牙周病和牙髓疾病的治療劑以及治療方法

2023-12-03 09:01:56

專利名稱：牙周病和牙髓疾病的治療劑以及治療方法
技術領域：
本發明涉及到牙周病和牙髓疾病的治療劑以及治療方法、牙周組織再生用移植材料、牙周組織的再生方法。
背景技術：
由牙肉、牙槽骨、牙周韌帶(牙根膜)、牙骨質、牙髓等構成的牙周組織是用於使牙直立，維持咀嚼和咬合等功能的重要組織，它的損傷或破壞與牙的喪失相關。例如，據稱日本國內約3000萬人患有牙周病，在牙病發展的同時牙周組織的損傷或破壞也隨之發展，成為喪失牙的很大的一個原因。在被損傷或破壞的包括牙髓在內的牙周組織的治療中，雖然嘗試了給藥或外科手術等各種各樣的方法，但任一種藥劑或治療方法使被損傷或破壞的包括牙髓在內的牙周組織再生的效果可以說都不理想。
神經營養因子中有來自腦的神經營養因子(Brain-derivedneurotrophic factor、BDNF)、神經生長因子(Nerve growth factor、NGF)、神經營養素3(Neurotrophin3、NT-3)以及神經營養素4/5(Neurotrophin4/5、NT-4/5)，參與促進神經細胞的分化或維持生存、促進再生、維持功能。BDNF和NT-4/5特異結合稱為TrkB(tropomyosin receptor kinase B)的高親和性受體、NGF特異結合稱為TrkA的高親和性受體、NT-3特異結合稱為TrkC的高親和性受體。
BDNF、NGF、NT-3是主要存在於腦內的神經營養因子，BDNF和NGF通過使用運動神經障礙模型、帕金森病模型、阿爾茨海默病模型等各種疾病模型動物的實驗已證明其有效性。人們正期盼其中BDNF可作為以下各種疾病的治療劑的開發，運動 末梢神經疾病-肌萎縮性側索硬化症(ALS)、糖尿病和由化療製劑導致的末梢神經障礙等，以及中樞神經系疾病-阿爾茨海默病、帕金森病、視網膜關聯疾病等。
可以說這些神經營養因子不僅在中樞神經系，而且在末梢神經系也起著重要的作用。有報導稱在小鼠肋骨骨折的治癒過程中，BDNF、NGF、NT-3、TrkC、TrkA的表達增加(K.Asaumi等人、Bone Vol26，No.6，625-633，2000)，BDNF、NGF、NT-3促進小鼠牙周韌帶細胞的增殖(Y.Tsuboi等人，J Dent Res 80，(3)，881-886，2001)等。然而，有關這些神經營養因子在牙周組織或牙髓組織中的作用的詳細報導還沒有。

發明內容
本發明的目的在於提供牙周病和牙髓疾病的治療劑以及治療方法、牙周組織再生用移植材料、牙周組織的再生方法。
本發明人為了解決上述課題進行了不斷研究，結果了解到神經營養因子促進來自人牙周韌帶的成纖維細胞的增殖，促進骨關聯蛋白質的mRNA表達，狗的牙根分叉部病變模型中促進牙周組織的再生，直至完成本發明。
即，利用本發明，可提供以神經營養因子作為有效成分的牙周病治療劑。
本發明的治療劑優選使牙周組織再生。
本發明的治療劑優選使牙骨質、牙周韌帶、牙槽骨或牙髓再生。
本發明的治療劑優選防止牙肉上皮沿著牙根面根尖方向侵入。
本發明的治療劑優選促進牙髓腔中修復象牙質的產生。另外優選促進修復象牙質向牙髓腔內壁的添加。
在本發明的治療劑中，神經營養因子優選是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。
根據本發明的另一個方面可提供含有神經營養因子的牙周組織再生用移植材料。
本發明的移植材料優選使牙周組織再生。
本發明的移植材料優選使牙骨質、牙周韌帶、牙槽骨或牙髓再生。
本發明的移植材料優選防止牙肉上皮沿著牙根面根尖方向。
本發明的移植材料優選促進牙髓腔中的修復象牙質的產生。另外，優選向牙髓腔內壁添加修復象牙質。
在本發明的移植材料中，神經營養因子優選是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。
根據本發明的另一個方面可以提供使用神經營養因子的牙周組織的再生方法。
本發明的再生方法優選使牙周組織再生。
本發明的再生方法優選使牙骨質、牙周韌帶、牙槽骨或牙髓再生。
本發明的再生方法優選防止牙肉上皮沿著牙根面根尖方向侵入。
在本發明的再生方法中，神經營養因子優選是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。
根據本發明的另一方面可以提供牙周病的治療法，作為牙周病的治療方法包括向患有或容易患有這樣疾病狀態的對象給予治療有效量的神經營養因子。
本發明的治療法優選使牙周組織再生。
本發明的治療法優選使牙骨質、牙周韌帶、牙槽骨或牙髓再生。
本發明的治療法優選防止牙肉上皮向牙根面根尖方向進入。
本發明的治療法優選促進牙髓腔中修復象牙質的產生。另外優選修復象牙質向牙髓腔內壁的添加。
在本發明的治療法中，神經營養因子優選是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。
根據本發明的另一方面可以提供用於製造牙周病治療中使用的藥劑的神經營養因子的使用。
該藥劑優選使牙周組織再生，優選使牙骨質、牙周韌帶、牙槽骨或牙髓再生。該藥劑優選防止牙肉上皮向牙根面根尖方向進入。該藥劑優選促進牙髓腔中修復象牙質的產生。另外優選促進修復象牙質向牙髓腔內壁的添加。神經營養因子優選是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。
根據本發明的另一方面可以提供以神經營養因子作為有效成分的修復象牙質的形成促進劑。神經營養因子優選是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。優選修復象牙質添加到牙髓腔的內壁。
根據本發明的另一方面可以提供牙髓疾病的治療法，作為牙髓疾病的治療方法，包括為了促進修復象牙質的形成向患有或容易患有這樣疾病的對象給予治療有效量的神經營養因子。其中神經營養因子優選是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。優選修復象牙質被添加到牙髓腔的內壁。
本發明的另一個方面可以提供為了製造在促進修復象牙質的形成中使用的藥劑的神經營養因子的使用。其中神經營養因子優選是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。優選修復象牙質被添加到牙髓腔的內壁。
附圖的簡單說明[

圖1]是在HPL細胞以及人牙周韌帶中顯示BDNF和TrkB的mRNA表達的電泳圖。各個電泳圖左端帶為標記。(A)表示甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA(613bp)在人牙周韌帶和HPL細胞中的表達。(B)表示BDNF的mRNA(438bp)和TrkB的mRNA(434bp)在人牙周韌帶中的表達。(C)表示BDNF和TrkB的mRNA在HPL細胞中的表達。
是表示在HPL細胞中BDNF的作用時間與ALPase的mRNA(381bp)的表達量的關係的電泳圖和圖。HPL細胞都用最終濃度50ng/ml的BDNF處理。電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以BDNF作用時間0的mRNA表達量作為1時各個作用時間中的mRNA表達量的比例。橫軸表示BDNF作用時間。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。**表示p＜0.01的統計學的有意義差(t-test)。
是表示在HPL細胞中BDNF的作用時間與OPN的mRNA(532bp)的表達量的關係的電泳圖和圖。HPL細胞都用最終濃度50ng/ml的BDNF處理。電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以BDNF作用時間0的mRNA表達量作為1時各個作用時間中的mRNA表達量的比例。橫軸表示BDNF作用時間。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。**表示p＜0.01的統計學的有意義差(t-test)。
是表示在HPL細胞中BDNF的作用時間與BMP-2的mRNA(440bp)的表達量的關係的電泳圖和圖。HPL細胞都用最終濃度50ng/ml的BDNF處理。電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以BDNF作用時間0的mRNA表達量作為1時各個作用時間中的mRNA表達量的比例。橫軸表示BDNF作用時間。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。**表示p＜0.01的統計學的有意義差(t-test)。
是表示在HPL細胞中BDNF的作用時間與GAPDH的mRNA的表達量的關係的電泳圖。HPL細胞都用最終濃度50ng/ml的BDNF處理。電泳圖左端帶為標記。
是表示在HPL細胞中BDNF的作用時間與BMP-4的mRNA(339bp)的表達量的關係的電泳圖和圖。HPL細胞都用最終濃度50ng/ml的BDNF處理。電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示 BDNF作用時間0的mRNA表達量作為100時各個作用時間中的mRNA表達量的百分率。橫軸表示BDNF作用時間。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。
是表示在HPL細胞中BDNF的作用時間與OPG的mRNA(736bp)的表達量的關係的電泳圖和圖。HPL細胞都用最終濃度50ng/ml的BDNF處理。電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示 BDNF作用時間0的mRNA表達量作為100時各個作用時間中的mRNA表達量的百分率。橫軸表示BDNF作用時間。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。
是表示在HPL細胞中BDNF的給予量與ALPase的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖。使各個濃度的BDNF作用於HPL細胞24小時。電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示BDNF的給予量為0的mRNA表達量作為1時在各個給予量下的mRNA表達量的比例。橫軸表示BDNF的濃度(ng/ml)。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。**表示p＜0.01的統計學的有意義差(t-test)。
是表示在HPL細胞中BDNF的給予量與OPN的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖。使各個濃度的BDNF作用於HPL細胞12小時。電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以BDNF的給予量為0的mRNA表達量作為1時於各個給予量下的mRNA表達量的比例。橫軸表示BDNF的濃度(ng/ml)。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。**表示p＜0.01的統計學的有意義差(t-test)。
是表示在HPL細胞中BDNF的給予量與BMP-2的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖。使各個濃度的BDNF作用於HPL細胞24小時。電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以BDNF的給予量為0的mRNA表達量作為1時於各個給予量下的mRNA表達量的比例。橫軸表示BDNF的濃度(ng/ml)。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01的統計學的有意義差(t-test)。
是表示在HPL細胞中BDNF的給予量與GAPDH的mRNA(613bp)的表達量關係的電泳圖。
(A)是表示在HPL細胞中BDNF的給予量與OPN的分泌量關係的圖。使各個濃度的BDNF作用於HPL細胞12小時。縱軸表示OPN的分泌量(ng/ml)，橫軸表示BDNF的濃度(ng/ml)。(B)表示在HPL細胞中BDNF的給予量與BMP-2分泌量關係的圖。使各個濃度的BDNF作用於HPL細胞24小時。縱軸表示表示BMP-2分泌量(pg/ml)，橫軸表示BDNF的濃度(ng/ml)。(C)是表示在HPL細胞中BDNF的作用時間與BMP-2的分泌量關係的圖。細胞用最終濃度50ng/ml的BDNF處理。縱軸表示表示BMP-2分泌量(pg/ml)，橫軸表示BDNF的作用時間。(A)～(C)的各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。**表示p＜0.01的統計學的有意義差(t-test)。
是表示BDNF的給予量與HPL細胞和HGK的DNA合成能力關係的圖。使各個濃度的BDNF作用於HPL細胞和HGK24小時。各個圖的縱軸以沒有給予BDNF或bFGF(即BDNF濃度為0或bFGF濃度為0)時的DNA合成能力作為100時的各個給予量下的DNA合成能力的比例。橫軸表示BDNF或bFGF的濃度(ng/ml)。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01的統計學的有意義差(t-test)。(A)表示HPL細胞中的DNA合成能力，(B)表示HGK細胞中的DNA合成能力。
(A)是表示HPL細胞中BDNF的給予量與I型膠原的合成量關係的圖。使各個濃度的BDNF作用於HPL細胞24小時。縱軸表示I型膠原的合成量(μg/ml)，橫軸表示BDNF的濃度(ng/ml)。(B)是表示HPL細胞中BDNF的作用時間與I型膠原的合成量關係的圖。細胞用最終濃度50ng/ml的BDNF處理。縱軸表示I型膠原的合成量(μg/ml)，橫軸表示BDNF的作用時間。(A)、(B)的各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01的統計學的有意義差(t-test)。
是表示狗的3級牙根分叉部病變模型中BDNF的給予量與牙骨質和牙槽骨再生的關係的圖。縱軸表示牙骨質再生率(％)或骨再生率(％)，橫軸表示BDNF的濃度(μg/ml)。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01的統計學的有意義差(t-test)。(A)表示與牙骨質再生率的關係，(B)表示與骨再生率的關係。
是填塞了實施例2做成的不含BDNF的TERUPLUGR的牙根分叉部骨缺損部位(對照組)的蘇木精·曙紅染色標本的光學顯微鏡像(倍率20倍)。
是填塞了實施例2做成的含有BDNF(5μg/ml)的移植材料的分叉部骨缺損部位的顯微鏡像(倍率20倍)。
是圖9B的牙根分叉部正下方的部分放大像(倍率200倍)。在牙根分叉部正下方，在裸露的牙根面的幾乎所有部分中埋入了膠原纖維的牙骨質已再生，也沒有看到上皮的侵入。
是表示HPL細胞中NGF的mRNA表達量的放射活性的帶和圖。圖縱軸表示NGF的mRNA表達量對GAPDH的mRNA表達量的比例。圖中，HGF表示牙肉成纖維細胞、HPC表示牙髓細胞、HSF表示來自包皮的成纖維細胞、HNB表示人成神經細胞瘤細胞。
是表示HPL細胞中TrkA的mRNA表達量的放射活性的帶和圖。圖縱軸表示TrkA的mRNA表達量對GAPDH的mRNA表達量的比例。圖中，HGF表示牙肉成纖維細胞、HPC表示牙髓細胞，HSF表示來自包皮的成纖維細胞、HNB表示人成神經細胞瘤細胞。
是NGF影響HPL細胞中OPN的mRNA表達量的圖。(A)是表示NGF的經時效果的測定結果的圖，圖縱軸表示以NGF作用時間0的mRNA表達量作為1時各個作用時間中的OPN的mRNA表達量的比例。圖橫軸表示NGF的作用時間。全部用最終濃度100ng/ml的NGF進行處理。(B)是表示濃度效果的測定結果的圖。圖縱軸表示以在NGF濃度0時mRNA表達量作為1時，各個濃度下OPN的mRNA表達量的比例。橫軸表示NGF的濃度(ng/ml)。NGF都作用24小時。
是表示NGF影響HPL細胞中ALPase的mRNA表達量的圖。(A)是表示NGF的經時效果的測定結果的圖，圖縱軸表示以NGF作用時間0的ALPase的mRNA表達量作為1時各個作用時間中的ALPase的mRNA表達量的比例。圖橫軸表示NGF的作用時間。(B)是表示濃度效果的測定結果的圖。圖縱軸表示以在NGF濃度0時ALPase的mRNA表達量作為1時，各個濃度下ALPase的mRNA表達量的比例。橫軸表示NGF的濃度(ng/ml)。
是表示NGF影響HPL細胞中BMP-2的mRNA表達量的圖。(A)是表示NGF的經時效果的測定結果的圖，圖縱軸表示以NGF作用時間0的BMP-2的mRNA表達量作為1時各個作用時間中的BMP-2的mRNA表達量的比例。圖橫軸表示NGF的作用時間。(B)是表示濃度效果的測定結果的圖。圖縱軸表示以在NGF濃度0時BMP-2的mRNA表達量作為1時，在各個濃度下BMP-2的mRNA表達量的比例。橫軸表示NGF的濃度(ng/ml)。
是表示NGF的給予量與HPL細胞和HGK的DNA合成能力關係的圖。使各個濃度的NGF作用於HPL細胞和HGK24小時。各個圖的縱軸以NGF濃度0時的DNA合成能力作為100時的各個NGF給予量下的DNA合成能力的比例。橫軸表示NGF的濃度(ng/ml)。(A)表示在HPL細胞中的DNA合成能力，(B)表示在HGK中的DNA合成能力。
是表示在HPL細胞中NT-3的mRNA表達量的放射活性的帶和圖。圖縱軸表示GAPDH的mRNA表達量作為1時的NT-3的mRNA表達量的比例。圖中，HGF表示牙肉成纖維細胞、HPC表示牙髓細胞、HSF表示來自包皮的成纖維細胞、HNB表示人成神經細胞瘤細胞。
是表示HPL細胞中TrkC的mRNA表達量的放射活性的帶和圖。圖縱軸表示GAPDH的mRNA表達量作為1時的TrkC的mRNA表達量的比例。圖中，HGF表示牙肉成纖維細胞、HPC表示牙髓細胞，HSF表示來自包皮的成纖維細胞、HNB表示人成神經細胞瘤細胞。
是HPL細胞中的表示NT-3的給予量與ALPase活性的關係的圖。圖縱軸表示ALPase活性(nmol/孔)，橫軸表示NT-3濃度(ng/ml)。
是表示在HPL細胞中的NT-3的給予量與HPL細胞的DNA合成能力的關係的圖。圖縱軸表示通過吸光度比較在NT-3各濃度下的HPL細胞的DNA合成能力，橫軸表示NT-3濃度(ng/ml)。
是表示在HPL細胞中NT-4/5的作用時間與OPN、OCN的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖。NT-4/5最終濃度調整到50ng/ml。電泳圖左端帶為標記。各個圖縱軸表示以NT-4/5作用時間0的各mRNA表達量作為100時各個作用時間中的各mRNA表達量的比例。橫軸表示NT-4/5作用時間。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。各圖中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(統計學的鑑定用t-test)。
是表示在HPL細胞中NT-4/5的作用時間與BMP-2、BMP-7的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖。NT-4/5最終濃度調整到50ng/ml。電泳圖左端帶為標記。各個圖縱軸表示以NT-4/5作用時間0的各mRNA表達量作為100時各個作用時間中的各mRNA表達量的比例。橫軸表示NT-4/5作用時間。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。各圖中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(統計學的鑑定用t-test)。
是表示在HPL細胞中NT-4/5的作用時間與ALPase的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖，以及NT-4/5的作用時間與GAPDH的表達量的關係的電泳圖。NT-4/5最終濃度調整到50ng/ml。電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以NT-4/5作用時間0的mRNA表達量作為100時各個作用時間中的各mRNA表達量的比例。橫軸表示NT-4/5作用時間。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。*表示p＜0.05(統計學的鑑定用t-test)。
是表示對於HP細胞的各個骨關聯蛋白質(ALPase、BMP-2、DSPP、OPN、OCN)的mRNA表達的NGF濃度效果的測定結果的圖。NGF作用時間是24小時。各圖縱軸表示以在NGF濃度0時mRNA表達量作為1時，在各個濃度下mRNA表達量的比例。橫軸表示NGF的濃度(ng/ml)。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。
是表示對於HP細胞的各個骨關聯蛋白質(ALPase、BMP-2、DSPP、I型膠原、OPN、OCN)的mRNA表達的BDNF濃度效果的測定結果的圖。各圖縱軸表示以在BDNF濃度0時各mRNA表達量作為1時，在各個濃度下mRNA表達量的比例。橫軸表示BDNF的濃度(ng/ml)。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。
是表示NT-3濃度對於HP細胞的各個骨關聯蛋白質(ALPase、BMP-2、DSPP、OPN、OCN)的mRNA表達的效果的測定結果的圖。各圖縱軸表示以在NT-3濃度0時mRNA表達量作為1時，在各個濃度下mRNA表達量的比例。橫軸表示NT-3的濃度(ng/ml)。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。
是表示NT-4/5濃度對HP細胞的各個骨關聯蛋白質(ALPase、BMP-2、DSPP、I型膠原、OPN、OCN)的mRNA表達的效果的測定結果的圖。各圖縱軸表示以在NT-4/5濃度0時mRNA表達量作為1時，在各個濃度下mRNA表達量的比例。橫軸表示NT-4/5的濃度(ng/ml)。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。
是表示各種神經營養因子(NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5)的給予量與HP細胞的DNA合成能力關係的圖。使各濃度神經營養因子作用於HP細胞24小時。各個圖的縱軸以沒有給予神經營養因子(即神經營養因子的濃度0)時的吸光度作為100時的各個給予量下的吸光度的比例。橫軸表示各神經營養因子的濃度(ng/ml)。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。
是表示在HMS細胞中NGF的作用時間與ALPase的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖。也顯示出表示與作為對照的GAPDH的mRNA表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的NGF處理。電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以NGF作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示NGF作用時間。
是表示在HMS細胞中NGF的作用時間與OCN的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖。也顯示出表示與GAPDH的mRNA的表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的NGF處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以NGF作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示NGF作用時間。
是表示在HMS細胞中NGF的作用時間與OPN的mRNA表達量的關係的電泳圖和圖。也給出了與GAPDH的mRNA表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的NGF處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以NGF作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示NGF作用時間。
是表示在HMS細胞中NGF的作用時間與BSP的mRNA表達量的關係的電泳圖和圖。也顯示出也給出了與GAPDH的mRNA表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的NGF處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以NGF作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示NGF作用時間。
是表示在HMS細胞中NGF的作用時間與I型膠原的mRNA表達量的關係的電泳圖和圖。也顯示出表示與GAPDH的mRNA的表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的NGF處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以NGF作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示NGF作用時間。
是表示在HMS細胞中BDNF的作用時間與ALPase的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖。也給出了與GAPDH的mRNA的表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的BDNF處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以BDNF作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示BDNF作用時間。
是表示在HMS細胞中BDNF的作用時間與OCN的mRNA表達量的關係的電泳圖和圖。也給出了與GAPDH的mRNA表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的BDNF處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以BDNF作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示BDNF作用時間。
是表示在HMS細胞中BDNF的作用時間與OPN的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖。也給出了與GAPDH的mRNA的表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的BDNF處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以BDNF作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示BDNF作用時間。
是表示在HMS細胞中BDNF的作用時間與BSP的mRNA表達量的關係的電泳圖和圖。也給出了與GAPDH的mRNA的表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的BDNF處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以BDNF作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示BDNF作用時間。
是表示在HMS細胞中BDNF的作用時間與I型膠原的mRNA表達量的關係的電泳圖和圖。也給出了表示與GAPDH的mRNA的表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的BDNF處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以BDNF作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示BDNF作用時間。
是表示在HMS細胞中NT-3的作用時間與ALPase的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖。也給出了與GAPDH的mRNA表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的NT-3處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以NT-3作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示NT-3作用時間。
是表示在HMS細胞中NT-3的作用時間與OCN的mRNA的表達量的關係的電泳圖和圖。也給出了與GAPDH的mRNA的表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的NT-3處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以NT-3作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示NT-3作用時間。
是表示在HMS細胞中NT-3的作用時間與OPN的mRNA表達量的關係的電泳圖和圖。也給出了與GAPDH的mRNA表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的NT-3處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以NT-3作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示NT-3作用時間。
是表示在HMS細胞中NT-3的作用時間與BSP的mRNA表達量的關係的電泳圖和圖。也給出了表示與GAPDH的mRNA表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的NT-3處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以NT-3作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示NT-3作用時間。
是表示在HMS細胞中NT-3的作用時間與I型膠原的mRNA表達量的關係的電泳圖和圖。也給出了與GAPDH的mRNA表達量的關係的電泳圖。HMS細胞都用最終濃度100ng/ml的NT-3處理。各電泳圖左端帶為標記。圖縱軸表示以NT-3作用時間0的mRNA表達量作為100％時各個作用時間下的mRNA表達量的百分率。橫軸表示NT-3作用時間。
是表示抗壞血酸(Aa)、NGF、BDNF、NT-3對HMS細胞的增殖影響的效果的圖。圖縱軸表示試驗組相對於對照組的吸光度的百分率。各個棒圖的杆表示平均值±標準偏差的範圍。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(統計學的鑑定用t-test)。
是填塞了實施例8做成的含NGF(100μg/ml)的移植材料的牙根分叉部骨缺損部位的光學顯微鏡像(倍率20倍)。
是填塞了實施例8做成的含NT-3(100μg/ml)的移植材料的牙根分叉部骨缺損部位的光學顯微鏡像(倍率20倍)。
具體實施例方式
以下就本發明的更具體的方式、以及用於實施本發明的方法進行說明。
在本說明書中，所謂「牙周組織」指的是由牙肉、牙槽骨、牙周韌帶(牙根膜)、牙骨質構成的組織。
所謂「牙肉」指的是被覆牙頸部和牙槽骨一部分的軟組織，由牙肉上皮和牙肉固有層構成。
所謂「牙周韌帶」是介於牙槽骨和牙骨質之間的結締組織，也稱為牙根膜。
「牙槽骨」分為相當於包圍牙根的牙槽壁的緻密質部分的固有牙槽骨、以及由處於它的外側的海綿質和緻密質的部分構成的支持牙槽骨。
「牙骨質」是牙根的最表層的硬組織，分為含有牙骨質細胞的有細胞性牙骨質和不含有牙骨質細胞的無細胞性牙骨質。
「牙髓」是負責牙的生活反應的組織，對生理、病的刺激反應，形成牙質。由牙髓細胞、神經纖維、細胞外基質、血管等構成。
所謂「再生(regeneration)」是喪失組織、被破壞的組織和損傷組織的再構成(reconstruction)以及再構建(reproduction)，「牙周組織的再生」是使牙周組織恢復到原來狀態的功能。
所謂「修復(repair)」指的是創傷部的結構和功能現在不能以完全的狀態恢復的組織的治癒，在「牙周組織的修復」中，包括對牙根表面的上皮性附著等。
所謂「防止牙肉上皮沿著牙根面根尖方向侵入」指的是防止牙肉上皮細胞沿著牙根面向牙根尖側增殖。
所謂「牙周組織再生用移植材料」是促進牙周組織再生的材料。為了使BDNF等神經營養因子以一定的濃度作用於所定的生物體部位(牙槽骨的缺損部位等)，需要某種支架材料(scaffold)。組合了可成為這樣支架材料的材料與BDNF等神經營養因子的材料是本申請的移植材料。
所謂「牙周病」指的是局部的細菌等為起因引起的牙周組織的發炎性疾病。
所謂「修復象牙質」指的是受到外來刺激的結果形成的象牙質。
所謂「牙髓疾病」指的是牙髓的發炎性疾病、退行變性等。
本發明在人等溫血動物中，特別優選的是適用於人。
本發明中使用的神經營養因子、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5等無論是通過基因重組或化學合成等人工製造的，還是天然型(native)的都可以。
本發明的牙周病治療劑優選是通過外用劑等局部給藥。也可以充填到注射器等，注入到牙周袋內。另外當進行牙周外科治療時，也可以向牙周組織的缺損部給藥。此時，為了能以一定濃度長時間作用，優選是使本發明的治療劑吸收到片材或海綿等後使用。優選將感染的牙周組織除去之後給藥。本發明的治療劑可以通過注射局部給藥。例如，可以注射到牙周袋部的牙肉，也可以注射到牙槽骨頂部附近的牙根膜腔。也可以注射到牙根尖部附近。
本發明的修復象牙質形成促進劑優選是通過外用劑等局部給藥。例如，可以將液狀、膏狀、糊狀等修復象牙質形成促進劑運用於露髓部，也可以運用於斷髓(amputation)或拔髓(extirpation of thepulp)。也可以運用吸收活性成分的片材或海綿，進行一定期間暫封。或當對由於外傷等脫落的牙進行再植時，也可以運用於牙根尖部等。
作為本發明的牙周病治療劑和修復象牙質形成促進劑的劑型，如通過通常的製劑方法使用製劑中容許的載體或稀釋劑等製造的膏劑、軟膏劑、洗劑等外用劑以及例如以水系的溶劑為主要成分的注射劑等。作為粉末狀劑型，也可以在使用之前溶解於精製水等後使用。
本發明的牙周病治療劑和修復象牙質形成促進劑的給藥量因給予對象的年齡、性別、症狀等不同而有所差異，在局部給藥時，通常每一顆牙作為神經營養因子為1×10-12g～1×10-3g、特優選1×10-11g～1×10-7g、更優選1×10-10g～1×10-8g。一般來說，當通過注射局部給藥時，比外用藥少的給藥量就可以。
本發明的移植材料每一個牙根分叉部缺損中使用的每份量，優選含有1×10-12g～1×10-3g、特別優選1×10-11g～1×10-8g、更特別優選1×10-10g～1×10-9g的神經營養因子。
本發明的牙周病治療劑、修復象牙質形成促進劑和移植材料只要是不妨礙其有效性，可以與其它藥劑組合使用。也可以將BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5相互組合後使用。也可以與來自骨髓的間葉系幹細胞(MSC)、來自牙周韌帶的成纖維細胞、牙肉成纖維細胞、血管內皮細胞等組合使用。也可以與氫氧化鈣製劑、抗菌劑等並用。
在本發明的移植材料中作為可與神經營養因子組合的材料只要是能在給藥局部保持神經營養因子的對生物體沒有危害性的材料就可以，例如優選多孔性的片材或海綿等。如果是生物體分解性蛋白質材料(膠原、明膠、白蛋白、富有血小板的血漿(PRP))或組織吸收性材料(聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、透明質酸(HA)、三磷酸鈣(TPC))，由於以後不用取出所以更優選。例如，TERUPLUG R(商品名)(TERUMO株式會社)、GC膜(商品名)(株式會社GC)、Osferion(商品名)(OLYMPUS株式會社)等。
實施例以下通過實施例對本發明進行更詳細說明。
(實施例1)BDNF對來自人牙周韌帶成纖維細胞(humanperiodontal ligament cell、HPL細胞)和人牙肉上皮細胞(humangingival keratinocyte、HGK)影響的研究。
(1)使用細胞(i)來自牙周韌帶的成纖維細胞(HPL細胞)從為矯正治療而方便拔出的健全的人小臼齒的牙周韌帶分離HPL細胞。為了防止來自牙周韌帶周圍的其它結締組織的細胞混入，用手術刀將除去人小臼齒的齒頸部、除去牙根部的牙根中央部的健康牙周韌帶剝離，切碎。將切碎的組織貼附在直徑60mm的細胞培養用皿(CORNING、NY)，於37℃、5％CO2氣相條件下進行培養。培養基使用添加了10％FBS(GIBCO、Buffalo、NY)、盤尼西林(100單位/ml)(明治制果、東京)、鏈黴素(100μg/ml)(明治制果)、以及兩性黴素B(1μg/ml)(GIBCO)的Dulbecco改進培養基(DMEM、日水製藥、東京)(這裡使用的培養基表記為「培養基A」)。將進行了4～8代繼代的HPL細胞供以下實驗用。
(ii)人牙肉上皮細胞(HGK)要將使用人培養細胞的實驗的必要性以及牙肉的使用目的等對患者充分說明，徵得患者同意後，接受牙肉的提供。以智齒牙周炎患者當在拔掉成為病因的智齒時，可以從剩餘的牙肉邊(gingival flap)獲得牙肉片。將得到的牙肉片於4℃下用含有0.01％乙二胺四乙酸(EDTA)和0.025％胰蛋白酶的Dulbecco PBS(-)(PBS(-)、日水制果)處理一晝夜，分離HGK。用含有牛胰島素(10μg/ml)(Sigma、St.Rouis，MO，USA)、人轉運鐵蛋白(5μg/ml)(Sigma)、2-巰基乙醇(10μM)、2-氨基乙醇(10μM)、亞硒酸鈉(10μM)、牛下垂體提取液(50μg/ml)、盤尼西林(100單位/ml)、鏈黴素(100μg/ml)以及兩性黴素B(50ng/ml)的MCDB153培養基(Sigma)進行初代培養(將這裡使用的培養基表記為「培養基C」)。培養使用牛I型膠原被覆的直徑60mm培養皿(SUMILON CELTITE C-1、住友BAKELIGHT、東京)，於37℃、5％CO2氣相條件下進行。將進行了3～4代繼代培養的HGK供以下實驗用。
(2)BDNF和它的受體在HPL細胞中的表達對於BDNF和TrkB的mRNA在HPL細胞以及人牙周韌帶中的表達使用用於RT-PCR的第1條鏈cDNA合成試劑盒(Roche、Indianapolis)，通過逆轉錄PCR法進行研究。
當上述(1)(i)中得到的HPL細胞達到鋪滿時，回收細胞，通過ISOGEN(Nippin Gene，東京)使細胞溶解後，加氯仿進行離心分離，向得到的水相中加異丙醇，提取總RNA。
將上述(1)(i)中得到的人牙周韌帶在ISOGEN中均勻化後，加入氯仿進行離心分離，在得到的水相中加入異丙醇，提取總RNA。
對於純化的總RNA中的1μg的各個RNA使用寡dT引物進行逆轉錄，通過PCR反應30個循環使得到的cDNA擴增後，進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳。作為對照使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。
結果如圖1所示。作為對照使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。就像圖表明的那樣，在人牙周韌帶中看到BDNF和TrkB的mRNA的表達，在從該人牙周韌帶分離、培養的HPL細胞中也確認BDNF和TrkB的mRNA表達。
(3)細胞用BDNF處理(i)HPL細胞將上述(1)(i)中得到的HPL細胞在用牛I型膠原被覆的直徑60mm培養皿(SUMILON CELTITE C-1)，每一個皿3.5×105個，使用含有50μg/ml的L-抗壞血酸的培養基A，於37℃、5％CO2氣相條件下培養13天(將這裡使用的培養基記為「培養基B」)。培養基每2天交換一次。在第14天培養結束前0、3、6、12或24小時，用DMEM將細胞洗2次，換成含有最終濃度0、1、10、50或100ng/ml的BDNF(Recombinant Human BDNF、RD system、Minneapolis、USA)的無血清培養基(添加了盤尼西林(100單位/ml)、鏈黴素(100μg/ml)以及兩性黴素B(1μg/ml)(GIBCO)以及L-抗壞血酸(50μg/ml)的DMEM)(將這裡使用的培養基記為「培養基D」)。
(ii)HGK將上述(1)(ii)中得到的HGK按照2×103個/孔接種到用牛I型膠原被覆的96孔板(SUMILON CELTITE C-1板96F、住友BEKELIGHT)，於37℃、5％CO2氣相條件下，使用培養基C進行培養。培養基每2天交換一次。當處於細胞增殖期的培養第4～5天，將板的細胞用MCDB153培養基洗2次，換成含有最終濃度0、1、10、25、50或100ng/ml的BDNF的培養基(除了不含牛下垂體提取液以外，其它與培養基C同一組成的培養基)培養24小時。
(4)骨相關蛋白在HPL細胞中的表達(i)mRNA的表達與上述(3)(i)所述方法同樣操作，使用ISOGEN從用最終濃度0、1、10、50或100ng/ml的BDNF處理的HPL細胞提取、純化總RNA。鹼性磷酸酶(ALPase)、骨形成蛋白-2(bone morphogeneticprotein-2，BMP-2)、骨形成蛋白-4(bone morphogeneticprotein-4、BMP-4)、骨橋蛋白(osteopontin、OPN)、護骨蛋白(osteoprotegerin、OPG)的mRNA表達量使用ABI PRISM7700(Applied Biosystems、東京)，通過實時監測PCR產物生成過程進行定量解析(Real-time PCR法)。作為對照使用GAPDH。
對於各個骨相關蛋白的mRNA表達的BDNF的經時效果測定的結果如圖2A～2C、3A、3B所示，濃度效果測定的結果如圖4A～4C所示。在各個圖中*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(統計學的鑑定通過t-test)。
就像這些圖所表明的那樣，BDNF不影響OPG、BMP-4的mRNA表達，但ALPase、BMP-2、OPN的mRNA表達量依賴於濃度和時間，隨著它們增加而增加。
(ii)蛋白質的表達將上述(1)(i)中得到的HPL細胞按照1×104個/孔接種到用牛I型膠原被覆的48孔板(SUMILON CELTITE C-1板48F、住友BEKELIGHT)，使用培養基B培養13天。培養基每2天交換一次。在第14天培養結束前24小時，將板的細胞用DMEM培養基洗2次，換成含有最終濃度0、1、10、25、50或100ng/ml的BDNF的無血清培養基D。培養結束後，回收上清，通過ELISA法測定上清中的分泌OPN量、分泌BMP-2量。在分泌OPN量的測定中使用夾心ELISA試劑盒(IBL、群馬)，在分泌BMP-2量的測定中使用夾心ELISA試劑盒(RDsystem)。
圖5中給出了BDNF對於HPL細胞的分泌OPN量和分泌BMP-2量的經時效果測定以及濃度效果測定的結果。在各個圖中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(統計學的鑑定通過t-test)。就像圖5所表明的那樣，BDNF促進OPN和BMP-2在HPL細胞中的分泌。
(5)HPL細胞和HGK的增殖對於BDNF對HPL細胞和HGK的DNA合成能力的影響使用CellProliferation ELISA system，version2(Amer sham PharmaciaBiotech)通過ELISA法進行測定。
將上述(1)(i)中得到的HPL細胞按照5×103個/孔接種到用牛I型膠原被覆的96孔板(SUMILON CELTITE C-1板96F、住友BEKELIGHT)，使用培養基B培養10天。將細胞用DMEM洗2次，替代10％FBS用添加了0.3％FBS的培養基B培養24小時後，與向同一培養基按照最終濃度為0、1、10、25、50或100ng/ml添加了BDNF製備的培養基交換，再培養24小時。培養結束的前2小時(即BDNF添加22小時後)，以10ng/ml的濃度向各個孔添加溴脫氧尿苷(BrdU)，整合到細胞。培養在37℃、5％CO2氣相條件下進行。
將上述(1)(ii)中得到的HGK用與上述(3)(ii)同一方法進行培養，用BDNF處理。培養結束的前2小時(即BDNF添加22小時後)，以10ng/ml的濃度向各個孔添加溴脫氧尿苷(BrdU)，整合到細胞。
培養結束後，將HPL細胞和HGK固定後，進行封閉，使過氧化物酶標記抗BrdU抗體於室溫下作用2小時，加TMB(3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺)底物，用吸光度計(MICRO PLATE READER、TOSOH)測定波長450nm的吸光度。作為對照，對使鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)在最終濃度0、0.3、1、3、5、10ng/ml下作用2 4小時的細胞進行同樣處理，測定DNA合成能力。
結果如圖6所示。(A)表示對HPL細胞的效果的圖，(B)表示對HGK的效果的圖。在各個圖中*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(統計學的鑑定通過t-test)。
就像圖6所表明的那樣，BDNF促進HPL細胞的DNA合成能力，而對HGK的DNA合成能力沒有影響。
(6)HPL細胞的膠原合成將上述(1)(i)中得到的HPL細胞接種到用牛I型膠原被覆的48孔板，使用培養基B培養13天。培養基每2天換一次。在第14日的培養結束的前0、3、6、12或24小時，將板中細胞用DMEM洗2次，換成含有最終濃度0、1、10、25、50或100ng/ml的BDNF的無血清培養基D。
使用I型原膠原C-肽(Procollagen type IC-peptide)(PIP)EIA試劑盒(TAKARA)，通過ELISA法測定HPL細胞的膠原合成量。使用對I型膠原C末端前肽(PIP)特異的單克隆抗體(過氧化物酶標記)通過吸光度計(MICRO PLATE READER)測定波長450nm的吸光度來測定HPL細胞培養上清中的膠原合成量。
結果如圖7所示。(A)表示BDNF對I型膠原合成的濃度效果測定的結果，(B)表示經時效果測定的結果。就像圖7表明的那樣，BDNF可使HPL細胞的I型膠原合成量增加。
(實施例2)BDNF在Beagle犬的3級牙根分叉部病變模型中的效果的研究。
使濃度5、25、50μg/ml的BDNF溶液(滅菌生理鹽水液中)的25μl浸透直徑8mm×5mm的TERUPLUGR(商品名)(TERUMO)，作為移植材料。
將7隻雌beagle犬(12～20個月齡、體重10～14kg)通過DOMITOR(明治制果)肌肉注射鎮靜下來，用手動刮牙器(scaler)進行全顎刮牙。以後按照每2天一次的比例進行刷牙和用以聚維酮碘為有效成分的漱口藥ISOJIN(商品名)(明治制果)進行口腔清掃一個月，確立臨床上健康牙周組織的狀態。
對這些Beagle犬通過戊巴比妥系麻醉劑的靜脈內注射實施金身麻醉，對左右兩側下顎頰側牙肉進行浸潤麻醉，由第一小臼齒遠心(distal part)至第一大臼齒近心(mesial part)的牙肉切開一個溝，剝離牙肉，形成黏膜骨膜瓣。然後，用圓頭銼(bur)和骨鑿消除左右兩側第二、第三、第四小臼齒的牙根分叉部牙槽骨，做成牙根分叉部3級(按照Lindhe Nyman的分類)的骨缺損。骨缺損的大小從未處置的牙根分叉部正下方至約4mm靠近牙根尖側。
將露出的牙根面的殘存牙骨質用手動刮牙器除去後，將牙根分叉部骨缺損內用生理鹽水充分清洗，衝去碎片，每一處填塞直徑8mm×5mm的TERUPLUGR移植材料。作為對照填塞滲透了不含BDNF，而只含滅菌生理鹽水25μl的8mm×5mm的TERUPLUGR移植材料。
手術6周後，在通過戊巴比妥系麻醉劑的靜脈內注射實施全身麻醉下，用4％多聚甲醛對全身進行灌流固定。灌流固定後，切斷下顎，將處理的牙和牙周組織一塊摘出。將得到的標本於4％聚多甲醛中浸漬固定1天後，用10％EDTA除去石灰質，根據通用做法進行乙醇脫水，包埋在石蠟中。從該標本製作在近遠心方向(mesial-distal plane)與牙軸平行的切片(厚度約5μm)實施蘇木精曙紅染色。
在做成的組織標本中，選擇與近遠心方向牙軸平行，而且在牙根中央附近被切得很薄的標本，用光學顯微鏡(ECLIPSE E600、NIKON)進行組織觀察和計測。骨再生率以再生牙槽骨的面積與裸露的牙根分叉部缺損的面積的比例(百分率)表示。牙骨質再生率以再生牙骨質的長度與裸露的牙根面的長度的比例(百分率)表示。
結果如圖8、9A、9B、10所示。圖8的(A)表示BDNF對牙骨質再生的效果的測定結果，圖8的(B)表示BDNF對牙槽骨再生的效果的測定結果。圖9A是沒有給予BDNF(對照)的牙根分叉部骨缺損部的蘇木精曙紅染色標本，圖9B是給予BDNF(填塞含有BDNF(5μg/ml)的移植材料)的牙根分叉部骨缺損部的光學顯微鏡像(倍率20倍)。圖10是圖9B的牙根分叉部正下方的部分放大像(倍率200倍)。
就像圖8表明的那樣，通過給予BDNF，在狗的3級牙根分叉部病變模型中證實牙骨質的再生和牙槽骨的再生。
在圖9A的對照標本中，雖然牙骨質、牙槽骨、牙周韌帶的再生可觀察到少許，但停留在從骨缺損底部到牙冠側方向大約1/2處。在牙根分叉部正下方的缺損部沒有看到牙骨質再生、牙槽骨再生，但看到上皮的進入，被以成纖維細胞、膠原纖維、血管為主體的結締組織佔據。
在圖9B和圖10的給予BDNF的牙根分叉部骨缺損部的標本中，在裸露的牙根面的幾乎所有部分牙骨質再生，沒有看到上皮的侵入。另外，在再生牙骨質和再生牙槽骨之間還觀察到維持一定寬度的牙周韌帶。
(實施例3)NGF對HPL細胞和HGK的影響的研究。
(1)NGF和它的受體在HPL細胞中的表達用與上述實施例1(2)同一的方法從HPL細胞回收、純化總RNA。將得到的的總RNA作為樣品，通過Northern blot法測定NGF和TrkA的mRNA表達。作為對照使用GAPDH。
結果如圖11A、11B所示。圖11A表示NGF的mRNA的表達，圖11B表示TrkA的mRNA表達。就像圖所表明的那樣，確認NGF的mRNA和TrkA的mRNA在HPL細胞中都表達。
(2)骨相關蛋白在HPL細胞中的表達NGF對HPL細胞中的骨相關蛋白的mRNA表達的影響的測定。
除了使用最終濃度0、5、10、25、50或100ng/ml的NGF(Recombinant Human NGF、RD system、Minneapolis、USA)取代BDNF以外，用與實施例1(4)(i)同一的方法對HPL細胞進行處理。用與實施例1(4)(i)同一的方法對NGF處理的HPL細胞的ALPase、BMP-2、OPN的各個mRNA表達量進行測定。
圖12、13、14分別給出了NGF對於OPN、ALPase、BMP-2的各個mRNA表達的經時效果測定和濃度效果測定的結果。在各個圖中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。檢驗通過t-test。
就像圖12、13、14所表明的那樣，NGF依賴於濃度和時間使ALPase、BMP-2、OPN的mRNA表達量增加。
(3)HPL細胞和HGK的增殖NGF對HPL細胞和HGK的DNA合成能力影響的測定。
除了使用最終濃度0、5、10、25、50或100ng/ml的NGF取代BDNF以外，用與實施例1(5)同一的方法對HPL細胞和HGK的DNA合成能力進行處理。用與實施例1(5)同一的方法對NGF處理的HPL細胞和HGK進行測定。
圖15給出了測定結果。NGF作用時間都是24小時。(A)表示對HPL細胞的效果，(B)表示對HGK的效果。在各個圖中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。鑑定通過t-test。
就像圖15所表明的那樣，NGF促進HPL細胞的DNA合成能力，而使HGK的DNA合成能力降低。
(實施例4)NT-3對HPL細胞和HGK影響的研究。
(1)NT-3和它的受體在HPL細胞中的表達用與上述實施例1(2)同一的方法從HPL細胞回收、純化總RNA。將得到的的總RNA作為樣品，通過Northern blot法測定NT-3和TrkC的mRNA表達。作為對照使用GAPDH。
結果如圖16A、16B所示。圖16A表示NT-3的mRNA的表達，圖16B表示TrkC的mRNA表達。就像這些圖所表明的那樣，確認NT-3的mRNA和TrkC的mRNA在HPL細胞中都表達。
(2)骨相關蛋白在HPL細胞中的表達
NT-3對HPL細胞的ALPase活性影響的測定。
除了使用最終濃度0、1、10或50ng/ml的NT-3(RecombinantHuman NT-3、RD system、Minneapolis、USA)取代BDNF以外，用與實施例1(3)(i)同一的方法對HPL細胞進行處理，該ALPase活性按照Bessey-Lowry法進行定量。即用磷酸緩衝液將NT-3處理的HPL細胞洗3次，加10mM Tris鹽酸緩衝液後，在冰冷下進行超聲波處理，製備樣品。使用對硝基苯磷酸作為底物的ALPase測定試劑盒(和光純藥)，測定樣品中的ALPase活性。
圖17給出了對於ALPase活性的NT-3濃度效果測定的結果。NT-3作用時間都是24小時。就像圖表明的那樣，幾乎沒有看到NT-3對ALPase活性有什麼影響。
(3)HPL細胞的增殖除了使用最終濃度0、1、5、10、50或100ng/ml的NT-3取代BDNF以外，用與實施例1(5)同一的方法對用實施例1(1)同一方法分離的HPL細胞進行處理。用與實施例1(5)同一的方法對它的DNA合成能力進行測定。
圖18給出了測定結果。NT-3作用時間都是24小時。在各個圖中，*表示p＜0.0 5，**表示p＜0.01。鑑定通過t-test。就像圖表明的那樣，NT-3促進HPL細胞的DNA合成能力。
(實施例5)對在來自人牙周韌帶成纖維細胞(human periodontal ligamentcell、HPL細胞)中NT-4/5導致骨相關蛋白的mRNA表達進行研究。
(1)用NT-4/5處理HPL細胞將上述實施例1(1)(i)中得到的HPL細胞按照每皿3.5×105個接種到用牛I型膠原被覆的直徑60mm的培養皿(SUMILON CELTITEC-1)，使用50μg/ml的培養基B在37℃、5％CO2氣相條件下培養13天。培養基每2天交換一次。在第14天培養結束前0、3、6、12或24小時，將細胞用DMEM洗2次，換成含有最終濃度50ng/ml的NT-4/5(RD)的培養基D。
(2)mRNA在HPL細胞中的表達與上述(3)(i)所述方法同樣操作，使用ISOGEN從用最終濃度50ng/ml的NT-4/5處理的HPL細胞提取、純化總RNA。ALPase、BMP-2、OPN、骨鈣蛋白(OCN)、BMP-7、BMP-4、OPG的mRNA表達量使用ABI PRISM7700(Applied Biosystems、東京)，通過實時監測PCR產物生成過程進行定量解析(Real-time PCR法)。作為對照使用GAPDH。
對於各個骨相關蛋白的mRNA表達的NT-4/5的經時效果測定的結果如圖19A、19B、19C所示。在各個圖中*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(統計學的鑑定通過t-test)。就像圖所表明的那樣，在HPL細胞中NT-4/5促進OPN、BMP-2、ALPase、OCN、BMP-7的mRNA表達。然而，對BMP-4、OPG的表達沒有影響。
(實施例6)NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5對人牙髓細胞(human pulp cell，HP細胞)的影響的研究。
(1)使用細胞將在方便除去牙髓時得到的健全牙髓切碎。將切碎的組織貼附在直徑60mm的細胞培養用皿(CORNI NG、NY)，於37℃、5％CO2氣相條件下用培養基A進行培養。將進行了4～8代繼代的HP細胞供以下實驗用。
(2)細胞用NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5處理將NGF、BDNF、NT-3或NT-4/5按照最終濃度0、5、10、25、50或100ng/ml加到培養基D中，製備含有各種濃度的神經營養因子的培養基。將上述(2)得到的HP細胞在用牛I型膠原被覆的直徑60mm培養皿(SUMILON CELTITE C-1)，每一個皿3.5×105個，使用培養基B，於37℃、5％CO2氣相條件下培養13天。培養基每2天交換一次。在第14天培養結束前24小時，用DMEM將細胞洗2次，換成含有任一個神經營養因子的培養基。
(3)mRNA在HP細胞中的表達使用ISOGEN從在上述(1)用各種濃度NGF、BDNF、NT-3或NT-4/5處理24小時的HP細胞提取、純化總RNA。ALPase、BMP-2、牙質唾液酸磷酸蛋白(DSPP)、I型膠原(collagen)、OPN、OCN的mRNA表達量使用ABI PRISM7700(Applied Biosystems、東京)，通過實時監測PCR產物生成過程進行定量解析(Real-time PCR法)。作為對照使用GAPDH。
對於NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5對於各個骨相關蛋白的mRNA表達的濃度效果測定的結果分別如圖20、21、22、23所示。就像圖所表明的那樣，NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5在HP細胞中促進ALPase、BMP-2、DSPP、OPN、OCN的mRNA表達。BDNF和NT-4/5也促進I型膠原mRNA的表達。
(4)HP細胞的增殖NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5對於對HP細胞的DNA合成能力的影響使用Cell Proliferation ELISA system，version 2(AmershamPharmacia Biotech)通過ELISA法進行測定。
取代10％的FBS，向添加了0.3％FBS的培養基B按照最終濃度為0、5、10、25、50或100ng/ml分別添加NGF、BDNF、NT-3或NT-4/5，製備含有各種神經營養因子的培養基。
將上述(1)中得到的HP細胞按照5×103個/孔接種到用牛I型膠原被覆的96孔板(SUMILON CELTITE C-1板96F)，使用培養基B培養10天。將細胞用DMEM洗2次，取代10％的FBS，用添加了0.3％FBS的培養基B培養24小時後，換成上述的含有各種神經營養因子的培養基，再培養24小時。培養結束的前2小時(即神經營養因子添加22小時後)，以10ng/ml的濃度向各個孔添加溴脫氧尿苷(BrdU)，整合到細胞。培養在37℃、5％CO2氣相條件下進行。
培養結束後，對HP細胞進行固定後，進行封閉，使過氧化物酶標記抗BrdU抗體於室溫下作用2小時，加TMB(3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺)底物，用吸光度計(MICRO PLATE READER、TOSOH)測定波長450nm的吸光度。
結果如圖24所示。就像圖表明的那樣，NGF、BDNF、NT-3或NT-4/5促進HP細胞的DNA合成能力。
(實施例7)NGF、BDNF、NT-3、抗壞血酸對人間葉系幹細胞(humanmesenchymal stem cell、HMS細胞)影響的研究。
(1)使用細胞HMS細胞的分離按照堤等人(S.TsutsumiBBRC，26，288(2)，2001)方法進行。即，在取得完全告知同意的患者的智齒拔去時，向下顎骨髓腔進行穿刺，得到骨髓液。將得到的骨髓液與含有肝磷脂鈉(heparinsodium)(200U/ml，Sigma，美國)的Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM、Sigma、美國)迅速混合，進行離心分離(150g，5分鐘)。離心分離後除去上清，將得到的細胞成分懸浮於含有10％的胎牛血清(FCS，Biological Industries，Israel)、100單位/ml的盤尼西林(明治制果、東京)、100μg/ml的鏈黴素(明治制果、東京)、1μg/ml的兩性黴素B(GIBCO，美國)的DMEM，按照骨髓液為200～500μl/dish、培養基為10ml/dish那樣接種於直徑100mm的細胞培養用培養皿(Corning、美國)。培養在37℃、5％CO2氣相條件下進行。以後每隔4天進行培養基交換。在增殖的細胞剛達到鋪滿時，用含有0.05％胰蛋白酶(GIBCO，美國)、0.02％EDTA(片山化學，大阪)、100單位/ml的盤尼西林、100μg/ml的鏈黴素的磷酸緩衝生理鹽水(PBS，日水製藥，東京)使細胞分散。分散的細胞按照最終細胞密度為1.0×106細胞/ml那樣懸浮於含有20％的FCS、10％二甲基亞碸(DMSO，片山化學，大阪)、100單位/ml的盤尼西林、100μg/ml的鏈黴素的DMEM中，按照每管1ml分裝於血清管(住友BAKELITE，東京)後，於-20℃下冷凍2小時，-80℃下冷凍過夜後，保存在液氮中。
(2)骨相關蛋白的mRNA在HMS細胞中的表達(i)將細胞用NGF、BDNF、NT-3處理將上述(1)得到的HMS細胞懸浮於含有10％的FCS的DMEM(含有100單位/ml的盤尼西林(明治制果，東京)、100μg/ml的鏈黴素(明治制果，東京)、的1μg/ml的兩性黴素B(GIBCO，美國))中，按照1.0×105細胞/孔的密度接種在6孔細胞培養板上。將細胞培養一周，在細胞要達到鋪滿前的時點，換成不含有FCS的DMEM(含有100單位/ml的盤尼西林(明治制果，東京)、100μg/ml的鏈黴素(明治制果，東京)、1μg/ml的兩性黴素B(GIBCO，美國))，使NGF、BDNF、NT-3中的任一個都以100ng/ml濃度作用12小時和24小時。培養結束後使用ISOGEN(商品名)進行總RNA的提取。
(ii)mRNA的表達使用對ALPase、OCN、OPN、骨唾液酸蛋白(BSP)、I型膠原特異的引物進行PCR。PCR反應在進行94℃、2分鐘變性後，按照每一循環為94℃15秒、退火30秒、72℃50秒反覆進行30循環(只有BSP進行35循環)，最後72℃進行7分鐘的延伸。得到的PCR產物使用含有0.002％溴化-3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶的2％瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳後的帶濃度用NIHimage進行測定。
結果如圖25A～E、26A～E27以及27A～E所示。就像圖表明的那樣，沒有看到NGF對HMS細胞的ALPase、OCN、OPN、BSP、I型膠原的任一個mRNA表達有顯著作用。BDNF明顯促進ALPase、OPN、BSP、BMP-2的mRNA表達，也對OCN的基因表達有些促進。NT-3促進ALPase和I型膠原的mRNA表達。
(3)抗壞血酸、NGF、BDNF、NT-3對HMS細胞增殖的影響將上述(1)得到的HMS細胞懸浮於含有10％FCS的DMEM(日水製藥制)(含有100單位/ml的盤尼西林(明治制果、東京)、100μg/ml的鏈黴素(明治制果、東京)、1μg/ml的兩性黴素B(GIBCO，美國))，按照5.0×103細胞/孔的密度接種在96孔細胞培養板(Corning、美國)。試驗組在培養開始24小時後分別單獨向培養基中加50μg/ml的抗壞血酸(Sigma、美國)、100ng/ml的NGF(FUNAKOSHI，東京)、100ng/ml的BDNF(FUNAKOSHI，東京)、或100ng/ml的NT-3(FUNAKOSHI，東京)，再培養7天。培養基交換在第4天進行。對照組為用含有10％FCS的DMEM(日水製藥制)(含有100單位/ml的盤尼西林(明治制果、東京)、100μg/ml的鏈黴素(明治制果、東京)、1μg/ml的兩性黴素B(GIBCO，美國))培養的細胞。培養7天後，培養基全部換成含有10％FCS的DMEM(含有100單位/ml的盤尼西林(明治制果、東京)、100μg/ml的鏈黴素(明治制果、東京)、1μg/ml的兩性黴素B(GIBCO，美國))，使用CellTiter96(商品名)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit(Promega、美國)，通過測定490nm的吸光度計測活細胞數。
結果如圖28所示。圖的縱軸表示試驗組相對於對照組的吸光度的百分率。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(統計學的鑑定通過t-test)。就像圖所表明的那樣，添加了抗壞血酸、NGF、BDNF、NT-3中任一個的培養基培養的HMS細胞與對照相比表現出有意義的很高的細胞增殖。特別是抗壞血酸、BDNF、NT-3的增殖促進作用比NGF強。
(實施例8)在Beagle犬的3級牙根分叉部病變模型中NGF和NT-3的效果的研究。
除了取代濃度5、25、50μg/ml的BDNF溶液(滅菌生理鹽水液中)的25μl，使濃度100μg/ml的NGF溶液(滅菌生理鹽水液中)的25μl浸透直徑8mm×5mm的TERUPLUG R後的材料和使濃度100μg/ml的NT-3溶液(滅菌生理鹽水液中)的25μl浸透的材料作為移植材料以外，其它與實施例2同樣進行實驗。從做成的組織標本(蘇木精曙紅染色)選擇與近遠心方向牙軸平行，而且在牙根中央附近被切得很薄的標本，用光學顯微鏡(ECLIPSE E600、NIKON)進行觀察。
圖29A是填塞含有NGF的移植材料的牙根分叉部骨缺損部的光學顯微鏡像，圖29B是填塞含有NT-3的移植材料的牙根分叉部骨缺損部的光學顯微鏡像(倍率20倍)。就像圖表明的那樣，通過給予NGF或NT-3，在狗的3級牙根分叉部病變模型中觀察到再生骨。
產業上利用的可能性本發明的牙周病治療劑、修復象牙質形成促進劑、治療方法、牙周組織再生用移植材料、牙周組織的再生方法在牙周病治療和牙內療法中都具有能成為有效治療的可能性。
權利要求
1.一種以神經營養因子作為有效成分的牙周病治療劑。
2.權利要求1所述的治療劑，其特徵是使牙周組織再生。
3.權利要求1或2所述的治療劑，其特徵是使牙骨質再生。
4.權利要求1～3任一項所述的治療劑，其特徵是使牙周韌帶再生。
5.權利要求1～4任一項所述的治療劑，其特徵是使牙槽骨再生。
6.權利要求1～5任一項所述的治療劑，其特徵是防止牙肉上皮沿著牙根面根尖方向侵入。
7.權利要求1～6任一項所述的治療劑，其特徵是使牙髓再生。
8.權利要求1～7任一項所述的治療劑，其特徵是促進牙髓腔中修復象牙質的產生。
9.權利要求1～8任一項所述的治療劑，其中神經營養因子是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。
10.一種含有神經營養因子的牙周組織再生用移植材料。
11.權利要求10所述的牙周組織再生用移植材料，是為了使牙骨質再生使用的材料。
12.權利要求10或11所述的牙周組織再生用移植材料，是為了使牙周韌帶再生使用的材料。
13.權利要求10～12任一項所述的牙周組織再生用移植材料，是為了使牙槽骨再生使用的材料。
14.權利要求10～13任一項所述的牙周組織再生用移植材料，是為了防止牙肉上皮沿著牙根面根尖方向侵入使用的材料。
15.權利要求10～14任一項所述的牙周組織再生用移植材料，是為了使牙髓再生使用的材料
16.權利要求10～15任一項所述的牙周組織再生用移植材料，是為了促進牙髓腔中修復象牙質的產生使用的材料。
17.權利要求10～16任一項所述的治療劑，其中神經營養因子是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。
18.一種使用神經營養因子的牙周組織的再生方法。
19.權利要求18所述的再生方法，其特徵是使牙骨質再生。
20.權利要求18所述的再生方法，其特徵是使牙周韌帶再生。
21.權利要求18所述的再生方法，其特徵是使牙槽骨再生。
22.權利要求18所述的再生方法，其特徵是防止牙肉上皮向牙根面根尖方向進入。
23.權利要求18所述的再生方法，其特徵是使牙髓再生。
24.權利要求18所述的再生方法，其特徵是促進牙髓腔中修復象牙質的產生。
25.權利要求18～24任一項所述的再生方法，其中神經營養因子是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。
26.一種以神經營養因子為有效成分的修復象牙質的形成促進劑。
27.權利要求26所述的修復象牙質的形成促進劑，其中神經營養因子是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。
28.一種牙髓疾病的治療法，包括為了促進修復象牙質的形成向患有或容易患有這樣疾病的對象給予治療有效量的神經營養因子。
29.權利要求28所述的方法，其中神經營養因子是來自腦的神經營養因子、神經生長因子、神經營養素3或神經營養素4/5。
全文摘要
本發明的目的在於提供牙周病和牙髓疾病的治療劑和治療方法、牙周組織再生用移植材料、牙周組織的再生方法。通過本發明可以提供以神經營養因子作為有效成分的牙周病和牙髓疾病的治療劑。
文檔編號A61L27/00GK1871024SQ20048003119
公開日2006年11月29日 申請日期2004年9月8日 優先權日2003年9月9日
發明者慄原英見, 河口浩之, 武田克浩, 柴秀樹, 水野智仁, 吉野宏, 長谷川直彥, 筱原弘明 申請人:智再如股份有限公司, 慄原英見