利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法的製作方法

2023-12-09 01:50:21 1

專利名稱：利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤檢測試劑盒開發領域，更具體地說，涉及一種利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法。
背景技術：
原癌基因C-myc是一種使細胞無限增殖、獲永生化功能、促進細胞分裂的可調節基因，在很多腫瘤中都高表達[1]。在癌變細胞中，C-myc蛋白表達異常增高，使細胞脫離正常生長的調節限制，向惡性表型轉化，發生癌變。據報導，C-myc基因的過表達與腫瘤發生發展密切相關，如白血病，肺癌，肝癌，胃癌，乳腺癌，結腸癌，宮頸癌，某些神經母細胞病，視網膜母細胞瘤，成骨肉瘤，軟骨肉瘤，脊索瘤，脂肪肉瘤，橫紋肌肉瘤，何杰金氏病及頭部腫瘤等都有C-myc基因的擴增或過度表達[2]。特別是在所有的B淋巴細胞性白血病組織中C-myc基因過表達[3]。與正常細胞相比，腫瘤細胞中C-myc的表達量增高几十倍，是惡性腫瘤發生的一個重要標誌。目前，有關C-Myc研究的文章及專利如下(I)Dang CV, Resar LM, Emi son E, et al. Function of the C-myconcogenictranscription factor[J]. Exp Cell Res, 1999, 253(1):63-77.(2) Riou GF, Bourhis J, Le MG. The C-myc proto-oncogene in invasivecarcinomasof the uterine cervix:clinical relevance of over expression in earlystages of thecancer[J]. Anticancer Res, 1990, 9-10(5A):1225-1231.(3) May PC, Foot N, Dunn R, et al. Detection of cryptic and variantIgH-MYCrearrangements in high-grade non-Hodgkin's lymphoma by fluorescencein situhybridization:1mplications for cytogenetic testing[J]. Cancer GenetCytogenet, 2010, 198(1) : 71-75.(4)用於檢測致癌基因C-myc重組蛋白的LSPR傳感晶片(專利公開號CN102175649A)(5)—種致癌基因C-myc蛋白的螢光光譜測定方法(專利公開號CN101893573A)文章1-3主要研究關於C-Myc在腫瘤組織中的高表達的意義以及其機理。專利4發明提供了一種基於局域表面等離子體共振(LSPR)光譜檢測致癌基因C-myc重組蛋白的LSPR傳感晶片。在LSPR傳感晶片的金膜表面組裝上一層DTT單分子層，接上金納米粒子層，在所述金納米粒子層表面修飾上3-巰基丙酸單分子層，然後通過DMAP-EDC活化,使3-巰基丙酸單分子層與C-myc單克隆抗體結合,通過C_myc單克隆抗體與C-myc重組蛋白的免疫反應結合，引起金納米粒子表面產生局域表面等離子體共振吸收峰的位移，以此來檢測癌變組織中C-myc重組蛋白的含量。專利5發明公開了一種致癌基因C-myc蛋白的螢光光譜測定方法，其測定依據是C-myc蛋白本身具有螢光性並且與金納米溶膠結合後發生螢光猝滅現象，該螢光猝滅強度(AF)與C-myc蛋白濃度變化之間呈線性對應關係,達到測定C_myc蛋白含量的目的。
目前,利用兩種單克隆抗體快速檢測c-Myc的ELISA尚無報導。

發明內容
本發明開發一種利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA，旨在獲得穩定分泌特異性和敏感性很高的抗C-myc IgG1單克隆抗體和IgM單克隆抗體，為多種腫瘤特別是B淋巴細胞性白血病診斷試劑盒的開發提供堅實的數據基礎。為了達到上述目的，本發明一種利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，包括如下步驟S1、製備C-myc抗原,並純化,獲得純化的C_myc蛋白；S2、利用所述純化的C-myc蛋白進行免疫健康Balb/c小鼠；S3、將免疫Balb/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合；S4、篩選陽性雜交瘤細胞；S5、對所述陽性雜交瘤細胞進行亞克隆，獲得2株能夠穩定分泌抗C-myc IgG1的克隆及抗C-myc IgM的單克隆抗體雜交瘤細胞株；S6、Balb/c小鼠腹腔內注射兩種所述單克隆抗體雜交瘤細胞株，大量製備單克隆抗體；S7、選用以下三種方法中的任意一種，實現快速檢測C-Myc 方法1:利用兩種抗c-Myc單克隆抗體檢測腫瘤細胞c_Myc表達量的夾心法ELISA法。方法2 :利用抗c-Myc IgM單克隆抗體檢測腫瘤細胞c-Myc表達量的直接法ELISA法。方法3:利用抗c-Myc IgG單克隆抗體檢測腫瘤細胞c-Myc表達量的直接法ELISA法。優選方式下，步驟SI的具體分步為S11、將含有原核表達載體的pET20b-C-myc表達菌E. coli BL21在37°C震蕩培養，170rpm ；S12、經IPTG誘導後，收集菌體，超聲波打碎、利用鎳柱子層析純化。具體說，步驟SI的具體方法為將含有原核表達載體pET20b-C-myc表達菌的E.coli BL21 在 37°C震蕩培養，170rpm;菌液 OD6tltol 值為 0.4-0.6時，經1-2禮 IPTG 誘導1-3小時後，6500rmp離心IOmin收集細胞，懸浮，破碎超聲破碎儀破碎細胞10min，2_8M尿素進行變性2h後再復性，經AKATA儀用鎳離子親和層析柱純化蛋白，最後得到90-95%以上純度的C-Myc蛋白。優選方式下，上述步驟S2具體步驟為利用原核表達並純化的C-myc蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，將抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔內，0. 4ml/只，抗原量為50-lOOy g/只；首次免疫14天後，改用弗氏不完全佐劑與同體積的抗原量充分乳化進行第
2次免疫，抗原量不變；第28天，按照100-200 u g/只抗原量對小鼠進行第三次免疫，小鼠的抗體效價達到了1:64000-1 1280000。優選方式下，上述步驟S3具體步驟為Balb/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以5:1-10:1的比例混合於50ml離心管中，1200rpm、5min離心，棄上清,在25s_30s內迅速滴A 37°C預熱的50%的PEG1000約0. 5ml並輕輕混勻，700rpm、2min離心，再沿管壁緩慢加入37°C預熱的RPM1-1640基礎培養基15ml，使試管做劃圓樣運動約2min，離心1400rpm、5min，棄上清，同法再清洗I次。沿管壁緩慢加入37°C預熱的HT培養基30ml，輕輕混勻融合細胞。優選方式下，上述步驟S5具體步驟為當雜交瘤細胞集落生長40-60%以上時，用ELISA方法篩選陽性孔；針對陽性孔，用HT培養基稀釋細胞，進行亞克隆。培養第8-9天，對標記的單克隆細胞孔的上清進行ELISA檢測，篩選陽性克隆。優選方式下，上述步驟S6具體步驟為向健康雌性Balb/c小鼠腹腔內注射高壓滅菌後的液體石臘油，0. 4-0. 6ml/只。一周後,再向其腹腔注射能穩定分泌C-myc抗體的雜交瘤細胞，0. 5ml/只，細胞數約為2-5X IO6個；10-14天後，待小鼠腹部明顯膨大並行動遲緩時，收集腹水，3000rpm、IOmin離心，棄去脂肪和石蠟油，收集中層澄清腹水，_20°C凍存備用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效價分別為1:64000、1:32000。優選方式下，上述步驟S7中方法I的具體步驟為用pH 9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋包被抗C-myc IgM的單克隆抗體 雜交瘤細胞株，使濃度達到5_20 y g/ml ;用PBS-T洗滌，200 iil/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次；加入1:10-1 :50倍稀釋的被檢腫瘤細胞裂解液，37°C反應Ih ;用PBS-T洗滌；加入封閉液200 U I/孔，37°C溼盒溫浴Ih ;加入I 1000-1 2000倍比稀釋的抗C-myc IgM的單克隆抗體雜交瘤細胞株，100 U I/孔，37°C溼盒溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；將HRP酶標羊抗小鼠IgG做1:5000稀釋，100 U I/孔加入酶標板，37°C溼盒溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；加入鄰苯二胺液100 iil/孔，37°C避光反應15min ;加入終止液，2mol/L硫酸溶液，100 u I/孔，酶標儀測定OD492nm值。優選方式下，上述步驟S7中方法2的具體步驟為用pH 9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋包被1:10-1 50倍稀釋的被檢腫瘤細胞裂解液。用PBS-T洗滌，200 u I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次；加入封閉液200 u I/孔，37°C溫浴Ih ;加入I =1000-1 2000倍比稀釋的抗C-Myc IgM (2A9) 100 U I/孔，37°C溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；將HRP酶標羊抗小鼠IgM做1:5000-1:10000稀釋，100 u I/孔加入酶標板，37°C溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；加入鄰苯二胺(OPD)液IOOu I/孔，37°C避光反應15min ;加入終止液(2mol/L硫酸溶液)100 U I/孔，酶標儀測定 0^49211111 值。優選方式下，上述步驟S7中方法3的具體步驟為用pH 9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋包被1:10-1 50倍稀釋的被檢腫瘤細胞裂解液。37°C反應Ih ;用PBS-T洗滌；加入封閉液200iil/孔，37°C 溫浴 Ih ;加入1:1000-1 :2000 倍比稀釋的抗 c_Myc IgG(2B2)100 iil/孔，37°C溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；將HRP酶標羊抗小鼠IgG做1:5000稀釋，100 U I/孔加入酶標板，37°C溫浴Ih ;用PBS-T洗滌;加入鄰苯二胺(OPD)液IOOiU/孔，37°C避光反應15min ；加入終止液(2mol/L硫酸溶液)100 u I/孔，酶標儀測定OD492nm值。本發明利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的夾心法ELISA,首先通過蛋白純化技術將原核表達C-Myc蛋白提純。利用純化C-myc進行免疫的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，經ELISA法篩選，亞克隆及單克隆抗體Ig亞型鑑定，獲得2株能夠穩定分泌抗C-myc IgG1的克隆(2B2)及抗C-myc IgM (2A9)克隆。利用抗C-myc IgG1抗體以及抗C-myc IgM抗體,建立快速檢測c_Myc的夾心法ELISA。應用本發明對C_myc蛋白樣品進行準確測定,可檢測的C-myc蛋白濃度範圍為0. 01 1000pmol/L,檢出下限為0. 01 0. 05pmol/L。本發明大大提高了檢測C-Myc的特異性和敏感性，操作簡單、重複性高，本發明檢測腫瘤組織中的C-Myc的表達量，為惡性腫瘤的篩選提供實驗數據。本發明可將利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的夾心法ELISA開發成具有自主智慧財產權的新型檢測腫瘤試劑盒並推向產業化，造福全人類，具有極大的社會意義和廣泛的市場意義。


圖1是C-myc蛋白純化圖；其中，泳道I為蛋白質marker ;泳道2為菌體裂解液上清；泳道3為菌體裂解液包涵體；純化的C-myc蛋白；圖2是小鼠3次免疫後血清中的抗體效價；圖3是融合第9天的雜交瘤細胞株(200倍)；圖4是單克隆抗體的亞型鑑定； 圖5是測定健康組織和腫瘤組織中c-Myc含量的比較。
具體實施例方式本發明的技術方案是本發明首先原核表達c-Myc蛋白，再通過蛋白純化技術將C-Myc蛋白提取、純化。利用純化C-myc進行免疫的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，經ELISA法篩選，亞克隆及單克隆抗體Ig亞型鑑定，獲得2株能夠穩定分泌抗C-myc IgG1的克隆(2B2)及抗C-myc IgM (2A9)克隆。利用抗C-myc IgG1單克隆抗體以及抗C-myc IgM單克隆抗體,建立快速檢測c_Myc的夾心法ELISA。實施例1 :具體方法步驟如下1. C-myc抗原的製備與純化菌液OD6tltol值為0. 4時，經IPTG誘導I小時後，6500rmp離心IOmin收集細胞，懸浮，超聲破碎儀破碎細胞(20%功率，破碎IOmin)，2-8M尿素進行變性2h後再復性，經AKATA儀用鎳離子親和層析柱純化蛋白，最後得到95%以上純度的c-Myc蛋白(圖1)。2.單克隆抗體的製備2.1動物免疫利用原核表達並純化的C-myc蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，將抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔內，0. 4ml/只，抗原量為50 u g/只；首次免疫14天後，改用弗氏不完全佐劑與同體積的抗原量充分乳化進行第2次免疫，抗原量不變;第28天，按照IOOyg/只抗原量對小鼠進行加強免疫。第三次免疫後，小鼠的抗體效價達到了 1:640000，見圖2，結果說明所建立的免疫程序合理有效。2. 2細胞融合收集免疫Balb/c小鼠脾細胞後與SP2/0骨髓瘤細胞以10:1的比例混合於50ml離心管中，1200rpm、5min離心，棄上清，在25s時迅速滴入37°C預熱的50%的PEG1000約0. 5ml並輕輕混勻，700rpm、2min離心，再沿管壁緩慢加入37°C預熱的RPM1-1640基礎培養基15ml,使試管做劃圓樣運動約2min, 1400rpm、5min離心,棄上清，同法再清洗I次。沿管壁緩慢加入37°C預熱的HT培養基30ml，輕輕混勻融合細胞，滴加到預先鋪有滋養層細胞的96孔板中，100 u I/孔，置於37°C、5%C02培養箱培養。次日補加HAT培養基[含有次黃嘌呤01)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培養基]50 ill/孔；第4天，每孔吸棄200111，再加入HAT培養基100 u I/孔；第7天，每孔再補加100 U I HAT培養基。融合後第9天，鏡下會觀察到未融合或自身融合的脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞會全部死亡，而雜交瘤細胞存活(圖3)。2. 3陽性雜交瘤細胞的篩選及亞克隆當雜交瘤細胞集落生長50%以上時，用ELISA方法篩選陽性孔。針對陽性孔，用HT培養基[含有次黃嘌呤01)、胸苷(T)的培養基]稀釋細胞，滴加到另一已鋪有滋養細胞的96孔板內，進行亞克隆。亞克隆第5天，標記有單克隆細胞的孔並半量更換HT培養基。第9天，對標記的單克隆細胞孔的上清進行ELISA檢測，獲得2株能穩定分泌抗C-myc的單克隆抗體雜交瘤細胞株，2B2及2A9克隆。經用Sigma 的 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 檢測，顯不出2B2及2A9克隆的抗體類型分別為IgG1亞類和IgM (圖4)。2. 4單克隆抗體的大量製備在健康雌性Balb/c小鼠腹腔內注射高壓滅菌後的液體石蠟油，0. 4ml/只。一周後，再向其腹腔注射能穩定分泌C-myc抗體的雜交瘤細胞，0. 5ml/只(細胞數約為2X IO6個)。10-14天後，待小鼠腹部明顯膨大並行動遲緩時，收集腹水，3000rpm、IOmin離心，棄去脂肪和石蠟油，收集中層澄清腹水，_20°C凍存備用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效價分別為1:64000、1:32000，表明獲得的單克隆抗體具有較高的敏感性。3利用兩種抗c-Myc單克隆抗體檢測腫瘤細胞c_Myc表達量的夾心法ELISA法3.1 包被包被抗c-Myc IgM (2A9),使濃度達到5 U g/ml,每孔50 ii I包被酶標板,37°C反應l-2h。3. 2 洗板甩幹包被液，用PBST洗滌，200iil/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 3 封閉加入封閉液200 U I/孔，37°C溼盒溫浴30min。3. 4 洗板用PBST洗滌，200 U I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 5加入被檢腫瘤細胞Raji細胞裂解物加入1:10倍稀釋的被檢腫瘤細胞裂解液。37°C反應lh。陰性對照為正常細胞裂解液；陽性對照為Raji細胞裂解液。3. 6 洗板用PBST洗滌，200 U I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 7 一抗反應加入I 1000倍比稀釋的抗C-myc IgM (2B2) 100 U I/孔，37°C溼盒溫浴lh。3. 8 洗板甩幹一抗，用PBST洗滌，200 U I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 9 二抗反應將HRP酶標羊抗小鼠IgG做1:5000稀釋，100 U I/孔加入酶標板，37°C溼盒溫浴Ih0
3. 10 洗板甩幹二抗，用PBST洗滌，200 μ I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 11 底物加入鄰苯二胺(OPD)液100 μ I/孔，37°C避光反應15min。3. 12 終止加入終止液(2mol/L硫酸溶液)100 μ I/孔，酶標儀測定OD492nm值。本實驗製備B淋巴細胞白血病細胞裂解液，進行夾心法ELISA實驗，測定健康組織和腫瘤組織中c-Myc含量。實驗結果用均數土準差表示表示與未免疫組比較Ρ〈0. 01,結果見圖5。由圖5中可見，腫瘤組織中c-Myc含量明顯高於健康組織，且差異具有統計學意義(Ρ〈0. 01)。本實驗使用抗C-Myc IgM (2Α9)和抗c_Myc IgGl (2B2)單克隆抗體快速檢測腫瘤細胞中的c-Myc抗原，具有高度特異性和敏感性，所需時間為4. 5-6h，陽性檢測率達到100%ο可檢測的c-Myc蛋白濃度範圍為O. 01 IOOOpmo 1/L，檢出下限為O. 01 O. 05pmo1/L。實施例2 具體方法步驟如下l.C-myc抗原的製備與純化菌液OD6tltol 值為O. 6時，經IPTG誘導I小時後，6500rmp離心IOmin收集細胞，懸浮，超聲破碎儀破碎細胞(20%功率，破碎IOmin)，2-8M尿素進行變性2h後再復性，經AKATA儀用鎳離子親和層析柱純化蛋白，最後得到95%以上純度的c-Myc蛋白(圖1)。2.單克隆抗體的製備2.1動物免疫利用原核表達並純化的C-myc蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，將抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔內，O. 6ml/只，抗原量為100 μ g/只；首次免疫14天後，改用弗氏不完全佐劑與同體積的抗原量充分乳化進行第2次免疫，抗原量不變;第28天，按照200 μ g/只抗原量對小鼠進行加強免疫。第三次免疫後，小鼠的抗體效價達到了1:1280000，見圖2，結果說明所建立的免疫程序合理有效。2. 2細胞融合收集免疫Balb/c小鼠脾細胞後與SP2/0骨髓瘤細胞以5:1的比例混合於50ml離心管中，1200rpm、5min離心，棄上清，在30s時迅速滴入37°C預熱的50%的PEG1000約O. 5ml並輕輕混勻，700rpm、2min離心，再沿管壁緩慢加入37°C預熱的RPM1-1640基礎培養基15ml,使試管做劃圓樣運動約2min, 1400rpm、5min離心,棄上清，同法再清洗I次。沿管壁緩慢加入37°C預熱的HT培養基30ml，輕輕混勻融合細胞，滴加到預先鋪有滋養層細胞的96孔板中，10(^1/孔，置於371、5%0)2培養箱培養。次日補加HAT培養基50 μ I/孔；第4天，每孔吸棄200 μ 1，再加入HAT培養基100 μ I/孔；第7天，每孔再補加100 μ I HAT培養基。融合後第9天，鏡下會觀察到未融合或自身融合的脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞會全部死亡，而雜交瘤細胞存活(圖3)。2. 3陽性雜交瘤細胞的篩選及亞克隆當雜交瘤細胞集落生長50%以上時，用ELISA方法篩選陽性孔。針對陽性孔，用HT培養基稀釋細胞，滴加到另一已鋪有滋養細胞的96孔板內，進行亞克隆。亞克隆第5天，標記有單克隆細胞的孔並半量更換HT培養基。第9天，對標記的單克隆細胞孔的上清進行ELISA檢測，獲得2株能穩定分泌抗C-myc的單克隆抗體雜交瘤細胞株，2B2及2A9克隆。經用Sigma 的 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 檢測，顯不出2B2及2A9克隆的抗體類型分別為IgG1亞類和IgM (圖4)。2. 4單克隆抗體的大量製備在健康雌性Balb/c小鼠腹腔內注射高壓滅菌後的液體石蠟油，O. 6ml/只。一周後，再向其腹腔注射能穩定分泌C-myc抗體的雜交瘤細胞，O. 5ml/只(細胞數約為5X IO6個)。10-14天後，待小鼠腹部明顯膨大並行動遲緩時，收集腹水，3000rpm、IOmin離心，棄去脂肪和石蠟油，收集中層澄清腹水，_20°C凍存備用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效價分別為1:64000、1:32000，表明獲得的單克隆抗體具有較高的敏感性3利用抗c-Myc IgM單克隆抗體檢測腫瘤細胞c-Myc表達量的直接法ELISA法3.1 包被包被0. 01 IOOOpmo 1/L的被檢腫瘤細胞裂解液。37°C反應lh。陰性對照為正常細胞裂解液；陽性對照為Raji細胞裂解液。3. 2 洗板甩幹包被液，用PBST洗滌，200 μ I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 3 封閉加入封閉液200 μ I/孔，37°C溼盒溫浴30min。3. 4 洗板用PBST洗滌，200 μ I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 5 —抗反應加入I 2000 倍稀釋的抗 C-Myc IgM (2A9) 100 μ I/ 孔，37°C溫浴 lh。3. 6 洗板甩幹一抗，用PBST洗滌，200 μ I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 7 二抗反應將HRP酶標羊抗鼠IgM做1:5000稀釋，100 μ I/孔加入酶標板，37°C溼盒溫浴lh。3. 8 洗板甩幹二抗，用PBST洗滌，200 μ I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 9 底物加入底物液100μ I/孔，37°C避光反應15min。

3. 10 終止加入終止液100 μ I/孔，酶標儀測定OD492nm值。本實驗使用抗C-Myc IgM (2Α9)單克隆抗體快速檢測腫瘤細胞中的c_Myc抗原，具有高度特異性和敏感性，所需時間為2. 5-3h，陽性檢測率達到100%。可檢測的c-Myc蛋白濃度範圍為0. 01 IOOOpmo 1/L，檢出下限為0. 01 0. 05pmol/L。實施例3:具體方法步驟如下1. C-myc抗原的製備與純化
菌液OD6tltol值為O. 6時，經IPTG誘導I小時後，6500rmp離心IOmin收集細胞，懸浮，超聲破碎儀破碎細胞(20%功率，破碎IOmin)，2-8M尿素進行變性2h後再復性，經AKATA儀用鎳離子親和層析柱純化蛋白，最後得到95%以上純度的c-Myc蛋白(圖1)。2.單克隆抗體的製備2.1動物免疫利用原核表達並純化的C-myc蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，將抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔內，O. 6ml/只，抗原量為100 μ g/只；首次免疫14天後，改用弗氏不完全佐劑與同體積的抗原量充分乳化進行第2次免疫，抗原量不變；第28天，按照200 μ g/只抗原量對小鼠進行加強免疫。第三次免疫後，小鼠的抗體效價達到了1:1280000，見圖2，結果說明所建立的免疫程序合理有效。2. 2細胞融合收集免疫Balb/c小鼠脾細胞後與SP2/0骨髓瘤細胞以5:1的比例混合於50ml離心管中，1200rpm、5min離心，棄上清，在30s時迅速滴入37°C預熱的50%的PEG1000約O. 5ml並輕輕混勻，700rpm、2min離心，再沿管壁緩慢加入37°C預熱的RPM1-1640基礎培養基15ml,使試管做劃圓樣運動約2min, 1400rpm、5min離心,棄上清，同法再清洗I次。沿管壁緩慢加入37°C預熱的HT培養基30ml，輕輕混勻融合細胞，滴加到預先鋪有滋養層細胞的96孔板中，10(^1/孔，置於371、5%0)2培養箱培養。次日補加HAT培養基50 μ I/孔；第4天，每孔吸棄200 μ 1，再加入HAT培養基100 μ I/孔 』第7天，每孔再補加100 μ I HAT培養基。融合後第9天，鏡下會觀察到未融合或自身融合的脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞會全部死亡，而雜交瘤細胞存活(圖3)。2. 3陽性雜交瘤細胞的篩選及亞克隆

當雜交瘤細胞集落生長50%以上時，用ELISA方法篩選陽性孔。針對陽性孔，用HT培養基稀釋細胞，滴加到另一已鋪有滋養細胞的96孔板內，進行亞克隆。亞克隆第5天，標記有單克隆細胞的孔並半量更換HT培養基。第9天，對標記的單克隆細胞孔的上清進行ELISA檢測，獲得2株能穩定分泌抗C-myc的單克隆抗體雜交瘤細胞株，2B2及2A9克隆。經用Sigma 的 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 檢測，顯不出2B2及2A9克隆的抗體類型分別為IgG1亞類和IgM (圖4)。2. 4單克隆抗體的大量製備在健康雌性Balb/c小鼠腹腔內注射高壓滅菌後的液體石蠟油，0. 6ml/只。一周後，再向其腹腔注射能穩定分泌C-myc抗體的雜交瘤細胞，0. 5ml/只(細胞數約為5X IO6個)。10-14天後，待小鼠腹部明顯膨大並行動遲緩時，收集腹水，3000rpm、IOmin離心，棄去脂肪和石蠟油，收集中層澄清腹水，_20°C凍存備用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效價分別為1:64000、1:32000，表明獲得的單克隆抗體具有較高的敏感性3利用抗c-Myc IgG單克隆抗體檢測腫瘤細胞c-Myc表達量的直接法ELISA法3.1 包被包被0. 01 IOOOpmo 1/L的被檢腫瘤細胞裂解液。37°C反應lh。陰性對照為正常細胞裂解液；陽性對照為Raj i細胞裂解液。3. 2 洗板用PBST洗滌，200 μ I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。
3. 3 封閉加入封閉液200 μ I/孔，37°C溼盒溫浴30min。3. 4 洗板用PBST洗滌，200 μ I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 5 —抗反應加入I 2000 倍稀釋的抗 c-Myc IgG (2B2) 100 μ I/ 孔，37°C溼盒溫浴 lh。3. 6 洗板甩幹一抗，用PBST洗滌，200 μ I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 7 二抗反應將HRP酶標羊抗鼠IgG做1:5000稀釋，100 μ I/孔加入酶標板，37°C溼盒溫浴lh。3. 8 洗板甩幹二抗，用PBST洗滌，200 μ I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次。3. 9 底物加入底物 液100 μ I/孔，37°C避光反應15min。3. 10 終止加入終止液100 μ I/孔，酶標儀測定OD492nm值。本實驗使用抗c-Myc IgG (2Β2)單克隆抗體快速檢測腫瘤細胞中的c_Myc抗原，具有高度特異性和敏感性，所需時間為2. 5-3h，陽性檢測率達到100%。可檢測的c-Myc蛋白濃度範圍為O. 01 1000pmol/L，檢出下限為O. 01 O. 05pmol/L。根據上述三個實施例，本發明利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，可概括為如下步驟S1、C-myc抗原的製備與純化，具體分步如下S11、將含有原核表達載體(pET20b-C_myc表達菌)的表達菌E. coli BL21在37°C震蕩培養(170rpm)；S12、經IPTG誘導後，收集菌體，超聲波打碎、利用鎳柱子層析純化；S2、製備抗C-myc單克隆抗體,具體分步如下S21、將利用純化的C-myc蛋白進行免疫健康Balb/c小鼠；S22、將免疫Balb/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合；S23、第3-4天，利用HAT培養基進行篩選。S24、對陽性雜交瘤細胞進行亞克隆，獲得2株能穩定分泌抗C-myc的單克隆抗體雜交瘤細胞株，2B2及2A9克隆。S25、2B2及2A9克隆的抗體亞型分別為IgG1亞類和IgM。S26、Balb/c小鼠腹腔內注射2B2及2A9克隆細胞株，大量製備單克隆抗體。S27、選用以下三種方法中的任意一種，實現快速檢測C-Myc 方法1:利用兩種抗c-Myc單克隆抗體檢測腫瘤細胞c-Myc表達量的夾心法ELISA法。方法2:利用抗c-Myc IgM單克隆抗體檢測腫瘤細胞c-Myc表達量的直接法ELISA法。方法3:利用抗c-Myc IgG單克隆抗體檢測腫瘤細胞c-Myc表達量的直接法ELISA法。優選方式下，步驟SI的具體步驟為將含有原核表達載體(pET20b-C-myc表達菌)的E. coli BL21在37°C震蕩培養(170rpm)，菌液 OD6ticinm 值為 O. 4-0. 6 時，經 l_2mM IPTG 誘導 1-3 小時後，6500rmp 離心 IOmin收集細胞，懸浮，超聲破碎儀破碎細胞(20%功率，破碎10min)，2-8M尿素進行變性2h後再復性，經AKATA儀用鎳離子親和層析柱純化蛋白，最後得到90-95%以上純度的C-Myc蛋白。優選方式下，步驟S21具體步驟為利用原核表達並純化的C-myc蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，將抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔內，O. 4ml/只，抗原量為50-100 μ g/只；首次免疫14天後，改用弗氏不完全佐劑與同體積的抗原量充分乳化進行第2次免疫，抗原量不變；第28天，按照100-200 μ g/只抗原量對小鼠進行第三次免疫，小鼠的抗體效價達到了1:64000-1:1280000。優選方式下，在步 驟S22具體步驟為Balb/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以5:1-10:1的比例混合於50ml離心管中，1200rpm、5min離心,棄上清,在25s_30s內迅速滴入37°C預熱的50%的PEG1000約O. 5ml並輕輕混勻，700rpm、2min離心，再沿管壁緩慢加入37°C預熱的RPM1-1640基礎培養基15ml，使試管做劃圓樣運動約2min，離心1400rpm、5min，棄上清，同法再清洗I次。沿管壁緩慢加入37°C預熱的HT培養基30ml，輕輕混勻融合細胞。優選方式下，在步驟S24具體步驟為當雜交瘤細胞集落生長40-60%以上時，用ELISA方法篩選陽性孔。針對陽性孔，用HT培養基稀釋細胞，進行亞克隆。培養第8-9天，對標記的單克隆細胞孔的上清進行ELISA檢測，篩選陽性克隆。優選方式下，在步驟S26具體步驟為向健康雌性Balb/c小鼠腹腔內注射高壓滅菌後的液體石臘油，O. 4-0. 6ml/只。一周後,再向其腹腔注射能穩定分泌C-myc抗體的雜交瘤細胞，O. 5ml/只(細胞數約為2-5X106個)。10-14天後，待小鼠腹部明顯膨大並行動遲緩時，收集腹水，3000rpm、IOmin離心，棄去脂肪和石蠟油，收集中層澄清腹水，_20°C凍存備用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效價分別為1:64000、1:32000。優選方式下，在步驟S27中方法I的具體步驟為用pH 9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋包被抗C-myc IgM (2A9)，使濃度達到5-20 μ g/ml ;用PBS-T洗滌，200 μ I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次；加入1:10-1 50倍稀釋的被檢腫瘤細胞裂解液。37°C反應Ih ;用PBS-T洗滌；加入封閉液200 μ I/孔，37°C溼盒溫浴Ih ;加入1:1000-1 :2000倍比稀釋的抗C-myc IgM(2B2)100 μ I/孔，37°C溼盒溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；將HRP酶標羊抗小鼠IgG做1:5000稀釋，100 μ I/孔加入酶標板，37°C溼盒溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；加入鄰苯二胺(OPD)液100μ I/孔，37°C避光反應15min ;加入終止液(2mol/L硫酸溶液)100 μ I/孔，酶標儀測定 OD492nm 值。優選方式下，在步驟S27中方法2的具體步驟為用pH 9.6的碳酸鹽緩衝液稀釋包被1:10_1 50倍稀釋的被檢腫瘤細胞裂解液。用PBS-T洗滌，200 μ I/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次；加入封閉液200 μ I/孔，37°C溫浴 Ih ;加入1:1000-1 :2000 倍比稀釋的抗 C-Myc IgM (2A9) 100 μ I/孔，37°C溫浴 Ih ；用I3BS-T洗滌；將HRP酶標羊抗小鼠IgM做1: 5000-1:10000稀釋，100 μ I/孔加入酶標板，37°C溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；加入鄰苯二胺(OPD)液100 μ I/孔，37°C避光反應15min ;加入終止液(2mol/L硫酸溶液)100 μ I/孔，酶標儀測定OD492nm值。
優選方式下，在步驟S27中方法3的具體步驟為用pH 9.6的碳酸鹽緩衝液稀釋包被1:10-1 50倍稀釋的被檢腫瘤細胞裂解液。37°C反應Ih ^PBS-T洗滌;加入封閉液200 μ I/孔，37°C溫浴Ih ;加入1:1000-1 :2000倍比稀釋的抗c-Myc IgG (2B2) 100 μ I/孔，37°C溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；將HRP酶標羊抗小鼠IgG做1:5000稀釋，100 μ I/孔加入酶標板，37°C溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；加入鄰苯二胺(OPD)液100 μ I/孔，37°C避光反應15min ;加入終止液(2mol/L硫酸溶液)100 μ I/孔，酶標儀測定 0^49211111 值。本發明還提供了一種利用單克隆抗體檢測腫瘤細胞c-Myc表達量的ELISA溶液配製方法，包括洗滌液，PBS-T緩衝液(20mM磷酸鹽緩衝液加入O. l%Tween20)；抗體稀釋液，2%脫脂奶粉PBS溶液；包被液，pH 9. 6碳酸鹽緩衝液；封閉液，5%脫脂奶粉PBS溶液；底物，鄰苯二胺(OPD)液；終止液，2mo 1/L硫酸溶液。本發明所述的三種ELISA測定方法具有操作簡便、靈敏度高、檢出限低、穩定性和重現性好等優點，對惡性腫瘤的篩選具有重大的意義。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式
，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術 人員在本發明披露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，其特徵在於，包括如下步驟 51、製備C-myc抗原,並純化,獲得純化的C-myc蛋白； 52、利用所述純化的C-myc蛋白進行免疫健康Balb/c小鼠； 53、將免疫Balb/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合； 54、篩選陽性雜交瘤細胞； 55、對所述陽性雜交瘤細胞進行亞克隆，獲得2株能夠穩定分泌抗C-mycIgG1的克隆及抗C-myc IgM的單克隆抗體雜交瘤細胞株； 56、Balb/c小鼠腹腔內注射兩種所述單克隆抗體雜交瘤細胞株，大量製備單克隆抗體； 57、選用以下三種方法中的任意一種,實現快速檢測C-Myc 方法1:利用兩種抗C-Myc單克隆抗體檢測腫瘤細胞c-Myc表達量的夾心法ELISA法。
方法2 :利用抗c-Myc IgM單克隆抗體檢測腫瘤細胞c-Myc表達量的直接法ELISA法。
方法3 :利用抗c-Myc IgG單克隆抗體檢測腫瘤細胞c-Myc表達量的直接法ELISA法。
2.根據權利要求1所述利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，其特徵在於，步驟SI的具體方法為 511、將含有原核表達載體的pET20b-C-myc表達菌E.coli BL21在37°C震蕩培養，170rpm ； 512、經IPTG誘導後，收集菌體，超聲波打碎、利用鎳柱子層析純化。
3.根據權利要求2所述利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，其特徵在於，SI的具體方法為將含有原核表達載體pET20b-C-myc表達菌的E. coliBL21在37°C震蕩培養，170rpm ;菌液 OD6ticinm 值為 0. 4-0. 6 時，經 l_2mM IPTG 誘導 1-3 小時後，6500rmp 離心 IOmin收集細胞，懸浮，破碎超聲破碎儀破碎細胞lOmin，2-8M尿素進行變性2h後再復性，經AKATA儀用鎳離子親和層析柱純化蛋白，最後得到90-95%以上純度的C-Myc蛋白。
4.根據權利要求3所述利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，其特徵在於，S2具體步驟為利用原核表達並純化的C-myc蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，將抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔內，0. 4ml/只，抗原量為50-100 y g/只；首次免疫14天後，改用弗氏不完全佐劑與同體積的抗原量充分乳化進行第2次免疫，抗原量不變；第28天，按照100-200 yg/只抗原量對小鼠進行第三次免疫，小鼠的抗體效價達到了1:64000-1 1280000。
5.根據權利要求4所述利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，其特徵在於，S3具體步驟為Balb/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以5:1-10:1的比例混合於50ml離心管中，1200rpm、5min離心，棄上清，在25s_30s內迅速滴入37°C預熱的50%的PEG1000約0. 5ml並輕輕混勻，700rpm、2min離心，再沿管壁緩慢加入37°C預熱的RPM1-1640基礎培養基15ml,使試管做劃圓樣運動約2min,離心1400rpm、5min,棄上清，同法再清洗I次。沿管壁緩慢加入37°C預熱的HT培養基30ml，輕輕混勻融合細胞。
6.根據權利要求5所述利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，其特徵在於，S5具體步驟為當雜交瘤細胞集落生長40-60%以上時，用ELISA方法篩選陽性孔； 針對陽性孔，用HT培養基稀釋細胞，進行亞克隆。培養第8-9天，對標記的單克隆細胞孔的上清進行ELISA檢測，篩選陽性克隆。
7.根據權利要求6所述利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，其特徵在於，S6具體步驟為向健康雌性Balb/c小鼠腹腔內注射高壓滅菌後的液體石蠟油，0. 4-0. 6ml/只。一周後，再向其腹腔注射能穩定分泌C-myc抗體的雜交瘤細胞，0. 5ml/只，細胞數約為2-5 X IO6 個； 10-14天後，待小鼠腹部明顯膨大並行動遲緩時，收集腹水，3000rpm、IOmin離心，棄去脂肪和石蠟油，收集中層澄清腹水，_20°C凍存備用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效價分別為1:64000、1:32000。
8.根據權利要求7所述利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，其特徵在於，S7中方法I的具體步驟為 用pH 9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋包被抗C-myc IgM的單克隆抗體雜交瘤細胞株，使濃度達到 5-20 u g/ml ； 用PBS-T洗漆,200 u I/孔,每次30s後甩乾洗板液，重複二次； 加入1:10-1 50倍稀釋的被檢腫瘤細胞裂解液，37°C反應Ih ； 用PBS-T洗滌；加入封閉液200 u I/孔，37°C溼盒溫浴Ih ； 加入1:1000-1 :2000倍比稀釋的抗C-myc IgM的單克隆抗體雜交瘤細胞株，100 yl/孔，37 °C溼盒溫浴Ih; 用PBS-T洗滌；將HRP酶標羊抗小鼠IgG做1:5000稀釋，100 U I/孔加入酶標板，37°C溼盒溫浴Ih ； 用PBS-T洗滌；加入鄰苯二胺液100 u I/孔，37°C避光反應15min ； 加入終止液，2mol/L硫酸溶液，100 u I/孔，酶標儀測定OD492nm值。
9.根據權利要求7所述利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，其特徵在於，S7中方法2的具體步驟為 用pH 9.6的碳酸鹽緩衝液稀釋包被1:10-1 50倍稀釋的被檢腫瘤細胞裂解液。用PBS-T洗滌，200 iil/孔，每次30s後甩乾洗板液，重複三次；加入封閉液200iil/孔，37°C溫浴 Ih ;加入1:1000-1 :2000 倍比稀釋的抗 C-Myc IgM (2A9) 100 iil/孔，37。。溫浴 Ih ；用PBS-T洗滌^fHRP酶標羊抗小鼠IgM做1:5000-1:10000稀釋，100 yl/孔加入酶標板，37°C溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；加入鄰苯二胺(OPD)液100111/孔，371避光反應15min ;加入終止液(2mo 1/L硫酸溶液)100 u I/孔，酶標儀測定OD492nm值。
10.根據權利要求7所述利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELISA法，其特徵在於，在步驟S7中方法3的具體步驟為 用pH 9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋包被1:10-1 50倍稀釋的被檢腫瘤細胞裂解液。37°C反應Ih ^PBS-T洗滌;加入封閉液200iU/孔，37°C溫浴Ih ;加入1:1000-1 :2000倍比稀釋的抗c-Myc IgG(2B2)100 U I/孔，37°C溫浴Ih ;用PBS-T洗滌；將HRP酶標羊抗小鼠IgG做1:5000稀釋，100 iil/孔加入酶標板，37°C溫浴Ih ;用PBS-T洗滌;加入鄰苯二胺(OPD)液100 iil/孔，37°C避光反應15min ;加入終止液(2mol/L硫酸溶液)100 U I/孔，酶標儀測定 OD492nm 值。
全文摘要
本發明一種利用單克隆抗體快速檢測C-Myc的ELI SA法，通過蛋白純化技術將原核表達C-Myc蛋白提純；進行免疫的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，經ELISA法篩選，亞克隆及單克隆抗體Ig亞型鑑定，獲得2株能夠穩定分泌抗C-myc IgG1的克隆及抗C-myc IgM克隆。利用抗c-Myc IgG1抗體以及抗c-Myc IgM抗體，建立快速檢測c-Myc的一種夾心法ELISA法和兩種直接法ELISA法。本發明對C-myc蛋白樣品進行準確測定，可檢測的C-myc蛋白濃度範圍為0.01～1000pmol/L，檢出下限為0.01～0.05pmol/L，大大提高了檢測C-Myc的特異性和敏感性，操作簡單、重複性高，本發明檢測腫瘤組織中的C-Myc的表達量，為惡性腫瘤的篩選提供實驗數據。
文檔編號G01N33/531GK103048458SQ20121049668
公開日2013年4月17日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年11月29日
發明者李文哲, 金錦花 申請人:大連大學