一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測試劑盒及檢測方法
2023-12-08 21:03:06 1
一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測試劑盒，該試劑盒由膠體金檢測卡(含酶標孔)和前處理試劑組裝而成，所述的檢測卡在現有的免疫競爭法膠體金卡基礎上進行改進，將硝基呋喃類藥物單克隆抗體膠體金標記物直接凍幹在酶標孔中，提高了靈敏度、穩定性和適用範圍；該試劑盒可用於硝基呋喃類藥物例如呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物或呋喃西林代謝物的快速檢測，適用於魚、蝦等水產品，雞肉、豬肉等畜禽產品。本發明簡化了樣本前處理方法，省去了傳統方法中萃取和復溶的步驟，大大縮短了檢測時間，並可根據不同需求同時檢測一種或多種藥物。
【專利說明】一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程【技術領域】，具體涉及一種藥物代謝物的檢測試劑盒及檢測方法，尤其涉及一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]硝基呋喃類藥物是一種常見的合成抗生素，因其極好的抗菌性和藥物動力學特性，常被用於動物飼養、流通等環節。這類物質也常被當作催長劑或肥育劑用於豬、家禽和魚類的飼養中。長期的動物實驗顯示，硝基呋喃類藥物及其代謝產物均具有致癌性和致誘變性。因此，硝基呋喃類物質被禁止在食用性飼養動物上使用。自1993年起，歐盟範圍內便禁止在動物飼養中使用硝基呋喃類藥物鹽酸呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林，而呋喃唑酮也從1995年起被禁用。
[0003]對硝基呋喃類藥物的檢測須建立在對其系列代謝產物的檢測的基礎之上。在施用了硝基呋喃類藥物短時間後便很難檢測到其原藥的存在，因為它很快地被代謝掉了。而其系列代謝產物則在用藥後的很長時間都能被發現和被檢測到。所以，這些代謝物被作為濫用硝基呋喃類藥物的檢測目標物。在攝入了呋喃唑酮(代謝物為AOZ:3_氨基-2-唑烷基酮)，鹽酸呋喃它酮(代謝物為AMOZ:5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮)，呋喃妥因(代謝物為AHD:1_氨基-2-內醯脲)和呋喃西林(代謝物為SEM:氨基脲)後均可檢出其硝基呋喃類系列代謝物。
[0004]目前硝基呋喃類藥物代謝物的測定方法主要有液相色譜/紫外(LC/UV)分析和液相色譜/質譜聯用分析法、液相色譜串聯質譜法，但這些方法所需儀器價格昂貴，實驗過程繁瑣，不適用於現場快速檢測。目前，在藥物殘留快速檢測中得到廣泛應用的有微生物法和酶聯免疫法，但是，微生物方法在靈敏度上常常達不到要求，酶聯免疫法對於操作人員技術要求較高。
[0005]因此，尋找一種具有靈敏度高、穩定性好和適用範圍廣的檢測方法是目前硝基呋喃類藥物代謝物檢測中亟待解決的問題。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於提供一種藥物代謝物的檢測試劑盒及檢測方法，特別是一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測試劑盒及檢測方法。
[0007]為達到此發明目的，本發明採用以下技術方案:
[0008]第一方面，本發明提供了一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測試劑盒，包括檢測卡和試劑，所述檢測卡的酶標孔中含有凍幹的硝基呋喃類藥物代謝物的單克隆抗體膠體金標記物。
[0009]本發明是在現有的免疫競爭法膠體金卡基礎上進行的改進，將硝基呋喃類藥物單克隆抗體膠體金標記物直接凍幹在酶標孔中，提高了靈敏度、穩定性和適用範圍。
[0010]本發明中，所述的硝基呋喃類藥物代謝物為呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃它酮代謝物(AMOZ)、呋喃妥因代謝物(AHD)或呋喃西林代謝物(SEM)中的任意一種或至少兩種的混合物。
[0011]本發明中，所述試劑包括IM鹽酸、衍生化試劑、提取劑和IM氫氧化鈉。
[0012]本發明中，所述檢測卡為膠體金試紙條。
[0013]第二方面，本發明還提供了一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法，包括以下步驟:
[0014](I)前處理待測樣品；
[0015](2)用本發明第一方面所述的試劑盒檢測樣品；
[0016](3)分析檢測結果。
[0017]本發明的檢測方法簡化了樣本前處理方法，省去了傳統方法中的萃取和復溶步驟，大大縮短了檢測時間，並可根據不同需求同時檢測一種或多種藥物。該方法靈活性高、操作簡單、檢測速度快、特異性高、準確性好、能夠進行現場大量篩查。
[0018]作為優選的具體實施方案，本發明中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法具體包括以下步驟:
[0019](I)取一定的動物組織去除脂肪後，用剪刀剪碎或者用絞肉機攪碎；
[0020](2)取l_3g待測樣品於50mL離心管中，依次加入3_5mL去離子水，0.3-0.6mL IM鹽酸，0.1-0.3mL衍生化試劑，震蕩混勻3-5min，55-60°C水浴條件下孵育30min ；
[0021](3)取出後，依次加入3-6mL提取劑，0.3-0.5mL IM氫氧化鈉，震蕩混勻l_3min ；4000轉離心2-10min，取上層清液待測；
[0022](4)吸取50_150μ L待測液於酶標孔中，反覆吹打至孔內紅色物質完全溶解，等待反應2-6min,吸取孔內所有溶液滴加到檢測卡的加樣孔中，加樣後開始計時,反應5_8min
判讀結果。
[0023]作為進一步優選的具體實施方案，本發明中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法具體包括以下步驟:
[0024](I)取一定的組織(魚、蝦、蟹、雞肉、豬肉等)去除脂肪後，用剪刀剪碎或者用絞肉機攪碎，若不及時檢測，分裝保存於_20°C ；
[0025](2)取2g待測樣品於50mL離心管中，依次加入4mL去離子水，0.4mL IM鹽酸，0.2mL衍生化試劑，震蕩混勻3min，60°C水浴條件下孵育30min ；
[0026](3)取出後，依次加入5mL提取劑，0.4mL IM氫氧化鈉，震蕩混勻Imin ；4000轉離心5min，取上層清液待測；
[0027](4)吸取100 μ L待測液於酶標孔中，反覆吹打至孔內紅色物質完全溶解，等待反應5min,吸取孔內所有溶液滴加到檢測卡的加樣孔中,加樣後開始計時,反應5_8min判讀結果，其他時間判讀無效。
[0028]本發明的檢測方法中，所述的硝基呋喃類藥物代謝物為呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物或呋喃西林代謝物中的任意一種或至少兩種的混合物。
[0029]本發明的試劑盒及檢測方法可廣泛適用於魚、蝦等水產品和雞肉、豬肉等畜禽產品O
[0030]與現有技術相比，本發明至少具有以下有益效果:
[0031](I)本發明的試劑盒靈敏度高，穩定性強和適用範圍廣，該試劑盒可用於硝基呋喃類藥物例如呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物或呋喃西林代謝物的快速檢測，適用於魚、蝦等水產品，雞肉、豬肉等畜禽產品；利用該試劑盒進行檢測時，對於所有樣品，靈敏度均可達Ippb ；
[0032](2)本發明的試劑盒操作簡單，讀取結果時間短，該試劑盒無需另配其它試劑，樣品無需無菌處理，按試劑盒說明在5-8min內即可判定檢測結果；
[0033](3)本發明簡化了樣本前處理方法，省去了傳統方法中萃取和復溶的步驟，大大縮短了檢測時間，並可根據不同需求同時檢測一種或多種藥物；
[0034](4)本發明的試劑盒可批量檢測，一步到位，成本低廉，投資少，見效快。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0035]圖1為本發明實施例1檢測樣品的結果判定示意組合圖；
[0036]其中，圖1a表示檢測結果為陰性，圖1b表示檢測結果為陽性，圖1c表示檢測結果失效。
【具體實施方式】
[0037]下面通過【具體實施方式】來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。
[0038]實施例1:檢測卡的製備
[0039]1.抗原製備
[0040]稱取40mg呋喃唑酮代謝物(AOZ)溶於16mL無水乙醇，18mg HS酶溶於2mL甲苯，常溫下磁力攪拌2h，SOOOrpm,離心15min，棄除上清，殘留物用無水乙醇洗三次，烘乾，得呋喃唑酮代謝物衍生物；用2mL水將衍生物溶解，加入活化劑1EDC.HAOZ 114mg，活化劑2NHS34mg，室溫活化2h，即得呋喃唑酮代謝物活潑酯。按照η (呋喃唑酮代謝物活潑酯產物):m(牛血清白蛋白)=60: 1，合成檢測抗原呋喃唑酮代謝物-牛血清白蛋白，用0.0IM PBS緩衝液透析3天，採用BCA法測定蛋白濃度，採用紫外分光光度計法測定偶聯比率；製備好的檢測抗原，冷凍乾燥後，於_20°C保存。
[0041]2.抗原噴膜
[0042]用純水把偶聯抗原稀釋至lmg/mL, 二抗稀釋至lmg/mL, 2h內用完。噴膜選用參數為0.74μ L/cm，氣壓為8psi，噴完後於37°C烘箱中乾燥過夜，用塑料薄膜包好，放入乾燥器中待用。
[0043]3.單克隆抗體的製備
[0044]從液氮罐中取出呋喃唑酮代謝物1G10-H5-C7細胞株進行復甦，將呋喃唑酮代謝物1G10-H5-C7細胞培養至對數生長期，離心收集後用RPMI 1640將其重懸，腹腔注射入BALB/C小鼠體內(該小鼠已於一周前腹腔注射液體石蠟，0.5mL/只)，劑量為100萬細胞/0.5mL/只小鼠，各5隻。7-10天後小鼠腹腔脹大，收集其腹水。37°C，靜置30min。4°C，5000r/min離心15min，取中央透明層進行腹水純化。純化後腹水濃度測定:用紫外分光光度計測定蛋白質的含量。將得到的抗體加入等體積甘油後，分別貼上標籤，_20°C保存備用。
[0045]4.膠體金的製備
[0046]取1980mL超純水，置於乾淨的5L玻璃反應器中，加入20mL I % HAuCL4溶液(終濃度0.0l % )。混勻，搭好回流裝置。100°c水浴加熱至HAuCL4溶液沸騰(轉速160RPM，約60min)，調整轉速至270rpm後，加入17.6mL 1%檸檬酸三鈉溶液。當溶液的顏色完全變為透明的紅色時(約2min)，調整轉速至160rpm，溫度調節至80°C，繼續回流約30min後停止加熱。放入冰箱，冷藏保存，二周內用完。採用紫外可見光分光光度計和電鏡檢測膠體金粒徑大小，以監控膠體金的質量。
[0047]5.金標抗體的製備
[0048]調節膠體金溶液pH值至8.2，用恆速攪拌器均勻攪拌，同時按正交分析結果逐滴加入相應的單克隆抗體量，並加入其它保護劑，全部加完後，繼續攪拌15分鐘。加入10%BSA進行封閉，1000r/min離心半小時除去雜質,6000r/min離心半小時獲得均一'I"生金標抗體沉澱。再加入重懸液重懸,混勻後移至乾淨燒杯中備用。在50 μ L的金標抗體中加入PNPB溶液200 μ L，以超純水為空白對照，掃描400-700nm之間的吸收值並精確測定OD值。
[0049]6.噴金操作
[0050]室內相對溼度為低於40%，氣壓為8psi，將金標抗體加入酶標孔中，37°C烘箱中乾燥1.5個小時，用塑料薄膜包好，放入乾燥器中待用。
[0051]7.訂購NC膜、樣品墊、吸水紙等材料及相關試劑，並進行切割和乾燥。
[0052]8.檢測卡的組裝小試
[0053]按膠體金免疫層析快速檢測卡結構圖組裝為卡,進行小試試驗。小試試驗的卡主要檢測陰性顯色強度，I μ g/L AOZ是否完全抑制。如有問題，需進一步調試至獲得滿意小試(主要調金標抗體量)結果後，再規模生產。
[0054]9.放大生產
[0055]按照既定條件生產，在相對溼度25% -35%，溫度20_25°C的條件下，進行裝卡封袋工序，並按一定的比例進行抽檢。
[0056]10.包裝
[0057]試劑盒組分:檢測卡(含酶標孔)、1M鹽酸、衍生化試劑、提取劑、IM氫氧化鈉、一次性吸管。
[0058]實施例2:試劑盒的應用
[0059]本發明的試劑盒可用於魚、蝦等水產品、雞肉、豬肉等畜禽產品中四種藥物的檢測。以魚肉中呋喃唑酮代謝物的檢測為例，具體操作如下:
[0060]取草魚背部樣本於絞肉機中絞碎，取2g樣品於50mL離心管中，依次加入4mL去離子水，0.4mL IM鹽酸，0.2mL衍生化試劑，振蕩混勻3min，60°C下水浴孵育半小時；取出後，依次加入5mL提取劑,0.4mL IM氫氧化鈉，I瓶萃取劑,振蕩混勻Imin, 4000轉離心5min,取上層清液待測，吸取100 μ L待測液於酶標孔中，反覆吹打至孔內紅色物質完全溶解，等待反應5min，吸取孔內所有溶液滴加到呋喃唑酮代謝物檢測卡的加樣孔中，加樣後開始計時，反應5min後判讀結果，結果檢測線(T線)比質控線(C線)深，為陰性結果。
[0061]通過上述實施例可以看出，本發明的試劑盒操作簡單，讀取結果時間短，該試劑盒無需另配其它試劑，樣品無需無菌處理，按試劑盒說明在5-8min內即可判定檢測結果?』另夕卜，本發明簡化了樣本前處理方法，省去了傳統方法中萃取和復溶的步驟，大大縮短了檢測時間，並可根據不同需求同時檢測一種或多種藥物，具有重要的應用價值。
[0062] 申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的工藝方法，但本發明並不局限於上述工藝步驟，即不意味著本發明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬【技術領域】的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。
【權利要求】
1.一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測試劑盒，包括檢測卡和試劑，其特徵在於，所述檢測卡的酶標孔中含有凍幹的硝基呋喃類藥物代謝物的單克隆抗體膠體金標記物。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的硝基呋喃類藥物代謝物為呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物或呋喃西林代謝物中的任意一種或至少兩種的混合物。
3.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑包括IM鹽酸、衍生化試劑、提取劑和IM氫氧化鈉。
4.如權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述檢測卡為膠體金試紙條。
5.一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)前處理待測樣品； (2)用權利要求1-4任一項所述的試劑盒檢測樣品； (3)分析檢測結果。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，具體包括以下步驟: (1)取一定的動物組織去除脂肪後，用剪刀剪碎或者用絞肉機攪碎； (2)取l-3g待測樣品於50mL離心管中，依次加入3-5mL去離子水，0.3-0.6mLIM鹽酸，0.1-0.3mL衍生化試劑，震蕩混勻3-5min，55-60°C水浴條件下孵育30min ； (3)取出後，依次加入3-6mL提取劑，0.3-0.5mL IM氫氧化鈉，震蕩混勻l_3min ；4000轉離心2-10min，取上層清液待測； (4)吸取50-150μL待測液於酶標孔中，反覆吹打至孔內紅色物質完全溶解，等待反應2-6min，吸取孔內所有溶液滴加到檢測卡的加樣孔中，加樣後開始計時,反應5_8min判讀結果。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特徵在於，所述的硝基呋喃類藥物代謝物為呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物或呋喃西林代謝物中的任意一種或至少兩種的混合物。
【文檔編號】G01N33/531GK104374910SQ201410660354
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月19日 優先權日:2014年11月19日
【發明者】徐波, 周麗, 李豔, 張勇攀, 梁如中, 卞禹卜 申請人:無錫中德伯爾生物技術有限公司