第一標記探針雜交；所述第二放大核酸能與第二輔放 大核酸和多個第二標記探針雜交。
76. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包含兩種或 多種第一捕獲探針、兩種或多種第二捕獲探針、多個第一放大核酸、多個第二 放大核酸、多個第一輔放大核酸、多個第二輔放大核酸；其中所述第一輔放大 核酸能與第一捕獲探針之一和多個第一放大核酸雜交；所述第二輔放大核酸能 與第二捕獲探針之一和多個第二放大核酸雜交；所述第一放大核酸能與第一輔 放大核酸和多個第一標記探針雜交；所述第二放大核酸能與第二輔放大核酸和 多個第二標記探針雜交。
77. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包含多個第一標記探針；多個第二標記探針；滾動循環擴增與第一捕獲探針雜交的第一環形多核苷酸產生的擴增的第一多核苷酸，此第一環形多核苷酸包含至少一個拷 貝的與第一標記探針中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，因此擴增的第一多核苷酸含有多個拷貝的與第一標記探針中該多核苷酸序列互補的多核苷酸 序列；滾動循環擴增與第二捕獲探針雜交的第二環形多核苷酸產生的擴增的第 二多核苷酸，此第二環形多核苷酸包含至少一個拷貝的與第二標記探針中某多 核苷酸序列相同的多核苷酸序列，因此擴增的第二多核苷酸含有多個拷貝的與 第二標記探針中該多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
78. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述細胞含有或被懷疑含 有第三靶核酸；所述組合物包含含第三標記的第三標記探針，其中第三標記 發出的第三信號可與第一和第二信號相區別；和至少能與第三靶核酸雜交的第 三捕獲探針。
79. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述第一靶核酸和第二靶 核酸獨立選自DNA、 RNA、染色體DNA、 mRNA、細胞的內源核酸、通過用 病原體感染細胞而導入細胞或在細胞中表達的核酸。
80. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述第一靶核酸是第一 mRNA，第二靶核酸是第二mRNA。
81. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述第一靶核酸包含第一染色體DNA多核苷酸序列，所述第二耙核酸包含第二染色體DNA多核苷酸序 列。
82. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述第一靶核酸包含某 mRNA的第一區域，和所述第二革巴核酸包含該同一 mRNA的第二區域。
83. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述第二靶核酸包括參比 核酸。
84. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述第一標記是第一螢光 標記，第二標記是第二螢光標記。
85. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述細胞是循環性腫瘤細胞。
86. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述細胞來自體液或血液。
87. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述細胞是特定類型細胞， 所述組合物包含一種或多種其它類型的細胞。
88. 如權利要求87所述的組合物，其特徵在於，所述特定類型細胞與該組 合物中所有其它類型細胞的比率低於l:lx104、低於l:lx105、低於l:lx106、低 於l:lx107、或低於l:lx108。
89. 如權利要求70所述的組合物，其特徵在於，所述細胞在所述組合物中 為懸浮細胞。
90. —種檢測單個細胞中第一靶核酸和第二靶核酸的試劑盒，該試劑盒的 一個或多個容器中裝有至少一種用於固定和滲透處理細胞的試劑； 能與第一靶核酸雜交的至少第一捕獲探針； 能與第二靶核酸雜交的至少第二捕獲探針；含第一標記的第一標記探針和含第二標記的第二標記探針，其中第一標記 發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別。
91. 一種通過檢測第一靶核酸和第二靶核酸來檢測細胞混合物中特定類型 單個細胞的試劑盒，該試劑盒的一個或多個容器中裝有至少一種用於固定和滲透處理細胞的試劑；含第一標記的第一標記探針和含第二標記的第二標記探針，其中第一標記 發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別；通過細胞中第一靶核酸的存在、缺失或含量，或細胞中第二靶核酸的存在、缺失或含量將特定類型細胞與混合物中其它類型的細胞相區別。
92. —種檢測單個細胞中兩種或多種靶核酸的方法，該方法包括 提供包含細胞的樣品，所述細胞含有或被懷疑含有第一靶核酸和第二耙核酸；在細胞中，第一標記探針被細胞中存在的第一靶核酸捕獲，第二標記探針 被細胞中存在的第二靶核酸捕獲，其中第一標記發出的第一信號可與第二標記 發出的第二信號相區別；第一靶核酸中跨越第一靶核酸至少20個毗連核苷酸 區域的每個核苷酸平均至少捕獲一個拷貝的第一標記，第二靶核酸中跨越第二 靶核酸至少20個毗連核苷酸區域的每個核苷酸平均至少捕獲一個拷貝的第二 豐示i己；禾口檢測第一標記發出的第一信號和第二標記發出的第二信號。
93. 如權利要求92所述的方法，其特徵在於，第一靶核酸橫跨至少20個毗 連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至少捕獲4、 8或12個拷貝的第一標記，第 二靶核酸橫跨至少20個毗連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至少捕獲4、 8或 12個拷貝的第二標記。
94. 如權利要求92所述的方法，其特徵在於，第一靶核酸橫跨至少20個 毗連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至少捕獲16個拷貝的第一標記，第二靶 核酸橫跨至少20個毗連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至少捕獲16個拷貝的 第二標記。
95. —種包含細胞的組合物，所述細胞含有第一靶核酸 第二靶核酸第一標記，細胞中存在該第一標記表明此細胞中存在第一靶核酸，細胞中第一耙核酸跨越第一靶核酸至少20個毗連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至 少存在一個拷貝的第一標記；和第二標記，細胞中存在該第二標記表明此細胞中存在第二靶核酸，細胞中 第二靶核酸跨越第二靶核酸至少20個毗連核苷酸的區域中每個核苷酸平均至 少存在一個拷貝的第二標記；其中第一標記發出的第一信號可與第二標記發出的第二信號相區別。
96. 如權利要求95所述的組合物，其特徵在於，所述第一標記的拷貝與第 一靶核酸實質相關，所述第二標記的拷貝與第二靶核酸實質相關。
97. —種進行單個細胞基因表達分析比較的方法，該方法包括 提供包含一種或多種特定類型細胞的第一混合細胞群；提供包含一種或多種特定類型細胞的第二混合細胞群；檢測第一細胞群中特定類型細胞的一種或多種靶核酸與參比核酸的相對表達水平，提供第一表達模式；檢測第二細胞群中特定類型細胞的一種或多種靶核酸與參比核酸的相對表達水平，提供第二表達模式；比較該第一和第二表達模式。
全文摘要
本發明提供了通過核酸間接捕獲標記來檢測單個細胞中多種靶核酸的方法。也提供通過按參比核酸水平標準化來檢測靶核酸相對水平的方法。描述了通過檢測核酸來檢測大的異質細胞群中單個細胞，特別是罕見細胞的方法。還提供相關的組合物、系統和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101495650SQ200680021808
公開日2009年7月29日 申請日期2006年6月19日 優先權日2005年6月20日
發明者羅宇齡, 陳世平 申請人:領先細胞醫療診斷有限公司